一种检测石斑鱼神经坏死病毒的胶体金试纸条及其制备和检测方法
阅读说明：本技术 一种检测石斑鱼神经坏死病毒的胶体金试纸条及其制备和检测方法 (Colloidal gold test strip for detecting nervous necrosis virus of grouper and preparation and detection methods thereof ) 是由 秦启伟 刘嘉昕 王劭雯 曾令文 俞也频 李趁 魏世娜 于 2019-09-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及病毒检测技术领域,公开了一种检测石斑鱼神经坏死病毒的胶体金试纸条及其制备方法,所述胶体金试纸条包括底板以及依次搭接固定于底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸收垫,所述结合垫上包被有金标探针,所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线,所述检测线固定有捕获探针,所述质控线固定有质控探针。本发明同时公开了一种采用上述胶体金试纸条检测石斑鱼神经坏死病毒的方法。本发明的胶体金试纸条基于核酸适配体结合侧流生物传感器以及胶体金显色的原理制成,具有较高的灵敏度和特异性,组装简单,便于携带,检测方法操作简便,可以对石斑鱼神经坏死病毒进行高效、准确、快速的现场实时检测。(the invention relates to the technical field of virus detection, and discloses a colloidal gold test strip for detecting a grouper nervous necrosis virus and a preparation method thereof. The invention also discloses a method for detecting the nervous necrosis virus of the grouper by adopting the colloidal gold test strip. The colloidal gold test strip is prepared based on the principles of aptamer combination with a lateral flow biosensor and colloidal gold color development, has high sensitivity and specificity, is simple to assemble and carry, is simple and convenient to operate, and can be used for efficiently, accurately and quickly detecting the nervous necrosis virus of the grouper on site in real time.)
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，更具体的，涉及一种检测石斑鱼神经坏死病毒的胶体金试纸条及其制备和检测方法。
背景技术
神经坏死病毒属于诺达病毒科的β-诺达病毒属，对水产养殖业构成了巨大威胁，其主要针对低等脊椎动物的中枢神经系统进行感染，在神经坏死病毒感染的鱼的视网膜和大脑中可以观察到明显的空泡现象。石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)、条纹鲹神经坏死病毒(SJNNV)、条纹星鲽神经坏死病毒(BFNNV)和虎斑东方鲀神经坏死病毒(TPNNV)属于神经坏死病毒的四个基因型，其中以RGNNV最为严重。
石斑鱼是一种极具经济价值的鱼类，被神经坏死病毒感染后仔鱼和幼鱼的死亡率可达100％，更严重的是，神经坏死病毒具有从受感染的石斑鱼转移到其后代的迁移能力。RGNNV给石斑鱼造成了毁灭性的损害，给水产养殖业带来了巨大的经济损失。因此，建立有效的诊断方法来早期检测和预防这种病毒性疾病是非常必要的。
目前的神经坏死病毒检测方法中，细胞培养是最基本的培养方法，但它费时且依赖于温度；作为标准方法的传统聚合酶链反应已发展成多种形式，如逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、实时定量RT-PCR(qRT-PCR)、环介导的等温扩增(LAMP)等，但尽管聚合酶链式反应应用广泛，但也存在着一些缺点，如需要复杂的程序和专用的设备，不能在现场使用。其他检测方法，如感染组织的电镜观察、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光抗体试验(IFAT)，由于需要专业人员操作且采用昂贵仪器，所以也很难满足实时检测的要求。
综上所述，研发一种检测石斑鱼神经坏死病毒的胶体金试纸条及其制备和检测方法实为必要。
发明内容
本发明提供的一种检测石斑鱼神经坏死病毒的胶体金试纸条及其制备和检测方法，解决了现有的神经坏死病毒检测方法费时费力，检测条件要求高以及检测程序复杂，不能在现场进行实时检测的问题。本发明的胶体金试纸条及检测方法基于核酸适配体结合侧流生物传感器以及胶体金显色的原理，具有较高的灵敏度和特异性，制备组装简单，便于携带，检测方法简单，操作方便，可以对石斑鱼神经坏死病毒进行高效、准确、快速的检测。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种检测石斑鱼神经坏死病毒的胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括底板以及依次搭接固定于底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸收垫，所述结合垫上包被有金标探针，所述金标探针为5’端巯基修饰的核酸适配体，其核苷酸序列为：5’-SH-AGCTACTGCT TTGGGGGT(序列1)；
所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线固定有捕获探针，所述质控线固定有质控探针：
所述捕获探针的核苷酸序列为：TTCTTTTATTAGTTGATTT(序列2)；
所述质控探针的核苷酸序列为：ACCCCCAAAGCAGTAGCT(序列3)。
本发明还公开了所述检测石斑鱼神经坏死病毒的胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：
S1.制备样品垫；
S2.制备结合垫，并在结合垫上包被金标探针；
S3.硝酸纤维素膜的处理：采用三维划膜喷金仪将捕获探针和质控探针以0.5-0.8μL/cm的喷样量在硝酸纤维素膜上划线得到检测线和质控线，所述检测线和质控线之间的距离为5～6mm；
S4.胶体金试纸条的组装：将所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次固定在所述底板上，各相邻的部件相互重叠2～3mm，然后将其整体切成4mm宽，避光密闭环境下保存备用。
进一步的，所述步骤S1具体为：将玻璃纤维置于含有0.5％的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、2％蔗糖、1％BSA、50mM硼酸，pH 8.0的溶液中浸泡后，室温干燥12h制成。
进一步的，所述步骤S2具体包括以下步骤：
a.胶体金(AuNP)的合成：取200ml浓度为0.01％的HAuCl4溶液置于500ml圆底烧瓶中，轻轻搅拌并加热至沸腾，快速加入8ml浓度为1％的柠檬酸三钠，溶液颜色先变为深蓝色，再变为葡萄酒红色，继续沸腾5min，保持温和搅拌；停止加热，15min后移至磁力搅拌器，搅拌冷却至室温，得到AuNP溶液；
b.胶体金-核酸适配体(AuNP-DNA)复合物的制备：将步骤①所得AuNP溶液进行10倍浓缩，取400μl浓缩液加入金标探针，于4℃下轻轻摇晃12h，然后加入浓度为10％的牛血清白蛋白(BSA)，反应4h，得到胶体金-核酸适配体(AuNP-DNA)复合物；在所述复合物中添加浓度为1％的十二烷基硫酸钠至其在体系中终浓度为0.01％，再加入浓度为1.5mol/L的NaCl溶液使体系中盐离子终浓度为150mM，所得复合溶液置于4℃反应12h；
c.将步骤b所得的复合溶液以12000rpm的转速离心10～20min，并用缓冲液清洗三次，去除多余的未结合DNA，丢弃上清，将所得红色颗粒重新悬浮在150μl的缓冲液中，得到胶体金-核酸适配体(AuNP-DNA)结合溶液，于4℃保存；
d.取步骤c所得的胶体金-核酸适配体结合溶液以每条2-3μl的量滴加在所述结合垫上，室温风干5min，即得包被有金标探针的结合垫。
进一步的，所述步骤c中的缓冲液为含有20mM Na3PO4、5％BSA、0.25％吐温以及10％蔗糖的溶液。
本发明同时公开了一种采用上述胶体金试纸条检测石斑鱼神经坏死病毒的检测方法，该检测方法包括以下步骤：
①病毒孵育：取100μl磷酸盐缓冲液(PBS)，加入捕获适配体(Aptamer1)和扩增适配体(Aptamer2)，使所述捕获适配体(Aptamer1)和扩增适配体(Aptamer2)的浓度分别达到200nM，再加入石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)感染的细胞裂解物孵育10～15min，得到含石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)的混合物；
②链置换反应：将2μl经链霉亲和素(SA)修饰的磁珠加入所述混合物中，振荡10～15min，得到Aptamer1-RGNNV-Aptamer2-磁珠复合物，用磁器分离架将Aptamer1-RGNNV-Aptamer2-磁珠复合物收集，用含吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤三次，将复合物转移到离心管中进行链置换反应(SDA)，反应温度为37℃，时间为30min，得到SDA反应产物；
③取样检测：取步骤②的SDA反应产物3～4滴至胶体金试纸条的样品垫上，反应5min，观察胶体金试纸条显色结果；
④结果判读：
阳性反应：胶体金试纸条的检测线、质控线均显色；
阴性反应：胶体金试纸条的检测线不显色，质控线显色。
进一步的，所述步骤②中的链置换反应(SDA)反应体系中，按体积量计，包括：SDA引物2μl、脱氧核苷三磷酸酯(dNTPs)2μl、聚合酶(Klenow fragment exo)0.6μl、切刻内切酶(Nt.BbvCI)0.4μl、SDA-buffer-2 2μl、10％BSA 1μl、超纯水12μl。
进一步的，所述SDA引物的核苷酸序列为：GAGACTTCATCTG CGTCCTTCG(序列7)。
进一步的，所述捕获适配体(Aptamer1)和扩增适配体(Aptamer2)的制备方法为：
①筛选病毒的核酸适配体：采用磁珠法SELEX技术，筛选得到石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白(简称RGNNV-CP)的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列为：TTCTTTTATTAGTTGATTTTTTT GATTTTGGCAGCTACTGCTTTGGGGGT(序列4)；
②核酸适配体修饰：对步骤①所述的核酸适配体进行3’端生物素修饰，得到捕获适配体(Aptamer1)，其序列为：TTCTTTTATTAGTTGATTTTTTTGATTTTGGCAGCTACTGCTTTGGGGGT-Bio(序列5)；
对步骤①所述的核酸适配体进行切刻内切酶(Nt.BbvCI)识别位点和引物结合位点修饰，得到扩增适配体(Aptamer2)，其序列为：TTCTTTTATTAGTTGATTTTTTTGATTTTGGCAGCTACTGCTTTGGGGGTGCTGAGGCGAAGGACGCAGATGAAGTCTC(序列6)；
在扩增适配体(Aptamer2)序列中，“GCTGAGG”为切刻内切酶(Nt.BbvCI)的识别位点，“CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC”为引物结合序列。
本发明的胶体金试纸条及其检测方法的优化筛选和检测原理为：
将受RGNNV感染的石斑鱼脑细胞在培养基中培养后，制备石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白(简称RGNNV-CP)，然后通过磁珠法SELEX技术，优化筛选RGNNV-CP，通过化学合成构建一个含有不同序列的单链寡核苷酸文库，将表面固定有RGNNV-CP的磁珠与文库一起孵育以便于靶标与相应的单链核酸充分结合，然后通过磁分离程序得到与磁珠表面靶标特异性结合的核酸单链，接着利用洗脱程序将结合的核酸洗脱，再以这些洗脱的核酸为模板进行扩增并用于下一轮筛选，通过反复地结合、分离、洗脱与扩增操作步骤，淘汰与靶标不结合、亲和力较小的核酸，而具有高亲和力的核酸适配体逐步被富集，最终筛选出与RGNNV-CP具有特异性结合力的核酸适配体。
对筛选出的RGNNV-CP的核酸适配体进行生物素修饰，可以得到捕获适配体(Aptamer1)，捕获适配体(Aptamer1)具有生物素修饰，可被链霉亲和素(SA)修饰的磁珠捕获从而可被用于富集；对RGNNV-CP的核酸适配体进行Nt.BbvCI酶识别位点和引物结合位点修饰，可以得到扩增适配体(Aptamer2)，扩增适配体(Aptamer2)被用于扩增，可作为链置换反应(SDA)的模板。
Aptamer1和Aptamer2在磷酸盐缓冲液(PBS)中与RGNNV孵育，得到的混合物中再加入SA修饰的磁珠，然后用磁器分离架将Aptamer1-RGNNV-Aptamer2-磁珠复合物收集，并用含吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)进行洗涤，再用超纯水将Aptamer1-RGNNV-Aptamer2-磁珠复合物转移到离心管中进行SDA反应。
在SDA反应过程中，Aptamer2与SDA引物结合，形成的互补链会在Nt.BbvCI酶识别位点被切割分离，在聚合酶的作用下，会从切割处继续进行扩增反应，扩增后继续被切割分离，循环往复，SDA反应后，产生大量的扩增产物，然后将这些扩增产物滴加到胶体金试纸条的样品垫上，扩增产物通过层析作用流经检测线和质控线，与捕获探针和质控探针发生互补反应。
综上所述，在RGNNV-CP存在的情况下，Aptamer1-RGNNV-Aptamer2-磁珠复合物首先进行SDA反应，得到反应产物ssDNA，在胶体金试纸条的结合垫上，AuNP-DNA复合物中的金标探针与SDA产物(ssDNA)进行互补反应，从而使AuNP-DNA复合物捕获ssDNA，形成ssDNA-AuNP-DNA复合物。
由于ssDNA也与检测线上的捕获探针互补，因此形成的ssDNA-AuNP-DNA复合物可以聚集在检测线，形成可见的红色带；过量的AuNP-DNA复合物在硝酸纤维素膜上继续迁移，由于AuNP-DNA复合物中的金标探针与质控线上的质控探针会发生互补反应，因此会在质控线形成另一条红色带。
与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是：
本发明的胶体金试纸条基于核酸适配体结合侧流生物传感器以及胶体金显色的原理制成，由于核酸适配体可以折叠成三维结构，进而通过空间构型互补或分子间作用力与靶物质发生结合，能结合多种靶点，包括有机分子、蛋白质、细胞和金属离子，并且具有很高的特异性以及与抗体相同的特性，核酸适配体与靶物质的识别模式与抗体类似，但与传统的蛋白质抗体相比，核酸适配体的本质是寡核苷酸链，远远小于抗体，因此可以识别并区分靶分子结构上的细微差别，而且更稳定、更便宜，并且易于通过修饰合成。因此，本发明的胶体金试纸条具有较高的灵敏度和特异性，性能稳定，易于保存备用，同时制备组装简单，成本低，便于携带和进行现场实时检测，使用方便。
本发明所提供的利用上述胶体金试纸条检测石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)的方法，步骤简单，操作方便，检测时间短，适用于进行现场实时检测，可以对石斑鱼神经坏死病毒进行高效、准确、快速的检测，从而及时了解早期发病情况，预防毁灭性损害，降低石斑鱼养殖风险，因此具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明的胶体金试纸条的结构示意图；
图2为本发明的胶体金试纸条的检测结果判定图；
图3为本发明对比例1的胶体金试纸条对比实验结果图；
图4为本发明对比例2的胶体金试纸条对比实验结果图；
图5为本发明对比例3的胶体金试纸条对比实验结果图。
图中：1-底板，2-样品垫，3-结合垫，4-硝酸纤维素膜，41-检测线，42-质控线，5-吸收垫。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制，因此本发明要求保护的范围并不局限于所述。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。本发明中的核苷酸序列均由发明人经过大量实验进行优化设计，然后由Invitrogen Biotechnology Co.Ltd(中国上海)合成。
1.主要试剂、材料：
HPLC纯化的寡核苷酸由Invitrogen Biotechnology Co.Ltd(中国上海)合成；
HAuCl4购自SigmaAldrich(德国)；
Bovine serum albumin(BSA)购自Sigma Aldrich(德国)；
聚合酶(Klenow-exo)购自新英格兰生物实验室(美国)；
切刻内切酶(Nt.BbvCI)购自新英格兰生物实验室(美国)；
SDA-buffer-2购自新英格兰生物实验室(美国)；
脱氧核苷三磷酸酯(dNTPs)购自Takara(中国北京)；
Streptavidin(SA)-修饰的磁珠(DynaBeadsTMMyoneTMStreptavidin C1)购自Invitrogen(美国)；
硝酸纤维素膜购自美国Millipore公司；
玻璃纤维、PVC底板和吸水垫购自广州奥威生物科技有限公司。
2.实施例1：
如图1所示，一种检测石斑鱼神经坏死病毒的胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括底板1以及依次搭接固定于底板1上的样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4以及吸收垫5，所述结合垫3上包被有金标探针，所述金标探针为5’端巯基修饰的核酸适配体，其核苷酸序列为：5’-SH-AGCTACTGCTTTGGGGGT(序列1)；
所述硝酸纤维素膜4上设置有检测线41和质控线42，所述检测线41固定有捕获探针，所述质控线42固定有质控探针：
所述捕获探针的核苷酸序列为：TTCTTTTATTAGTTGATTT(序列2)；
所述质控探针的核苷酸序列为：ACCCCCAAAGCAGTAGCT(序列3)。
所述检测石斑鱼神经坏死病毒的胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：
S1.制备样品垫2：将玻璃纤维置于含有0.5％的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、2％蔗糖、1％BSA、50mM硼酸，pH 8.0的溶液中浸泡后，室温干燥12h制成；
S2.制备结合垫3，并在结合垫上包被金标探针；
S3.硝酸纤维素膜4的处理：采用三维划膜喷金仪将捕获探针和质控探针以0.6μL/cm的喷样量在硝酸纤维素膜4上划线得到检测线41和质控线42，所述检测线41和质控线42之间的距离为6mm；
S4.胶体金试纸条的组装：将所述样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸收垫5依次组装在所述底板1上，各相邻的部件相互重叠2mm，然后用切纸机将其整体切成4mm宽，避光密闭环境下保存备用。
其中，所述步骤S2具体包括以下步骤：
a.胶体金(AuNP)的合成：取200ml浓度为0.01％的HAuCl4溶液置于500ml圆底烧瓶中，轻轻搅拌并加热至沸腾，快速加入8ml浓度为1％的柠檬酸三钠，溶液颜色先变为深蓝色，再变为葡萄酒红色，继续沸腾5min，保持温和搅拌；停止加热，15min后移至磁力搅拌器，搅拌冷却至室温，得到AuNP溶液；
b.胶体金-核酸适配体(AuNP-DNA)复合物的制备：将步骤①所得AuNP溶液进行10倍浓缩，取400μl浓缩液加入金标探针，于4℃下轻轻摇晃12h，然后加入浓度为10％的牛血清白蛋白(BSA)，反应4h，得到胶体金-核酸适配体(AuNP-DNA)复合物；在所述复合物中添加浓度为1％的十二烷基硫酸钠至其在体系中的终浓度为0.01％，再加入浓度为1.5mol/L的NaCl溶液使体系中的盐离子终浓度为150mM，所得复合溶液置于4℃反应12h；
c.将步骤b所得的复合溶液以12000rpm的转速离心20min，并用缓冲液清洗三次，去除多余的未结合DNA，丢弃上清，将所得红色颗粒重新悬浮在150μl的缓冲液中，得到胶体金-核酸适配体(AuNP-DNA)结合溶液，于4℃保存；所述缓冲液为含有20mM Na3PO4、5％BSA、0.25％吐温以及10％蔗糖的溶液；
d.取步骤c所得的胶体金-核酸适配体结合溶液以每条2.5μl的量滴加在所述结合垫上，室温风干5min，即得包被有金标探针的结合垫。
如图3-5所示，为方便携带以及使用，可以给胶体金试纸条设计特制的包装盒，将胶体金试纸条嵌装在包装盒内，包装盒下段设置加样孔，加样孔针对样品垫，包装盒上端设置透明视窗，可以看到胶体金试纸条的检测线和质控线，便于观察显色结果。
3.实施例2：
一种采用本发明的胶体金试纸条检测石斑鱼神经坏死病毒的方法，该检测方法包括以下步骤：
①病毒孵育：取100μl磷酸盐缓冲液(PBS)，加入捕获适配体(Aptamer1)和扩增适配体(Aptamer2)，使所述捕获适配体(Aptamer1)和扩增适配体(Aptamer2)的浓度分别为200nM，再加入石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)感染的细胞裂解物孵育15min，得到含石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)的混合物；
②链置换反应：将2μl经链霉亲和素(SA)修饰的磁珠加入所述混合物中，振荡15min，得到Aptamer1-RGNNV-Aptamer2-磁珠复合物，用磁器分离架将Aptamer1-RGNNV-Aptamer2-磁珠复合物收集，用含吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤三次，将复合物转移到离心管(EP管)中进行链置换反应(SDA)，反应温度为37℃，时间为30min，得到链置换反应(SDA)产物；
③取样检测：取步骤②的反应产物3～4滴至胶体金试纸条的样品垫上，反应5min，观察胶体金试纸条显色结果；
④结果判读：
如图2所示，阳性反应：胶体金试纸条的检测线、质控线均显色；阴性反应：胶体金试纸条的检测线不显色，质控线显色。
所述步骤②中的链置换反应(SDA)反应体系中，按体积量计，包括：SDA引物2μl、脱氧核苷三磷酸酯(dNTPs)2μl、切刻内切酶(Nt.BbvCI)0.4μl、聚合酶(Klenow fragmentexo)0.6μl、SDA-buffer-2 2μl、10％BSA 1μl、超纯水12μl。
其中，所述SDA引物的核苷酸序列为：GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG(序列7)。
所述捕获适配体(Aptamer1)和扩增适配体(Aptamer2)的制备方法为：
①筛选核酸适配体：采用磁珠法SELEX技术，筛选得到石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白(简称RGNNV-CP)的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列为：TTCTTTTATTAGTTGATTTTTTTGATTTTGGCAGCTACTGCTTTGGGGGT(序列4)；
②核酸适配体修饰：对步骤①所述的核酸适配体进行3’端生物素修饰，得到捕获适配体(Aptamer1)，其序列为：TTCTTTTATTAGTTGATTTTTTTGATTTTGGCAGCTACTGCTTTGGGGGT-Bio(序列5)；
对步骤①所述的核酸适配体进行Nt.BbvCI酶识别位点和引物结合位点修饰，得到扩增适配体(Aptamer2)，其序列为：TTCTTTTATTAGTTGATTTTTTTGATTTTGGCAGCTACTGCTTTGGGGGTGCTGAGGCGAAGGACGCAGATGAAGTCTC(序列6)；
在扩增适配体(Aptamer2)序列中，“GCTGAGG”片段为Nt.BbvCI酶的识别位点，“CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC”片段为引物结合序列。
4.对比例1
为了对本发明的胶体金试纸条以及检测方法的可行性和有效性进行分析，特设立对比实验1，对比实验1设立实验组、对照组1-3，各组具体情况如下：
实验组：RGNNV感染的细胞裂解物与Aptamer1和Aptamer2同时孵育；
对照组1(阴性对照组)：磷酸盐缓冲液(PBS)与Aptamer1和Aptamer2进行孵育；
对照组2：RGNNV感染的细胞裂解物仅与Aptamer1进行孵育；
对照组3：RGNNV感染的细胞裂解物仅与Aptamer2进行孵育。
上述各组在孵育后，进行链置换反应(SDA)，孵育方法以及链置换反应(SDA)反应的条件均与实施例2中的方法和条件相同，然后取各组的反应产物滴加在胶体金试纸条的样品垫上进行检测。
如图3所示，实验组的胶体金试纸条检测线(T线)和质控线(C线)均显示出色带，对照组1～3的胶体金试纸条检测线(T线)均未显示色带。
由此看出，只有在RGNNV存在的情况下，才能使Aptamer1-RGNNV-Aptamer2-磁珠复合物首先进行SDA反应，得到反应产物ssDNA，然后在胶体金试纸条的结合垫上，AuNP-DNA复合物中的金标探针与SDA产物(ssDNA)进行互补反应，从而使AuNP-DNA复合物捕获ssDNA，形成ssDNA-AuNP-DNA复合物。
由于ssDNA也与检测线上的捕获探针互补，因此形成的ssDNA-AuNP-DNA复合物可以聚集在检测线，形成可见的红色带；过量的AuNP-DNA复合物在硝酸纤维素膜上继续迁移，由于AuNP-DNA复合物中的金标探针与质控线上的质控探针会发生互补反应，因此会在质控线形成另一条红色带。
在没有RGNNV或Aptamer1和Aptamer2只有一种的情况下，由于没有Aptamer1被磁珠富集或者没有Aptamer2进行扩增得到SDA产物，因此检测线不显色。
因此，只有在同时含有Aptamer1和Aptamer2以及存在RGNNV的情况下，才能看到胶体金试纸条的检测线(T线)显色。实验表明，本发明的胶体金试纸条以及检测方法能有效地检测石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)。
5.对比例2
为了对本发明的胶体金试纸条以及其检测方法的特异性进行分析，特设立对比实验2，对比实验2设立实验组、对照组，各组具体情况如下：
实验组：RGNNV感染的细胞裂解物与Aptamer1和Aptamer2同时孵育；
对照组：MBP与Aptamer1和Aptamer2进行孵育，所述MBP为麦芽糖结合蛋白。
上述各组在孵育后，进行链置换反应(SDA)，孵育方法以及链置换反应(SDA)反应的条件均与实施例2中的方法和条件相同，然后取各组的反应产物滴加在胶体金试纸条上进行检测。
如图4所示，实验组的胶体金试纸条检测线(T线)和质控线(C线)均显示色带，对照组的胶体金试纸条检测线(T线)未显色。
由此可见，本发明的胶体金试纸条以及检测方法对石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)具有特异性。
6.对比例3
为了对本发明的胶体金试纸条以及检测方法的灵敏度进行分析，特设立对比实验3，对比实验3设立实验组和对照组，各组具体情况如下：
实验组：将RGNNV感染的细胞裂解物分别溶解在PBS中，得到不同RGNNV浓度的稀释溶液，如：1μg/ml、500ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml、5ng/ml；
对照组(阴性对照组)：PBS中不含RGNNV，即RGNNV浓度为0ng/ml。
上述各组在孵育后，进行链置换反应(SDA)，孵育方法以及链置换反应(SDA)反应的条件均与实施例2中的方法和条件相同，然后取各组的反应产物滴加在胶体金试纸条上进行检测。
如图5所示，各胶体金试纸条显示了检测不同浓度RGNNV的显色结果，虽然RGNNV浓度为5ng/ml所对应的检测线(T线)色带较浅，但仍能观察到。由此可见，检测线(T线)能观测到的石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)的最低浓度为5ng/ml，而对照组胶体金试纸条的检测线(T线)未显色，从而说明本发明的胶体金试纸条以及检测方法的检测灵敏度较高。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施例的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施例予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。