阅读说明：本技术 一种快速分离免疫磁珠的方法 (method for quickly separating immunomagnetic beads ) 是由 姜宇腾 于 2019-08-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了快速分离免疫磁珠的方法,可应用于化学发光仪和核酸提取仪。是将包被抗体/抗原的免疫磁珠和标记物标记的抗体/抗原以及待测物在反应杯中孵育；反应结束后,加入小型永小型永磁体吸附免疫磁珠,使抗原-抗体-磁珠免疫复合物从反应液中分离；清洗液清洗后加入发光底物/激发系统促使反应杯内发光物质释放光子,进行光子计数检测发光强度。本发明将小型永磁体置入反应液内,使永小型永磁体和反应液中的免疫磁珠直接接触,在极短时间(3-15s)内实现快速分离。分离速度快,效率高,免疫磁珠流失率大幅度降低,并且大大简化了仪器设计过程中磁分离模块的结构,缩短了免疫磁珠从反应液中分离和清洗的时间。(the invention discloses a method for quickly separating immunomagnetic beads, which can be applied to a chemiluminescence apparatus and a nucleic acid extraction apparatus. Incubating immune magnetic beads coated with antibody/antigen, antibody/antigen marked by a marker and a substance to be detected in a reaction cup; after the reaction is finished, adding a small permanent magnet to adsorb the immunomagnetic beads, and separating the antigen-antibody-magnetic bead immune compound from the reaction solution; after cleaning, adding a luminescent substrate/excitation system to promote the luminescent substance in the reaction cup to release photons, and carrying out photon counting to detect the luminous intensity. The invention puts the small permanent magnet into the reaction liquid, so that the permanent small permanent magnet is directly contacted with the immunomagnetic beads in the reaction liquid, and the rapid separation is realized in a very short time (3-15 s). The separation speed is fast, the efficiency is high, the loss rate of the immunomagnetic beads is greatly reduced, the structure of a magnetic separation module in the design process of an instrument is greatly simplified, and the time for separating and cleaning the immunomagnetic beads from reaction liquid is shortened.)

一种快速分离免疫磁珠的方法

技术领域

本发明涉及一种快速分离免疫磁珠的方法，由小型永磁体在反应杯外部变为反应杯内部，属于免疫学检测领域。

背景技术

免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验方法。随着学科间的相互渗透，免疫学涉及的范围不断扩大，新的免疫学检测方法层出不穷。免疫学方法的应用范围亦在日益扩大，不仅成为多种临床疾病诊断的重要方法，也为众多学科的研究提供了方便。

化学发光是体外诊断行业最重要的细分之一，其在免疫学检验方面的应用日益受到人们的重视，该法具有高灵敏度、宽线性、反应快速，影响因素少，结果准确等优点，各种化学发光的标记物如下：直接化学发光，标记物为吖啶酯(雅培)或者ABEI(新产业)；酶促化学发光，标记物为碱性磷酸酶(厦门波生)或者辣根过氧化物酶(强生)；电化学发光，标记物为三联吡啶钌(罗氏)。

基于磁性颗粒的化学发光技术是免疫诊断中更为先进的检测技术，也是目前化学发光免疫检测的主流。免疫磁性微球可以简单快速地从血液或者骨髓中富集、清除癌细胞，广泛地应用于疾病检测、癌症治疗和自身骨髓移植中，还被用于从母体外周血中分离胎儿细胞进行无创性产前诊断。免疫磁珠分离技术用在微生物检测方面能准确快速地检测出样品中的Coli O 157，这对于食品卫生和预防疾病的传播具有重要的意义。磁珠内部含有人工合成的磁核，可被磁铁磁力所吸引；外部接枝功能基团，可结合活性蛋白质(抗体)，作为固相载体。当磁珠上的抗体与相应的微生物或特异性抗原物质结合后，则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，这种复合物具有较高的磁响应性，在磁铁磁力的作用下定向移动，使复合物与其他物质分离，而达到分离、浓缩、纯化微生物或特异性抗原物质的目的。图1是传统磁分离装置结构示意图；其磁分离装置是一个机械臂固定小型永磁体，在反应杯内反应液孵育时，远离反应杯；孵育结束后，机械臂移动小型永磁体至反应杯侧面，将抗原-抗体-磁珠免疫复合物从反应液中分离。图5是公开号为CN105758848 A，名称为应用于化学发光测定的温育磁分离装置的机械臂-磁铁装置；图6是公开号为CN208019096 U，名称为一种用于发光免疫磁分离清洗装置的机械臂-磁铁装置。总之，永磁铁或者电磁铁在发光管或者酶标板外侧运作。我们知道，对同一种磁微粒进行磁分离，磁场强度越强，分离越快，用时越短。根据如下电磁场强度公式，

磁场强度与磁铁磁性成正比，与磁路长度成反比。由于磁铁与反应杯侧面接触，与反应液中的磁微粒最短距离是隔着反应杯壁，最长距离是反应杯壁厚度加内径，平均磁路长度较大，导致反应杯整体磁场强度较弱，磁分离用时约3min。目前所使用的强力永磁体充磁量基本达到上限，若继续增加磁力，其技术难度和成本均大大增加（即相当于公式中N*I基本趋于定值）。因此在磁力不变的情况下，有效缩短磁路长度，是实现快速磁分离的有效手段。磁分离后，除去反应液，加入清洗液清洗，反复清洗5次。由于抗原-抗体-磁珠免疫复合物被磁铁吸附的不够牢固，每次加入清洗液过程中，会将复合物冲散一部分，避免抗原-抗体-磁珠免疫复合物损失，除去洗液前，要继续磁分离1min以上，这样整个检测过程（反应孵育+注液+磁分离+洗液）用时至少10min以上。当然这对传统的常规测试速度（20-40分钟）的化学发光检测方式影响不是太大，但是对快速化学发光（3-7min）严重影响了其测试速度。因此，要想尽快获得检测结果，缩短抗原-抗体-磁珠免疫复合物的磁分离时间和清洗时间是其中的关键。

发明内容

目前化学发光仪器所采用的磁分离方法主要是将永磁铁/电磁铁置于反应杯外侧，属于非接触磁分离，由于磁铁与反应液的距离相对较大，再加上反应杯壁的厚度，导致磁性微粒磁分离时间较长、且分离效果较差。为了克服目前化学发光仪的缺点，本发明提供了一种快速分离免疫磁珠的方法，由磁铁装置在反应杯外部改变为将小型永磁体置于反应杯内部，分离速度快，效率高，缩短了反应液磁分离和清洗的时间，有助于临床的快速判断，简化了仪器设计过程中磁分离模块的结构。

为了实现上述发明目的，本申请采用了以下技术方案：

一种快速分离免疫磁珠的方法，步骤如下：

（1）、反应杯内加入免疫磁珠、标记抗原/抗体和待测物，进行孵育，获得抗原-抗体-磁珠免疫复合物；

所述反应杯可以是单个或者连在一起的发光管和酶标板，以及其他相似的反应容器；

小型永磁体是根据反应杯大小选择，直径0.05-10mm；

小型永磁体是裸露的小型永磁体，也可以是表面包覆一层保护层的小型永磁体；

保护层可以是聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、尼龙塑料、ABS塑料等聚合物包覆层，可以是特氟龙、陶瓷、油漆等涂层，可以是铜、银、金、铂等镀层，以及其他类似的保护层物质。

小型永磁体形状不限，可以是球形、橄榄球形、柱状体、锥形体、星状体、芒状体、簇状体、规则和不规则多面体等。

磁铁种类不限，可以是永久性磁铁，可以是钐钴小型永磁体、钕铁硼磁铁(强力磁铁)、铁氧体磁铁、铝镍钴磁铁、铁铬钴磁铁。

所述抗原/抗体可以是动物源、人源、基因重组表达的完全和部分抗原/抗体；

标记抗体的标记物可以是生物素、同位素、酶、发光物质和荧光物质的一种；

例如：标记同位素是³H、¹⁸O、⁴²K、¹³¹I、³⁵S、³²P、¹⁵N等。

例如：标记荧光物质是FITC、稀土元素配合物、CY系列和Alexa系列荧光类蛋白染料的一种或者几种。

例如：标记生物酶是辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等；

（2）、反应结束后，在反应杯内部加入永小型永磁体，将原先分散在反应液中的结合样本和标记抗原/抗体的免疫磁珠（抗原-抗体-磁珠免疫复合物）在反应液中聚集；

（3）、经清洗液清洗，分离，加入发光底物溶液或者激发物溶液使反应杯内的发光物质释放光子，化学发光仪测定光子量，记录发光值，获得标准曲线，根据标准曲线，获得样品的含量。

所述的发光底物溶液为AMPPD-增强剂或者CSPD-增强剂（碱性磷酸酶），鲁米诺-H2O2-增强剂溶液（辣根过氧化物酶）；

所述的激发物溶液可以是硝酸-H₂O₂/NaOH-表面活性剂，二丁基乙醇胺溶液；

本发明将小型永磁体放置在充分反应后的反应杯内部的反应液内，小型永磁体和反应液直接接触，在磁力作用下，磁微粒小型永磁体结合，两者的最大距离为反应杯内径的一半，平均磁路长度小，反应杯内整体磁场很强，完全磁分离用时仅为3-10s。由于小型永磁体与抗原-抗体-磁珠免疫复合物结合牢固，加或者弃去洗液时不会冲散复合物，加完洗液无需磁分离时间，可立即除去清洗液，大大缩短了清洗时间，整个检测过程（孵育+磁分离+清洗）用时在3-5min以内。

本发明的直接接触式快速磁分离方法，适用于管式化学发光仪、板式化学发光仪、核酸提取仪等仪器平台。传统的外置磁铁磁分离方法对仪器的磁分离模块要求比较高，不但需要设置机械臂控制磁铁运行轨迹，还需配套软件程序，结构复杂，成本较高。而本发明内置磁铁磁分离方法，只需在反应杯孵育反应结束后，在反应液里加入一颗或多颗小型永磁体即可实现分离，大大简化仪器结构，使化学发光仪简单化和微型化，降低仪器故障，提高测试结果可靠性和准确性，大大缩短了检测时间，使实验报告结果即时化成为了可能，对医院临床医生对患者的快速诊断和治疗具有巨大的意义。

综上所述，相对于现有技术，本发明具有以下优点：

（1）本发明改变了免疫磁珠分离时磁体设置方式，由磁体在反应杯外部变为反应杯内部，由非接触磁分离方式变为直接接触式磁分离；即本发明将小型永磁体直接放入发光管或者反应杯中，由于反应液各位置与磁铁的距离明显缩短，免疫磁珠从反应液中完全分离开的时间大大缩短，最快可达到15s以内，缩短了实验的磁分离和清洗时间，而且在清洗、弃去清洗液的过程，避免了磁微粒被打散后重新聚集的过程，能更快的得到诊断结果，大大有助于临床的快速判断，使疾病得到尽早诊断和更好治疗。

（2）将小型永磁体直接放入反应杯内部，可省去化学发光仪器的磁分离构件，简化硬件和软件，降低仪器的故障率，提高检测的准确度和可靠度，有助于实现仪器小型化和自动化，降低仪器成本。

（3）、用本发明制备的化学发光仪及其配套诊断试剂盒，用于临床检验最快仅需4-6分钟即可测出第一个样本结果，测试速度和样本通量大大提高，实现在患者身边快速取得诊断结果，使疾病得到尽早诊断和更好治疗。

（4）本发明适用于双抗体夹心法、双抗原夹心法、竞争法、间接法等实验方法，可用于核酸提取，环境监测，生物分析，药物筛选等方面。

附图说明

图1是传统磁分离装置结构示意图；其中：1-发光管、2-磁铁；

图2是图1的俯视图；

图3是本发明磁分离装置结构示意图；

图4是图3的俯视图；3-永久磁珠；

图5是公开号为CN105758848 A传统磁分离装置示意图，方框内部分为机械臂-磁铁装置；

图6是公开号为CN208019096 U传统磁分离装置示意图，方框内部分为机械臂-磁铁装置；

图7是实施例1中吖啶酯双抗夹心法化学发光测试结果；

图8是实施例2中碱性磷酸酶竞争法化学发光测试结果。

具体实施方式

下面的实施例有助于本领域技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

因现有永久磁铁制备工艺已经相当成熟，本发明所采用的小型永磁体可以根据所需要的尺寸以及所需磁力大小进行定制，磁铁成分和试剂盒中磁微粒（即免疫磁珠）的磁性成分一致，在使用前均已清洁消毒不带抗原，不用担心小型永磁体内置所带来的污染问题，在检测之后，无需回收重复实验，与酶标板或者发光管等作为实验器材易耗品一并摒弃。

实施例1

吖啶酯双单抗夹心化学发光法检测，采用的材料是：（1）包被配对单抗1的免疫磁珠悬液，（2）吖啶酯标记的配对单抗2溶液，（3）球形小型永磁体，（4）激发物溶液。

详述如下：

（1）将30微升待测血清样品(或抗原标准品0.01-100.00ng/ml)、100微升包被抗体1的免疫磁珠悬液、200微升吖啶酯标记单抗2溶液加入反应杯中，37℃孵育3min；

（2）将直径3mm的小型永磁体加入反应管中进行磁分离10s，抽走反应液，用清洗液清洗磁微粒5次；

（3）加入激发物溶液（先加入100微升 0.1 mol/L HNO₃+0.1％H₂O₂溶液，再加入100微升0.15mol/L NaOH+表面活性剂溶液），进行发光反应，最后记录发光值，获得标准曲线如图3所示，根据标准曲线算出样品含量。

该方法用时较短，5-7min内出结果，灵敏度经测定(Bo+2SD)为0.03ng/ml，检测范围0.01-100.00ng/ml（图7）。批内CV％平均值为2.3％，批间CV％平均值为4.2％，平均回收率为99.8％。

实施例2

碱性磷酸酶竞争性化学发光法检测，采用的材料是：（1）包被与抗原特异性反应单抗的免疫磁珠悬液，（2）碱性磷酸酶标记的抗原溶液，（3）球形小型永磁体，（4）发光底物溶液。

详述如下：

（1）将30微升待测血清样品(或抗原标准品0.01-100.00ng/ml)、100微升包被抗体的免疫磁珠悬液、200微升碱性磷酸酶标记的抗原溶液加入反应杯中，37℃孵育3min；

（2）将直径3mm的小型永磁体加入反应管中进行磁分离10s，抽走反应液，用清洗液清洗磁微粒5次；

（3）加入发光底物溶液（AMPPD-增强剂溶液）150微升，进行发光反应，最后记录发光值，根据标准曲线由微机软件算出样品含量。

本方法用时较短，10-15min即可出结果，灵敏度测定值(B0均值-2SD)为0.08 ng/ml，检测范围0.01-100.00 ng/ml（图8），批内CV％平均值为3.8％，批间CV％平均值为4.7％，平均回收率为98.5％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。