阅读说明：本技术 一种磁响应的天然血管基质凝胶支架材料及其制备方法 (Magnetic-response natural vascular matrix gel scaffold material and preparation method thereof ) 是由 陈国宝 付强 黄湘 *** 夏斌 王富平 陈忠敏 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种磁响应的天然血管基质凝胶支架材料及其制备方法,所述支架材料在冰浴条件下,将脱细胞化血管、壳聚糖、β-甘油磷酸钠和磁性纳米颗粒复合构建水凝胶体系,然后将其固化得到凝胶,再将所述凝胶冷冻干燥即得到磁响应的天然血管基质凝胶支架材料。本发明制备的凝胶支架材料具有良好的生物相容性,能保证细胞在支架上的粘附与生长,并且该支架可以在磁场作用下促进支架内细胞的代谢速率和细胞增殖,还可以诱导凝胶支架的血管生成。本发明还可以根据需要来调节四氧化三铁纳米颗粒和脱细胞血管基质的含量从而改变其磁响应性和血管生成能力,适用范围广,具有良好的应用价值。本发明原料来源广泛,成本低廉,易于保存,更易于临床推广。(The invention discloses a magnetic-response natural blood vessel matrix gel scaffold material and a preparation method thereof. The gel scaffold material prepared by the invention has good biocompatibility, can ensure the adhesion and growth of cells on the scaffold, can promote the metabolic rate and cell proliferation of the cells in the scaffold under the action of a magnetic field, and can also induce the angiogenesis of the gel scaffold. The invention can also adjust the content of ferroferric oxide nano particles and acellular vascular matrixes according to the requirement so as to change the magnetic responsiveness and the angiogenesis capacity of the ferroferric oxide nano particles and the acellular vascular matrixes, has wide application range and good application value. The invention has wide raw material source, low cost, easy preservation and easy clinical popularization.)

一种磁响应的天然血管基质凝胶支架材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及血管组织工程支架材料技术领域，特别的涉及一种磁响应的天然血管基质凝胶支架材料及其制备方法。

背景技术

组织工程技术是近年出现的能重建缺损组织并促使其再生的新兴技术，其基本要素包括种子细胞、生物支架及生物活性因子等。生物支架为种子细胞提供一个三维生长的支架，从而使种子细胞增殖和分化，它起着代替组织或器官的细胞外基质的作用，使细胞间形成适宜的空间分布和细胞联系，成为人工模拟的细胞外基质，构成细胞生长的微环境。用于组织工程的生物支架材料包括：骨、软骨、血管、神经、皮肤和人工器官，如肝、脾、肾、膀胱等组织支架材料。

目前，虽然已经用薄壁组织(例如工程化膀胱)实现了令人鼓舞的结果，但依赖于血管供应的致密组织(例如心脏)的组织工程仍然是一个挑战。设计厚的复杂组织(例如肌肉)的主要障碍之一是需要在体外使组织血管化。体外血管化对于在组织生长期间维持细胞活力，诱导结构组织和促进植入时的血管形成是重要的。

发明专利CN201810741671.1公开了一种内层经过修饰的双层人工小口径血管的制备方法，该方法将羧基化的介孔硅分散到NaOH中，得到MSN；将其分散于MES和NaCl的混合溶液中，搅拌后加入EDC、PEG及NHS，获得MSN-PEG；将其分散在肝素溶液中得到MSN-PEG-Heparin；将其分散在HFIP中，得到分散液；分别制备内、外层纺丝液，并纺丝制成血管支架即可。虽然由静电纺丝得到的纳米纤维为细胞的黏附和生长提供合适的表面形态，利于细胞在支架上的粘附与生长，然而由静电纺丝制备的支架由于孔径太小，不利于细胞在深度方向上的迁移、增殖，且难以实现细胞在纤维支架上分布的有效调控，这限制了支架在组织再生医学治疗领域中的应用。值得注意的是，作为血管再生支架，除了能够具有支持细胞生长和增殖的作用外，还需要支架具有促进细胞增殖和代谢能力以及快速有效的血管化能力。

水凝胶因为其高含水量(通常含水量大于总质量的80％)和结构类似于生物体组织，比如，人体中的一些软组织(如肌腱、韧带、半月板软骨等)也是由凝胶物质构成的，故在与血液、体液、人体组织相接触时表现出良好的生物相容性。目前促进新血管生成的策略主要包括：1）在植入物中添加血管生成因子或激活血管生成信号通路的药物；2）植入物结合内皮细胞/间充质干细胞，通过体外细胞在植入物中的预血管化刺激体内新血管的生成；3）注射编码血管生成因子的质粒转导成血管生成因子；4）调节ROS/NO激活血管生成通路。目前有很多研究者研制开发了水凝胶血管再生支架，如发明专利CN201810986445.X，公开一种具有血管结构的组织工程支架及其制备方法，包括以下步骤：S1.构建三维立体网络模型，通过3D打印出三维网络结构的糖支架；S2.将S1打印出的糖支架浸入钙盐的乙醇混合溶液中，待乙醇挥发后获得表面载有钙盐的糖支架；S3.在所述步骤S2的糖支架中填充经过改性的光固化高分子，经过光固化形成固化的水凝胶支架；S4.将固化后的水凝胶支架置于水、PBS或者细胞培养基中除去糖支架，得到所述具有仿生血管网络的组织工程支架。发明专利CN201811326186.4公开了一种水凝胶、纳米纤维支架与皮肤细胞层层组装的血管化全层组织工程皮肤及其制备方法，人工组织工程皮肤包括表皮层和真皮层，其中表皮层是位于真皮层上方的纳米纤维支架与一种种子细胞交替层叠组成；真皮层由下层纳米纤维支架、上层水凝胶支架与三种种子细胞组成，种子细胞分布在纳米纤维支架表面与水凝胶内部及表面。上述专利利用体外细胞预血管化的方式刺激新血管的出芽，但这种方法因无法确定细胞在体内的存活率而饱受争议，并且其支架的制作工艺复杂，耗时较长，同时起促进血管生成作用的生长因子价格昂贵、易失活，临床上由于个体对于生长因子的使用存在差异，难以明确生长因子的用量。通过质粒转导成血管生成因子的方式由于其效率低下并且可能伴有炎症反应，因此在应用上受到限制。而利用ROS/NO激活血管生成通路的方式目前还停留在实验室阶段。由此可以看出现有的技术还无法完全克服促进受损组织内新血管生成的这一难题。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供了一种磁响应的天然血管基质凝胶支架材料，解决现有支架材料在促进血管生成上还存在成本高、效率低下和可能伴有炎症反应的问题，并且还无法完全克服促进受损组织内新血管快速有效生成的问题。

本发明还提供了一种磁响应的天然血管基质凝胶支架材料的制备方法，解决现有制备方法存在操作方法复杂、成本高和不易工业化生产的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种磁响应的天然血管基质凝胶支架材料，所述支架材料在冰浴条件下，将脱细胞化血管基质、壳聚糖、β-甘油磷酸钠和磁性纳米颗粒复合构建水凝胶体系，然后将其固化得到凝胶，再将所述凝胶冷冻干燥即得到磁响应的天然血管基质凝胶支架材料。

进一步，所述脱细胞化血管基质、壳聚糖、β-甘油磷酸钠和磁性纳米颗粒的质量比为0.5~3:10~27:5~21:1~10。

进一步，所述磁性纳米颗粒的粒径小于或等于20 nm，所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁。

本发明还提供了上述磁响应的天然血管基质凝胶支架材料的制备方法，包括以下步骤：

1）将胃蛋白酶溶于稀盐酸中得到胃蛋白酶溶液，然后加入脱细胞血管基质，再调节pH值至中性，得到脱细胞血管基质溶液；

2）在冰浴条件下，将β-甘油磷酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中混合均匀，得到混合溶液，然后向所述混合溶液中加入步骤1）制得的脱细胞血管基质溶液混匀，得到复合凝胶溶液；

3）将步骤2）复合凝胶溶液中加入磁性纳米颗粒，超声分散至均匀，调节pH值，再将其静置于4℃冰箱中除去表面气泡，然后放入恒温箱中待体系凝胶化，随后冷冻干燥，即得到具有磁响应的天然血管基质凝胶支架材料。

进一步，所述胃蛋白酶溶液的浓度为0.5~2 mg/mL，稀盐酸的浓度为0.01~0.05mol/L。

进一步，所述脱细胞血管基质溶液的质量浓度为5~20 mg/mL。

进一步，所述壳聚糖溶液的浓度为2~4%（m/v）。

进一步，所述甘油磷酸钠溶液的浓度为30%~60%（m/v）。

进一步，步骤3）所述pH值为6.5~7.5。

进一步，所述恒温箱温度为35~40℃。

进一步，所述冷冻干燥温度为-20~-80℃，时间为12~48h。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明制备的磁响应天然血管基质凝胶支架，以脱细胞化血管基质、壳聚糖、β-甘油磷酸钠和磁性纳米颗粒为原料，壳聚糖与β-甘油磷酸钠的水凝胶体系附载脱细胞化血管和磁性纳米颗粒在原位进行凝胶化形成表面多孔隙结构，这样不仅增加了脱细胞化血管和磁性纳米颗粒在水凝胶上的固着力，而且多孔隙结构更有利于细胞在支架上的粘附并在深度方向上生长。通过复配不同浓度的四氧化三铁纳米颗粒使得支架具备磁响应能力，在磁场作用下，细胞可以感知外加磁场施加的刺激，促进血管内皮细胞在支架上的增殖和代谢能力；添加的脱细胞血管基质是通过物理、化学或酶学的方法来去除血管内的细胞，消除了免疫原性并保留血管的天然细胞外基质成分，且这些天然细胞外基质成分中含有生物活性成分具有促进细胞向血管普系分化的能力，赋予支架诱导血管再生的能力，同时避免使用生长因子。可见，本发明的支架在脱细胞化血管、壳聚糖、β-甘油磷酸钠和磁性纳米颗粒协同配伍，既促进血管内细胞增殖和代谢能力，又有利于血管再生和创伤愈合过程中细胞的迁移和向血管普系分化，提高了血管再生和修复的速度。本发明为促进受损组织内新血管生成提供了新思路，具有良好的应用前景。

2、本发明制得的磁响应天然血管基质凝胶支架，生物相容性好，降解速度可控，可通过肾排出体外，不会积累在体内，无细胞免疫活性，安全性高，能在短时间内完成由溶胶到凝胶的转变并且具有较好的成型性，克服了天然高分子水凝胶机械性能不足的缺点，同时也具有生物活性，将支架植入SD大鼠皮下28天后，支架内产生了新的胞外基质并且布满了细胞，同时内部出现了大量孔径不一的血管。本发明还可以根据需要来调节四氧化三铁纳米颗粒和脱细胞血管基质的含量，从而改变支架的磁响应性和血管生成能力，在生物医药领域具有广泛的应用前景。

3、本发明制备的磁响应天然血管基质凝胶支架，制备工艺简单，原料来源广泛，成本低廉，易于保存。本发明的凝胶支架具有不可逆凝胶化，具有较好的力学性能，同时可以通过改变原料的比例来改变支架的刚度，由于不同组织的细胞对环境刚度会产生不同的响应，这直接影响到细胞的粘附增殖以及代谢，因此该方法能扩大支架的应用范围。

附图说明

图1为新鲜血管和脱细胞血管的H-E染色图，A为新鲜血管；B为脱细胞血管；

图2为本发明的磁响应天然血管基质凝胶支架及其各组分的FTIR图；

图3为本发明的磁响应天然血管基质凝胶支架的磁响应图；

图4为本发明的磁响应天然血管基质凝胶支架植入SD大鼠皮下28天后的H-E染色图。A为壳聚糖/β-甘油磷酸钠-四氧化三铁纳米颗粒凝胶支架；B为壳聚糖/β-甘油磷酸钠-四氧化三铁纳米颗粒-脱细胞血管基质凝胶支架。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例中所用试剂未特别说明均市售可得。

用于制备天然血管基质的脱细胞血管可选择不同动物不同部分的血管作为材料，只要满足所要修复血管的要求即可。为简洁期间，本发明主要以猪的主动脉的脱细胞血管为例加以阐述，其它动物和部分血管也可以采用相同的原理。具体采用以下方法制得：

S1：在屠宰场取得新鲜的猪主动脉剪碎后放入去离子水中浸泡过夜，然后置于气浴恒温振荡器中振荡浸浴12h，对新鲜猪主动脉进行清洗，清洗期间需更换去离子水2次，将清洗后的猪主动脉在浓度为3%的Triton X-100溶液中振荡浸浴12h；然后用甲醇对猪主动脉进行脱脂处理24h，处理期间需更换甲醇三次，脱脂结束需使用无去离子水振荡浸浴30min，清洗多余的甲醇。

S2：在37℃下，利用DNase I温育步骤S1得到脱脂处理后的猪主动脉2h，并保持震荡，用PBS溶液清洗，清洗过程保持轻微的震荡。然后用去离子水清洗，震荡浸浴猪主动脉30min；再将猪主动脉浸入无水乙醇中震荡浸浴4h，中途更换酒精一次；用大量的去离子水浸没猪主动脉，在气浴恒温振荡器中振荡浸浴脱细胞的主动脉；将处理后的脱细胞猪主动脉置于37℃的真空干燥箱内，进行干燥处理；将完全干燥后的脱细胞猪主动脉利用研钵研磨至粉末状，即得到脱细胞化血管，将其封装放在4℃冰箱，备用。

将新鲜血管和得到的脱细胞血管进行H-E染色，其中，苏木素染色液能将细胞核染成蓝色，伊红染色液能将细胞质染成粉红色，结果如图1所示。

从图中可以看出，新鲜的血管中原本含有大量的细胞核，表明里面含有大量细胞，通过脱细胞处理后，细胞基本除去并且完整地保留了细胞外基质，表明该脱细胞方法能够有效地达到获取完整细胞外基质的目的。

实施例1

1）将胃蛋白酶溶于0.01 N盐酸中配置1 mg/mL的胃蛋白酶溶液，然后加入脱细胞血管基质粉末放入胃蛋白酶溶液中，磁力搅拌至完全溶解，使脱细胞血管基质溶液的浓度为10mg/mL，再用氢氧化钠调节pH值至中性。

2）用0.1 mol/L稀盐酸配置100 mL浓度为2.86%的壳聚糖溶液（每100份体积的壳聚糖溶液含10份质量的壳聚糖）；将β-甘油磷酸钠粉末放入质量分数为3.36%的碳酸氢钠溶液中，配置成浓度为50%的β-甘油磷酸钠溶液；

3）在冰浴条件下，取9 mL的β-甘油磷酸钠溶液缓慢滴加入到21 mL壳聚糖溶液中，然后加入9 mL脱细胞血管基质溶液，持续搅拌；再加入1.8 g四氧化三铁纳米颗粒，超声分散至均匀，调节pH值至6.5-7.5，持续搅拌，得到水凝胶体系。

4）将步骤3）得到的水凝胶体系放入4℃冰箱除去气泡，再放入37℃恒温培养箱中，待体系从溶胶到凝胶的转变；然后将得到的凝胶放入-20℃冰箱中冷冻干燥24h，得到具有磁响应的天然血管基质凝胶支架材料。

实施例2

1）将胃蛋白酶溶于0.01 N盐酸中配置1 mg/mL的胃蛋白酶溶液，然后加入脱细胞血管基质粉末放入胃蛋白酶溶液中，磁力搅拌至完全溶解，使脱细胞血管基质溶液的浓度为10mg/mL，再用氢氧化钠调节pH值至中性。

2）用0.1 mol/L稀盐酸配置100 mL 浓度为2.86%的壳聚糖溶液；将β-甘油磷酸钠粉末放入质量分数为3.36%的碳酸氢钠溶液中，配置成浓度为50%的β-甘油磷酸钠溶液；

3）在冰浴条件下，取12 mL的β-甘油磷酸钠溶液缓慢滴加入到20 mL壳聚糖溶液中，然后加入12 mL脱细胞血管溶液，持续搅拌；再加入1.8 g四氧化三铁纳米颗粒，超声分散至均匀，调节pH值至6.5~7.5，持续搅拌，得到水凝胶体系。

4）将步骤3）得到的水凝胶体系放入4℃冰箱除去气泡，再放入37℃恒温培养箱中，待体系从溶胶到凝胶的转变；然后将得到的凝胶放入-20℃冰箱中冷冻干燥24h，得到具有磁响应的天然血管基质凝胶支架材料。

1、将本发明制得的天然血管基质凝胶支架材料（CS/GP-DVM-Fe₃O₄）及脱细胞化血管（DVM）、壳聚糖（CS）、β-甘油磷酸钠（GP）和磁性纳米颗粒四氧化三铁（Fe₃O₄）进行红外光谱分析，结果如图2所示。

从图中可以看出，天然血管基质凝胶支架材料的红外光谱图中分别出现了脱细胞化血管、壳聚糖、β-甘油磷酸钠和磁性纳米颗粒四氧化三铁的特征峰，并未出现新的特征峰，可知该支架材料基本保留了各组分原有的特性。

2、将本发明制得的天然血管基质凝胶支架材料（CS/GP-DVM-Fe₃O₄）和未添加四氧化三铁的凝胶材料CS/GP-DVM进行磁响应测试，结果如图3所示。

从图中可以看出，与未添加四氧化三铁纳米颗粒的CS/GP-DVM相比，本发明制备的天然血管基质凝胶支架材料被磁铁吸引，具有良好的磁响应性。

3、将本发明制得的天然血管基质凝胶支架材料（CS/GP-DVM-Fe₃O₄）进行大鼠皮下埋植实验，同时将未加天然血管基质凝胶的支架材料（CS/GP-Fe₃O₄）设为对照组，结果如图4所示。

从图4中可以看出，在将CS/GP-Fe₃O₄支架植入SD大鼠皮下28天后，支架内细胞数量稀疏，且仅有少量的血管生成，而添加了天然血管基质凝胶的CS/GP-DVM-Fe₃O₄支架内布满了细胞，同时内部出现了大量孔径不一的血管，由此可以证明本发明制备的天然血管基质凝胶支架材料具有良好的组织相容性并且具有极好的促进管内细胞增殖和新血管生成的能力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。