阅读说明：本技术 一种定量检测鸡蛋中氟苯尼考的嵌合elisa试剂盒及其制备方法 (Chimeric ELISA kit for quantitatively detecting florfenicol in eggs and preparation method thereof ) 是由 武玉香 李建林 于 2019-09-04 设计创作，主要内容包括：本发明实施例公开了一种定量检测鸡蛋中氟苯尼考的嵌合ELISA试剂盒,所述ELISA试剂盒包括氟苯尼考单克隆抗体、氟苯尼考偶联抗原、基准液、酶标物、包被所述氟苯尼考偶联抗原的酶标板,以及用于ELISA实验的显色液、终止液和稀释液；所述基准液用于作为空白对照组的溶液；测定待测样品时,同时检测空白对照组和待测样品组的OD值,通过所述OD值计算得到所述待测样品的浓度。本发明实施例提供的定量检测鸡蛋中氟苯尼考残留的检测试剂盒,其操作简便,可批量快速准确检测,且成本低、稳定性好,需要的技术含量不高。(The embodiment of the invention discloses a chimeric ELISA kit for quantitatively detecting florfenicol in eggs, which comprises a florfenicol monoclonal antibody, a florfenicol coupled antigen, a reference solution, an enzyme label plate coating the florfenicol coupled antigen, and a color development solution, a stop solution and a diluent for an ELISA experiment; the reference solution is used as a solution of a blank control group; and when the sample to be detected is detected, detecting the OD values of the blank control group and the sample group to be detected at the same time, and calculating the concentration of the sample to be detected through the OD values. The detection kit for quantitatively detecting florfenicol residues in eggs, provided by the embodiment of the invention, is simple and convenient to operate, can be used for rapidly and accurately detecting in batches, and is low in cost, good in stability and low in required technical content.)

一种定量检测鸡蛋中氟苯尼考的嵌合ELISA试剂盒及其制备 方法

技术领域

本发明实施例涉及生物检测技术领域，具体涉及一种定量检测鸡蛋中氟苯尼考的嵌合ELISA试剂盒及其制备方法。

背景技术

氟苯尼考是酰胺醇类第3代动物专用抗菌药，其具有广谱、高效、吸收好、体内分布广、无致再生障碍性贫血作用等特点，作为氯霉素的替代药物被广泛用于治疗畜禽的细菌性疾病。氟苯尼考具有胚胎毒性和耐药性，在畜禽生产上的大量应用也导致其在畜禽产品中残留，危害人体的健康。目前，针对氟苯尼考检测的试剂盒，往往需要一套系列标准品，这样不仅增加了工作量，而且为了标准曲线线性复合，对操作要求极高；系列标准品的使得一盒96T规格的试剂盒，所需检测的样本数量多，试剂盒的操作复杂，检测结果的稳定性差，检测精密度差，检测所需的时间长。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种定量检测鸡蛋中氟苯尼考的嵌合ELISA试剂盒及其制备方法，以解决现有技术中试剂盒操作麻烦，检测结果稳定性差的问题。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种定量检测鸡蛋中氟苯尼考的嵌合ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括氟苯尼考单克隆抗体、氟苯尼考偶联抗原、基准液、酶标物、包被所述氟苯尼考偶联抗原的酶标板，以及用于ELISA实验的显色液、终止液和稀释液；所述基准液用于作为空白对照组的溶液；

测定待测样品时，同时检测加入基准液的空白对照组和待测样品组的OD值，通过所述OD值计算得到所述待测样品的浓度。

优选的，所述基准液为硼酸、氢氧化钠、色氨酸和乙二胺四乙酸的水溶液。

优选的，所述单克隆抗体是通过氟苯尼考FF3C11细胞株制备得到的，所述氟苯尼考FF3C11细胞株已于2019年7月4日保藏于位于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CTCC NO：C2019152。

本发明实施例还包括：储存有预先建立的用于计算待测样本中氟苯尼考含量的标准曲线的数据处理装置。

优选的，所述标准曲线建立包括：利用标准品稀释液配成不同质量浓度的氟苯尼考标准品溶液，用缓冲液稀释的氟苯尼考抗体，用缓冲液稀释的所述酶标物，进行间接ELISA测定，计算各浓度氟苯尼考的结合率，并以氟苯尼考的结合率为纵坐标、氟苯尼考浓度为横坐标，建立IC₅₀最低的氟苯尼考抑制标准曲线。

优选的，所述酶标液为羊抗鼠IgG-HRP溶液。

本发明实施例还提供一种制备所述的定量检测鸡蛋中氟苯尼考的嵌合ELISA试剂盒的方法，其特征在于包括制备基准液，制备氟苯尼考单克隆抗体，配制用于ELISA实验的显色液、终止液和稀释液以及将所述氟苯尼考偶联抗原包被在酶标板上的过程。

优选的，所述基准液为硼酸、氢氧化钠、色氨酸和乙二胺四乙酸的水溶液。

优选的，所述单克隆抗体是通过氟苯尼考FF3C11细胞株制备得到的，所述氟苯尼考FF3C11细胞株已于2019年7月4日保藏于位于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CTCC NO：C2019152。

本发明实施例还包括：预先建立用于计算待测样本中氟苯尼考含量的标准曲线，其建立过程为：利用标准品稀释液配成不同质量浓度的氟苯尼考标准品溶液，用缓冲液稀释的氟苯尼考抗体，用缓冲液稀释的所述酶标物，进行间接ELISA测定，计算各浓度氟苯尼考的结合率，并以氟苯尼考的结合率为纵坐标、氟苯尼考浓度为横坐标，建立IC₅₀最低的氟苯尼考抑制标准曲线。

本发明实施例具有如下优点：

本发明实施例提供的定量检测鸡蛋中氟苯尼考残留的检测试剂盒，其操作简便，可批量快速准确检测，且成本低、稳定性好，需要的技术含量不高，本发明的试剂盒，操作人员无需接触标准品，避免了标准品对操作人员的伤害，本发明实施例的ELISA试剂盒，一盒96T规格的试剂盒，实际测试样本的数量远远大于90个，同时可以定量检测鸡蛋中氟苯尼考含量，减少了检验样本所需要的处理时间和数据分析时间，大大节约了检测时间和工作量，降低了检测成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明实施例提供的SPG单克隆抗体纯化纯度鉴定图；

图2为本发明实施例提供的嵌合ELISA试剂盒利用预建立的标准曲线的计算的软件主界面图；

图3为本发明实施例提供的嵌合ELISA试剂盒预建立的标准曲线图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施1、氟苯尼考单克隆抗体的制备

1、细胞复苏

将杂交瘤细胞株3C11从液氮罐内快速取出后，该氟苯尼考FF3C11细胞株已于2019年7月4日保藏于位于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CTCC NO：C2019152。迅速放至37℃水中融化，完全融化后1000转离心3分钟，酒精擦拭消毒放置无菌工作台操作，弃上清，用600ul HT培养基悬浮管内细胞，转至24孔培养板中，放至37℃CO₂培养箱中培养。

2、腹水制备

氟苯尼考单克隆抗体的制备采用动物体内腹水诱生法，按照0.5ml矿物油/只小鼠的用量制敏，制敏后7至10天将至80％满时的细胞打入小小鼠腹腔，按照100万/只的数量注入，稀释液为无菌生理盐水，7至10天取腹水。

氟苯尼考单克隆抗体的纯化：采用SPG柱法对腹水进行纯化，按常规操作，将2批次纯化的氟苯尼考单克隆抗体进行抗体纯度鉴定如图1所示，泳道1为批次2016FF23，泳道2为批次2016FF21，SDS-PAGE电泳观察到25KD和55KD的清晰条带，分别是抗体的轻链和重连，并无杂带，表明两个批次抗体纯度均达到95％以上。

实施例2、定量检测氟苯尼考的嵌合ELISA试剂盒及其制备方法

1.酶标板的制备

1.1包被：将包被偶联氟苯尼考抗原(FF-BSA，货号LD-007；山东绿都生物科技有限公司)用包被缓冲液稀释，FF-BSA按照1：30000稀释，每孔取100μL加入酶标板，盖好盖板膜，置4℃静置20h。

1.2洗板：包被后要进行两次洗涤，用蒸馏水，250微升/孔，洗涤完毕后，应在毛巾上拍干残余液体，并及时进行下一步封闭。

1.3封闭：封闭液应提前一小时取出初步回温，用前摇匀，每孔取180μL加入酶标板，盖好盖板膜，37℃封闭1.5h，酶标板之间的间距应保持一致(一般为5cm)。

1.4烘干装袋：封闭完后，摔倒孔内液体，并在毛巾上拍干，后采取烘方式彻底干燥酶标板，37℃倒置，不加盖板膜或用自封袋，烘干30min。酶标板干燥后，应及时装入自封袋，按照每块酶标板板1袋干燥剂的量装入，放入本成品库冷藏保存备用。

2.嵌合ELISA试剂盒的制备

2.1氟苯尼考嵌合ELISA标准曲线的建立

用方阵法筛选氟苯尼考抗原以及氟苯尼考抗体的工作浓度，以OD₄₅₀最接近2.0、P/N比最大时的氟苯尼考抗原包被浓度、氟苯尼考单克隆抗体稀释倍数为进行FF间接竞争ELISA时检测抗原的包被浓度、氟苯尼考单克隆抗体工作浓度。

确定的最佳条件为：偶联氟苯尼考抗原FF-BSA最佳包被浓度为1：30000，氟苯尼考单克隆抗体工作浓度为1：100000，酶标物羊抗鼠IgG-HRP工作浓度为l：5000。

将氟苯尼考抗原标准品用不同的标准品稀释液配成不同质量浓度(0、0.03、0.09、0.27、0.81μg/mL)，将氟苯尼考单克隆抗体用不同的缓冲液A1、A2、A3稀释成1：100000，将酶标二抗用不同的缓冲液E1、E2、E3，在选定的最佳工作浓度和最佳反应条件下进行间接ELISA测定，计算各浓度氟苯尼考抗原的结合率(％)，并以结合率为纵坐标、氟苯尼考抗原浓度为横坐标，绘制IC₅₀最低的FF抑制标准曲线，如图3所示，回归方程线性R：0.9921，曲线：y＝-2.2155x-0.9161，将回归方程嵌合在数据分析软件中，即数据处理装置中，即通过输入B₀进行数据处理。结合率(％)＝B/B₀×100％，其中，B₀为不加氟苯尼考的OD₄₅₀值，B为加氟苯尼考的OD₄₅₀值。

本发明实施例中，将预先建立的标准曲线录入分析软件，通过基准液的校准使得数据分析软件分析不同OD值下的含量趋于准确和精确，计算时，只需要选择项目，输入OD值、输入基准液和稀释倍数，即可得到氟苯尼考的含量。

2.2配制用于ELISA实验的溶液：包被液、封闭液、洗涤液、抗体稀释液A2、酶标物稀释液E1、底物液、终止液、样品稀释液。各种配制溶液配方如下：①包被液，0.01MPBS,0.5L：1.2g磷酸二氢钾；1g氯化钾；14.5g磷酸氢二钠.12g水；4.5g氯化钠；0.5L蒸馏水。

②封闭液，0.5L：1.2g磷酸二氢钾；1g氯化钾；14.5g磷酸氢二钠.12水；4.5g氯化钠；20g牛血清白蛋白；0.5L蒸馏水；1.5g防腐剂。

③10X洗涤液，0.5L：1.2g磷酸二氢钾；1g氯化钾；14.5g磷酸氢二钠.12水；0.5L蒸馏水；50μL吐温20；

④抗体工作液A2，0.5L；1.2g磷酸二氢钠；18g磷酸氢二钠.12水；4.5g氯化钠；3.6g懒氨酸；10g酪蛋白；0.5L蒸馏水；1.5g防腐剂；5μL FF单克隆抗体；

⑤酶标物工作液E1，0.5L；；1.2g磷酸二氢钠；18g磷酸氢二钠.12水；4.5g氯化钠；1.5g懒氨酸；30g酪蛋白；0.5L蒸馏水；1.5g防腐剂；100μL HRP-羊抗鼠二抗

⑥底物液A，0.5L：1.2g磷酸二氢钠；18g磷酸氢二钠.12水；20g过氧化物脲；0.5L蒸馏水；

⑥底物液B，0.5L；1.9g磷酸二氢钠；5g磷酸氢二钠.12水；5g 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺；2.8g懒氨酸；0.5L蒸馏水。

⑦终止液，10ml浓硫酸缓慢加到500ml蒸馏水，切记添加顺序是硫酸加到水。

3.待测样本的前处理方法

3.1称取打碎的全鸡蛋2.0g±0.05g至50mL离心管中，加入2mL蒸馏水和3mL样品稀释液，震荡提取1min；4000rpm离心5min；小心取出0.5mL上清液至另一离心管，加入1mL样品稀释液复溶，混匀，取50μL用于分析。

3.2.溶液配制

①样品稀释液：0.5g磷酸二氢钠；7.7g磷酸氢二钠.12水；2.5g氯化钠；3g懒氨酸；6.2g乙二胺四乙酸(EDTA)；0.5L蒸馏水；

②基准液：0.7g硼酸；2g氢氧化钠；0.6g色氨酸；2.0g乙二胺四乙酸(EDTA)；0.5L蒸馏水。

3.4添加回收测定

分别在鸡蛋中添加氟苯尼考5μg/kg、20μg/kg、100μg/kg，对同一试样进行3次平行试验测定。计算平均值、回收率及变异系数，变异系数＝标准差/平均值，由此验证试剂盒的准确度和精密度，如表1所示，氟苯尼考添加回收测定，可知回收率均在80％～93％，变异系数均小于5％。

表1

4.嵌合ELISA试剂盒测定氟苯尼考的方法

1、从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室温20-25℃环境中，平衡30min以上，每种溶液试剂使用前均须摇匀。

2、取出包被的酶标板并保存于2-8℃。

3、确定待测样本微孔和基准液加入微孔，每个待测样本和每个基准液均平行做2孔，并标记加入基准液微孔和待测样本液孔。

4、分别对应加入基准液和待测样本各50μl/孔，加入酶标物50μl/孔，再加入抗体工作液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置，37℃避光环境中反应20min。

5、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μl/孔，充分洗涤3次，每次间隔10秒，用吸水纸拍干。

6、加入底物液A液50μl/孔，再加B液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中避光反应10min。

7、加入终止液50μl/孔，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。

8、定量分析：使用嵌合试剂盒配套数据分析软件中预建立的标准曲线进行计算，如图2所示，输入待测样本微孔及基准液微孔的OD值，以及基准液和稀释倍数，即可得到待测样本中氟苯尼考的浓度值。

实施例3、嵌合ELISA试剂盒的准确度与精密度

GB/T 20756-2006可食动物肌肉、肝脏、和水产品中氟苯尼考残留量的测定-液相色谱-串联质谱法

按照以上国标方法与本发明实施例的嵌合ELISA检测试剂盒方法分别对20份鸡蛋进行测定，平行测定3次，比较测定结果平均值，验证嵌合ELISA检测试剂盒的准确性和可靠性。国标测定与嵌合ELISA检测加过进行T检验，

为本嵌合ELISA检测的平均质量分数，μ为GB/T20756-2006对同一样本检测的质量分数，s为标准偏差。t＝0.924，t<t0.05(1.725)，说明2种方法对样品的检测结果无显著差异。表明该嵌合ELISA与GB/T 20756-2006测定结果的符合率为95％以上。如表2所示，与国际(GB/T20756-2006)仪器测定方法比较(μg/kg)

表2

注：“ND”表示未检出

实施例4、嵌合ELISA试剂盒的稳定性

将试剂盒放置于37℃和4℃，观察试剂盒的稳定性，37℃保存一天相当于4保存1个半月，一般认为OD值低于1.0时试剂盒性能已经严重下降到不可应用的程度，37℃加速破坏性实验与4℃保存实验，如表3所示，嵌合ELISA的稳定性试验，本发明实施例的试剂盒在4℃下的保质期为至少24个月。

表3

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。