阅读说明：本技术 一种长非编码rna在诊断和治疗乳腺癌中的应用 (Application of long non-coding RNA in diagnosis and treatment of breast cancer ) 是由 张智弘 狄世豪 于 2019-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明属于基因工程领域,特别涉及长非编码RNA LCT-AS1在乳腺癌中作为发生和转移的分子标记物且成为乳腺癌治疗靶点的潜在作用。通过改变长非编码RNA LCT-AS1的表达对乳腺癌细胞的增殖、转移等产生影响,说明敲低长非编码RNA LCT-AS1的表达能够抑制乳腺癌细胞的增殖、转移和细胞周期进展,促进凋亡。(The invention belongs to the field of genetic engineering, and particularly relates to a potential effect of long non-coding RNA LCT-AS1 serving AS a molecular marker for generation and transfer in breast cancer and becoming a breast cancer treatment target. The influence of the expression of the long non-coding RNA LCT-AS1 on the proliferation, the metastasis and the like of the breast cancer cells is changed, so that the knocking down of the expression of the long non-coding RNA LCT-AS1 can inhibit the proliferation, the metastasis and the cell cycle progression of the breast cancer cells and promote the apoptosis.)

一种长非编码RNA在诊断和治疗乳腺癌中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种长非编码RNA LCT-AS1在诊断/治疗乳腺癌中的应用。

背景技术

乳腺癌(Breast Cancer,BC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，也是全世界妇女癌症死亡的首要原因，随着手术、内分泌治疗、化疗和靶向治疗等综合性治疗手段的发展，乳腺癌的死亡率呈下降趋势，但仍是导致绝经后妇女癌症相关死亡的主要原因之一，占所有癌症死亡人数的23％。早期乳腺癌可通过治疗获得治愈效果，但由于女性对***的自我检查和临床检查的疏忽，绝大多数乳腺癌患者在初诊时已处于临床中晚期，即使综合运用以上治疗手段，仍有较高的复发转移风险，预后不容乐观。

芯片技术和全转录组测序技术研究发现人类基因组中能编码蛋白的RNA仅占2％，其余的均为非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)。长非编码RNA(Long non-codi ng RNA,LncRNA)是一类长度超过200nt，无蛋白质编码能力的RNA分子，在转录、转录后以及表观遗传水平广泛参与调控细胞的各种生命活动，其异常表达与恶性肿瘤的发生发展之间存在着密切联系。大量研究表明，lncRNA在乳腺癌的发生发展过程中发挥着重要的作用。例如，LncRNA AFAP1-AS1、ARNLA、ZNF469、DANCR达水平的升高和LncRNA H19、LncRNA GASS表达水平的降低与TNBC的预后不良有关。又如， LncRNA MALAT1调节了三阴性乳腺癌(TripleNegative Breast Cancer,TNBC)发生和进展的关键途径，高表达的MALAT1可以通过竞争性结合miR-34a/c-5p和miR-449a/ b等靶向mRNAs来上调c-MET和SOX4的表达水平，进而促进了肿瘤细胞的增殖和转移。

发明内容

本发明发现LncRNA LCT antisense RNA 1(LCT-AS1)在乳腺癌组织中与邻近正常组织相比表达显著上调。研究发现过表达LncRNA LCT-AS1会促进乳腺癌细胞的增殖与转移，是乳腺癌的一个重要致癌因子，可作为乳腺癌发生和转移的潜在分子标记物和乳腺癌治疗的一个靶点，因此在预测和治疗乳腺癌方面具有良好的应用前景。

LncRNA LCT-AS1是一条长度为1862bp的LncRNA，是由发明人提供正常乳腺组织和乳腺癌组织标本，通过TCGA数据库分析和qPCR的检测筛选出的在乳腺癌组织中显著高表达的RNA。由本发明首次发现它在乳腺癌中的调控作用，具有新颖性。

本发明的目的是提供用于判断乳腺癌预后情况或作为乳腺癌治疗靶点的LncRNALCT-AS1，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，

本发明还涉及识别所述的长非编码RNA的标记物在制备判断乳腺癌治疗预后情况的诊断产品中的应用，所述的标记物包括但不限于：

(1)结合所述长非编码RNA的引物/引物组或荧光标记的结合所述长非编码RNA 的引物/引物组；

(2)结合所述长非编码RNA的小分子化合物；

(3)结合所述长非编码RNA的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于：抗体或抗体功能片段、荧光标记的抗体或抗体功能片段、RNA结合蛋白或其功能片段、荧光标记的RNA结合蛋白或其功能片段。

所述的引物组或荧光标记的引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，

Primer F(SEQ ID NO：2)：

5’-CGGGAGGAAGATAAACGGGG-3’，

Primer R(SEQ ID NO：3)：

5’-TGACCACGGGAACACCTTCAG-3’。

本发明还涉及包含所述的识别所述的长非编码RNA的标记物的用于判断乳腺癌治疗预后情况的试剂或试剂盒。

本发明还涉及所述的识别所述的长非编码RNA的标记物或包含所述标记物的试剂或试剂盒在判断乳腺癌的治疗预后情况中的应用。

本发明还涉及所述的长非编码RNA在制备治疗乳腺癌的药物中的应用；

本发明还涉及所述的长非编码RNA在作为筛选判断乳腺癌预后情况的诊断试剂中的应用。

本发明还涉及所述的长非编码RNA在作为筛选治疗乳腺癌的药物中的应用。

技术方案

1、组织收集

56对乳腺癌和对应的癌旁组织样本是从病人中获得，这些病人是在南京医科大学第一附属医院进行手术。所有病例根据组织病理学评价确认为乳腺癌。这些病人手术前没有进行局部的或系统的治疗。所有收集的组织样本立即速冻在液氮里，并储存在-80℃备用。我们的研究得到了南京医科大学第一附属医院的研究伦理委员会批准。

2、细胞培养

两个乳腺癌细胞系(T-47D&MDA-MB-231)是从中国科学院上海细胞库购买(上海，中国)。T-47D细胞培养条件为RPMI 1640+10％胎牛血清+0.2Units/ml胰岛素； MDA-MB-231细胞培养条件为L-15+10％胎牛血清。完全培养基中含有10％的胎牛血清、 100U/毫升青霉素和100毫克/毫升的链霉素，在37℃，5％CO2的培养箱中培养。

3、RNA提取和定量PCR分析

根据试剂的使用说明，用Trizol试剂分离总RNA。逆转录反应应用TaKaRa PrimeScript试剂盒(TaKaRa，大连，中国)。逆转录试剂盒对1μg总RNA进行逆转录，最终体积为20μl。结果分析：分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。计算公式为：2^(-△Ct)，△Ct＝Ct gene-Ct control。

4、质粒构建

人LCT-AS1全长cDNA序列合成并***到pcDNA载体中。LncRNA-LCT-AS1的异位过表达是通过pcDNA-LCT-AS1转染获得的，以一个空的pcDNA载体为对照。48小时后qRT-PCR检测LncRNA LCT-AS1的表达水平。

5、细胞转染

所有用于转染的质粒载体，均用去除内毒素的质粒提取试剂盒提取(DNAMidiprep 试剂盒，Qiagen)。LncRNA LCT-AS1的干扰序列及乱序对照(si-NC)均购自Invitrogen 公司(Invitrogen公司，CA，USA)。

将T-47D和MDA-MB-231细胞按每孔2×10⁵个细胞种于6孔培养板，待细胞贴壁后，在转染前12h弃掉原有培养基，换成无双抗培养基；取10μl脂质体稀释于250μl 的OPTI-MEM中，温和吹打混匀，室温下孵育5min；取100pmol siRNA、si-NC或4ug pcDNA、pcDNA-LCT-AS1分别稀释于250μl OPTI-MEM中，吹打混匀，室温下孵育5 min；将孵育好的脂质体与siRNA或质粒稀释液混合，温和吹打混匀，在室温下继续孵育20min；将上述混合物均匀滴入事先加好1.5mL OPTI-MEM的6孔培养板中，轻轻混匀，继续放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；培养6h后，弃去OPTI-MEM培养基，更换为完全培养基，继续放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；转染后24-48h，收集细胞提取总RNA或蛋白进行qRT-PCR检测或western blot分析。

根据操作说明用lipofectamine2000转染试剂转染质粒载体(pcDNA3.1-LncRNALCT-AS1和空的pcDNA载体)。T-47D和MDA-MB-231细胞融合满了就接种到六孔板里，然后根据说明操作。转染48小时后，收集细胞，用于qRT-PCR或免疫印迹分析。

6、CCK8实验将转染后24h的T-47D和MDA-MB-231细胞按每孔3000个细胞接种于96孔培养板；待细胞80％贴壁后，细胞同步化12h，弃去原有培养基。每个样本设置6个复孔，每孔总反应体积为200μl。每孔加入20μl的CCK8反应液(5mg/ml，溶于PBS)，37℃避光孵育2h，酶标仪测定450nm波长处的吸光度。共测五次，每次间隔时间相同。

7、克隆形成实验

用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单细胞悬液，以适当的细胞密度(500个)接种于6孔板，使细胞分散均匀；放入细胞培养箱中，每4天换液一次，培养2周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS轻轻清洗2次；加纯甲醇或1: 3醋酸/甲醇1ml，固定15分钟；弃甲醇固定液，加1ml 0.1％结晶紫染色液染15分钟，然后用PBS缓慢洗去染色液，空气干燥。将6孔板倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。

8、流式细胞术

细胞样品的准备：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm左右离心3-5分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50μl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1mL冰浴预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。再次加入1mL冰浴预冷的PBS，重悬细胞。

细胞固定：取4ml冰浴预冷的95％乙醇，低速涡施需荡的同时逐商加入1ml细胞悬液(在水上操作)，混匀后4℃固定2小时或更长时间。固定12-24小时可能效果更佳。1000rpm左右离心3-5分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50μl左右的乙醇，以避免吸走细胞。加入约5ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50μl左右的PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

碘化丙啶染色液的配制：参考下表，根据待检测样品的数量配制适量的碘化丙啶染色液：

注：配制好的碘化丙啶染色液短时间内可以4℃保存，宜当日使用。

染色：每管细胞样品中加入0.4mL碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30分钟。随后可以4℃或冰浴避光存放。染色完成后宜在24小时内完成流式检测，最好能在当日完成流式检测。

流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

9、Transwell实验消化已转染好的细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1－10×10⁴。取细胞悬液300μl加入Transwell小室。24 孔板下室加入700μl含20％FBS或趋化因子的培养基，放入孵箱中常规培养12-48h。取小室用棉签擦去上室内的细胞，用0.1％结晶紫将小室外底面的细胞染色利用倒置显微镜对Transwell小室底膜下室侧附着的染色的细胞拍照计数。

10、数据处理

实验数据皆用SPSS17.0软件分析，以实验的平均值±标准误表示，组间差异用双尾 Student’s T检验、秩和检验和卡方检验。

附图说明

图1.LncRNA LCT-AS1在乳腺癌组织中上调

1A：QRT-PCR法检测LncRNA LCT-AS1在乳腺癌组织表达较正常组织上调；

1B：根据LncRNA LCT-AS1在乳腺癌组织中的表达水平分为两组。

图2.LncRNA LCT-AS1在乳腺癌细胞中的表达水平

2A:LncRNA LCT-AS1在乳腺癌细胞中表达较正常细胞上调；

2B：QRT-PCR法检测乳腺癌细胞中转染si-LCT-AS1的干扰效率；

2C：同上在乳腺癌细胞中过表达LncRNALCT-AS1。

图3.LncRNA LCT-AS1促进乳腺癌细胞增殖

3A：CCK8实验发现干扰LncRNA LCT-AS1后抑制乳腺癌细胞增殖；

3B：克隆形成实验发现干扰LncRNA LCT-AS1后抑制乳腺癌细胞增殖；

3C：CCK8实验发现过表达LncRNA LCT-AS1后促进乳腺癌细胞增殖；

3D：克隆形成实验发现过表达LncRNA LCT-AS1后促进乳腺癌细胞增殖。

图4.LncRNA LCT-AS1对乳腺癌细胞凋亡和转移的影响

4A、4B：流式细胞分析发现干扰LncRNA LCT-AS1能够促进乳腺癌细胞凋亡；

4C：Transwell实验提示干扰LncRNA LCT-AS1能够抑制乳腺癌细胞转移；

4D：同上过表达LncRNA LCT-AS1能够促进乳腺癌细胞转移。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。

一般性说明：

实施例中末注明具体条件的的实验方法，基本上都按照Sambrook，J等人编著的《分子克隆实验指南(第3版)》(MolecularCloning：ALaboratoryManual，3rded.黄培堂等译，科学出版社.2002.8)中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。

本发明的材料：本申请中提及的细胞株、干扰载体以及培养基均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。

实施例1检测LncRNA LCT-AS1在组织和细胞中的表达情况

取0.1g组织，液氮研磨充分(成粉末状)或1-5×10⁷细胞弃培养基，预冷的PBS 润洗2次。加入1ml的Trizol裂解液，以无酶枪头吹打混匀，静置5min，将裂解液移入预先标记好的无酶1.5ml的离心管中。4℃7500g离心5分钟，取上清加入1/5体积的氯仿，颠倒混匀30s，静置2min。4℃，12000g离心，15min。溶液分三层(水相- 白色沉淀-红色有机物)，转移水相层至新的1.5ml离心管中，尽量不要吸到白色沉淀。加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，放置5-10min。4℃，12000g离心，10min。吸弃上清，加入1ml 75％的乙醇(现配)，洗涤RNA沉淀。4℃，7500g离心，5min，弃上清。尽量去除75％的酒精，于室温中晾干，约15min。用无RNA酶水(20-25μl)溶解RNA沉淀。

紫外吸收测定法测定RNA的浓度。使用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零。在260nm处读值1为表示40ng/μl，RNA溶液的A260/A280的比值用于RNA纯度的检测，比值范围在1.8到2.1表明符合要求。琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性。配制1％的琼脂糖胶。加热溶解琼脂糖，冷却，加入1 μl溴化乙锭(EB，10mg/ml)。摇匀后倒胶，待胶冷凝后，置于电泳槽中，浸于1×TAE 缓冲液中平衡10min，待用。点样。按1：4(v/v)将5×核酸电泳上样缓冲液与样本混合，准确将各样本含有1μg的RNA加入凝胶孔中。80V恒压电泳50min。电泳结束后，在凝胶成像仪上观察结果。

Tris-乙酸(TAE)缓冲液配方(1L)50×：

2M Tris碱 242g

1M乙酸 57.1mL冰乙酸(17.4M)

100mM EDTA 200mL 0.5M EDTA(pH8.0)

去离子水至1L

实时定量PCR

乳腺癌组织及癌旁组织标本，乳腺癌细胞的总RNA，逆转录反应应用TaKaRaPrimeScript试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。逆转录反应体系如下：

反转录反应条件如下：37℃15min(反转录反应)；85℃5sec(反转录酶的失活反应)。根据Genebank提供的基因序列，设计引物序列，

qPCR应用7300 PCR系统(Applied Biosystems，Warrington，UK)。cDNA样品采用三部法PCR扩增标准程序。反应体系：

反应条件：

结果分析：分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。计算公式为：2^{^(-△Ct)}，△Ct＝Ct gene-Ct control。

LncRNA LCT-AS1的引物如下：

Primer F(SEQ ID NO：2)：

5’-CGGGAGGAAGATAAACGGGG-3’，

Primer R(SEQ ID NO：3)：

5’-TGACCACGGGAACACCTTCAG-3’。

利用实时定量PCR检测了54对乳腺癌组织/癌旁正常组织中LncRNA LCT-AS1 的表达水平，结果显示与癌旁正常组织相比，LncRNA LCT-AS1的表达在癌组织中上调(图1B)。为了探究LncRNA LCT-AS1在乳腺癌细胞中的功能，我们先用 qRT-PCR实验检测LncRNA LCT-AS1在几种人乳腺癌细胞中的表达情况，结果显示与正常乳腺细胞相比，乳腺癌细胞中lncRNA LCT-AS1的表达明显上调，且在 MDA-MB-231和T-47D两个乳腺癌细胞中上调较为显著，因此我们选取这两种细胞作为实验验证对象(图2A)。接着，我们合成3条针对LncRNALCT-AS1的干扰序列来沉默其表达。结果显示，3条干扰均能有效敲低LINC LCT-AS1的水平，我们选取了干扰效率较高的si-LncRNA LCT-AS1 2#和3#来进行后续的实验(图2B)。同时，我们也构建了pcDNA-LncRNA LCT-AS1表达载体，使LncRNA LCT-AS1在 MDA-MB-231和T-47D细胞中的表达明显上调(图2C)。

实施例2 LncRNA LCT-AS1对乳腺癌细胞增殖的影响

CCK8实验

将转染后24h的T-47D和MDA-MB-231细胞按每孔3000个细胞接种于96孔培养板；待细胞80％贴壁后，细胞同步化12h，弃去原有培养基。每个样本设置6个复孔，每孔总反应体积为200μl。每孔加入20μl的CCK8反应液(5mg/ml，溶于PBS)，37℃避光孵育2h,酶标仪测定450nm波长处的吸光度。

克隆形成实验

用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单细胞悬液，以适当的细胞密度(500个)接种于6孔板，使细胞分散均匀；放入细胞培养箱中，每4天换液一次，培养2周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS轻轻清洗2次；加纯甲醇或1: 3醋酸/甲醇1ml，固定15分钟；弃甲醇固定液，加1ml 0.1％结晶紫染色液染15分钟，然后用PBS缓慢洗去染色液，空气干燥。将6孔板倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。

为了研究LncRNA LCT-AS1是否对乳腺癌细胞的增殖具有调控作用，我们进行了CCK8实验及克隆实验。结果表明，干扰LncRNA LCT-AS1后乳腺癌细胞的增殖能力下调(图3A，3B)，而过表达LncRNA LCT-AS1后乳腺癌细胞的增值能力上调(图3C， 3D)。

实施例3 LncRNA LCT-AS1对乳腺癌细胞凋亡及转移的影响

流式细胞术

细胞样品的准备：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm左右离心3-5分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50μl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1mL冰浴预冷的PBS，重细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。再次加入1mL冰浴预冷的PBS，重悬细胞。

细胞固定：取4ml冰浴预冷的95％乙醇，低速涡施需荡的同时逐滴加入1ml细胞悬液(在水上操作)，混匀后4℃固定2小时或更长时间。固定12-24小时可能效果更佳。1000rpm左右离心3-5分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50μl左右的乙醇，以避免吸走细胞。加入约5ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉流细胞，小心吸除上清，可以残留约50μl左右的PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

碘化丙啶染色液的配制：参考下表，根据待检测样品的数量配制适量的碘化丙啶染色液：

注：配制好的碘化丙啶染色液短时间内可以4℃保存，宜当日使用。

染色：每管细胞样品中加入0.4mL碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30分钟。随后可以4℃或冰浴避光存放。染色完成后宜在24小时内完成流式检测，最好能在当日完成流式检测。

流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

Transwell实验

消化已转染好的细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1－10×10⁴。取细胞悬液300μl加入Transwell小室。 24孔板下室加入700μl含20％FBS或趋化因子的培养基，放入孵箱中常规培养12-48h。取小室用棉签擦去上室内的细胞，用0.1％结晶紫将小室外底面的细胞染色利用倒置显微镜对Transwell小室底膜上下室侧附着的染色的细胞拍照计数。

细胞凋亡和转移在肿瘤的发展发展过程中发挥着重要作用。因此，我们用流式细胞术和Transwell实验来评价LncRNA LCT-AS1对乳腺癌细胞凋亡和转移的影响。如图4A 和4B所示，干扰LncRNA LCT-AS1后能够促进乳腺癌细胞凋亡。并且干扰LncRNA L CT-AS1后能够抑制乳腺癌细胞转移(图4C),而过表达LncRNA LCT-AS1后能够促进乳腺癌细胞转移(图4D)。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）

<120> 一种长非编码RNA在诊断和治疗乳腺癌中的应用

<130> 2019

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1862

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence)

<400> 1

acatcctcct gagtaggggc ccctggctgt ccgtttaatg taagcctgtg ttggccctcc 60

ccttcaggca aagcaccacc aagcgctgag agaatctccg agctggtgtc acttgtaatc 120

actggctttt cagggaaccc attttattac ggcttcttga gttttctttt gtgaagccac 180

agccagtcct tcttggctga ctccaagtgt ggtcaggaag cagtggtaac ccatgtctgt 240

ctattgcaag tctacactgc cacacaaagc ctgaggtaca gctgctgctg cgggtctgtt 300

gatctgaact gctgatttga agtggattga gaggatggaa caatagaagg aggatatggc 360

tcaggacagt caagtactgg aagaggaaag gtacaaagag gtgttggcac tgaatgaccc 420

tgaacagggc tgcactggaa atatcagaga gacagagttt caccatgttg cccagcccag 480

tcttgaactc ctggactcaa gcaatcttcc cacctttgcc taccagagtg ctgggattac 540

aggtgtgagc catcatgcta gttgcgcaca gttgggcgaa ctgacagatg agaaagcaga 600

acctcgtgag tcccactcag taagagactc cctactttct ttctgagtct ttgtttctca 660

tcaattgaat ggcaataaac aacttggtgg cccaagagtt gatgacaaca gtcctataag 720

attatacatg taaaagaaac agagtattct acaaatatca gttattgata gttcaatagg 780

caacctgaca ttaccttttc ttggaacttg atgaacaact cagaaactca ttaatatcaa 840

acccaatggt gagcacttgg tctttattta tggctgtaag agaagaaatt gaattaactc 900

tatgtaaatg ccaactaaga acatgcaagt ctgaaatcaa cagttttcct cgctcatacg 960

acacacccaa actccaagca gtggttccaa gcccctttgg aaaataccat gggctaacga 1020

ctttaaaagc ttagaagtga attctactta cttattactt aaaagtggtt ctcaaacttc 1080

aaggtgaatc aaaatcatct gtagagcttg ttaaaacaca ggttgctggt cccaccccaa 1140

gagtgtctga tgcagtaggt ctcaagtagg gctcaagaat atgcatttct aatgagctcc 1200

caggtgatgc taatgttgat gctgctggtc tggggaccac aactttggga acaattgatt 1260

tagaagaact caaagatcag aaaggggtgg aatattttta aaattgtggt aaaatacgca 1320

taaacagaaa aggtacaatt ttaaccactt agagagaggt gggatctaag aacagaaatt 1380

gttatgccat caaaggtgag ttcagataag cattattaaa tggtatctat ggataaactt 1440

caggggccct gtggagccaa cccattgctg ggatggggtc caggtgtgct atggtttgga 1500

tgtggtttgt ccctacaaaa actcatgttg aaatttaatt gccagtgtaa cattattgag 1560

aggttatgga cttttaagag gcatttgggt catgagggat ccgccttcag ggattagtgc 1620

agtctccagg gagtgagtga gttcccattc tagtgggact ggattagtta ccatacagtg 1680

gttgttataa agtgaggctg cttctggtgt tttatctgtt tgcaggcact tccttcccct 1740

tccacttctc tgccaggtta ggatgcagca tgaggccctc accagaagct gaccagatgt 1800

ggctgcctga tcttgaactt cccagtcccc agaaccatga gctaaataaa ccttttttct 1860

ct 1862

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence)

<400> 2

cgggaggaag ataaacgggg 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial squence)

<400> 3

tgaccacggg aacaccttca g 21