一种用于肺癌早期筛查和诊断的联合检测血清标志物、试剂盒及检测方法
阅读说明：本技术 一种用于肺癌早期筛查和诊断的联合检测血清标志物、试剂盒及检测方法 (Combined detection serum marker, kit and detection method for early screening and diagnosis of lung cancer ) 是由 张建营 代丽萍 史健翔 王鹏 王晓 叶华 蒋迪 于 2019-09-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种用于肺癌早期筛查和诊断的联合检测血清标志物、包含该联合检测血清标志物的试剂盒以及检测方法,属于生物医学技术领域。本发明基于癌症驱动基因在肿瘤发生和发展中所起的作用,定制138个癌症驱动基因编码的154个人源重组蛋白和本实验室提供的26种人源重组蛋白的蛋白质芯片,共包含180个人源重组蛋白质,通过蛋白质芯片初步筛选出肺癌的早期检测血清标志物,再经过ELISA实验进行验证,最终筛选出可用于肺癌早期筛查和诊断的一组肺癌联合检测血清标志物,其包括TP53、NPM1、GNA11、JAK2、TSC1和PIK3CA共6种基因编码的蛋白,可辅助肺癌的临床诊断,具有灵敏度高、特异性强、成本低等优点。(the invention relates to a combined detection serum marker for early screening and diagnosis of lung cancer, a kit containing the combined detection serum marker and a detection method, and belongs to the technical field of biomedicine. Based on the functions of the cancer driver genes in tumorigenesis and development, the invention customizes 154 human-derived recombinant proteins coded by 138 cancer driver genes and a protein chip of 26 human-derived recombinant proteins provided by the laboratory, totally comprises 180 human-derived recombinant proteins, preliminarily screens out early detection serum markers of lung cancer through the protein chip, verifies through an ELISA experiment, and finally screens out a group of lung cancer combined detection serum markers which can be used for early screening and diagnosis of lung cancer, wherein the lung cancer combined detection serum markers comprise 6 gene coded proteins including TP53, NPM1, GNA11, JAK2, TSC1 and PIK3CA, can assist clinical diagnosis of lung cancer, and has the advantages of high sensitivity, strong specificity, low cost and the like.)
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种用于肺癌早期筛查和诊断的联合检测血清标志物、包含该联合检测血清标志物的试剂盒以及检测方法。。
背景技术
肺癌是中国以及全球发病率及死亡率第一的恶性肿瘤。在过去的40年间，肺癌的5年生存率仅从12％上升至16％，最主要原因是诊断时已属晚期，相反，早期诊断的肺癌进行手术后生存率可提高到80％。可见，早发现、早期诊断对肺癌的治疗及预后具有重要的临床意义。当前广泛运用的检测手段包括无创检查(如X线、CT、钼靶摄片等)和有创检查(纤维支气管镜、支气管造影、B超或CT定位下穿刺活检等)，但缺乏依从性和普及运用的可能。找寻新的肺癌分子标志物，尤其是血清分子标志物，让肺癌患者能够及时有效的早查、早诊、早治，是提高肺癌患者生存率、降低死亡率的关键科学问题。尽管目前有一些肿瘤标志物，如CA125(癌抗原125)、CA19-9(癌抗原19-9)、CEA(癌胚抗原)等可用于肺癌的辅助检测，但敏感性和特异性均不高，所以到目前为止尚没有理想的可供临床使用的肺癌早期筛查和诊断的标志物。
近年来，在人类肿瘤学的研究领域内，许多研究已经发现癌症患者血清中含有一组独特的诱发自身抗体反应的细胞蛋白，被称为肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)，其诱导产生的抗体称为抗TAA-抗体(autoantibody)。这一概念的提出对肺癌早期诊断研究指引了一个新的方向。肿瘤相关抗原(tumor-associate antigens，TAAs)的自身抗体在正常人和非肿瘤患者血清中不存在或滴度很低，而且患者血清中自身抗体水平的升高往往早于肿瘤症状的出现。再者，抗-TAA抗体具有其它肿瘤标志物不具备的优势，一方面是它能够在血清中持续稳定存在，而其它的标志物，包括TAA本身，在其被肿瘤细胞释放后就被快速降解或者在其进入血液循环后的很短时间内就被机体清除。而且，检测自身抗体的方法和试剂的普及性也有助于研究癌症患者体内抗-TAA抗体的产生规律和功能。因此，检测抗-TAAs的自身抗体可以作为早期肿瘤辅助筛查和诊断的血清标志物。目前各国学者已开展相关多项研究，值得一提的是EarlyCDT-Lung test的研究成果。EarlyCDT-Lungtest是首个通过检测血清中自身抗体以检测肺癌的工具，用以辅助内科医生的物理检查方法，从而提高肺癌诊断率。最初，该实验包括六种TAAs自身抗体(p53、NY-ESO-1、CAGE、GBU4-5、Annexin I和SOX2)的检测，检测肺癌的灵敏度和特异度分别为40％和82％。新一版的EarlyCDT-Lung test将TAAs自身抗体更新至7种(p53、NY-ESO-1、CAGE、GBU4-5、SOX2、HuD和MAGE A4)，其灵敏度和特异度也分别提高到47％和90％。有研究显示，这些自身抗体检测结果阳性的非小细胞肺癌患者中超过一半(57％)为I期和II期的早期肺癌，提示EarlyCDT-Lung test可作为辅助CT早期检测肺癌的生物学标志物检查工具。这些研究成果提示肿瘤相关抗原抗体的检测将有望成为肺癌早期检测的重要血清学生物标志物。但值得注意的是，EarlyCDT-Lung test虽然具有较高的特异度和阳性预测值，但灵敏度仍然不够理想(不到50％)，漏诊的病例较多，导致大量患者未能被及时发现，而错失手术治疗的良机。鉴于目前自身抗体检测在肺癌诊断的临床应用中仍有不足，不断地发现和鉴定新的肺癌相关TAAs仍是一项重要的工作。
十余年来的后续研究一直试图寻找诊断肺癌更加敏感特异的抗TAA自身抗体，优化诊断肺癌的组合。寻找有价值的TAA自身抗体，常用的方法有两种：一是重组cDNA表达文库血清学筛选(serological analysis of recombinant cDNA expression libraries，SEREX)；另一种是蛋白质组学技术。与SEREX相比，蛋白组学技术能够对多个肿瘤血清进行筛选，并且能够筛选出具有翻译后修饰的TAA。在肿瘤的发生发展过程中，涉及到几十万个基因的突变，但仅有某些关键基因突变才可引起肿瘤的发生发展，这些关键基因被称为癌症驱动基因。研究认为不同类型的肿瘤发生时，一般都包含2-8个驱动基因，正是因为这些基因的突变才可导致肿瘤的优势生长，这些基因可以通过调节细胞周期、细胞生存和基因组维持3个细胞核心过程，被分为12个信号通路。目前在多种肿瘤的全基因组测序研究中共发现138个癌症驱动基因(参见Vogelstein B.Science.(2013)339(6127):1546-1558)，包括74个抑癌基因和64个癌症基因。这些基于癌症驱动基因编码的蛋白亦可诱发机体在其循环血液中产生相应的自身抗体，通过对癌症驱动基因编码蛋白及其诱发的血清中的自身抗体的研究可在一定程度上揭示肿瘤的发生发展或预后等。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于肺癌早期筛查和诊断的联合检测血清标志物，辅助肺癌的临床诊断。
同时，本发明还提供一种包含上述联合检测血清标志物的试剂盒。
最后，本发明提供一种灵敏度高、特异性强、成本低且可辅助肺癌临床诊断的检测方法。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种用于肺癌早期筛查和诊断的联合检测血清标志物，包括TP53、NPM1、GNA11、JAK2、TSC1和PIK3CA基因编码的蛋白。
进一步的，所述联合检测血清标志物由TP53、NPM1、GNA11、JAK2、TSC1和PIK3CA共6种基因编码的蛋白组成。
所述TP53基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
所述NPM1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
所述GNA11基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
所述JAK2基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。
所述TSC1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。
所述PIK3CA基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。
一种用于肺癌早期筛查和诊断的试剂盒，包含上述联合检测血清标志物。具体包括TP53、NPM1、GNA11、JAK2、TSC1和PIK3CA基因编码的蛋白。
进一步的，所述联合检测血清标志物由TP53、NPM1、GNA11、JAK2、TSC1和PIK3CA共6种基因编码的蛋白组成。
更进一步的，上述联合检测血清标志物包被于固相载体上。
所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素等。
所述固相载体的存在形式为凹孔平板、试管、球粒等。
进一步的，所述试剂盒还包括阳性对照血清、阴性对照血清、封闭液、样本稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。上述试剂在实际应用中可根据需要进行选择。
1)对上述联合检测血清标志物分别进行包被，封闭后清洗；
2)与待检测血清进行一抗孵育，清洗，再进行二抗孵育，再清洗；
3)显色系统显色后终止反应，测定吸光度值；
4)以OD450-OD620为相对OD值，然后扣去空白对照，将各个指标(即血清标志物)的吸光度值代入以下公式，计算预测概率P值大小；
P＝1/(1+Exp(-(-9.161+42.136×ODTP53-12.510×ODNPM1+15.889×ODGNA11+17.433×ODJAK2+34.955×ODTSC1-56.240×ODPIK3CA)))；
式中ODTP53、ODNPM1、ODGNA11、ODJAK2、ODTSC1、ODPIK3CA分别为各个指标的相对OD值减去空白对照后的吸光度值；
当P值≥0.5时，初步判定为疑似肺癌样品；
当P值＜0.5时，初步判定为正常样品。
所述二抗孵育中使用的二抗为HRP标记的鼠抗人IgG。
本发明的有益效果：
本发明基于癌症驱动基因在肿瘤发生和发展中所起的作用，定制138个癌症驱动基因编码的人类蛋白质芯片，共包含180个人源重组蛋白质，用以筛选潜在的可用于诊断或其他表征癌症的标志物。本发明先通过蛋白质芯片初步筛选出肺癌的早期检测血清标志物，再经过ELISA实验进行验证，最终筛选出可用于肺癌早期筛查和诊断的一组肺癌联合检测血清标志物，其包括TP53、NPM1、GNA11、JAK2、TSC1和PIK3CA共6种基因编码的蛋白，可辅助肺癌的临床诊断，具有较好的参考价值。
本发明中包含上述6种血清蛋白标志物的试剂盒可用于肺癌的早期筛查和诊断，其检测方法具有灵敏度高、特异性强、成本低等特点，且操作简单、快捷，可为肺癌的早期诊断提供依据。
附图说明
图1为实验例中基于focused array人蛋白质芯片检测原理图；
图2为实验例中蛋白质芯片筛选出的12个TAA单独诊断肺癌ROC曲线分析图；
图3为实验例中蛋白质芯片筛选出的12个TAA的SNR值散点图；
图4为实验例中间接ELISA检测原理图；
图5为实验例中ELISA验证12个TAA单独诊断肺癌ROC曲线分析图；
图6为实验例中ELISA验证12个TAA的OD值散点分布图；
图7为实验例中ELISA验证6个TAAs联合诊断肺癌在训练集数据中的ROC曲线图；
图8为实验例中ELISA验证6个TAAs联合诊断肺癌在验证集数据中的ROC曲线图。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。除特殊说明外，以下实施例及实验例中所用设备和试剂均从商业途径获得。
实验例
1 血清样本的准备
1.1用于进行蛋白芯片实验的血清样本
收集在北京佑安医院和郑州大学第一附属医院原发性肺癌病人(肺癌经病理诊断)，病人同意以及机构审查委员会和医院伦理委员会批准。所有标本均用红头采血管采集研究对象全血5-10mL，在室温放置2小时后，1000g离心15分钟，取上清液，每个样本分装若干份贴好标签于-80℃低温冰箱保存，避免反复冻融。
根据流行病学分析，最终收集100例原发性肺癌血清以及同时期体检的50例佑安医院正常对照血清进行初步芯片筛选。100例原发性肺癌患者中，共有男性66(66％)例，女性34(34％)例，平均年龄为61±11岁，年龄范围为26-85岁；50例正常血清中，有男性23(46.0％)例，女性27(54.0％)例，平均年龄为40±13，年龄范围为20-71岁。所有肺癌患者血清都是在患者最初诊断为肺癌尚未接受任何放化疗及手术治疗时收集的。正常人血清来自参加年度健康体检，无任何恶性肿瘤症状的体检人群。
1.2用于进行ELISA实验验证的血清样本
(1)收集自北京佑安医院和郑州大学第一附属医院的血清样本(详见上述1.1部分)。
(2)来自郑州大学第一附属医院检验科(155例原发性肺癌)和郑州市金水区心血管调查项目(155例正常人)，155例原发性肺癌患者中，共有男性116例(74.84％)，女性39例(25.16％)，平均年龄为61±10岁，年龄范围为30-83岁；155例正常血清中，有男性116例(74.84％)，女性39例(25.16％)，平均年龄为60±11，年龄范围为28-81岁。所有肺癌患者血清都是在患者最初诊断为肺癌尚未接受任何放化疗及手术治疗时收集的。
2 用于筛选肺癌诊断标志物的蛋白芯片定制
将138个癌症驱动基因(参见Vogelstein B.Science.(2013)339(6127):1546-1558)编码的蛋白(共180个人源重组蛋白质)固定于蛋白芯片上，用于肿瘤标志物的筛选。用于筛选肿瘤标志物的蛋白芯片为在广州博翀生物科技有限公司定制的HuProtTM人类蛋白质芯片。
3 蛋白芯片实验
实验原理参见图1。
3.1实验所需试剂：
1)封闭液：3mL 10％BSA，加入7mL 1×PBS溶液，混匀，置于冰上。
2)血清孵育液：1mL 10％BSA，加入9mL 1×PBST溶液，混匀，置于冰上。
3)清洗液：1×PBST，存放于4℃冰箱。
4)二抗孵育液：包括荧光标记抗人IgM二抗(cy5标记，呈现红色)和荧光标记抗人IgG二抗(cy3标记，呈现绿色)。
3.2蛋白芯片具体实验步骤
(a)复温：将芯片从-80℃冰箱取出，于4℃冰箱复温半小时，然后于室温复温15min。
(b)封闭：复温后的芯片，14blocks围栏固定，向每个block中加入封闭液，并放置在侧摆摇床上，室温封闭3小时。
(c)血清样本孵育：封闭完成后，倒尽封闭液体，然后迅速加入预先准备好的血清孵育液，每张芯片孵育14个样本(样本先放在4℃层析柜冻融，以1:50比例稀释)，每个血清样本的上样体积为200μL，侧摆摇床20rpm，4℃过夜孵育。
(d)清洗：将芯片及芯片夹一同取出，吸去样本，然后迅速加入等体积的PBST，如此循环数次，保证在拆除芯片夹时血清样本间无交叉污染。拆除芯片夹后，将芯片置于加有清洗液的芯片清洗盒，水平摇床，室温80rpm，清洗3次，每次10min。
(e)二抗孵育：将芯片转移到加入了3mL二抗孵育液的孵育盒中，侧摆摇床40rpm，避光，室温60min。
(f)清洗：将芯片取出(注意不能触及或划破芯片的上表面)，置于加入有清洗液的芯片清洗盒，至于水平摇床上，80rpm清洗3次，每次10min。完成后用ddH2O清洗2次，每次10min。
(g)干燥：将芯片置于芯片干燥机离心干燥。
(h)扫描：按照扫描仪的操作规范和使用说明操作。
(i)数据提取：将芯片图像和结果每个阵列整体对齐，按下自动对齐按钮，提取数据并保存。
(j)进行数据预处理。
(k)进行数据分析，首先根据AUC>0.5，P<0.05筛选，并根据Logistic回归分析获得最终的肺癌血清标志物，该蛋白质芯片实验筛选出以下血清蛋白标志物：癌症驱动基因TP53、P62、NPM1、Survivin、GNA11、HIST1H3B、SRSF2、FGFR2、PBRM1、JAK2、TSC1和PIK3CA编码的蛋白(图2为上述蛋白芯片筛选出的12个TAA单独诊断肺癌的ROC曲线分析图，图中(1)-(12)依次为TP53、P62、NPM1、Survivin、GNA11、HIST1H3B、SRSF2、FGFR2、PBRM1、JAK2、TSC1和PIK3CA编码的蛋白单独诊断肺癌的ROC曲线；图3为上述12个TAA的SNR值散点图，图中N表示Normal，即健康正常血清，LC表示lung cancer，即肺癌病例)。其中，TP53、P62、NPM1、Survivin、GNA11、HIST1H3B、SRSF2、FGFR2、PBRM1、JAK2、TSC1和PIK3CA基因编码的蛋白依次具有如SEQ ID NO.1-12所示的氨基酸序列。
4 ELISA实验验证
实验原理参见图4。
具体实验步骤如下：
a)包被：按照表1中浓度进行包被100μL/孔，4℃过夜。
b)封闭：2％BSA(索莱宝，北京，分析纯)的PBST(PBS，Tween20索莱宝，北京)溶液，200μL/孔，4℃过夜。
c)清洗：350μL/孔PBST清洗3次。
d)一抗孵育：血清与含1％BSA的PBST 1:100稀释后，100μL/孔，37℃半水浴1h。
e)清洗：350μL/孔PBST清洗5次。
f)二抗孵育：HRP标记的鼠抗人IgG(奥科，武汉)与含1％BSA的PBST 1:10000稀释后，100μL/孔，37℃半水浴1h。
g)清洗：350μL/孔PBST清洗5次。
h)显色：TMB显色系统，A液(索莱宝，北京，分析纯)与B液1:1混合后100μL/孔，室温避光，达到预期颜色(约需5-15min)。
i)终止：10％的浓硫酸50μL/孔后10min内测吸光度。
j)测吸光度：以OD450-OD620为相对OD值，然后扣去空白对照，调整IgG做归一化处理，然后进行后续数据处理(数据处理方法详见下述“5数据处理”部分b)-d)所示)。
其中，上述经蛋白芯片实验筛选出的12个TAA进行ELISA实验验证时各自的包被浓度如下表1所示，ELISA实验的96孔板排布表如下表2所示。表2中阳性质控为ELISA实验OD值较高的并经Western Blot实验验证为相应抗体阳性的血清，阴性质控为正常对照人群中ELISA实验OD值处于均值附近的且经Western Blot验证为阴性的血清，空白为血清稀释液，人IgG-1-人IgG-8为梯度稀释的人IgG抗体，浓度依次为10、20、50、100、150、200、250、300ng/ml。
表1 筛选出的12个TAA各自的包被浓度
表2 ELISA实验的96孔板排布
实验结果：采用ELISA方法对12个TAA进行检测，结果见图5和图6。图5为ELISA验证实验中12个TAA单独诊断肺癌的ROC曲线分析图，图中(1)-(12)依次为TP53、P62、NPM1、Survivin、GNA11、HIST1H3B、SRSF2、FGFR2、PBRM1、JAK2、TSC1和PIK3CA编码的蛋白单独诊断肺癌的ROC曲线；图6为ELISA验证实验中12个TAA的OD值散点分布图，图中N表示Normal，即健康正常血清，LC表示lung cancer，即肺癌病例。
从图5可以看出，单个指标诊断肺癌ROC曲线下面积为0.524-0.812，保证特异度最低90％时，灵敏度范围为19.4％-61.3％。其中GNA11的曲线下面积最大，为0.812，灵敏度达到54.8％，特异度为90.3％；JAK2的ROC曲线下面积次之，为0.811，灵敏度达60％，特异度为90.3％；P62的ROC曲线下面积最小，为0.524，灵敏度为23.9％，特异度为90.3％。从图6可以看出，12个指标OD值分布于0-1之间，中位OD值基本上均分布于0.2-0.4之间，健康对照与肺癌病例之间差异均有统计学意义。
5 数据处理
通过使用focused array人蛋白质芯片在肺癌组和NC正常对照组，通过统计学数据分析筛选出差异表达蛋白，具体方法如下：
(1)通过Focused Array蛋白质芯片实验获得芯片初筛结果。
(2)稳定性分析：在实验过程中，根据不同时间、不同芯片、不同位置，将测试样本test进行重复，用以评价不同芯片在不同时间的稳定性。
(3)数据分析及结果：剔除高背景、极端样本干扰后的样本，将IgG和IgM响应类型的各180个蛋白进行一致的统计学分析，分析逻辑如下：
a)为消除同一张芯片内不同蛋白点之间由于背景值不一致导致的信号不均一的情况，故通过背景归一化方法进行处理，实现方式为每个蛋白的前景值与背景值比值，即F/B，并此基础上定义SNR(信噪比)，即两个重复蛋白的F/B的均值，进行后续统计学分析。
b)假设需要比对的样本分别来自完全相同的两个总体，并通过F检验确定所需比对两组方差是否齐性，然后把F检验结果选择对应t检验，并且t检验结果以P-value进行表征。定义，当p-value<0.05时，拒绝原假设，即两者存在显著性差异。
c)对于任一蛋白，计算癌症组与正常组的组间的差异倍数，即fold change，用以表示两组间差异。
d)对于任一蛋白，根据所比对两组的诊断意义，首先，定义cutoff＝1.5为阳性判断阈值，即样本在蛋白上的SNR≥1.5时，该蛋白为阳性蛋白；然后，以对照组为基础，设置合适的cutoff阈值，在此cutoff阈值下计算癌症组与对照组阳性率之差，并且以最大的差值作为该蛋白在所比较的癌症组中的阳性率，用以寻找癌症组针对对照组特异的高响应蛋白，最后，定义阳性率不得低于15％。
e)基于以上逻辑，进行肺癌组(收集自北京佑安医院和郑州大学第一附属医院的100例原发性肺癌患者血清)和佑安对照组(50例佑安医院正常血清)比对，筛选出肺癌组明显高于对照组的差异蛋白作为肺癌候选标志物，最终经芯片选定了12种血清蛋白标志物(TP53、P62、NPM1、Survivin、GNA11、HIST1H3B、SRSF2、FGFR2、PBRM1、JAK2、TSC1和PIK3CA)来评价肺癌的诊断价值。
其中，TP53基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，P62基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，NPM1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，Survivin基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，GNA11基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，HIST1H3B基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，SRSF2基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，FGFR2基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，PBRM1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，JAK2基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，TSC1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，PIK3CA基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。上述12种基因的信息来源见下表3。
表3 上述12种基因的信息来源
(4)对经蛋白质芯片筛选出的12种血清蛋白标志物进行ELISA实验验证：包括对送检芯片样本验证以及送检芯片之外重新收集的样本进行验证，既实现了蛋白芯片的验证又保证了推广性。
(5)实验结果：经蛋白质芯片筛选出的12种血清蛋白标志物进行ELISA实验验证，对所有验证人群利用随机抽样的方法，抽取总人群的70％作为训练集，利用二元logistics回归构建疾病预测模型，分别用逐步向前(Forward：conditional)、逐步向后(Backward：conditional)以及直接输入法(Enter)三种方法筛选指标，分别有6种、8种、12种蛋白进入模型，其所对应的ROC曲线下面积(AUC)、灵敏度(Se)、特异度(Sp)如下表4所示。
表4 不同筛选方法筛选出的模型指标
对以上所构建的模型的诊断价值以及经济效益分析，含有6个指标(TP53、NPM1、GNA11、JAK2、TSC1、PIK3CA)的模型效果最佳，在剩余的30％人群(验证集)中进行验证，如图7、8所示，其联合诊断肺癌ROC曲线下面积达0.922，95％CI为0.870-0.974，保证特异度91.5％时，灵敏度为70.7％，一致率达到81.1％。
实施例1
本实施例中用于肺癌早期筛查和诊断的联合检测血清标志物，由TP53、NPM1、GNA11、JAK2、TSC1和PIK3CA共6种基因编码的蛋白组成。其中TP53基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，NPM1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，GNA11基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，JAK2基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，TSC1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，PIK3CA基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。
实施例2
本实施例中用于肺癌早期筛查和诊断的试剂盒，包含上述实施例1的联合检测血清标志物，联合检测血清标志物包被于聚氯乙烯的凹孔平板上。同时，试剂盒内还包括一定量的阳性对照血清、阴性对照血清、封闭液、样本稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、洗涤液、显色液和终止液，阳性对照血清为ELISA实验OD值较高的并经Western Blot实验验证为相应抗体阳性的血清，阴性对照血清为正常对照人群中ELISA实验OD值处于均值附近的且经Western Blot验证为阴性的血清，第二抗体为HRP标记的鼠抗人IgG。
实施例3
本实施例的检测方法使用上述实施例1的联合检测血清标志物，具体步骤如下：
1)包被：对联合检测血清标志物分别进行包被(包被浓度见上表1)，100μL/孔，4℃过夜。
2)封闭：2％BSA的PBST(PBS，Tween20)溶液，200μL/孔，4℃过夜。
3)清洗：350μL/孔PBST清洗3次。
4)一抗孵育：待测血清与含1％BSA的PBST 1:100稀释后，100μL/孔，37℃半水浴1h。
5)清洗：350μL/孔PBST清洗5次。
6)二抗孵育：HRP标记的鼠抗人IgG与含1％BSA的PBST 1:10000稀释后，100μL/孔，37℃半水浴1h。
7)清洗：350μL/孔PBST清洗5次。
8)显色：TMB显色系统，A液(索莱宝，北京)与B液1:1混合后100μL/孔，室温避光，达到预期颜色。
9)终止：10％的浓硫酸50μL/孔终止后10min内测吸光度。
10)判定：以OD450-OD620为相对OD值，然后扣去空白对照，将各个指标(即血清标志物)的吸光度值代入以下公式，计算预测概率P值大小；
P＝1/(1+Exp(-(-9.161+42.136×ODTP53-12.510×ODNPM1+15.889×ODGNA11+17.433×ODJAK2+34.955×ODTSC1-56.240×ODPIK3CA)))；
式中ODTP53、ODNPM1、ODGNA11、ODJAK2、ODTSC1、ODPIK3CA分别为各个指标的相对OD值减去空白对照后的吸光度值；
当P值≥0.5时，初步判定为疑似肺癌样品；
当P值＜0.5时，初步判定为正常样品。
结果显示，待测血清的P值大于0.5，初步判定为疑似肺癌样品。
由于本实施例的方法测定的结果只能作为中间结果的信息，不能直接判定患者是否患有肺癌，因此后续还需要结合临床症状、影像学及组织病理学等信息，最终判定患者的患病情况。
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<160> 12
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<212> PRT
<213> 人
<221> TP53基因编码的蛋白
<400> 1
MEEPQSDPSV EPPLSQETFS DLWKLLPENN VLSPLPSQAM DDLMLSPDDI EQWFTEDPGP 60
DEAPRMPEAA PPVAPAPAAP TPAAPAPAPS WPLSSSVPSQ KTYQGSYGFR LGFLHSGTAK 120
SVTCTYSPAL NKMFCQLAKT CPVQLWVDST PPPGTRVRAM AIYKQSQHMT EVVRRCPHHE 180
RCSDSDGLAP PQHLIRVEGN LRVEYLDDRN TFRHSVVVPY EPPEVGSDCT TIHYNYMCNS 240
SCMGGMNRRP ILTIITLEDS SGNLLGRNSF EVRVCACPGR DRRTEEENLR KKGEPHHELP 300
PGSTKRALPN NTSSSPQPKK KPLDGEYFTL QIRGRERFEM FRELNEALEL KDAQAGKEPG 360
GSRAHSSHLK SKKGQSTSRH KKLMFKTEGP DSD 393
<211> 598
<212> PRT
<213> 人
<221> P62基因编码的蛋白
<400> 2
MNKLYIGNLS PAVTADDLRQ LFGDRKLPLA GQVLLKSGYA FVDYPDQNWA IRAIETLSGK 60
VELHGKIMEV DYSVSKKLRS RKIQIRNIPP HLQWEVLDGL LAQYGTVENV EQVNTDTETA 120
VVNVTYATRE EAKIAMEKLS GHQFENYSFK ISYIPDEEVS SPSPPQRAQR GDHSSREQGH 180
APGGTSQARQ IDFPLRILVP TQFVGAIIGK EGLTIKNITK QTQSRVDIHR KENSGAAEKP 240
VTIHATPEGT SEACRMILEI MQKEADETKL AEEIPLKILA HNGLVGRLIG KEGRNLKKIE 300
HETGTKITIS SLQDLSIYNP ERTITVKGTV EACASAEIEI MKKLREAFEN DMLAVNQQAN 360
LIPGLNLSAL GIFSTGLSVL SPPAGPRGAP PAAPYHPFTT HSGYFSSLYP HHQFGPFPHH 420
HSYPEQEIVN LFIPTQAVGA IIGKKGAHIK QLARFAGASI KIAPAEGPDV SERMVIITGP 480
PEAQFKAQGR IFGKLKEENF FNPKEEVKLE AHIRVPSSTA GRVIGKGGKT VNELQNLTSA 540
EVIVPRDQTP DENEEVIVRI IGHFFASQTA QRKIREIVQQ VKQQEQKYPQ GVASQRSK 598
<211> 265
<212> PRT
<213> 人
<221> NPM1基因编码的蛋白
<400> 3
MEDSMDMDMS PLRPQNYLFG CELKADKDYH FKVDNDENEH QLSLRTVSLG AGAKDELHIV 60
EAEAMNYEGS PIKVTLATLK MSVQPTVSLG GFEITPPVVL RLKCGSGPVH ISGQHLVAVE 120
EDAESEDEEE EDVKLLSISG KRSAPGGGSK VPQKKVKLAA DEDDDDDDEE DDDEDDDDDD 180
FDDEEAEEKA PVKKGQESFK KQEKTPKTPK GPSSVEDIKA KMQASIEKGG SLPKVEAKFI 240
NYVKNCFRMT DQEAIQDLWQ WRKSL 265
<211> 137
<212> PRT
<213> 人
<221> Survivin基因编码的蛋白
<400> 4
MGAPTLPPAW QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACTPERMAE AGFIHCPTEN EPDLAQCFFC 60
FKELEGWEPD DDPMQRKPTI RRKNLRKLRR KCAVPSSSWL PWIEASGRSC LVPEWLHHFQ 120
GLFPGATSLP VGPLAMS 137
<211> 359
<212> PRT
<213> 人
<221> GNA11基因编码的蛋白
<400> 5
MTLESMMACC LSDEVKESKR INAEIEKQLR RDKRDARREL KLLLLGTGES GKSTFIKQMR 60
IIHGAGYSEE DKRGFTKLVY QNIFTAMQAM IRAMETLKIL YKYEQNKANA LLIREVDVEK 120
VTTFEHQYVS AIKTLWEDPG IQECYDRRRE YQLSDSAKYY LTDVDRIATL GYLPTQQDVL 180
RVRVPTTGII EYPFDLENII FRMVDVGGQR SERRKWIHCF ENVTSIMFLV ALSEYDQVLV 240
ESDNENRMEE SKALFRTIIT YPWFQNSSVI LFLNKKDLLE DKILYSHLVD YFPEFDGPQR 300
DAQAAREFIL KMFVDLNPDS DKIIYSHFTC ATDTENIRFV FAAVKDTILQ LNLKEYNLV 359
<211> 136
<212> PRT
<213> 人
<221> HIST1H3B基因编码的蛋白
<400> 6
MARTKQTARK STGGKAPRKQ LATKAARKSA PATGGVKKPH RYRPGTVALR EIRRYQKSTE 60
LLIRKLPFQR LVREIAQDFK TDLRFQSSAV MALQEACEAY LVGLFEDTNL CAIHAKRVTI 120
MPKDIQLARR IRGERA 136
<211> 221
<212> PRT
<213> 人
<221> SRSF2基因编码的蛋白
<400> 7
MSYGRPPPDV EGMTSLKVDN LTYRTSPDTL RRVFEKYGRV GDVYIPRDRY TKESRGFAFV 60
RFHDKRDAED AMDAMDGAVL DGRELRVQMA RYGRPPDSHH SRRGPPPRRY GGGGYGRRSR 120
SPRRRRRSRS RSRSRSRSRS RSRYSRSKSR SRTRSRSRST SKSRSARRSK SKSSSVSRSR 180
SRSRSRSRSR SPPPVSKRES KSRSRSKSPP KSPEEEGAVS S 221
<211> 723
<212> PRT
<213> 人
<221> FGFR2基因编码的蛋白
<400> 8
MGLTSTWRYG RGPGIGTVTM VSWGRFICLV VVTMATLSLA RPSFSLVEDT TLEPEGAPYW 60
TNTEKMEKRL HAVPAANTVK FRCPAGGNPM PTMRWLKNGK EFKQEHRIGG YKVRNQHWSL 120
IMESVVPSDK GNYTCVVENE YGSINHTYHL DVVERSPHRP ILQAGLPANA STVVGGDVEF 180
VCKVYSDAQP HIQWIKHVEK NGSKYGPDGL PYLKVLKAAG VNTTDKEIEV LYIRNVTFED 240
AGEYTCLAGN SIGISFHSAW LTVLPAPGRE KEITASPDYL EIAIYCIGVF LIACMVVTVI 300
LCRMKNTTKK PDFSSQPAVH KLTKRIPLRR QVSAESSSSM NSNTPLVRIT TRLSSTADTP 360
MLAGVSEYEL PEDPKWEFPR DKLTLGKPLG EGCFGQVVMA EAVGIDKDKP KEAVTVAVKM 420
LKDDATEKDL SDLVSEMEMM KMIGKHKNII NLLGACTQDG PLYVIVEYAS KGNLREYLRA 480
RRPPGMEYSY DINRVPEEQM TFKDLVSCTY QLARGMEYLA SQKCIHRDLA ARNVLVTENN 540
VMKIADFGLA RDINNIDYYK KTTNGRLPVK WMAPEALFDR VYTHQSDVWS FGVLMWEIFT 600
LGGSPYPGIP VEELFKLLKE GHRMDKPANC TNELYMMMRD CWHAVPSQRP TFKQLVEDLD 660
RILTLTTNEE YLDLSQPLEQ YSPSYPDTRS SCSSGDDSVF SPDPMPYEPC LPQYPHINGS 720
VKT 723
<211> 306
<212> PRT
<213> 人
<221> PBRM1基因编码的蛋白
<400> 9
MGEEDSEVIE PPSLPQLQTP LASELDLMPY TPPQSTPKSA KGSAKKEGSK RKINMSGYIL 60
FSSEMRAVIK AQHPDYSFGE LSRLVGTEWR NLETAKKAEY EGMMGGYPPG LPPLQGPVDG 120
LVSMGSMQPL HPGGPPPHHL PPGVPGLPGI PPPGVMNQGV APMVGTPAPG GSPYGQQVGV 180
LGPPGQQAPP PYPGPHPAGP PVIQQPTTPM FVAPPPKTQR LLHSEAYLKY IEGLSAESNS 240
ISKWDQTLAA RRRDVHLSKE QESRLPSHWL KSKGAHTTMA DALWRLRDLM LRDTLNIRQA 300
YNLENV 306
<211> 1132
<212> PRT
<213> 人
<221> JAK2基因编码的蛋白
<400> 10
MGMACLTMTE MEGTSTSSIY QNGDISGNAN SMKQIDPVLQ VYLYHSLGKS EADYLTFPSG 60
EYVAEEICIA ASKACGITPV YHNMFALMSE TERIWYPPNH VFHIDESTRH NVLYRIRFYF 120
PRWYCSGSNR AYRHGISRGA EAPLLDDFVM SYLFAQWRHD FVHGWIKVPV THETQEECLG 180
MAVLDMMRIA KENDQTPLAI YNSISYKTFL PKCIRAKIQD YHILTRKRIR YRFRRFIQQF 240
SQCKATARNL KLKYLINLET LQSAFYTEKF EVKEPGSGPS GEEIFATIII TGNGGIQWSR 300
GKHKESETLT EQDLQLYCDF PNIIDVSIKQ ANQEGSNESR VVTIHKQDGK NLEIELSSLR 360
EALSFVSLID GYYRLTADAH HYLCKEVAPP AVLENIQSNC HGPISMDFAI SKLKKAGNQT 420
GLYVLRCSPK DFNKYFLTFA VERENVIEYK HCLITKNENE EYNLSGTKKN FSSLKDLLNC 480
YQMETVRSDN IIFQFTKCCP PKPKDKSNLL VFRTNGVSDV PTSPTLQRPT HMNQMVFHKI 540
RNEDLIFNES LGQGTFTKIF KGVRREVGDY GQLHETEVLL KVLDKAHRNY SESFFEAASM 600
MSKLSHKHLV LNYGVCVCGD ENILVQEFVK FGSLDTYLKK NKNCINILWK LEVAKQLAWA 660
MHFLEENTLI HGNVCAKNIL LIREEDRKTG NPPFIKLSDP GISITVLPKD ILQERIPWVP 720
PECIENPKNL NLATDKWSFG TTLWEICSGG DKPLSALDSQ RKLQFYEDRH QLPAPKWAEL 780
ANLINNCMDY EPDFRPSFRA IIRDLNSLFT PDYELLTEND MLPNMRIGAL GFSGAFEDRD 840
PTQFEERHLK FLQQLGKGNF GSVEMCRYDP LQDNTGEVVA VKKLQHSTEE HLRDFEREIE 900
ILKSLQHDNI VKYKGVCYSA GRRNLKLIME YLPYGSLRDY LQKHKERIDH IKLLQYTSQI 960
CKGMEYLGTK RYIHRDLATR NILVENENRV KIGDFGLTKV LPQDKEYYKV KEPGESPIFW 1020
YAPESLTESK FSVASDVWSF GVVLYELFTY IEKSKSPPAE FMRMIGNDKQ GQMIVFHLIE 1080
LLKNNGRLPR PDGCPDEIYM IMTECWNNNV NQRPSFRDLA LRVDQIRDNM AG 1132
<211> 1164
<212> PRT
<213> 人
<221> TSC1基因编码的蛋白
<400> 11
MAQQANVGEL LAMLDSPMLG VRDDVTAVFK ENLNSDRGPM LVNTLVDYYL ETSSQPALHI 60
LTTLQEPHDK HLLDRINEYV GKAATRLSIL SLLGHVIRLQ PSWKHKLSQA PLLPSLLKCL 120
KMDTDVVVLT TGVLVLITML PMIPQSGKQH LLDFFDIFGR LSSWCLKKPG HVAEVYLVHL 180
HASVYALFHR LYGMYPCNFV SFLRSHYSMK ENLETFEEVV KPMMEHVRIH PELVTGSKDH 240
ELDPRRWKRL ETHDVVIECA KISLDPTEAS YEDGYSVSHQ ISARFPHRSA DVTTSPYADT 300
QNSYGCATST PYSTSRLMLL NMPGQLPQTL SSPSTRLITE PPQATLWSPS MVCGMTTPPT 360
SPGNVPPDLS HPYSKVFGTT AGGKGTPLGT PATSPPPAPL CHSDDYVHIS LPQATVTPPR 420
KEERMDSARP CLHRQHHLLN DRGSEEPPGS KGSVTLSDLP GFLGDLASEE DSIEKDKEEA 480
AISRELSEIT TAEAEPVVPR GGFDSPFYRD SLPGSQRKTH SAASSSQGAS VNPEPLHSSL 540
DKLGPDTPKQ AFTPIDLPCG SADESPAGDR ECQTSLETSI FTPSPCKIPP PTRVGFGSGQ 600
PPPYDHLFEV ALPKTAHHFV IRKTEELLKK AKGNTEEDGV PSTSPMEVLD RLIQQGADAH 660
SKELNKLPLP SKSVDWTHFG GSPPSDEIRT LRDQLLLLHN QLLYERFKRQ QHALRNRRLL 720
RKVIKAAALE EHNAAMKDQL KLQEKDIQMW KVSLQKEQAR YNQLQEQRDT MVTKLHSQIR 780
QLQHDREEFY NQSQELQTKL EDCRNMIAEL RIELKKANNK VCHTELLLSQ VSQKLSNSES 840
VQQQMEFLNR QLLVLGEVNE LYLEQLQNKH SDTTKEVEMM KAAYRKELEK NRSHVLQQTQ 900
RLDTSQKRIL ELESHLAKKD HLLLEQKKYL EDVKLQARGQ LQAAESRYEA QKRITQVFEL 960
EILDLYGRLE KDGLLKKLEE EKAEAAEAAE ERLDCCNDGC SDSMVGHNEE ASGHNGETKT 1020
PRPSSARGSS GSRGGGGSSS SSSELSTPEK PPHQRAGPFS SRWETTMGEA SASIPTTVGS 1080
LPSSKSFLGM KARELFRNKS ESQCDEDGMT SSLSESLKTE LGKDLGVEAK IPLNLDGPHP 1140
SPPTPDSVGQ LHIMDYNETH HEHS 1164
<211> 1068
<212> PRT
<213> 人
<221> PIK3CA基因编码的蛋白
<400> 12
MPPRPSSGEL WGIHLMPPRI LVECLLPNGM IVTLECLREA TLITIKHELF KEARKYPLHQ 60
LLQDESSYIF VSVTQEAERE EFFDETRRLC DLRLFQPFLK VIEPVGNREE KILNREIGFA 120
IGMPVCEFDM VKDPEVQDFR RNILNVCKEA VDLRDLNSPH SRAMYVYPPN VESSPELPKH 180
IYNKLDKGQI IVVIWVIVSP NNDKQKYTLK INHDCVPEQV IAEAIRKKTR SMLLSSEQLK 240
LCVLEYQGKY ILKVCGCDEY FLEKYPLSQY KYIRSCIMLG RMPNLMLMAK ESLYSQLPMD 300
CFTMPSYSRR ISTATPYMNG ETSTKSLWVI NSALRIKILC ATYVNVNIRD IDKIYVRTGI 360
YHGGEPLCDN VNTQRVPCSN PRWNEWLNYD IYIPDLPRAA RLCLSICSVK GRKGAKEEHC 420
PLAWGNINLF DYTDTLVSGK MALNLWPVPH GLEDLLNPIG VTGSNPNKET PCLELEFDWF 480
SSVVKFPDMS VIEEHANWSV SREAGFSYSH AGLSNRLARD NELRENDKEQ LKAISTRDPL 540
SEITEQEKDF LWSHRHYCVT IPEILPKLLL SVKWNSRDEV AQMYCLVKDW PPIKPEQAME 600
LLDCNYPDPM VRGFAVRCLE KYLTDDKLSQ YLIQLVQVLK YEQYLDNLLV RFLLKKALTN 660
QRIGHFFFWH LKSEMHNKTV SQRFGLLLES YCRACGMYLK HLNRQVEAME KLINLTDILK 720
QEKKDETQKV QMKFLVEQMR RPDFMDALQG FLSPLNPAHQ LGNLRLEECR IMSSAKRPLW 780
LNWENPDIMS ELLFQNNEII FKNGDDLRQD MLTLQIIRIM ENIWQNQGLD LRMLPYGCLS 840
IGDCVGLIEV VRNSHTIMQI QCKGGLKGAL QFNSHTLHQW LKDKNKGEIY DAAIDLFTRS 900
CAGYCVATFI LGIGDRHNSN IMVKDDGQLF HIDFGHFLDH KKKKFGYKRE RVPFVLTQDF 960
LIVISKGAQE CTKTREFERF QEMCYKAYLA IRQHANLFIN LFSMMLGSGM PELQSFDDIA 1020
YIRKTLALDK TEQEALEYFM KQMNDAHHGG WTTKMDWIFH TIKQHALN 1068