阅读说明：本技术 用于祛斑、除细纹、黑眼圈和眼袋的复合物及其制备方法 (Compound for removing freckles, fine lines, black eyes and under-eye bags and preparation method thereof ) 是由 张传旋 于 2019-10-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供用于祛斑、除细纹、黑眼圈和眼袋的复合物及其制备方法,属于化妆品技术领域,包括式(I)所示罗汉果醇衍生物和玫瑰花渣醇提取物,其中罗汉果醇衍生物的制备方法包括：将罗汉果醇的邻羟基结构氧化成醛,再将醛基结构还原成羟基,然后和BOC-氨基酸羧基缩合,脱去BOC,得式(I)所示罗汉果醇衍生物。复合物的制备方法为：将式(I)所示罗汉果醇衍生物和玫瑰花渣醇提取物混合均匀,即得复合物。本发明罗汉果醇衍生物式能够祛除皮肤表面沉着的斑,去除皮肤表面的细纹和皱纹,改善黑眼圈和眼袋。本发明用玫瑰花渣醇能够增强罗汉果醇衍生物的生物活性,提高复合物祛斑、除细纹、黑眼圈和眼袋的效果。(The invention provides a compound for removing freckles, fine lines, dark circles and under-eyes and a preparation method thereof, belongs to the technical field of cosmetics, and comprises a mogrol derivative shown in a formula (I) and a rose dreg alcohol extract, wherein the preparation method of the mogrol derivative comprises the following steps: oxidizing the o-hydroxyl structure of the mogrol into aldehyde, reducing the aldehyde structure into hydroxyl, condensing with BOC-amino acid carboxyl, and removing BOC to obtain the mogrol derivative shown in the formula (I). The preparation method of the compound comprises the following steps: mixing the mogrol derivative shown in formula (I) and the alcohol extract of flos Rosae Rugosae residue uniformly to obtain the compound. The mogrol derivative can dispel skin surface pigmentation spots, remove fine lines and wrinkles on the skin surface, and improve dark eye circles and under-eye puffiness. The invention uses rose dreg alcohol to enhance the biological activity of the mogrol derivative and improve the effects of the compound in removing spots, fine lines, dark circles and under-eye puffiness.)

用于祛斑、除细纹、黑眼圈和眼袋的复合物及其制备方法

技术领域

本发明属于化妆品技术领域，具体涉及用于祛斑、除细纹、黑眼圈和眼袋的复合物及其制备方法。

背景技术

皮肤衰老(skin ageing)是随着增龄而出现的皮肤生理结构紊乱以及功能退化的复杂过程，它同时受到内在因素和外在因素的综合影响，一般表现为自然衰老和光老化两种形式。自然衰老主要受遗传等内源性因素导致，随时间流逝而逐渐显现，多表现在皱纹细浅，皮肤干燥、松他和粗糙。光老化则是由长期紫外线照射等外界环境因素引发，临床特征性改变包括皱纹粗深、弹性降低、斑点状色素沉着等。胶原是细胞外基质最基本的成分之一，真皮层约75％由胶原蛋白组成，纤维状的胶原蛋白形成网状结构，胶原蛋白提供皮肤的张力和弹性的同时，还是表皮层和表皮附属器官毛发的营养供应站，并为表皮输送水分。老化过程伴随着皮肤中胶原纤维和弹性纤维的变性和裂解。皮肤中弹性纤维逐渐消失导致皮肤弹性进行性丧失。胶原纤维的变性和裂解导致皮肤失去抵抗力。真皮中连接纤维裂解的进一步的后果是整体上真皮厚度的逐渐降低，特别是通过胶原纤维减少所致的真皮厚度的逐渐降低，进而降低皮肤弹性、紧致度和厚度，皮肤出现皱纹。老化过程也影响皮肤的脉管系统，使得毛细血管壁变薄和微循环减慢，血管壁的改变引起血管通透性的变化，并且可导致纤维间水肿的出现，因此，老化的一个迹象是眼睛周围和下面的间质液的积累，例如，浮肿的眼睛和眼袋。此外，由于眼部皮肤血管血流速度过于缓慢而形成滞留，组织供养不足，血管中代谢废物积累过多，造成眼部色素沉着，形成黑眼圈，且由于眼部皮肤较为脆弱，出现黑眼圈后，不易消退，严重影响美观。皮肤覆盖体表，是人体与外界交流联系的最重要窗口，在衰老时极易显露，直接引发焦虑、抑郁、自卑等一系列的心理及社会问题，对人们的生活、工作带来严重影响。随着全球老龄化问题的益加剧，如何延缓衰老的发生，尤其是如何“美容颜”、“驻颜色”成为全世界关注的焦点，因此预防和延缓皮肤衰老成为当今研究的热点之一。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种能够能够祛除皮肤表面沉着的斑，去除皮肤表面的细纹和皱纹，改善黑眼圈和眼袋的罗汉果醇衍生物。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

式(I)所示罗汉果醇衍生物在制备用于祛斑、除细纹、黑眼圈和眼袋的复合物中的用途，

其中，R表示-(CH₂)-S-CH₃；或-CH₂-SH。

本发明罗汉果醇衍生物能够抑制Hacat细胞SCF蛋白的表达和黑素细胞C-kit受体蛋白的表达，且能够抑制酪氨酸酶活性，从而抑制Hacat细胞和黑素细胞增殖及黑素细胞中黑色素的产生，使皮肤黑色素沉着减少，因此可以作为皮肤去色素剂/美白剂/颜色淡化剂而祛除皮肤表面沉着的斑(黄褐斑、雀斑、色斑、年龄斑等)、改善黑眼圈；同时本发明罗汉果醇衍生物能够抑制胶原酶(MMP-1)的活性，有效保护胶原蛋白及蛋白多糖，降低老化损伤，祛除皮肤表面的斑、细纹和皱纹；此外，本发明罗汉果醇衍生物还可改善机体的血液流变学，降低局部血流灌注量，降低微血管血流量，减少氧气消耗量，降低缺氧血红蛋白比例和血管通透性，从而达到治疗黑眼圈和眼袋的目的。因此，本发明罗汉果醇衍生物式能够祛除皮肤表面沉着的斑(黄褐斑、雀斑、色斑、年龄斑等)，去除皮肤表面的细纹和皱纹，改善黑眼圈和眼袋。

本发明的又一目的，在于提供制备上述式(I)所示罗汉果醇衍生物的方法，其包括：

步骤a，将罗汉果醇的邻羟基结构氧化成醛，得具有C-24位醛基结构中间体A；

步骤b，将中间体A的C-24位醛基结构还原成羟基，得中间体B；

步骤c，将中间体B和BOC-氨基酸羧基缩合，得BOC-罗汉果醇衍生物；

步骤d，将BOC-罗汉果醇衍生物的BOC脱去，得式(I)所示罗汉果醇衍生物。

本发明的又一目的，在于提供用于祛斑、除细纹、黑眼圈和眼袋的复合物，其包括：式(I)所示罗汉果醇衍生物。

根据本发明一实施方式，复合物还包括玫瑰花渣醇提取物。玫瑰花提取精油后产生大量的花渣，营养成分丰富，含有多糖、黄酮、多酚、蛋白质、维生素C、维生素E、胡萝卜素及矿质营养元素，有望开发成有应用前景的天然功能型配料。本发明用玫瑰花渣醇提取物中含有黄酮和多酚类物质，能够增强罗汉果醇衍生物的生物活性，提高复合物祛斑、除细纹、黑眼圈和眼袋的效果。

根据本发明一实施方式，玫瑰花渣醇提取物的制备步骤为：将玫瑰花渣按料液比1:20-30(g/mL)加入40-60％乙醇溶液后置于超声萃取仪中，超声辅助提取30-60min，过滤除去悬浮颗粒，取滤液再于10000-15000rpm下离心10-20min，收集上清，旋转蒸发除去提取剂，真空冷冻干燥，即得玫瑰花渣醇提取物。

根据本发明一实施方式，复合物中罗汉果醇衍生物和玫瑰花渣醇提取物的重量比为1:1-3。

本发明的又一目的，在于提供用于祛斑、除细纹、黑眼圈和眼袋的复合物的制备方法，将式(I)所示罗汉果醇衍生物和玫瑰花渣醇提取物混合均匀，即得复合物。

本发明的又一目的，在于提供复合物在皮肤及其附件的非治疗性美容处理中的用途。

本发明的又一目的，在于提供复合物在制备用于治疗处理人体或动物体的内皮细胞缺氧的药物组合物中的用途。

本发明的又一目的，在于提供祛斑、除细纹、黑眼圈和眼袋的方法，包括施用上述复合物。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明罗汉果醇衍生物式能够祛除皮肤表面沉着的斑(黄褐斑、雀斑、色斑、年龄斑等)，去除皮肤表面的细纹和皱纹，改善黑眼圈和眼袋。本发明用玫瑰花渣醇提取物中含有黄酮和多酚类物质，能够增强罗汉果醇衍生物的生物活性，提高复合物祛斑、除细纹、黑眼圈和眼袋的效果。

本发明采用了上述技术方案提供用于祛斑、除细纹、黑眼圈和眼袋的复合物及其制备方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。

附图说明

图1是本发明试验例1中Hacat细胞的增殖结果；

图2是本发明试验例1中黑素细胞的增殖结果；

图3是本发明试验例1中Hacat细胞SCF蛋白的表达结果；

图4是本发明试验例1中黑素细胞的C-kit蛋白的表达结果；

图5是本发明试验例2中酪氨酸酶活性的抑制率的测定结果；

图6是本发明试验例3中MMP-1活性抑制率的测定结果。

具体实施方式

本发明允许各种修改及变形，其特定实施例进行了举例，下面进行详细说明。但并非要把本发明限定于公开的特别形态之意，相反，本发明包括与由权利要求项所定义的本发明思想一致的所有修改、均等及替代。

这些实施例只用于更具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围并非限定于这些实施例，这是所属技术领域的技术人员不言而喻的。

本发明一实施方式提供了式(I)所示罗汉果醇衍生物在制备用于祛斑、除细纹、黑眼圈和眼袋的复合物中的用途，

其中，R表示-(CH₂)-S-CH₃；或-CH₂-SH。

本实施方式罗汉果醇衍生物能够抑制Hacat细胞SCF蛋白的表达和黑素细胞C-kit受体蛋白的表达，且能够抑制酪氨酸酶活性，从而抑制Hacat细胞和黑素细胞增殖及黑素细胞中黑色素的产生，使皮肤黑色素沉着减少，因此可以作为皮肤去色素剂/美白剂/颜色淡化剂而祛除皮肤表面沉着的斑(黄褐斑、雀斑、色斑、年龄斑等)、改善黑眼圈；同时该罗汉果醇衍生物能够抑制胶原酶(MMP-1)的活性，有效保护胶原蛋白及蛋白多糖，降低老化损伤，祛除皮肤表面的斑、细纹和皱纹；此外，该罗汉果醇衍生物还可改善机体的血液流变学，降低局部血流灌注量，降低微血管血流量，减少氧气消耗量，降低缺氧血红蛋白比例和血管通透性，从而达到治疗黑眼圈和眼袋的目的。因此，上述罗汉果醇衍生物式能够祛除皮肤表面沉着的斑(黄褐斑、雀斑、色斑、年龄斑等)，去除皮肤表面的细纹和皱纹，改善黑眼圈和眼袋。

本发明一实施方式提供了制备上述式(I)所示罗汉果醇衍生物的方法，其包括：

步骤a，将罗汉果醇的邻羟基结构氧化成醛，得具有C-24位醛基结构中间体A；

步骤b，将中间体A的C-24位醛基结构还原成羟基，得中间体B；

步骤c，将中间体B和BOC-氨基酸羧基缩合，得BOC-罗汉果醇衍生物；

步骤d，将BOC-罗汉果醇衍生物的BOC脱去，得式(I)所示罗汉果醇衍生物。

罗汉果醇C-24、C-25为邻羟基结构，需将邻羟基氧化成具有C-24位醛基结构的中间体A，再进行结构修饰。于本发明一实施方式中，步骤a的具体步骤为：将高碘酸钠用含1-3％(体积分数)乙酸的水溶解，再加入丙酮，丙酮:水的体积比为1:1，待用。另按料液比1:8-13(g/mL)将罗汉果醇用丙酮溶解，再加入等体积的水，在55-70℃下搅拌并缓慢加入配好的高碘酸钠溶液，30min内加完，避光反应18-24h，减压蒸去丙酮，加水稀释，用二氯甲烷萃取2-4次，合并有机相，无水硫酸镁干燥，减压蒸去溶剂，硅胶层析柱分离纯化(二氯甲烷/乙酸乙酯＝3-5:1)，得到中间体A。

于本发明一实施方式中，步骤b的具体步骤为：按料液比1:30-35(g/mL)将中间体A用四氢呋喃溶解，冰浴下，缓慢加入硼氢化钠，中间体A和硼氢化钠的重量比为1:0.3-0.4，反应过夜，过滤，减压蒸去溶剂，硅胶层析柱分离(二氯甲烷/乙酸乙酯＝3-5:1)得到中间体B。

于本发明一实施方式中，步骤c的具体步骤为：将摩尔比为1:1的中间体B和BOC保护的氨基酸用二氯甲烷溶解，另将重量比为1:0.55-0.65的N,N'-二环己基碳酰亚胺和4-二甲氨基吡啶溶于二氯甲烷，将其缓慢滴加至原料中，30min滴完，搅拌反应8-12h，过滤掉不溶物，减压蒸除溶剂，硅胶层析柱分离(二氯甲烷/乙酸乙酯＝5-8:1)，得到BOC-罗汉果醇衍生物。

于本发明一实施方式中，步骤d的具体步骤为：将BOC-氨基酸酯溶于无水二氯甲烷，常温下，然后缓慢加入三氟乙酸，搅拌反应1-3h，然后用碳酸氢钠溶液(pH＝8)和饱和食盐水各洗1次，硅胶层析柱分离(二氯甲烷/乙酸乙酯＝1:1)，得到式(I)所示罗汉果醇衍生物。

本发明一实施方式提供了用于祛斑、除细纹、黑眼圈和眼袋的复合物，其包括：式(I)所示罗汉果醇衍生物。

于本发明一实施方式中，复合物还包括玫瑰花渣醇提取物。玫瑰花提取精油后产生大量的花渣，营养成分丰富，含有多糖、黄酮、多酚、蛋白质、维生素C、维生素E、胡萝卜素及矿质营养元素，有望开发成有应用前景的天然功能型配料。本发明用玫瑰花渣醇提取物中含有黄酮和多酚类物质，能够增强罗汉果醇衍生物的生物活性，提高复合物祛斑、除细纹、黑眼圈和眼袋的效果。

于本发明一实施方式中，玫瑰花渣醇提取物的制备步骤为：将玫瑰花渣按料液比1:20-30(g/mL)加入40-60％乙醇溶液后置于超声萃取仪中，超声辅助提取30-60min，过滤除去悬浮颗粒，取滤液再于10000-15000rpm下离心10-20min，收集上清，旋转蒸发除去提取剂，真空冷冻干燥，即得玫瑰花渣醇提取物。

于本发明一实施方式中，复合物中罗汉果醇衍生物和玫瑰花渣醇提取物的重量比为1:1-3。

本发明一实施方式提供了用于祛斑、除细纹、黑眼圈和眼袋的复合物的制备方法，将式(I)所示罗汉果醇衍生物和玫瑰花渣醇提取物混合均匀，即得复合物。

本发明一实施方式提供了复合物在皮肤及其附件的非治疗性美容处理中的用途。

本发明一实施方式提供了复合物在制备用于治疗处理人体或动物体的内皮细胞缺氧的药物组合物中的用途。

本发明一实施方式提供了祛斑、除细纹、黑眼圈和眼袋的方法，包括施用上述复合物。

以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。

实施例1：

式(I)所示罗汉果醇衍生物的方法，其包括：

步骤a，称取高碘酸钠5g于锥形瓶，用50ml水(1ml乙酸助溶)溶解，再加入50ml丙酮(保持溶剂体系为丙酮：水＝1:1)，待用；另称取罗汉果醇5g于圆底烧瓶，用50ml丙酮溶解，再加入50ml水，60℃搅拌并缓慢加入刚配好的高碘酸钠溶液，30min内加完，避光反应20h，减压蒸去丙酮，加适量水稀释，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸镁干燥，减压蒸去溶剂，硅胶层析柱分离纯化(二氯甲烷/乙酸乙酯＝4:1)，得到中间体A；

步骤b，称取中间体A3g于250ml圆底烧瓶，100ml四氢呋喃溶解，冰浴下，缓慢加入硼氢化钠1.09g，反应过夜，过滤，减压旋干溶剂，硅胶层析柱分离(二氯甲烷/乙酸乙酯＝4:1)得到中间体B；

步骤c，称取中间体B 0.1g和相应的BOC保护的甲硫氨酸于50ml圆底烧瓶，二氯甲烷溶解，称取DCC 0.098g和DMAP 0.006g溶于二氯甲烷，将其缓慢滴加至原料中约30min滴完，搅拌反应，薄层色谱跟踪反应进程，10h反应结束。过滤掉不溶物，减压蒸除溶剂，硅胶层析柱分离(二氯甲烷/乙酸乙酯＝6:1)，得到BOC-罗汉果醇衍生物；

步骤d，将BOC-氨基酸酯溶于4ml无水二氯甲烷，常温下，量取0.2ml三氟乙酸缓慢加入，搅拌反应，薄层色谱跟踪反应进程，2h反应结束，碳酸氢钠溶液(pH＝8)和饱和食盐水各洗一遍，硅胶层析柱分离(二氯甲烷/乙酸乙酯＝1:1)，得到罗汉果醇甲硫氨酸酯类衍生物。

实施例2：

式(I)所示罗汉果醇衍生物的方法，其包括：

步骤a，称取高碘酸钠5g于锥形瓶，用50ml水(1ml乙酸助溶)溶解，再加入50ml丙酮(保持溶剂体系为丙酮：水＝1:1)，待用；另称取罗汉果醇5g于圆底烧瓶，用50ml丙酮溶解，再加入50ml水，60℃搅拌并缓慢加入刚配好的高碘酸钠溶液，30min内加完，避光反应20h，减压蒸去丙酮，加适量水稀释，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸镁干燥，减压蒸去溶剂，硅胶层析柱分离纯化(二氯甲烷/乙酸乙酯＝4:1)，得到中间体A；

步骤b，称取中间体A3g于250ml圆底烧瓶，100ml四氢呋喃溶解，冰浴下，缓慢加入硼氢化钠1.09g，反应过夜，过滤，减压旋干溶剂，硅胶层析柱分离(二氯甲烷/乙酸乙酯＝4:1)得到中间体B；

步骤c，称取中间体B 0.1g和相应的BOC保护的半胱氨酸于50ml圆底烧瓶，二氯甲烷溶解，称取DCC 0.098g和DMAP 0.006g溶于二氯甲烷，将其缓慢滴加至原料中约30min滴完，搅拌反应，薄层色谱跟踪反应进程，10h反应结束。过滤掉不溶物，减压蒸除溶剂，硅胶层析柱分离(二氯甲烷/乙酸乙酯＝6:1)，得到BOC-罗汉果醇衍生物；

步骤d，将BOC-氨基酸酯溶于4ml无水二氯甲烷，常温下，量取0.2ml三氟乙酸缓慢加入，搅拌反应，薄层色谱跟踪反应进程，2h反应结束，碳酸氢钠溶液(pH＝8)和饱和食盐水各洗一遍，硅胶层析柱分离(二氯甲烷/乙酸乙酯＝1:1)，得到罗汉果醇半胱氨酸酯类衍生物。

实施例3：

用于祛斑、除细纹、黑眼圈和眼袋的复合物，包括重量比为1:1.8的罗汉果醇甲硫氨酸酯类衍生物和玫瑰花渣醇提取物。其中，玫瑰花渣醇提取物的制备步骤为：将玫瑰花渣按料液比1:25(g/mL)加入50％乙醇溶液后置于超声萃取仪中，超声辅助提取45min，过滤除去悬浮颗粒，取滤液再于13000rpm下离心15min，收集上清，旋转蒸发除去提取剂，真空冷冻干燥，即得玫瑰花渣醇提取物。

实施例4：

用于祛斑、除细纹、黑眼圈和眼袋的复合物，包括重量比为1:1.8的罗汉果醇半胱氨酸酯类衍生物和玫瑰花渣醇提取物。其中，玫瑰花渣醇提取物的制备步骤为：将玫瑰花渣按料液比1:25(g/mL)加入50％乙醇溶液后置于超声萃取仪中，超声辅助提取45min，过滤除去悬浮颗粒，取滤液再于13000rpm下离心15min，收集上清，旋转蒸发除去提取剂，真空冷冻干燥，即得玫瑰花渣醇提取物。

对比例1：

用于祛斑、除细纹、黑眼圈和眼袋的复合物仅包括玫瑰花渣醇提取物。

试验例1：

1.罗汉果醇衍生物和复合物对Hacat细胞和黑素细胞增殖的影响

1.1Hacat细胞：将Hacat细胞以1×10⁵/mL的密度种植于96孔板，每孔100μL，分为6组(分别为实施例1组、实施例2组、实施例3组、实施例4组、对比例1组和对照组)，每组6个复孔，置于5％CO₂、37℃恒温培养箱中培养24h，待细胞铺满培养孔底部60-70％时，吸除培养液，用PBS冲洗两次，分别加入用PBS配成的实施例1-2罗汉果醇衍生物溶液(浓度为10μg/mL)、实施例3-4复合物溶液(复合物溶液中罗汉果醇衍生物的浓度为10μg/mL，玫瑰花渣醇提取物的浓度为18μg/mL)、对比例1复合物溶液(浓度为18μg/mL)、对照组只加入PBS，继续培养24h后吸除培养液，每孔加入20μL用PBS配成的MTT(5mg/mL)，放置于5％CO₂、37℃恒温培养箱中3h，去培养液，加入150μL DMSO后震荡10min，置于酶标仪570nm读取吸光度值，比较各组OD值。结果如图1所示，从图1中可以看出，实施例1-2罗汉果醇衍生物、实施例3-4复合物、对比例1复合物均能抑制HaCat细胞增殖，其中，实施例3-4复合物的抑制效果最好，实施例1-2罗汉果醇衍生物的抑制效果次之，这说明罗汉果醇衍生物能够抑制Hacat细胞的增殖，而玫瑰花渣醇提取物能够增强罗汉果醇衍生物抑制Hacat细胞增殖的活性。

2.2黑素细胞细胞：黑素细胞的增殖检测同Hacat细胞。结果如图2所示，从图2中可以看出，实施例1-2罗汉果醇衍生物、实施例3-4复合物、对比例1复合物均能抑制黑素细胞的增殖，其中，实施例3-4复合物的抑制效果最好，实施例1-2罗汉果醇衍生物的抑制效果次之，这说明罗汉果醇衍生物能够抑制黑素细胞的增殖，而玫瑰花渣醇提取物能够增强罗汉果醇衍生物抑制黑素细胞增殖的活性。

2.Hacat细胞SCF蛋白的表达和黑素细胞C-kit受体蛋白的表达

皮肤上斑的色素加深主要是由于皮肤中的黑素颗粒增多引起的，干细胞因子(stem cell factor SCF)和C-kit受体是其中一对重要的细胞因子，在黑素代谢中起关键作用。UVB照射可以引起皮肤色素沉着，UVB照射可以促进黑素细胞增殖，增加黑素合成。本试验例通过观察UVB、罗汉果醇衍生物和复合物处理下Hacat细胞/黑素细胞SCF和C-kit蛋白的表达情况，研究罗汉果醇衍生物和复合物的祛斑效果。

设立12组，各组为：

DMEM培养基组，即DMEM组；

实施例1罗汉果醇衍生物溶液组，罗汉果醇衍生物的浓度为10μg/mL，即实施例1组；

实施例2罗汉果醇衍生物溶液组，罗汉果醇衍生物的浓度为10μg/mL，即实施例2组；

实施例3复合物溶液组，复合物溶液中罗汉果醇衍生物的浓度为10μg/mL，玫瑰花渣醇提取物的浓度为18μg/mL，即实施例3组；

实施例4复合物溶液组，复合物溶液中罗汉果醇衍生物的浓度为10μg/mL，玫瑰花渣醇提取物的浓度为18μg/mL，即实施例4组；

对比例1复合物溶液组，复合物溶液中玫瑰花渣醇提取物的浓度为18μg/mL，即对比例1组；

UVB照射组，40mJ/cm² UVB预照射30min，即UVB组；

UVB照射+实施例1罗汉果醇衍生物溶液组，40mJ/cm² UVB预照射30min，后再用实施例1罗汉果醇衍生物溶液处理，罗汉果醇衍生物的浓度为10μg/mL，即UVB 1组；

UVB照射+实施例2罗汉果醇衍生物溶液组，40mJ/cm² UVB预照射30min，后再用实施例2罗汉果醇衍生物溶液处理，罗汉果醇衍生物的浓度为10μg/mL，即UVB 2组；

UVB照射+实施例3复合物溶液组，40mJ/cm² UVB预照射30min，后再用实施例3复合物溶液处理，复合物溶液中罗汉果醇衍生物的浓度为10μg/mL，玫瑰花渣醇提取物的浓度为18μg/mL，即UVB 3组；

UVB照射+实施例4复合物溶液组，40mJ/cm² UVB预照射30min，后再用实施例4复合物溶液处理，复合物溶液中罗汉果醇衍生物的浓度为10μg/mL，玫瑰花渣醇提取物的浓度为18μg/mL，即UVB 4组；

UVB照射+对比例1复合物溶液组，40mJ/cm² UVB预照射30min，后再用对比例1复合物溶液处理，复合物溶液中罗汉果醇衍生物的浓度为10μg/mL，玫瑰花渣醇提取物的浓度为18μg/mL，即UVB 5组。

具体步骤为：取对数生长期Hacat细胞，待细胞铺满培养瓶70％时，根据分组对其进行处理，继续培养24h。吸除培养液，用PBS冲洗两次，细胞刮刷刮瓶底细胞，然后用移液器将细胞碎片转移至1.5mL EP管中，4℃、12000r/min、5min离心，弃上清；每个EP管加入300μLRIPA细胞裂解液，冰上均匀裂解30min；裂解完成后用BCA法测定蛋白浓度。根据所测蛋白浓度，计算40μg溶液蛋白的体积为上样量。将40μg样品蛋白SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜上，封闭后加入相应的一抗(用5％脱脂奶粉封闭液稀释过的SCF、β-actin抗体，稀释度为1:1000)，4℃过夜孵育。一抗反应结束后，用1×TBST在摇床上室温洗3次，每次10min；再加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(稀释度为1:1000)，室温孵育2h，二抗孵育结束后用1×TBST在摇床上室温洗3次，每次10min；最后用ECL试剂盒显影拍照，测得Hacat细胞SCF蛋白的表达。再用同样的方法检测黑素细胞的C-kit蛋白表达。Hacat细胞SCF蛋白的表达结果如图3所示，可以看出，与DMEM培养基组相比，实施例1-2罗汉果醇衍生物、实施例3-4复合物、对比例1复合物均能抑制Hacat细胞SCF蛋白表达，其中，实施例3-4复合物的抑制效果最好，实施例1-2罗汉果醇衍生物的抑制效果次之，这说明罗汉果醇衍生物能够抑制Hacat细胞SCF蛋白表达，而玫瑰花渣醇提取物能够增强罗汉果醇衍生物抑制Hacat细胞SCF蛋白表达的活性；与DMEM培养基组相比，UVB能促进Hacat细胞SCF蛋白表达，实施例1-2罗汉果醇衍生物、实施例3-4复合物、对比例1复合物均能抑制UVB促进Hacat细胞SCF蛋白表达能力，其中，实施例3-4复合物的抑制效果最好，实施例1-2罗汉果醇衍生物的抑制效果次之，这说明罗汉果醇衍生物能够抑制抑制UVB促进Hacat细胞SCF蛋白表达能力，而玫瑰花渣醇提取物能够增强罗汉果醇衍生物的活性。

黑素细胞的C-kit蛋白的表达结果如图4所示，可以看出，与DMEM培养基组相比，实施例1-2罗汉果醇衍生物、实施例3-4复合物、对比例1复合物均能抑制黑素细胞的C-kit蛋白的表达，其中，实施例3-4复合物的抑制效果最好，实施例1-2罗汉果醇衍生物的抑制效果次之，这说明罗汉果醇衍生物能够抑制黑素细胞的C-kit蛋白表达，而玫瑰花渣醇提取物能够增强罗汉果醇衍生物抑制黑素细胞的C-kit蛋白的活性；与DMEM培养基组相比，UVB能促进黑素细胞的C-kit蛋白表达，实施例1-2罗汉果醇衍生物、实施例3-4复合物、对比例1复合物均能抑制UVB促进黑素细胞的C-kit蛋白表达能力，其中，实施例3-4复合物的抑制效果最好，实施例1-2罗汉果醇衍生物的抑制效果次之，这说明罗汉果醇衍生物能够抑制抑制UVB促进黑素细胞的C-kit蛋白表达能力，而玫瑰花渣醇提取物能够增强罗汉果醇衍生物的活性。

试验例2：

罗汉果醇衍生物和复合物对酪氨酸酶活性的影响

酪氨酸酶是一种含铜氧化还原酶，参与黑色素合成的前两个步骤，不仅影响黑色素合成的速率，而且标记着黑素细胞的分化和成熟，在黑色素的合成中起关键作用。酪氨酸酶的活性决定了黑色素的合成量。因此，通过抑制酪氨酸酶的活性，可以减少黑色素的产生。本试验例测定罗汉果醇衍生物和复合物对酪氨酸酶活性的影响，具体方法为：

待测样品溶液为：用PBS配成的实施例1-2罗汉果醇衍生物溶液(浓度为10μg/mL)、实施例3-4复合物溶液(复合物溶液中罗汉果醇衍生物的浓度为10μg/mL，玫瑰花渣醇提取物的浓度为18μg/mL)、对比例1复合物溶液(浓度为18μg/mL)。

将110μL的酪氨酸溶液分别加入96孔板的三个孔中，记为1号、2号、3号，在1号孔中加入70μL样品溶剂，在2、3孔中加入已配制好的待测样品溶液70μL，然后，在1、2号孔加入30μL酪氨酸酶溶液(溶于磷酸盐缓冲溶液)，用磷酸盐缓冲溶液将三个孔内的溶液体积补至210μL，体系中酶的终浓度为173U/mL。将反应液于30℃孵育后，在492nm处测其吸光值，计为A₁、A₂、A₃，待测样品对酪氨酸酶活性的抑制率(％)通过下式：

抑制率(％)＝(1-(A₂-A₃)/A₁)×100％；其中，

A₁-底物、酪氨酸酶在样品溶剂存在下体系反应的吸光度；

A₂-底物、酪氨酸酶在抑制剂存在下体系反应的吸光度；

A₃-底物、抑制剂反应的吸光度。

罗汉果醇衍生物和复合物对酪氨酸酶活性的抑制率如图5所示，可以看出，实施例1-2罗汉果醇衍生物、实施例3-4复合物、对比例1复合物均能抑制酪氨酸酶活性，其中，实施例3-4复合物的抑制效果最好，实施例1-2罗汉果醇衍生物的抑制效果次之，这说明玫瑰花渣醇提取物能够增强罗汉果醇衍生物抑制酪氨酸酶的活性，减小黑色素的产生。

试验例3：

罗汉果醇衍生物和复合物对胶原蛋白的影响

用活化后的MMP-1水解特殊的荧光底物FRET后，被酶解的产物能够发出荧光。对MMP-1活力有抑制作用的样品可以抑制或终止该反应的发生，从而使生成的产物减少，荧光强度降低。因此，可通过检测荧光强度的变化，间接反映酶活力的变化，从而反映试验组样品对MMP-1活性的抑制情况。本试验例通过构建抑制MMP-1活性试验反应体系，评估罗汉果醇衍生物和复合物对MMP-1活性的抑制能力，其中待测样品溶液为：用PBS配成的实施例1-2罗汉果醇衍生物溶液(浓度为10μg/mL)、实施例3-4复合物溶液(复合物溶液中罗汉果醇衍生物的浓度为10μg/mL，玫瑰花渣醇提取物的浓度为18μg/mL)、对比例1复合物溶液(浓度为18μg/mL)。本试验的反应体系如表1所示，按照表1中顺序，加样结束后，37℃避光孵育5min，然后加入25μL荧光底物FRET。用荧光酶标仪在Ex/Em＝490nm/520nm立刻检测得荧光值F₁后，37℃避光孵育30min，用荧光酶标仪在490nm/520nm测试荧光值，得F₂。MMP-1活性抑制率按下式计算：

抑制率(％)＝(1-(F_2试验组-F_1试验组)/(F_{2阴性对照组}-F_{1阴性对照组}))×100％；其中，

F₁-反应刚开始时体系的荧光值；

F₂-反应30min时体系的荧光值。

结果如图6所示，可以看出，实施例1-2罗汉果醇衍生物、实施例3-4复合物、对比例1复合物均能抑制MMP-1活性，其中，实施例3-4复合物的抑制效果最好，实施例1-2罗汉果醇衍生物的抑制效果次之，这说明玫瑰花渣醇提取物能够增强罗汉果醇衍生物抑制MMP-1的活性，有效保护胶原蛋白及蛋白多糖，降低老化损伤。

表1抑制MMP-1活性试验反应体系

试验例4：

罗汉果醇衍生物和复合物对大鼠耳廓局部血流量的影响

1.分组与给药：SD大鼠，体重140-200g，雌雄各半，随机分成空白对照组、基质对照组、模型对照组、试验组，每组8只，药物配制方法见表2。其中中剂量为人临床常规用量。

表2药物配制方法

2.使用激光散斑血流监测视频系

统监测SD大鼠耳廓血流，此系统不但可以掌握血流灌注的空间分布，而且能够直观地观察血流实时动态变化。将麻醉的大鼠固定在台面，不同给药组均匀涂抹于大鼠右侧耳廓，监测给药前、后耳廓固定位置5min的平均血流灌注量，计算血流变化率(％)，公式为：血流变化率(％)＝(血流灌注量_给药后－血流灌注量_给药前)/血流灌注量_给药前×100％。结果如表3，可以看出，实施例1-2罗汉果醇衍生物、实施例3-4复合物均能降低耳廓局部血流灌注量，其中，实施例3-4复合物的抑制效果最好，实施例1-2罗汉果醇衍生物的抑制效果次之，这说明玫瑰花渣醇提取物能够增强罗汉果醇衍生物降低血流量的活性，有效保护胶原蛋白及蛋白多糖，降低老化损伤，从而达到治疗黑眼圈和眼袋的目的。

表3对大鼠耳廓局部血流量变化率

组别	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	对比例1
						血流变化率(％)	-28.33±0.76	-25.68±0.83	-48.54±1.06	-51.67±1.10	13.25±0.54

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。