阅读说明：本技术 基因突变体及其应用 (gene mutant and application thereof ) 是由 江宠颐 方明艳 刘晓 伦纳特·哈马斯特罗姆 孙宇辉 陈玲燕 于 2018-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了核酸、基因突变及其应用。其中,该核酸,与野生型RAD50基因相比,所述核酸具有选自下列的至少一种突变类型：c.379G>A、c.137T>A/c.980G>A或c.494C>A/c.980G>A。通过检测这些突变在生物样品中是否存在,可以有效地检测生物样品是否患免疫缺陷病。(The invention discloses nucleic acid, gene mutation and application thereof. Wherein the nucleic acid has at least one mutation type selected from the group consisting of: c.379G > A, c.137T > A/c.980G > A or c.494C > A/c.980G > A. By detecting the presence of these mutations in a biological sample, it is possible to effectively detect whether the biological sample is afflicted with immunodeficiency.)

基因突变体及其应用

技术领域

本发明涉及基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及核酸、基因突变、蛋白质、筛选患免疫缺陷病的生物样品的系统、用于筛选治疗免疫缺陷病的药物、用于筛选患免疫缺陷病的生物样品的试剂盒、生物模型、构建体以及重组细胞。

背景技术

常见变异型免疫缺陷疾病(CVID)和选择性IgA缺陷(SIgAD)是最常见的原发性免疫缺陷病(PID)。这两种病的比例占全世界PID的四分之一。CVID的主要特征是血清免疫球蛋白，尤其是IgA、IgE和IgG降低，发病率约为1/50000。CVID临床表现异质性高，患者会出现粘膜反复感染，且其中20％～30％伴有自身免疫疾病、脾肿大和恶性肿瘤。CVID遗传方式不定，目前发现既有常染色隐形遗传，也有常染色体显性遗传。SIgAD的遗传方式与CVID相似，可为常染色体隐性遗传或常染色体显性遗传，也可为散发性发病。SIgAD发病率具有种族特异性，白种人发病率约为1/223～1/1000，日本为1/18500；我国SIgAD患病率为1/4100。SIgAD患者可能长期无任何症状，不少患者仅出现上呼吸道感染；有的患者出现各种伴发病，特别是自身免疫疾病(约占50％)和过敏性疾病；有的患者伴有智力低下和感觉神经异常，且与原发性癫痫密切相关；有的患者还伴发哮喘，约10％欧美哮喘患者被诊断为SIgAD。研究发现某些SIgAD患者会发展成CVID，并且在其他SIgAD家系中发现过CVID患者，这些证据说明CVID和SIgAD可能是由相同遗传突变导致的。

同时，外显子组是指人类基因组全部外显子区域的集合，包含蛋白质编码区和非翻译区的侧翼序列，该区域涵盖了与个体表型相关的大部分功能性变异。外显子组测序技术是指利用特制的探针对人类基因组的外显子组序列进行捕获富集后，利用第二代测序技术进行高通量测序及生物信息学分析的方法。人类全基因组有180,000个外显子，占全基因组序列的1％，而85％的致病突变(特别是罕见病的致病变异)位于该区域内。所以，对于CVID和SIgAD这类罕见病而言，外显子组测序分析比全基因组测序分析更加经济、高效。此外，在相同的预算情况下，外显子测序的深度更高，更利于发现新的致病基因。通过外显子组测序技术发现的新致病基因，可以在大样本量的患者和正常对照中采用靶基因关联分析进行验证，并可以在更低的测序成本下，发现更多致病位点。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效筛选患有免疫缺陷病的生物样品的方法。

目前人类孟德尔遗传数据库(OMIM)收录13种CVID亚型，13个致病基因(CR2，IRF2BP2，ICOS，NFKB1，IL21，LRBA，IKZF1，NFKB2，CD81，MS4A1，CD19，TNFRSF13B和TNFRSF13C)。OMIM只收录一个SIgAD的致病基因TNFRSF13B。然而，尽管已经发现数个CVID和一个SIgAD致病基因，仍有许多患者的发病原因无法解释。因此，要提高CVID和SIgAD的早期诊断和治疗效果，尽快发现更多新的CVID和SIgAD致病基因显得尤为重要。

基于上述事实和问题的发现，发明人克隆了一个新的CVID和SIgAD的致病基因——RAD50，并通过高通量外显子组测序发现了如果生物样本的RAD50发生纯合c.379G>A或复合杂合c.137T>A/c.980G>A会患CVID；如果生物样本的RAD50发生复合杂合c.494C>A/c.980G>A会患SIgAD。

需要说明的是，本申请中所涉及的c.379G>A是指RAD50基因编码区第379位碱基发生纯合G->A改变；c.137T>A/c.980G>A是指RAD50基因编码区第137位碱基发生杂合T->A改变和编码区第980位碱基发生杂合G->A改变；c.494C>A/c.980G>A是指RAD50基因编码区第494位碱基发生杂合C->A改变和编码区第980位碱基发生杂合G->A改变。

根据本发明的第一方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，与野生型RAD50基因相比，所述核酸具有选自下列的至少一种类型突变：c.379G>A、c.137T>A/c.980G>A或c.494C>A/c.980G>A。根据本发明的实施例，发明人克隆了一个新的CVID和SIgAD致病基因RAD50基因，并确定了RAD50基因发生上述至少之一的突变与原发性免疫缺陷病(CVID和SIgAD)发病密切相关，从而通过检测这些突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否患免疫缺陷病，尤其是是否患CVID和SIgAD。

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种基因突变。根据本发明的实施例，与野生型RAD50基因相比，所述核酸具有选自下列的至少一种类型突变：c.379G>A、c.137T>A/c.980G>A或c.494C>A/c.980G>A。根据本发明的实施例，发明人发现了一个新的CVID和SIgAD致病基因RAD50基因，并确定了RAD50基因发生根据本发明实施例的突变与免疫缺陷病，尤其是CVID和SIgAD等原发性免疫缺陷病的发病密切相关，从而通过检测RAD50基因在生物样品中在上述位点是否发生上述突变，可以有效地检测生物样品是否患免疫缺陷病，尤其是生物样品是否患CVID和SIgAD等原发性免疫缺陷病。

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种蛋白质。根据本发明的实施例，与所述野生型RAD50基因表达的蛋白质的氨基酸序列相比，所述蛋白质具有下列的至少一种类型突变：(1)氨基酸序列46位的异亮氨酸突变为缬氨酸，且327位的精氨酸突变为组氨酸氨，所述蛋白质具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；(2)氨基酸序列127位，并且由缬氨酸突变为异亮氨酸纯合突变，所述蛋白质具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；(3)氨基酸序列165位的脯氨酸突变为组氨酸，且327位的精氨酸突变为组氨酸，所述蛋白质具有如SEQ IDNO：3所示的氨基酸序列。发明人克隆了一个新的CVID和SIgAD致病基因-RAD50基因，并确定了RAD50基因发生根据本发明实施例的突变与原发性免疫缺陷病，尤其是CVID和SIgAD发病密切相关，从而通过检测表达这些突变的RAD50基因的蛋白质在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否患原发性免疫缺陷病，尤其是否患CVID和SIgAD。

根据本发明的第四方面，本发明提出了检测前面所述核酸或前面所述基因突变或前面所述蛋白质的试剂在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂用于诊断原发性免疫缺陷病。根据本发明的实施例，所述试剂能够有效地筛选患有免疫缺陷病，尤其是CVID和SIgAD等原发性免疫缺陷病的生物样品，进而用于制备筛选患有原发性免疫缺陷病，尤其是CVID和SIgAD原发性免疫缺陷病的生物样品的试剂盒。

根据本发明的第五方面，本发明提出了生物模型在筛选药物中的用途。根据本发明的实施例，所述生物模型携带下列至少之一：(1)前面所述的核酸；(2)前面所述的基因突变；(3)表达前面所述的蛋白质。需要说明的是，“生物模型携带前面所述的核酸”表示，本发明的生物模型携带与野生型RAD50基因相比具有选自下列的至少一种类型突变：c.379G>A、c.137T>A/c.980G>A或c.494C>A/c.980G>A的RAD50基因突变体的核酸序列或者同时包含上述各种基因突变体的核酸序列；“生物模型携带前面所述的基因突变”表示，本发明的生物模型携带的RAD50基因与野生型RAD50基因相比具有选自下列的至少一种类型突变：c.379G>A、c.137T>A/c.980G>A或c.494C>A/c.980G>A的RAD50基因突变或者同时包含上述各种基因突变。“生物模型携带前面所述的蛋白质”表示，本发明的生物模型携带与野生型RAD50基因相比具有选自下列的至少一种类型突变：c.379G>A、c.137T>A/c.980G>A或c.494C>A/c.980G>A的RAD50基因突变体所表达的蛋白质或者同时包含上述各种基因突变的基因所表达的蛋白质。根据本发明的实施例的生物模型能有效地用作免疫缺陷病，尤其是CVID和SIgAD等原发性免疫缺陷病的相关研究的模型。

根据本发明的第六方面，本发明提出了一种用于治疗免疫缺陷病的药物。根据本发明的实施例，所述药物含有：特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变或者前面所述的蛋白质的试剂。需要说明的是，这里的特异性改变是指能使得突变的核酸或者基因突变的位点或者突变的蛋白质恢复到原来的野生状态或者其他不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其他序列不产生实质影响。根据本发明实施例的药物能特异性预防或治疗免疫缺陷病，尤其是CVID和SIgAD等原发性免疫缺陷病。

根据本发明的第七方面，本发明提出了一种筛选患免疫缺陷病的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：从生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与野生型RAD50基因相比，所述核酸具有选自下列的至少一种类型突变：c.379G>A、c.137T>A/c.980G>A或c.494C>A/c.980G>A，是所述生物样品患免疫缺陷病的指示。通过根据本发明实施例的筛选患免疫缺陷病的生物样品的方法，可以有效地筛选患免疫缺陷病，尤其是CVID和SIgAD等原发性免疫缺陷病的生物样品。

根据本发明的第八方面，本发明提出了一种筛选患免疫缺陷病的生物样品的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与野生型RAD50基因相比，所述核酸具有选自下列的至少一种类型突变：c.379G>A、c.137T>A/c.980G>A或或c.494C>A/c.980G>A，判断所述生物样品是否患免疫缺陷病。利用该系统，能够有效地实施前述筛选患免疫缺陷病，尤其是CVID和SIgAD等原发性免疫缺陷病的生物样品的方法，从而可以有效地筛选患免疫缺陷病，尤其是CVID和SIgAD等原发性免疫缺陷病的生物样品。

根据本发明的第九方面，本发明提出了一种用于筛选患免疫缺陷病的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测RAD50基因突变体的至少一种的试剂，其中与野生型RAD50基因相比，核酸具有选自下列的至少一种类型突变：c.379G>A、c.137T>A/c.980G>A或c.494C>A/c.980G>A。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选患免疫缺陷病，尤其是患CVID和SIgAD等原发性免疫缺陷病的生物样品。

根据本发明的第十方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的核酸或所述的基因突变。需要说明的是，“构建体包含前面所述的核酸”表示，本发明的构建体包含与野生型RAD50基因相比，核酸具有选自下列的至少一种类型突变：c.379G>A、c.137T>A/c.980G>A或c.494C>A/c.980G>A或者同时包含上述各种基因突变体的核酸序列。“构建体包含前面所述的基因突变”表示，本发明的构建体包含的RAD50基因与野生型RAD50基因相比具有选自下列的至少一种类型突变：c.379G>A、c.137T>A/c.980G>A或c.494C>A/c.980G>A或者同时包含上述各种基因突变。由此，本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用作免疫缺陷病，尤其是CVID和SIgAD等原发性免疫缺陷病的相关研究的模型。

根据本发明的第十一方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的或者前面所述的蛋白质而获得的。根据本发明的一些实施例，本发明的重组细胞，能够有效地用作免疫缺陷病，尤其是CVID和SIgAD等原发性免疫缺陷病的相关研究的模型。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为根据本发明实施例的筛选患免疫缺陷病的生物样品的系统的示意图，

图2为根据本发明实施例的筛选患免疫缺陷病的生物样品的系统(进一步包括核酸提取装置)的示意图，

图3为根据本发明实施例的筛选患免疫缺陷病的生物样品的系统(进一步包括核酸序列确定装置)的示意图；

图4：显示了根据本发明一个实施例，检出新致病位点的3个CVID和SIgAD家系图谱，其中家系1和2为CVID家系，通过外显子测序技术确定其致病位点；家系3为SIgAD家系，通过对RAD50基因扫描，确定其致病位点，正方形表示男性，圆形表示女性，菱形表示性别未知，图形中未填充颜色表示正常人，图形中为黑色表示患者，箭头指示该患者为先证者，斜线表示该被检测者已去世；

图5：显示了根据本发明一个实施例，CVID家系1和2的RAD50基因Sanger测序结果；

图6：显示了根据本发明一个实施例，RAD50基因两条转录本(ENST00000265335和ENST00000453394)的蛋白产物广泛参与不同的生理生化通路；

图7：显示了根据本发明一个实施例，RAD50基因同源性比较分析(BLAST结果)；

图8：显示了根据本发明一个实施例，RAD50蛋白卡通模型图，其中，

A为根据本发明实施例的鉴定的突变在外显子上的位置，

B为根据本发明实施例的突变在蛋白结构域的位置，

C为根据本发明实施例的突变在蛋白空间结构的位置，

D为根据本发明实施例的突变在核酸酶复合物MRN的位置；

图9：显示了根据本发明一个实施例，细胞实验验证RAD50突变影响DNA修复，其中，

A为根据本发明实施例的患者P1染色体断裂、融合(箭头所指)，

B为根据本发明实施例的患者P1与对照组(30个正常对照和6个A-T病人)在G0和G2期染色质异常分析比较，

C为根据本发明实施例的RAD50患者与对照组(正常对照，MRE11患者，NBS患者和DNA连接酶4缺失患者)MN长度使用情况分析。

附图标记：筛选患免疫缺陷病的生物样品的系统1000，核酸提取装置100，核酸序列确定装置200，判断装置300，RNA提取单元101，反转录单元102，DNA提取单元103，目标核酸捕获富集单元104，文库构建单元201，测序单元202。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，本领域技术人员能够理解，在本文中所使用的野生型RAD50基因序列位置是以人类基因组中野生型RAD50基因的序列为准，但当该野生型RAD50基因存在与其他物种中时，该序列会有差异，可以通过将该物种的野生型RAD50基因与人野生型RAD50基因进行比对获得该物种的野生型RAD50基因中所对应的位置。

核酸

根据本发明的第一方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，与野生型RAD50基因相比，所述核酸具有选自下列的至少一种类型突变：c.379G>A、c.137T>A/c.980G>A或c.494C>A/c.980G>A。需要说明的是，本发明的核酸编码RAD50突变体，也可以称为“编码RAD50突变体的核酸”，即该核酸可以理解为与编码RAD50突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与RAD50的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一个具体示例，前面所述的编码RAD50突变体的核酸为DNA。根据本发明的实施例，发明人克隆了一个新的CVID和SIgAD致病基因-RAD50基因，并确定了这些RAD50基因突变体与CVID和SIgAD等原发性免疫缺陷病的发病密切相关，从而通过检测这些突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否患原发性免疫缺陷病，尤其是否患CVID和SIgAD。

对于本发明说明书和权利要求书中，提及核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQ ID NO:10～SEQ ID NO:15，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

发明人发现的RAD50基因突变体，与野生型RAD50基因相比具有选自下列的至少一种类型突变：RAD50基因编码区第379位碱基发生纯合G->A改变(c.379G>A)；RAD50基因编码区第137位碱基发生杂合T->A改变和编码区第980位碱基发生杂合G->A改变(c.137T>A/c.980G>A)；RAD50基因编码区第494位碱基发生杂合C->A改变和编码区第980位碱基发生杂合G->A改变(c.494C>A/c.980G>A)。

发明人首次提出了RAD50基因为CVID和SIgAD的致病基因，并首次发现了RAD50基因的c.379G>A或c.137T>A/c.980G>A突变能够导致患者患CVID；RAD50基因的c.494C>A/c.980G>A会导致患者患SIgAD。

需要说明的是，上述野生型基因的cDNA和/或基因组DNA序列可以从如下网址获得：

RAD50基因组DNA序列获取网址如下所示：

http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens/Transcript/Summary？db＝core；g＝ENSG00000113522；r＝5:131892630-131979752；t＝ENST00000378823。

根据本发明的具体实施例，所述野生型RAD50基因2号外显子区具有如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列，其中标下划线的碱基位点为易发生突变的位点。

ACCATCATTGAATGTCTAAAATATATTTGTACTGGAGATTTCCCTCCTGGAACCAAAGGAAATACATTTGTACACGATCCCAAG(SEQ ID NO：10)。

所述野生型RAD50基因4号外显子区具有如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列，其中标下划线的碱基位点为易发生突变的位点。

GCATGGTGAAAAGGTCAGTCTGAGCTCTAAGTGTGCAGAAATTGACCGAGAAATGATCAGTTCTCTTGGGGTTTCCAAGGCTGTGCTAAATAATGTCATTTTCTGTCATCAAGAAGATTCTAATTGGCCTTTAAGTGAAGGAAAGGCTTTGAAGCAAAAGTTTGATGAGATTTTTTCAGCAACAAG(SEQ ID NO：11)。

所述野生型RAD50基因7号外显子区具有如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列，其中标下划线的碱基位点为易发生突变的位点。

GTTTTTCAAGGGACTGATGAGCAACTAAATGACTTATATCACAATCACCAGAGAACAGTAAGGGAGAAAGAAAGGAAATTGGTAGACTGTCATCGTGAACTGGAAAAACTAAATAAAGAATCTAGGCTTCTCAATCAGGAAAAATCAGAACTGCTTGTTGAACAGG(SEQ ID NO：12)。

基因突变

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种基因突变。根据本发明的实施例，与野生型RAD50基因相比，所述核酸具有选自下列的至少一种类型突变：c.379G>A、c.137T>A/c.980G>A或c.494C>A/c.980G>A。换句话说，也就是与野生型RAD50基因相比，所述基因突变位于RAD50基因核苷酸序列的下列的至少一个位置：所述基因突变位于RAD50基因2号外显子区的8位，并且由T突变为A，所述基因突变后的RAD50基因2号外显子区具有如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列；所述基因突变位于RAD50基因4号外显子区的14位及129位，并且由G突变为A以及C突变为A，所述基因突变后的RAD50基因4号外显子区具有如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列；所述基因突变位于RAD50基因7号外显子区的95位，并且由G突变为A，所述基因突变后的RAD50基因7号外显子区具有如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，发明人发现了一个新的CVID和SIgAD致病基因-RAD50基因，并确定了RAD50基因发生根据本发明实施例的突变与原发性免疫缺陷病(CVID和SIgAD)发病密切相关，从而通过检测RAD50基因在生物样品中在上述位点是否发生上述突变，可以有效地检测生物样品是否患原发性免疫缺陷病，尤其是否患CVID和SIgAD。其中，SEQ ID NO：13～15如下所示，标下划线的碱基位点为发生突变的位点。

ACCATCAATGAATGTCTAAAATATATTTGTACTGGAGATTTCCCTCCTGGAACCAAAGGAAATACATTTGTACACGATCCCAAG(SEQ ID NO：13)。

GCATGGTGAAAAGATCAGTCTGAGCTCTAAGTGTGCAGAAATTGACCGAGAAATGATCAGTTCTCTTGGGGTTTCCAAGGCTGTGCTAAATAATGTCATTTTCTGTCATCAAGAAGATTCTAATTGGCATTTAAGTGAAGGAAAGGCTTTGAAGCAAAAGTTTGATGAGATTTTTTCAGCAACAAG(SEQ ID NO：14)。

GTTTTTCAAGGGACTGATGAGCAACTAAATGACTTATATCACAATCACCAGAGAACAGTAAGGGAGAAAGAAAGGAAATTGGTAGACTGTCATCATGAACTGGAAAAACTAAATAAAGAATCTAGGCTTCTCAATCAGGAAAAATCAGAACTGCTTGTTGAACAGG(SEQ ID NO：15)。

蛋白质

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种蛋白质。根据本发明的实施例，与所述野生型RAD50基因表达的蛋白质的氨基酸序列相比，所述蛋白质具有下列的至少一种类型突变：(1)氨基酸序列46位的异亮氨酸突变为缬氨酸，且327位的精氨酸突变为组氨酸，所述蛋白质具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；(2)氨基酸序列127位的缬氨酸突变为异亮氨酸，且该位点为纯合突变，所述蛋白质具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；(3)氨基酸序列165位的脯氨酸突变为组氨酸，且327位的精氨酸突变为组氨酸，所述蛋白质具有如SEQID NO：3所示的氨基酸序列。发明人发现了一个新的CVID和SIgAD致病基因-RAD50基因，并确定了RAD50基因发生根据本发明实施例的突变与免疫缺陷病，尤其是CVID和SIgAD等原发性免疫缺陷病的发病密切相关，从而通过检测表达这些突变的RAD50基因的蛋白质在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否患免疫缺陷病，尤其是是否患CVID和SIgAD等原发性免疫缺陷病。

根据本发明的实施例，所述野生型RAD50基因表达的蛋白质具有如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，其中标下划线的氨基酸位点为易发生突变的位点。

MSRIEKMSILGVRSFGIEDKDKQIITFFSPLTILVGPNGAGKTTIIECLKYICTGDFPPGTKGNTFVHDPKVAQETDVRAQIRLQFRDVNGELIAVQRSMVCTQKSKKTEFKTLEGVITRTKHGEKVSLSSKCAEIDREMISSLGVSKAVLNNVIFCHQEDSNWPLSEGKALKQKFDEIFSATRYIKALETLRQVRQTQGQKVKEYQMELKYLKQYKEKACEIRDQITSKEAQLTSSKEIVKSYENELDPLKNRLKEIEHNLSKIMKLDNEIKALDSRKKQMEKDNSELEEKMEKVFQGTDEQLNDLYHNHQRTVREKERKLVDCHRELEKLNKESRLLNQEKSELLVEQGRLQLQADRHQEHIRARDSLIQSLATQLELDGFERGPFSERQIKNFHKLVRERQEGEAKTANQLMNDFAEKETLKQKQIDEIRDKKTGLGRIIELKSEILSKKQNELKNVKYELQQLEGSSDRILELDQELIKAERELSKAEKNSNVETLKMEVISLQNEKADLDRTLRKLDQEMEQLNHHTTTRTQMEMLTKDKADKDEQIRKIKSRHSDELTSLLGYFPNKKQLEDWLHSKSKEINQTRDRLAKLNKELASSEQNKNHINNELKRKEEQLSSYEDKLFDVCGSQDFESDLDRLKEEIEKSSKQRAMLAGATAVYSQFITQLTDENQSCCPVCQRVFQTEAELQEVISDLQSKLRLAPDKLKSTESELKKKEKRRDEMLGLVPMRQSIIDLKEKEIPELRNKLQNVNRDIQRLKNDIEEQETLLGTIMPEEESAKVCLTDVTIMERFQMELKDVERKIAQQAAKLQGIDLDRTVQQVNQEKQEKQHKLDTVSSKIELNRKLIQDQQEQIQHLKSTTNELKSEKLQISTNLQRRQQLEEQTVELSTEVQSLYREIKDAKEQVSPLETTLEKFQQEKEELINKKNTSNKIAQDKLNDIKEKVKNIHGYMKDIENYIQDGKDDYKKQKETELNKVIAQLSECEKHKEKINEDMRLMRQDIDTQKIQERWLQDNLTLRKRNEELKEVEEERKQHLKEMGQMQVLQMKSEHQKLEENIDNIKRNHNLALGrQKGYEEEIIHFKKELREPQFRDAEEKYREMMIVMRTTELVNKDLDIYYKTLDQAIMKFHSMKMEEINKIIRDLWRSTYRGQDIEYIEIRSDADENVSASDKRRNYNYRVVMLKGDTALDMRGRCSAGQKVLASLIIRLALAETFCLNCGIIALDEPTTNLDRENIESLAHALVEIIKSRSQQRNFQLLVITHDEDFVELLGRSEYVEKFYRIKKNIDQCSEIVKCSVSSLGFNVH(SEQ ID NO：16)。

根据本发明的实施例，与所述野生型RAD50基因表达的蛋白质的氨基酸序列相比，所述蛋白质具有下列的至少一个位置突变：

(1)氨基酸序列46位的异亮氨酸突变为缬氨酸，且327位的精氨酸突变为组氨酸，所述蛋白质具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，其中标下划线的氨基酸位点为发生突变的位点，根据本发明具体实施例的氨基酸的突变，能够使患者患变异型免疫缺陷病；

MSRIEKMSILGVRSFGIEDKDKQIITFFSPLTILVGPNGAGKTTIVECLKYICTGDFPPGTKGNTFVHDPKVAQETDVRAQIRLQFRDVNGELIAVQRSMVCTQKSKKTEFKTLEGVITRTKHGEKVSLSSKCAEIDREMISSLGVSKAVLNNVIFCHQEDSNWPLSEGKALKQKFDEIFSATRYIKALETLRQVRQTQGQKVKEYQMELKYLKQYKEKACEIRDQITSKEAQLTSSKEIVKSYENELDPLKNRLKEIEHNLSKIMKLDNEIKALDSRKKQMEKDNSELEEKMEKVFQGTDEQLNDLYHNHQRTVREKERKLVDCHHELEKLNKESRLLNQEKSELLVEQGRLQLQADRHQEHIRARDSLIQSLATQLELDGFERGPFSERQIKNFHKLVRERQEGEAKTANQLMNDFAEKETLKQKQIDEIRDKKTGLGRIIELKSEILSKKQNELKNVKYELQQLEGSSDRILELDQELIKAERELSKAEKNSNVETLKMEVISLQNEKADLDRTLRKLDQEMEQLNHHTTTRTQMEMLTKDKADKDEQIRKIKSRHSDELTSLLGYFPNKKQLEDWLHSKSKEINQTRDRLAKLNKELASSEQNKNHINNELKRKEEQLSSYEDKLFDVCGSQDFESDLDRLKEEIEKSSKQRAMLAGATAVYSQFITQLTDENQSCCPVCQRVFQTEAELQEVISDLQSKLRLAPDKLKSTESELKKKEKRRDEMLGLVPMRQSIIDLKEKEIPELRNKLQNVNRDIQRLKNDIEEQETLLGTIMPEEESAKVCLTDVTIMERFQMELKDVERKIAQQAAKLQGIDLDRTVQQVNQEKQEKQHKLDTVSSKIELNRKLIQDQQEQIQHLKSTTNELKSEKLQISTNLQRRQQLEEQTVELSTEVQSLYREIKDAKEQVSPLETTLEKFQQEKEELINKKNTSNKIAQDKLNDIKEKVKNIHGYMKDIENYIQDGKDDYKKQKETELNKVIAQLSECEKHKEKINEDMRLMRQDIDTQKIQERWLQDNLTLRKRNEELKEVEEERKQHLKEMGQMQVLQMKSEHQKLEENIDNIKRNHNLALGRQKGYEEEIIHFKKELREPQFRDAEEKYREMMIVMRTTELVNKDLDIYYKTLDQAIMKFHSMKMEEINKIIRDLWRSTYRGQDIEYIEIRSDADENVSASDKRRNYNYRVVMLKGDTALDMRGRCSAGQKVLASLIIRLALAETFCLNCGIIALDEPTTNLDRENIESLAHALVEIIKSRSQQRNFQLLVITHDEDFVELLGRSEYVEKFYRIKKNIDQCSEIVKCSVSSLGFNVH(SEQ ID NO：1)。

(2)氨基酸序列127位的缬氨酸突变为异亮氨酸，且该位点为纯合突变，所述蛋白质具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其中标下划线的氨基酸位点为发生突变的位点，根据本发明具体实施例的氨基酸的突变，能够使患者患变异型免疫缺陷病；

MSRIEKMSILGVRSFGIEDKDKQIITFFSPLTILVGPNGAGKTTIIECLKYICTGDFPPGTKGNTFVHDPKVAQETDVRAQIRLQFRDVNGELIAVQRSMVCTQKSKKTEFKTLEGVITRTKHGEKISLSSKCAEIDREMISSLGVSKAVLNNVIFCHQEDSNWPLSEGKALKQKFDEIFSATRYIKALETLRQVRQTQGQKVKEYQMELKYLKQYKEKACEIRDQITSKEAQLTSSKEIVKSYENELDPLKNRLKEIEHNLSKIMKLDNEIKALDSRKKQMEKDNSELEEKMEKVFQGTDEQLNDLYHNHQRTVREKERKLVDCHRELEKLNKESRLLNQEKSELLVEQGRLQLQADRHQEHIRARDSLIQSLATQLELDGFERGPFSERQIKNFHKLVRERQEGEAKTANQLMNDFAEKETLKQKQIDEIRDKKTGLGRIIELKSEILSKKQNELKNVKYELQQLEGSSDRILELDQELIKAERELSKAEKNSNVETLKMEVISLQNEKADLDRTLRKLDQEMEQLNHHTTTRTQMEMLTKDKADKDEQIRKIKSRHSDELTSLLGYFPNKKQLEDWLHSKSKEINQTRDRLAKLNKELASSEQNKNHINNELKRKEEQLSSYEDKLFDVCGSQDFESDLDRLKEEIEKSSKQRAMLAGATAVYSQFITQLTDENQSCCPVCQRVFQTEAELQEVISDLQSKLRLAPDKLKSTESELKKKEKRRDEMLGLVPMRQSIIDLKEKEIPELRNKLQNVNRDIQRLKNDIEEQETLLGTIMPEEESAKVCLTDVTIMERFQMELKDVERKIAQQAAKLQGIDLDRTVQQVNQEKQEKQHKLDTVSSKIELNRKLIQDQQEQIQHLKSTTNELKSEKLQISTNLQRRQQLEEQTVELSTEVQSLYREIKDAKEQVSPLETTLEKFQQEKEELINKKNTSNKIAQDKLNDIKEKVKNIHGYMKDIENYIQDGKDDYKKQKETELNKVIAQLSECEKHKEKINEDMRLMRQDIDTQKIQERWLQDNLTLRKRNEELKEVEEERKQHLKEMGQMQVLQMKSEHQKLEENIDNIKRNHNLALGRQKGYEEEIIHFKKELREPQFRDAEEKYREMMIVMRTTELVNKDLDIYYKTLDQAIMKFHSMKMEEINKIIRDLWRSTYRGQDIEYIEIRSDADENVSASDKRRNYNYRVVMLKGDTALDMRGRCSAGQKVLASLIIRLALAETFCLNCGIIALDEPTTNLDRENIESLAHALVEIIKSRSQQRNFQLLVITHDEDFVELLGRSEYVEKFYRIKKNIDQCSEIVKCSVSSLGFNVH(SEQ ID NO：2)。

(3)氨基酸序列165位的脯氨酸突变为组氨酸，且327位的精氨酸突变为组氨酸，所述蛋白质具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，其中标下划线的氨基酸位点为发生突变的位点，根据本发明具体实施例的氨基酸的突变，能够使患者患选择性IgA缺陷：

MSRIEKMSILGVRSFGIEDKDKQIITFFSPLTILVGPNGAGKTTIIECLKYICTGDFPPGTKGNTFVHDPKVAQETDVRAQIRLQFRDVNGELIAVQRSMVCTQKSKKTEFKTLEGVITRTKHGEKVSLSSKCAEIDREMISSLGVSKAVLNNVIFCHQEDSNWHLSEGKALKQKFDEIFSATRYIKALETLRQVRQTQGQKVKEYQMELKYLKQYKEKACEIRDQITSKEAQLTSSKEIVKSYENELDPLKNRLKEIEHNLSKIMKLDNEIKALDSRKKQMEKDNSELEEKMEKVFQGTDEQLNDLYHNHQRTVREKERKLVDCHHELEKLNKESRLLNQEKSELLVEQGRLQLQADRHQEHIRARDSLIQSLATQLELDGFERGPFSERQIKNFHKLVRERQEGEAKTANQLMNDFAEKETLKQKQIDEIRDKKTGLGRIIELKSEILSKKQNELKNVKYELQQLEGSSDRILELDQELIKAERELSKAEKNSNVETLKMEVISLQNEKADLDRTLRKLDQEMEQLNHHTTTRTQMEMLTKDKADKDEQIRKIKSRHSDELTSLLGYFPNKKQLEDWLHSKSKEINQTRDRLAKLNKELASSEQNKNHINNELKRKEEQLSSYEDKLFDVCGSQDFESDLDRLKEEIEKSSKQRAMLAGATAVYSQFITQLTDENQSCCPVCQRVFQTEAELQEVISDLQSKLRLAPDKLKSTESELKKKEKRRDEMLGLVPMRQSIIDLKEKEIPELRNKLQNVNRDIQRLKNDIEEQETLLGTIMPEEESAKVCLTDVTIMERFQMELKDVERKIAQQAAKLQGIDLDRTVQQVNQEKQEKQHKLDTVSSKIELNRKLIQDQQEQIQHLKSTTNELKSEKLQISTNLQRRQQLEEQTVELSTEVQSLYREIKDAKEQVSPLETTLEKFQQEKEELINKKNTSNKIAQDKLNDIKEKVKNIHGYMKDIENYIQDGKDDYKKQKETELNKVIAQLSECEKHKEKINEDMRLMRQDIDTQKIQERWLQDNLTLRKRNEELKEVEEERKQHLKEMGQMQVLQMKSEHQKLEENIDNIKRNHNLALGRQKGYEEEIIHFKKELREPQFRDAEEKYREMMIVMRTTELVNKDLDIYYKTLDQAIMKFHSMKMEEINKIIRDLWRSTYRGQDIEYIEIRSDADENVSASDKRRNYNYRVVMLKGDTALDMRGRCSAGQKVLASLIIRLALAETFCLNCGIIALDEPTTNLDRENIESLAHALVEIIKSRSQQRNFQLLVITHDEDFVELLGRSEYVEKFYRIKKNIDQCSEIVKCSVSSLGFNVH(SEQ ID NO：3)。

携带根据本发明具体实施例的蛋白质的生物体患免疫缺陷病，尤其患CVID和SigAD等原发性免疫缺陷病。

试剂在制备试剂盒中的用途

根据本发明的第四方面，本发明提出了检测前面所述核酸或前面所述基因突变或前面所述蛋白质的试剂在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂用于诊断原发性免疫缺陷病。根据本发明的实施例，所述试剂能够有效地筛选患免疫缺陷病，尤其是CVID和SIgAD等原发性免疫缺陷病的生物样品，进而用于制备筛选患原发性免疫缺陷病，尤其是CVID和SIgAD等原发性免疫缺陷病的生物样品的试剂盒。

根据本发明的实施例，所述试剂包括特异性针对所述核酸、所述基因突变和所述蛋白质的至少之一的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一。根据本发明的具体实施例的试剂能特异性、高灵敏性地筛选出前面所述的核酸或者前面所述的基因突变或者前面所述的蛋白质，进而特异性、高灵敏性地筛选出患免疫缺陷病，尤其是CVID和SIgAD等原发性免疫缺陷病的生物样品，进而能有效用于筛选患免疫缺陷病，尤其是CVID和SIgAD等原发性免疫缺陷病的生物样品的试剂盒的制备。

根据发明的具体实施例，所述免疫缺陷病为原发性免疫缺陷病。

根据本发明的具体实施例，所述原发性免疫缺陷病为变异型免疫缺陷病或选择性IgA缺陷。

根据本发明的具体实施例，与野生型RAD50基因相比，所述RAD50基因突变体具有选自下列一种突变：c.379G>A或c.137T>A/c.980G>A，所述原发性免疫缺陷病为变异型免疫缺陷病(CVID)。发明人发现，RAD50基因编码区发生上述至少之一的突变，可以确认生物体患CVID。

根据本发明的具体实施例，与野生型RAD50基因相比，所述RAD50基因突变体具有突变c.494C>A/c.980G>A，所述原发性免疫缺陷病为选择性IgA缺陷(SIgAD)。发明人发现，RAD50基因编码区发生上述突变，可以确认生物体患SIgAD。

根据本发明的具体实施例，所述蛋白质的编码基因，与所述野生型RAD50基因表达的蛋白质的氨基酸序列相比，所述蛋白质具有下列的至少一种类型突变：氨基酸序列46位的异亮氨酸突变为缬氨酸，且327位的精氨酸突变为组氨酸；或氨基酸序列127位的缬氨酸突变为异亮氨酸，且该位点为纯合突变，所述原发性免疫缺陷病为变异型免疫缺陷病。发明人发现，RAD50基因表达的蛋白质发生上述至少之一的突变，可以确认生物体患CVID。

根据本发明的具体实施例，所述蛋白质的编码基因，与所述野生型RAD50基因表达的蛋白质的氨基酸序列相比，所述蛋白质具有下列突变氨基酸序列165位的脯氨酸突变为组氨酸，且327位的精氨酸突变为组氨酸，所述原发性免疫缺陷病为选择性IgA缺陷。发明人发现，RAD50基因表达的蛋白质发生上述突变，可以确认生物体患SIgAD。

生物模型在筛选药物中的用途

根据本发明的第五方面，本发明提出了生物模型在筛选药物中的用途。根据本发明的实施例，所述生物模型携带下列至少之一：(1)前面所述的核酸；(2)前面所述的基因突变；(3)表达前面所述的蛋白质。需要说明的是，“生物模型携带前面所述的核酸”表示，本发明的生物模型携带与野生型RAD50基因相比具有选自下列的至少一种类型突变：c.379G>A、c.137T>A/c.980G>A或c.494C>A/c.980G>A的RAD50基因突变体的核酸序列；“生物模型携带前面所述的基因突变”表示，本发明的生物模型携带的RAD50基因与野生型RAD50基因相比具有选自下列的至少一种类型突变：c.379G>A、c.137T>A/c.980G>A或c.494C>A/c.980G>A的RAD50基因突变。“生物模型携带前面所述的蛋白质”表示，本发明的生物模型携带与野生型RAD50基因相比具有选自下列的至少一种突变：c.379G>A、c.137T>A/c.980G>A或c.494C>A/c.980G>A的RAD50基因突变体所表达的蛋白质。根据本发明的实施例的生物模型能有效地用作原发性免疫缺陷病，尤其是CVID和SIgAD相关研究的模型。

根据本发明的具体实施例，所述生物模型为细胞模型或者动物模型。

治疗免疫缺陷病的药物

根据本发明的第六方面，本发明提出了一种用于治疗免疫缺陷病的药物。根据本发明的实施例，所述药物含有：特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂。需要说明的是，这里的特异性改变是指能使得突变的核酸或者基因突变的位点恢复到原来的野生状态或者其他不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其他序列不产生实质影响。根据本发明实施例的药物能特异性预防或治疗免疫缺陷病，尤其是CVID和SIgAD等原发性免疫缺陷病。

根据本发明的实施例，所述试剂为基于基因编辑或核酸合成方法的试剂。

根据本发明的实施例，所述免疫缺陷病为原发性免疫缺陷病。

根据本发明的实施例，所述原发性免疫缺陷病包括变异型免疫缺陷病和选择性IgA缺陷

根据本发明的实施例，所述核酸或者所述基因突变为c.379G>A或c.137T>A/c.980G>A，所述原发性免疫缺陷病为变异型免疫缺陷病。发明人发现，药物用来特异性改变上述至少之一的突变可以预防或者治疗CVID。

根据本发明的具体实施例，所述核酸或者所述基因突变为c.494C>A/c.980G>A，所述原发性免疫缺陷病为选择性IgA缺陷。发明人发现，药物用来特异性改变上述突变可以预防或者治疗SIgAD。

筛选患免疫缺陷病的生物样品的方法

根据本发明的第七方面，本发明提出了一种筛选患原发性免疫缺陷病的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该筛选患原发性免疫缺陷病的生物样品的方法可以包括以下步骤：根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：从生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与野生型RAD50基因相比，所述核酸具有选自下列的至少一种类型突变：c.379G>A、c.137T>A/c.980G>A或c.494C>A/c.980G>A，是所述生物样品患免疫缺陷病的指示。通过根据本发明实施例的筛选患免疫缺陷病的生物样品的方法，可以有效地筛选患免疫缺陷病，尤其是CVID和SIgAD等原发性免疫缺陷病的生物样品。

首先，从生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品RAD50基因是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选患原发性免疫缺陷病的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中RAD50基因是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含RAD50基因编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选患原发性免疫缺陷病的生物样品的效率。另外，根据本发明的实施例，针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括：从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选患原发性免疫缺陷病的生物样品的效率。

接下来，在得到核酸样本之后，可以对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以通过测序方法，确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，可以用于进行测序的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及***或者更先进的测序技术。根据本发明的具体示例，可以利用选自BGIseq500、Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。由此，根据本发明的实施例，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及对所得到的核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。根据本发明的一些实施例，可以采用选自BGIseq500、Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对所得到的核酸测序文库进行测序。另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集RAD50基因外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。可以采用外显子靶向序列富集系统如：华大自主外显子捕获芯片，AglientSureSelect，Nimblegen等其他外显子或目标区域捕获平台，对目标片段进行富集。根据本发明的一个实施例，针对核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括：利用选自RAD50基因外显子特异性引物的至少一种，对核酸样本进行PCR扩增；以及针对所得到的扩增产物，构建核酸测序文库。由此，可以通过PCR扩增，富集RAD50基因外显子，从而能够进一步提高筛选患原发性免疫缺陷病的生物样品的效率。根据本发明的实施例，RAD50基因外显子特异性引物的序列不受特别限制，例如可以参考人类基因组序列数据库GRCh37.1/hg19，采用Primer3.0在线设计获得，例如可以参考UCSC(http://genome.ucsc.edu/)，应用Primer3(version 0.4.0,http://primer3.ut.ee/)设计候选基因的引物并合成(生工生物工程公司合成)，并利用Primer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)验证引物特异性。根据本发明的优选实施例，所述RAD50基因2号外显子特异性引物具有如SEQID NO：4-5所示的核苷酸序列，所述RAD50基因4号外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：6-7所示的核苷酸序列，所述RAD50基因7号外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：8-9所示的核苷酸序列。根据本发明的一些具体示例，针对c.379G>A突变，所述RAD50基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：6-7所示的核苷酸序列，针对c.137T>A突变，所述RAD50基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：4-5所示的核苷酸序列，针对c.980G>A突变，所述RAD50基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：8-9所示的核苷酸序列，针对c.494C>A突变，所述RAD50基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：6-7所示的核苷酸序列。发明人惊奇地发现，通过采用SEQ ID NO：4-9所示的引物，可以在PCR反应体系中显著有效地完成对RAD50基因突变所在外显子序列的扩增。需要说明的是，下表中的这些SEQ ID NO：4-9所示的核苷酸序列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后，意外获得的。

关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序技术进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如Illumina公司所提供的规程，例如参见Illumina公司Multiplexing Sample Preparation Guide(Part#1005361；Feb 2010)或Paired-End SamplePrep Guide(Part#1005063；Feb 2010)，通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。

需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据(reads)作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应RAD50基因的编码序列即可。

最后，在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列相应的参考序列进行比对，当所得到的核酸序列中具有前述各突变的至少之一时，即指示生物样品患免疫缺陷病。由此，通过根据本发明实施例的筛选患免疫缺陷病的生物样品的方法，可以有效地筛选患免疫缺陷病的生物样品。根据本发明的实施例，对核酸序列与相应野生型基因序列进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAPALIGNER/SOAP2进行比对。

需要说明的是，根据本发明实施例的“筛选患免疫缺陷病的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法。

筛选患免疫缺陷病的生物样品的系统

根据本发明的第八方面，本发明提出了一种能够有效实施上述筛选患免疫缺陷病的生物样品的方法的系统。

参考图1，根据本发明的实施例，该筛选患免疫缺陷病的生物样品的系统1000包括：核酸提取装置100、核酸序列确定装置200以及判断装置300。

根据本发明的实施例，核酸提取装置100用于从生物样品提取核酸样本。如前所述，参考图2A，根据本发明的实施例，核酸样本的类型并不受特别限制，对于采用RNA作为核酸样本，则核酸提取装置100进一步包括RNA提取单元101和反转录单元102，其中，提取单元101用于从生物样品提取RNA样本，反转录单元102与RNA提取单元101相连，用于对RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。根据本发明的另一实施例，参考图2B所述核酸提取装置100进一步包括：DNA提取单元103和目标核酸捕获富集单元104，所述DNA提取单元用于从所述生物样本中提取DNA样本，所述目标核酸富集捕获单元用于从所述生物样本中富集捕获目标核酸，所述DNA样本和目标核酸构成所述核酸样本。根据本发明的另一实施例，参考图2C所述核酸提取装置100进一步包括：DNA提取单元103，所述DNA提取单元用于从所述生物样本中提取DNA样本，所述DNA样本构成所述核酸样本。根据本发明的另一实施例，参考图2D所述核酸提取装置100进一步包括：目标核酸捕获富集单元104，所述目标核酸富集捕获单元用于从所述生物样本中富集捕获目标核酸，所述目标核酸构成所述核酸样本。

根据本发明的实施例，核酸序列确定装置200与核酸提取装置100相连，用于对核酸样本进行分析，以便确定核酸样本的核酸序列。如前所示，可以采用测序的方法确定核酸样本的核酸序列。由此，参考图3，根据本发明的一个实施例，所述核酸序列确定装置200可以进一步包括：文库构建单元201以及测序单元202。文库构建单元201用于针对核酸样本，构建核酸测序文库；测序单元202与文库构建单元201相连，用于对核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。如前所述，可以通过PCR扩增，富集RAD50基因外显子，进一步提高筛选患免疫缺陷病的生物样品的效率。由此，文库构建单元201可以进一步包括PCR扩增模块(图中未示出)，在该PCR扩增模块中设置有选自RAD50基因外显子特异性引物的至少一种，以便利用RAD50基因外显子特异性引物的至少一种，对所述核酸样本进行PCR扩增。根据本发明的实施例，RAD50基因外显子特异性引物的序列不受特别限制，例如可以参考人类基因组序列数据库GRCh37.1/hg19，采用Primer3.0在线设计获得，也可以采用Aglient SureSelect外显子靶向序列富集系统(SureSelect_Human_All_Exon_V4和SureSelect_Human_All_Exon_V6)，对目标片段进行富集。根据本发明的优选实施例，所述RAD50基因2号外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：4-5所示的核苷酸序列，所述RAD50基因4号外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：6-7所示的核苷酸序列，所述RAD50基因7号外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：8-9所示的核苷酸序列。根据本发明的一些具体示例，根据本发明的一些具体示例，针对c.379G>A突变，所述RAD50基因外显子特异性引物具有如SEQ IDNO：6-7所示的核苷酸序列，针对c.137T>A突变，所述RAD50基因外显子特异性引物具有如SEQID NO：4-5所示的核苷酸序列，针对c.980G>A突变，所述RAD50基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：8-9所示的核苷酸序列，针对c.494C>A突变，所述RAD50基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：6-7所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，测序单元202可以包括选自BGISEQ500、HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。

根据本发明的实施例，参考图1，判断装置300与核酸序列确定装置200相连，适于将核酸样本的核酸序列进行比对，以便基于核酸样本的核酸序列与相应的野生型基因序列的区别判断生物样品是否患免疫缺陷病。具体地，基于所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与野生型RAD50基因相比具有选自下列的至少一种类型突变：c.379G>A、c.137T>A/c.980G>A或c.494C>A/c.980G>A突变，判断所述生物样品是否患免疫缺陷病。如前所述，根据本发明的实施例，对核酸序列与相应的野生型基因序列进行比对的设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，例如根据本发明的具体实例，可以采用SOAPALIGNER/SOAP2进行比对。

由此，利用该系统，能够有效地实施前述筛选患免疫缺陷病的生物样品的方法，从而可以有效地筛选患免疫缺陷病的生物样品。

用于筛选患免疫缺陷病的生物样品的试剂盒

根据本发明的第九方面，本发明提出了一种用于筛选患免疫缺陷病的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该用于筛选患免疫缺陷病的生物样品的试剂盒包括：适于检测RAD50基因突变体的至少一种的试剂，其中与与野生型RAD50基因相比，核酸具有选自下列的至少一种突变：c.379G>A、c.137T>A/c.980G>A或c.494C>A/c.980G>A。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选患免疫缺陷病的生物样品。在本文中，所使用的术语“适于检测RAD50基因突变体的至少一种的试剂”应做广义理解，即可以是检测RAD50突变体编码基因的至少一种的试剂，也可以是检测RAD50蛋白突变体的至少一种的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。

根据发明的具体实施例，所述免疫缺陷病为原发性免疫缺陷病。

根据本发明的具体实施例，所述原发性免疫缺陷病为变异型免疫缺陷病或选择性IgA缺陷。

根据本发明的具体实施例，与野生型RAD50基因相比，所述RAD50基因突变体具有选自下列的一种类型突变：c.379G>A或c.137T>A/c.980G>A，所述原发性免疫缺陷病为变异型免疫缺陷病(CVID)。发明人发现，RAD50基因编码区发生上述至少之一的突变，可以确认生物体患CVID。

根据本发明的具体实施例，与野生型RAD50基因相比，所述RAD50基因突变体具有选自下列突变：c.494C>A/c.980G>A，所述原发性免疫缺陷病为选择性IgA缺陷(SIgAD)。发明人发现，RAD50基因编码区发生上述突变，可以确认生物体患SIgAD。

根据本发明的一个实施例，所述试剂包括特异性针对RAD50基因突变体或者表达RAD50基因突变蛋白质的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一。由此，可以高效地筛选患免疫缺陷病的生物样品。

构建体及重组细胞

根据本发明的第十方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的核酸。需要说明的是，“构建体包含前面所述的核酸”表示，本发明的构建体包含与野生型RAD50基因相比，核酸具有选自下列的至少一种类型突变：c.379G>A、c.137T>A/c.980G>A或c.494C>A/c.980G>A或者同时包含上述各种基因突变体的核酸序列。“构建体包含前面所述的基因突变”表示，本发明的构建体包含的RAD50基因与野生型RAD50基因相比具有选自下列的至少一种类型突变：c.379G>A、c.137T>A/c.980G>A或c.494C>A/c.980G>A或者同时包含上述各种基因突变。由此，本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用作免疫缺陷病，尤其是CVID和SIgAD等原发性免疫缺陷病的相关研究的模型。其中，所述受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选该受体细胞来源于哺乳动物。

在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。

根据本发明的第十一方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的或者表达前面所述的蛋白质而获得的。从而，本发明的重组细胞能够有效表达构建体所携带的RAD50基因突变体的至少一种或者RAD50基因突变表达的蛋白质的至少一种。根据本发明的一些实施例，本发明的重组细胞，能够有效地用作免疫缺陷病，尤其是CVID和SIgAD等原发性免疫缺陷病相关研究的模型。根据本发明的实施例，受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选所述受体细胞来源于非人哺乳动物。

需要说明的是，在本文前面筛选患免疫缺陷病的生物样品的方法部分中所描述的特征和优点，同样适用于筛选患免疫缺陷病的生物样品的系统或者试剂盒，在此不再赘述。

此外，还需要说明的是，根据本发明实施例的筛选患免疫缺陷病的生物样品的方法、系统以及试剂盒，是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才完成的。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1外显子组测序确定致病基因及突变位点

1、样本收集：

发明人采集到2个CVID家系(见图1)，对应的先证者为P1和P2。P1是伊朗人，来自近亲家系；P2是瑞典人。患者具体表型信息如表1所示。

表1：CVID患者P1、P2和SIgAD患者P4表型信息

患者编号	P1	P2	P4
				种群	伊朗	瑞典	瑞典
性别	女	女	男
				发病年龄/基因诊断年龄	1.5/28	12/46	5/40
疾病	CVID	CVID	SIgAD
				IgG(mg/dl)	195↓	265↓	2130↑
IgG1	40↓	137↓	1490↑
				IgG2	140	85↓	150
IgG3	10↓	18↓	159↑
				IgA(mg/dl)	5↓	<2↓	1
IgM(mg/dl)	20↓	4.4↓	320
				IgE(IU/ml)	18	<2↓	-
特定抗体生成情况	受损	受损	受损
				反复感染	+	+	-
过敏	+	+	-
				生长迟缓	+	-	-
神经功能障碍	-	-	+
				小头畸形	+	-	-
性发育延迟	+	-	-
				皮肤色素代谢异常	+	-	-
辐射敏感	+	+	-
				免疫缺陷	+	+	+
治疗用药	IVIg+预防性抗生素	SCIg+预防性抗生素	-
				现状	依赖IVIg	依赖SCIg	64岁死于髋骨折

备注：↓检测项目比正常对照水平低；↑检测项目比正常对照水平高；

+检测项目结果阳性；-检测项目结果为阴性。

2、外显子组测序确定致病基因及突变位点

发明人通过外显子测序技术筛选2个CVID家系的候选变异，通过生物信息学分析(VEP、公共频率数据库、危害性预测、同原序列比对等注释)，过滤非致病核苷酸变异，针对近亲家系(家系1)利用纯合子定位分析进一步缩小候选变异数目，对候选变异设计引物，进行PCR扩增，产物纯化，Sanger测序，对家系内成员和正常对照人群进行候选变异检测，共分离分析，明确基因突变与疾病的关系。基于外显子组测序结果，通过收集其他患病家系样本(48个CVID患者、791个SIgAD患者)和正常对照样本(1118个)，进行靶基因关联分析，发现另一CVID家系和两个SIgAD家系患者的致病突变。具体方法步骤如下：

1.DNA提取：采外周静脉血10ml，经枸橼酸钠抗凝，常规苯酚-氯仿法提取基因组DNA，分光光度计测DNA浓度及OD值，并稀释至100ng/μl；

2.外显子组测序：对2个CVID家系的先证者(P1和P2)进行外显子组测序，获得核苷酸变异数据；

1)将基因组DNA打断成随机片段并建立随机片段文库；

2)采用Aglient SureSelect外显子靶向序列富集系统(SureSelect_Human_All_Exon_V4和SureSelect_Human_All_Exon_V6)，对目标片段进行富集；

3)利用第二代高通量测序仪Hiseq2000进行高通量的测序；

3.生物信息学分析获得候选基因和位点：

1)外显子组测序得到原始数据后，去除接头序列、低质量序列，使用比对软件bwa-men(v0.7.10-r789)与参考基因组(GRCh37)进行比对，并基于比对结果使用GTAK(v3.3-0)获得核苷酸变异数据；

2)对核苷酸变异数据进行注释，包括VEP(v77)，公共频率数据库(千人数据库，ExAC数据库等)、危害性预测(SIFT，PolyPhen2_HDIV，PolyPhen2_HVAR，LRT，MutationTaster，MutationAssessor，FATHMM，GERP++，PhyloP，SiPhy，Gerp，PhastCons，和GWAWA)；基于注释信息，过滤同义突变、突变频率大于0.01的位点；

3)对CVID患者P1剩余的位点进行纯合子定位，进一步缩小候选变异数目；对CVID患者P2保留纯合突变位点以及复合杂合突变位点；

4)根据变异位点所在基因的功能确定候选基因及突变；

4.引物设计：候选基因Genomic DNA标准序列来自于UCSC(http://genome.ucsc.edu/)，应用Primer3(version 0.4.0,http://primer3.ut.ee/)设计候选基因的引物并合成(生工生物工程公司合成)，利用Primer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)验证引物特异性。引物序列如下：

P1:(纯合c.379G>A)

正向引物：5′-AGCAATAGAATAGATACACTGAAGGTT-3′(SEQ ID NO：6)

反向引物：5′-TGGACTACAAAGTCTATTTAAGGGTTA-3′(SEQ ID NO：7)

P2:(复合杂合c.137T>A/c.980G>A)

针对c.137T>A：

正向引物：5′-TGGTAAACTTCTGTGGTTCTCTT-3′(SEQ ID NO：4)

反向引物：5′-TGGGGCTGACTTTCATTTCT-3′(SEQ ID NO：5)

针对c.980G>A：

正向引物：5′-TGTACATTAAAGCTTTTTATTTTGGTG-3′(SEQ ID NO：8)

5.反向向引物：5′-CATCATAGTAGGAAAAACGACCA-3′(SEQ ID NO：9)对患者及对应家系内成员进行候选核苷酸变异突变检测：

1)PCR扩增：利用所设计的引物对提取的DNA标本进行扩增；

①PCR反应体系：25μl

②2号外显子的PCR反应条件：

4号外显子PCR反应条件：

7号外显子PCR反应条件：

8号外显子PCR反应条件：

21号外显子PCR反应条件：

2)PCR产物分析：将PCR产物于6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(据扩增片段大小选择合适的电压)，硝酸银溶液染色显带；分析电泳图谱；

3)选择带型单一且浓度较高的样本经PCR产物纯化后，按BigDye 3.1Sequencingkit(ABI公司)试剂盒操作，采用美国ABI公司自动基因分析仪3500测序分析PCR扩增产物，分析测序图，与标准序列进行对比，分析突变。鉴定致病基因及致病突变，发现P1是RAD50基因编码区第379位碱基发生纯合G->A改变(图5A)，P2是RAD50基因编码区第137位碱基发生杂合T->A改变和编码区第980位碱基发生杂合G->A改变(图5B)；

①PCR产物纯化反应体系：

②PCR产物纯化反应条件：37℃120分钟→80℃15分钟→4℃保温

③测序PCR反应体系为1/16反应体系(10μl)：

④测序PCR反应条件：(96℃30秒→55℃15秒→60℃3分钟)×33个循环→4℃保温

⑤测序产物纯化：采用乙醇/EDTA/NaAc(乙酸钠)法纯化测序PCR产物，10μl反应体系，96孔板。具体操作步骤如下：

a)每孔加入1μl 125mM EDTA与1μl 3M NaAc的混合液；

b)每孔加入25μl 100％无水乙醇，铝箔纸密封后震荡混匀4次，于室温放置15分钟；

c)置于离心机中2800×g离心30分钟，马上倒置96孔板，离心至185×g停止离心(从离心机启动到达185×g停止，离心时间共1分钟)；

d)每孔加入70％乙醇35μl，4℃1650×g离心15分钟，马上倒置96孔板，离心至185×g停止离心(从离心机启动到达185×g停止，离心时间共1分钟)；

e)重复步骤d一次，置于室温；

f)待乙醇挥发干净后，每孔加入10μl Hi-Di Formamide溶解DNA；

g)待样品完全溶解后置于96℃变性5分钟后，迅速置于冰中冷却15分钟，上机；

4)测序仪(ABI 3500DNA Analyzer)操作；

6.突变分析：PCR扩增产物进行Sanger测序后，比对标准序列，鉴定患者P1的RAD50基因编码区第379位碱基是否发生G→A纯合改变，患者P2的RAD50基因是否同时发生c.137T>A杂合突变和c.980G>A杂合改变；

7.收集其他CVID家系样本(48个)和正常对照样本(1118个)，对RAD50基因进行扫描，发现另一个CVID家系患者的致病突变是RAD50的c.1114C>T；鉴于SIgAD和CVID可能具有相同致病基因，发明人还收集了791个SIgAD患者，对其RAD50进行扫描，发现两个SIgAD患者的致病突变，分别为复合杂合c.494C>A/c.980G>A和杂合c.3230G>A。

发明人发现P1在RAD50的4号外显子发生一个纯合突变c.379G>A，该突变导致氨基酸序列127位缬氨酸(Val)被异亮氨酸(Ile)取代。Sanger测序发现该患者的母亲携带杂合c.379G>A(患者父亲已去世)，患者的表型正常的兄弟无该突变(图5A)。P2的致病突变为复合杂合，其RAD50的2号外显子发生杂合突变c.137T>A，7号外显子发生杂合突变c.980G>A，分别导致氨基酸序列46位异亮氨酸被缬氨酸取代，327位精氨酸被组氨酸取代(图5B)。发明人收集48个CVID患者、791个SIgAD患者和1118个正常对照，对这些样本的RAD50基因进行扫描，保留频率低于千分之一的位点。发明人发现一个SIgAD家系(图4，家系3)患者的致病突变，患者P4的致病突变为复合杂合，4号外显子上的c.494C>A(p.165P>H)和7号外显子上的c.980G>A(p.327R>H)。RAD50是核酸酶复合物MRE11/RAD50/NBS1(MRN)的组成部分。MRN通过募集并激活ATM蛋白，进而提高DNA双链断裂损伤修复效率。研究发现ATM、MER11或NBS1有缺陷的患者出现一系列抗体不足的症状，包括SIgAD、CVID和高免疫球蛋白M综合症。RAD50有两条主要的转录本(ENST00000265335和ENST00000453394)。这两条转录本的蛋白产物广泛参与多个不同的生理生化通路，包括DNA双链断裂损伤修复通路、维持端粒酶活性、DNA单链断裂损伤修复通路和减数***重组等(图6)。上述发现的突变位点对两条转录本均有影响。通过跨物种同源序列比对发现所有突变位点在多个物种均高度保守(图7)；p.127V>I位于蛋白RAD50的表面，可能会破坏其ATP酶-DNA结合域的结合能力(图8)；野生型RAD50第46位的异亮氨酸位于第一个α螺旋凹槽的中心，并分别于蛋白序列的第26位(苏氨酸)，第34位(亮氨酸)，第156位(苯丙氨酸)，第1229位(丙氨酸)，1267位(异亮氨酸)形成氢键，所以p.46I>N突变会破坏这些相互作用，改变RAD50蛋白产物的三级结构和稳定性(图8)；c.494C>A突变导致蛋白序列第165位带正电荷，具有强极性的组氨酸被不带电荷，没有极性的脯氨酸代替，这个位置紧挨N端核苷水解酶结构域，该结构域被认为对RAD50与MER11结合起重要作用(图8)；第327位精氨酸(不带电荷)位于N端卷曲螺旋结构域，被带正电荷的组氨酸替换，该突变可能是亚效等位基因突变。

实施例2验证新基因RAD50突变为致病基因

1、观察辐射后细胞间期G2和G0期染色质异常情况，其中G2期染色质异常实验步骤如下：

1)使用添加10％小牛血清、1％左旋谷酰胺、青霉素(100U/mL)和链霉素(100g/mL)的RPMI-1640细胞培养基培养经过肝素化的患者及对照组的血液细胞，并使用植物凝集素(1μg/ml)诱导淋巴细胞繁殖；

2)将培养基系统置于37℃、5％CO₂、湿润环境中4天；

3)将培养基暴露于γ射线(100cGy)辐射环境中4小时；

4)往经过辐射的培养基中添加加秋水仙酰胺(0.15μg/mL)，固定细胞***中期；

5)将培养基置于离心机(1200RPM)10分钟，并取淋巴细胞；

6)用氯化钠溶液处理淋巴细胞15分钟，并用新鲜的固定剂(甲醇/冰乙酸:3/1)进行固定；

7)重复步骤6；

8)使用Giemsa(2％)染色5分钟；

9)观察并计数患者和对照的染色体单体型和等点染色单体的断裂数；

G2期染色质异常实验步骤如下：

1)使用添加10％小牛血清、1％左旋谷酰胺、青霉素(100U/mL)和链霉素(100g/mL)的RPMI-1640细胞培养基培养经过肝素化的患者及对照组的血液细胞；

2)将细胞暴露于γ射线(300cGy)辐射环境；

3)使用植物凝集素进行刺激，并放置在37℃、5％CO₂环境中培养44小时；

4)往培养基中添加细胞松驰素B(6μg/mL)；

5)92小时后，使用氯化钠溶液进行低渗刺激，并重复固定3次(甲醇/冰乙酸：3/1)；

6)使用Giemsa(2％)进行染色；

7)患者和对照各取500个出现双核的细胞统计各自微核出现频率；

发明人观察γ射线照射后患者和对照组染色质异常情况(染色体单体型和等点染色单体的断裂数)，发现CVID患者P1淋巴细胞染色质异常的频率高达92.5％，而正常对照淋巴细胞染色质异常频率为40％(图9A，B)。

2、观察辐射后，患者和对照组细胞的相对活性：

1)采CVID患者及对照组的外周血淋巴细胞，使用EBV进行感染，获得B细胞系；

2)克隆形成实验：取适量照射后(1.0Gy)的细胞接种到培养基中，培养10～13天，用MTT进行染色，统计大于32个细胞的克隆数，并计算细胞存活分数；

发明人观察患者B淋巴细胞在辐射后的克隆形成率，发现CVID患者P2细胞的平均存活率为31％，属中等水平。

3、分析免疫细胞VDJ重排时微小同源序列(microhomology，MH)使用情况：从白细胞中提取DNA进行多重PCR，扩增B记忆细胞中的Sμ-Sα片段；通过与生殖系的Sμ和Sα序列比对判断交换重组连接；通过与对照组的Sμ-Sα片段比较，判断微小同源序列的使用情况。

发明人观察B淋巴细胞VDJ重排时微小同源序列(microhomology，MH)使用情况，发现RAD50缺陷的患者使用的MH长度大于10bp的频率大于40％，而正常对照中只有5％～15％；与MRE11患者和NBS患者相比，携带RAD50缺陷的患者使用MH的比例更高(图9C)。

实施例3检测DNA样品中是否具有RAD50基因突变

1)针对CVID和SIgAD致病基因RAD50设计引物，进行PCR扩增；

2)对PCR产物纯化，并进行Sanger测序分析；

3)鉴定RAD50编码区是否携带以下任一突变：c.379G>A纯合突变、c.137T>A/c.980G>A复合杂合突变或c.494C>A/c.980G>A复合杂合突变＝。其中c.379G>A纯合突变和c.137T>A/c.980G>A复合杂合突变导致CVID。

该突变发生在基因RAD50的2、4、7号外显子，其PCR扩增核苷酸序列如SEQ ID NO：13～15所示，对应的正常基因序列为SEQ ID NO：10～12。

实施例4体外检测CVID和SIgAD致病基因RAD50突变的试剂盒

试剂盒包括：

1)用于扩增CVID和SIgAD致病基因RAD50外显子的引物；

2)PCR扩增的酶和相应缓冲液；

3)试剂盒组成：

试剂盒内含扩增外显子和外显子与内含子交界处序列所有正向(F)及反向(R)引物(SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：9RAD50-2F,2R；RAD50-4F,4R；RAD50-7F,7R)，引物配对使用。

4)使用方法：

a)采用上述试剂盒内PCR引物、Taq DNA聚合酶等试剂加入待测DNA样品后进行PCR反应；

b)PCR反应产物经纯化后进行Sanger测序，将所得到的序列与该基因标准序列比对确定突变是否存在。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。