阅读说明：本技术 一种支架复合材料及其制备方法、应用 (scaffold composite material and preparation method and application thereof ) 是由 杨熙 于 2019-08-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开支架复合材料及其制备方法,包括制备间充质干细胞的单细胞悬液,然后取水解胎盘提取物、生物大分子、可降解高分子和溶剂混合,调节pH至7.2-7.4,制备得到第一支架材料预混溶液；最后将间充质干细胞的单细胞悬液和第一支架材料预混溶液按预设配方混合,得到支架复合材料。本发明还公开上述支架复合材料的应用。本发明实施例应用间充质干细胞和传统支架相结合技术,制备得到的支架复合材料分离工艺简单、体外扩增容易、生物相容性好,不易过敏、机械强度良好,未见破碎和大幅降解。(The invention discloses a scaffold composite material and a preparation method thereof, which comprises the steps of preparing single cell suspension of mesenchymal stem cells, then mixing hydrolyzed placenta extract, biological macromolecules, degradable macromolecules and a solvent, adjusting the pH value to 7.2-7.4, and preparing to obtain a first scaffold material premixed solution; and finally, mixing the single cell suspension of the mesenchymal stem cells and the first scaffold material premixed solution according to a preset formula to obtain the scaffold composite material. The invention also discloses application of the bracket composite material. The embodiment of the invention applies the technology of combining the mesenchymal stem cells and the traditional scaffold, and the prepared scaffold composite material has the advantages of simple separation process, easy in-vitro amplification, good biocompatibility, difficult allergy, good mechanical strength, no breakage and no substantial degradation.)

一种支架复合材料及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及医学材料技术领域，尤其涉及一种支架复合材料及其制备方法、应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一组源于基质的异质细胞群，可以从人体大多数组织获取。它们具有自我更新能力、组织修复、免疫调节能力，可以向中胚层谱系分化，例如：脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等，此外还能够向及其它胚层谱系细胞分化，例如向表皮细胞、血管内皮细胞分化。

干细胞凭借极强的自我复制能力和分化能力，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能。间充质干细胞相对于其它种子细胞，具有来源广泛、含量丰富、分离简单、体外扩增稳定容易、不涉及伦理问题、便于自体移植、免疫原性低、对供区损伤小等优势，备受外科医生的重视。

而现有支架材料如采用生物材质，存在机械强度差，在用手术钳夹取过程中和加入培养基后易松散，在培养过程中易破碎和大幅降解的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供支架复合材料及其制备方法、应用。

一方面，本发明实施例提供了一种支架复合材料的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

S1、制备间充质干细胞的单细胞悬液，所述单细胞悬液的浓度0.9×10⁵至1.1×10⁶个/ml；

S2、取水解胎盘提取物、生物大分子、可降解高分子和溶剂混合，调节pH至7.2-7.4，制备得到第一支架材料预混溶液；

S3、将S1制备得到的间充质干细胞的单细胞悬液和S2制备得到的第一支架材料预混溶液按预设配方混合，制备得到所述支架复合材料。

作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S2前还包括预先制备水解胎盘提取物，具体包括以下步骤：

1、制备胎盘组织块；

将分离间充质干细胞时剥离下的红色松散组织及剩余胎盘组织用纯化水冲洗去掉表面的血块，加DMEM浸没后-80℃冷冻，然后37℃水浴解冻和4℃条件下去离子水洗涤、用1％Triton x-100和0.1％的氢氧化铵进行洗脱、去离子水洗涤、PBS洗涤、去离子水洗涤后；将组织块沥干；

2、制备不同粒径的胎盘冻干组织；

将沥干后的组织放置于-80℃冰箱冷冻和冻干24h，将冻干组织用高速粉碎机进行粉碎；用100um、70um、4um细胞筛进行分筛，分出不同粒径；将100um、70um粒径的胎盘组织进行重复粉碎；

3、制备水解胎盘提取物；

用4um细胞筛分筛，将小于4um粒径的胎盘粉每克加入9mL 0.1M的HCl，室温下离心，用1M NaOH调上清液的pH至7.4，用0.22um的过滤器过滤上清液，制成水解胎盘提取物。

作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S1包括制备间充质干细胞的单细胞悬液，具体包括以下步骤：

S101、分离培养间充质干细胞；

S102、将间充质干细胞细胞传代扩增；

S103、取对数生长期第2代的细胞，吸出培养基，加入消化液进行消化，之后用适量血清终止消化，吹打形成单细胞悬液。

作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S101分离培养间充质干细胞的具体步骤包括：

取健康供体胎盘组织，用PBS反复清洗数次，剥离胎盘表面的羊膜。取小块组织，用虎齿镊刮掉上面附着的红色松散组织，保留所有血管，生理盐水清洗，将胎盘组织剪切成1～4mm²的组织匀浆块，胶原酶消化，离心消化液10min，细胞沉淀用无血清无酚红的间充质干细胞专用培养基培养，在温度为37℃，CO₂体积分数为5％的培养箱中培养。

作为本发明实施方式的进一步改进，所述将间充质干细胞细胞传代扩增并消化，并形成单细胞悬液的具体步骤包括：

当细胞汇合率达70％时进行传代，加入预热后的0.05％胰酶，轻轻旋转覆盖瓶底，置37℃培养箱中消化3～5min；消化3min后显微镜下观察；大多数细胞变圆，且部分细胞已经悬浮时终止消化；

吸出细胞悬液后用DMEM清洗培养瓶，离心10min后，吸出上清，培养基重悬细胞沉淀，计数，3000-6000个cell/cm²密度接种入T75培养瓶中，当P1细胞汇合率达70％时进行第二次传代操作，3000-6000个cell/cm²密度接种入T175培养瓶中。

作为本发明实施方式的进一步改进，所述生物大分子包括壳多糖、胶原蛋白。

作为本发明实施方式的进一步改进，所述生长因子包括表皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF、角质细胞生长因子KGF-2、血小板衍生因子PDGF、转化生长因子TGF-β、血管内皮生长因子VEGF、肝细胞生长因子HGF、***IGF、白细胞介素6、白细胞介素8中任意一种或多种的组合。

作为本发明实施方式的进一步改进，所述胶原蛋白为I型胶原蛋白。

作为本发明实施方式的进一步改进，所述间充质干细胞提取自动物、同种异体或自体，或者提取自胎盘组织、脐带、骨髓、脂肪组织。

作为本发明实施方式的进一步改进，所述水解胎盘提取物提取自动物的胎盘或人异体的胎盘、产妇自身分娩产生的胎盘。

另一方面，本发明实施例提供了由上述制备方法得到的支架复合材料。

再一方面，本发明实施例提供了由上述的制备方法得到的支架复合材料在制造创伤修复的支架中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

1、本发明实施例利用人体干细胞，具有强大再生、修复、分化能力，能明显促进衰老细胞的修复再生，间充质干细胞分泌物，拥有更多种类和含量的生物活性物质，活性因子EGF配合FGF和KGF等协同作用，能够支持受损细胞的修复和增殖，提供组织再生和细胞增殖的微环境，帮助真皮成纤维细胞的增殖，促进胶原合成；

2、本发明实施例中应用干细胞分泌物和脱细胞胎盘组织，降低了直接使用干细胞可能造成的过敏反应的风险，利用低免疫原性的脱细胞生物材料因具有天然特定的三维结构、富含活性因子等特点在一定程度上解决了细胞成活率低的问题；支架材料也可以为间充质干细胞提供合适的生存和分化环境，选择合适的生物支架材料可以提高创面修复的效果；

3、本发明利用间充质干细胞和支架相结合的技术，形成的新的支架材料机械强度良好，可用手术钳夹取，加入培养基后不松散，继续培养过程中未见破碎和大幅降解。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为实施例洗脱组织HE染色图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例一

本发明实施例提供了一种支架复合材料的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

S1、制备间充质干细胞的单细胞悬液，所述单细胞悬液的浓度0.9×10⁵至1.1×10⁶个/ml；

S2、取水解胎盘提取物、生物大分子、可降解高分子和溶剂混合，调节pH至7.2-7.4，制备得到第一支架材料预混溶液；

S3、将S1制备得到的间充质干细胞的单细胞悬液和S2制备得到的第一支架材料预混溶液按预设配方混合，制备得到所述支架复合材料。

其中步骤S2前还包括预先制备水解胎盘提取物，具体包括以下步骤：

1、制备胎盘组织块；

将分离间充质干细胞时剥离下的红色松散组织及剩余胎盘组织用纯化水冲洗去掉表面的血块，加DMEM浸没后-80℃冷冻，然后37℃水浴20min，重复多次后加入纯化水放入4℃的摇床上震荡24h，每6h换一次去离子水，用1％Triton x-100和0.1％的氢氧化铵进行洗脱3天，去离子水洗涤组织块1天；用PBS洗涤组织块1天，去离子水洗涤组织块1天；将组织块沥干后称重记录；

2、制备不同粒径的胎盘冻干组织；

将沥干后的组织放置于-80℃冰箱24h，将冷冻后的组织冻干24h，将冻干组织用高速粉碎机进行粉碎；用100um、70um、4um细胞筛进行分筛，分出不同粒径；将100um、70um粒径的胎盘组织进行重复粉碎；

3、制备水解胎盘提取物；

用4um细胞筛分筛，将小于4um粒径的胎盘粉每克加入9mL 0.1M的HCl，室温下(26℃)进行震荡48h，1500rpm，15min离心3次，每次取上清液沉淀物质加入40ml去离子水混匀后再次离心，得到上清液，用1M NaOH调pH至7.4，用0.22um的过滤器进行过滤，制成水解胎盘提取物。

在步骤3之后，用天根DP304试剂盒提取DNA并用微量核酸测定仪测得100g胎盘新鲜组织中的DNA含量约为1789.2ng/mg，脱细胞后的9.1g冻干粉DNA含量平均为44.6ng/mg，脱细胞效率为99.8％；对脱细胞后的组织进行HE染色切片结果如图1所示，图中没有明显可见的细胞核分布，说明脱细胞效果达到要求，有效去除过敏源。

其中，在本发明实施例中，水解胎盘提取物由胎盘组织脱细胞效率达到99％-99.9％。

进一步地，步骤S1包括制备间充质干细胞的单细胞悬液，具体包括以下步骤：

S101、分离培养间充质干细胞；

S102、将间充质干细胞细胞传代扩增；

S103、取对数生长期第2代的细胞，吸出培养基，加入消化液进行消化，之后用适量血清终止消化，吹打形成单细胞悬液。

其中，所述步骤S101分离培养间充质干细胞的具体步骤包括：

取健康供体胎盘组织，用PBS反复清洗数次，剥离胎盘表面的羊膜。取小块组织，用虎齿镊刮掉上面附着的红色松散组织，保留所有血管，生理盐水清洗，将胎盘组织剪切成1～4mm²的组织匀浆块，胶原酶消化，离心消化液10min，细胞沉淀用无血清无酚红的间充质干细胞专用培养基培养，在温度为37℃，CO₂体积分数为5％的培养箱中培养。

作为本发明实施方式的进一步改进，所述将间充质干细胞细胞传代扩增并消化，并形成单细胞悬液的具体步骤包括：

当细胞汇合率达70％时进行传代，加入预热后的0.05％胰酶，轻轻旋转覆盖瓶底，置37℃培养箱中消化3～5min；消化3min后显微镜下观察；大多数细胞变圆，且部分细胞已经悬浮时终止消化；

吸出细胞悬液后用DMEM清洗培养瓶，离心10min后，吸出上清，培养基重悬细胞沉淀，计数，3000-6000个cell/cm²密度接种入T75培养瓶中，当P1细胞汇合率达70％时进行第二次传代操作，3000-6000个cell/cm²密度接种入T175培养瓶中。

在本发明实施例中，生物大分子为壳多糖；生长因子包括表皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF、角质细胞生长因子KGF-2、血小板衍生因子PDGF、转化生长因子TGF-β、血管内皮生长因子VEGF、肝细胞生长因子HGF、***IGF、白细胞介素6、白细胞介素8中任意一种或多种的组合。

本发明实施例生长因子采用多种复合物，含量测定结果，如表一所示：

表一 各种活性因子含量的含量为

具体地，胶原蛋白为I型胶原蛋白。

在本发明实施例中，间充质干细胞提取自动物、同种异体或自体，或者提取自胎盘组织、脐带、骨髓、脂肪组织，而水解胎盘提取物提取自动物的胎盘或人异体的胎盘、产妇自身分娩产生的胎盘。

在本发明实施例中，步骤S3中将S1制备得到的间充质干细胞的单细胞悬液和S2制备得到的第一支架材料预混溶液按预设配方混合的预设配方可以选择以下配比方式：

具体例1

间充质干细胞悬浮液 0.9×10⁵个/ml～1.1×10⁵个/ml

水解胎盘提取物 3～5.5％

壳多糖 1.5～2.5％

I型胶原 0.4～0.6％

EGF 4.5～5.5ng/ml

具体例2

间充质干细胞悬浮液 0.9×10⁵个/ml～1.1×10⁵个/ml

水解胎盘提取物 2～3.5％

壳多糖 1.8～2.2％

I型胶原 0.4～0.6％

EGF 4.5～5.5ng/ml

具体例3

间充质干细胞悬浮液 1.0×10⁵个/ml～1.1×10⁵个/ml

水解胎盘提取物 3～5.5％

壳多糖 2.0～2.5％

I型胶原 0.4～0.6％

EGF 4.5～5.5ng/ml

实施例二

本发明实施例提供了由实施例一公开的制备方法得到的支架复合材料，具体例也参照实施例1中配比组成，需要说明的是：

在本发明实施例中，胶原蛋白还可以选自其他材料A，材料A选自脱细胞基质与二型胶原、丝素蛋白、甲壳素及其衍生物、透明质酸、海藻酸、明胶、纤维蛋白中一种或几种的组合；

本发明实施例中还可以添加材料B，材料B选自聚己内酯、羟基磷灰石(纳米羟基磷灰石)、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸羟基乙酸共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、磷酸八钙、磷酸三钙、聚对二氧环己酮、PVA、聚氨酯、聚碳酸酯、聚羟基烷酸酯(聚羟基丁酸酯和聚羟基戊酸酯以及共聚物)、多糖、聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、聚乙交酯-共-三亚甲基碳酸酯、聚合物糖、蛋白质、亲水嵌段共聚物、聚糖醛酸、粘多糖、聚氧乙烯、表面活性剂、多羟基化合物、多羟基酯、脂肪醇、脂肪醇酯、脂肪酸、脂肪酸酯、液体硅酮中的任意一种或几种的组合；还包括其他辅助试剂，如粘合用的纤维素及玻璃、金属、生长激素、蛋白质、聚乙烯醇、延胡索酸、透明质酸、柠檬酸等；

本发明实施例包括将间充质干细胞悬浮液连同水解胎盘提取物及其他生物大分子、包括但不限于上述提及的材料A及材料B等传统软骨支架材料；

传统支架材料还包括以下配方：

传统支架一包括水凝胶A和水凝胶B；水凝胶A和水凝胶B打印时的使用质量比例为4∶3～3∶2；

其中，水凝胶A：甲基丙烯酰基甘氨酰胺水凝胶40～50份、三斜磷钙石10～15份、硫酸钙13～18份、非离子型表面活性剂0.3～0.6份、乙酸乙酯16.4～36.7份；

水凝胶B中：二氧化硅凝胶22～30份、硅酸18～26份、聚乳酸短纤维25～32份、两性离子表面活性剂0.2～0.5份、乙醇11.5～34.8份。

传统支架二的浆料配方包括4-8％的聚乙烯醇水溶液、氧化铜以及含有钙磷的生物陶瓷材料组成，其中，含有钙磷的生物陶瓷材料与所述聚乙烯醇水溶液的质量体积比为2.5-3.5g/mL，氧化铜与所述含有钙磷的生物陶瓷材料的质量比为0.005-0.05∶1。其中，含有钙磷的生物陶瓷材料为羟基磷灰石、磷酸八钙、磷酸钙或双相磷酸钙，粒径为10-15μm。

传统支架三的配方包括II型胶原蛋白、透明质酸、硫酸软骨素以及羟基磷灰石；其中提取的II型胶原蛋白制备成浓度为1％-2％(m/V)的II型胶原蛋白溶液，将上述均一的混合溶液体系转移至24孔板中，真空冷冻干燥，得到三维软骨支架。

实施例三

本发明实施例提供了由上述的制备方法得到的支架复合材料在制造创伤修复的支架中的应用。

具体的支架制备工艺包括以下步骤：

本发明实施例将制备的间充质干细胞的单细胞悬液与实施例2中由间充质干细胞的单细胞悬液、水解胎盘提取物、生物大分子、胶原蛋白、生长因子混合制备得到的支架复合材料进行打印，将实施例2所述的支架复合材料做为支架结构打印成有序排列的含孔结构，孔径为100-500um，其孔隙结构可为正交的正方形孔，或三角孔。

负载细胞打印填充在实施例2所述的支架复合材料的孔隙中，层层叠加，打印完成后进行交联培养。

进一步地，可以将通过3D打印装备进行打印，打印具有有序排列的孔隙结构，将细胞按照1x10⁵-1x10⁷个/ml的密度，将打印的实施例2所述的支架复合材料支架浸泡其中，再进行交联后得到骨支架。

将实施例2所述的支架复合材料通过3D打印装备进行打印，打印具有有序排列的孔隙结构，将打印的实施例2所述的支架复合材料支架浸泡于材料A中，交联后进行冷冻干燥12-24h得到支架。

为了进一步验证上述支架复合材料在在制造创伤修复的支架中的应用，将本发明制备的支架复合材料的机械性能、生物相容性能进行测试，实验设计及参数如下：

1、细胞活力测试：

将制备的负载间充质干细胞的复合材料支架放入培养基中进行培养，在培养1、4、7d时对复合材料支架中的细胞用活/死细胞染色试剂盒进行活/死细胞染色，在荧光显微镜下观察并拍照，红色的是死细胞，绿色的为活细胞，分别对支架中的活、死细胞进行数量统计，计算出活细胞所占总细胞数量的百分比；结果表明细胞存活率为80％以上，说明所制备得的支架复合材料能很好地保持细胞活性，具有良好的细胞相容性。

2、孔径检测

将制备的复合材料支架干燥后在表面喷金，放入扫描电子显微镜下进行表面形态观察，并拍照记录；主要观察复合材料支架的孔径大小及网络分布情况，测定结果表明复合材料支架的孔径为100um～500um本发明实施例公开的复合材料支架孔径大小适宜，且孔隙之间相互连通，提高的比表面积，利于氧气和营养物质的输送及代谢物质的排除，有利于细胞的粘附、生长及增殖。

3、力学性能检测

用万能试验机检测复合材料支架的压缩强度，测量复合材料支架的高度及直径，保持1mm/min的压缩速度，根据测量的数据绘制应力-应变曲线，计算压缩强度；测试结果表明形成的新的复合材料支架具有较好的机械强度，可用手术钳夹取，加入培养基后不松散，继续培养过程中未见破碎和大幅降解。

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

1、本发明实施例利用人体干细胞，具有强大再生、修复、分化能力，能明显促进衰老细胞的修复再生，间充质干细胞分泌物，拥有更多种类和含量的生物活性物质，活性因子EGF配合FGF和KGF等协同作用，能够支持受损细胞的修复和增殖，提供组织再生和细胞增殖的微环境，帮助真皮成纤维细胞的增殖，促进胶原合成；

2、本发明实施例中应用干细胞分泌物和脱细胞胎盘组织，降低了直接使用干细胞可能造成的过敏反应的风险，利用低免疫原性的脱细胞生物材料因具有天然特定的三维结构、富含活性因子等特点在一定程度上解决了细胞成活率低的问题；支架材料也可以为间充质干细胞提供合适的生存和分化环境，选择合适的生物支架材料可以提高创面修复的效果；

3、本发明利用间充质干细胞和支架相结合的技术，形成的新的支架材料机械强度良好，可用手术钳夹取，加入培养基后不松散，继续培养过程中未见破碎和大幅降解。

在上述实施方式的描述中，具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。