阅读说明：本技术 一种具有抗菌性能的杂萘联苯聚芳醚腈及其表面改性方法 (Heteronaphthalene biphenyl poly (arylene ether nitrile) with antibacterial property and surface modification method thereof ) 是由 蹇锡高 柳承德 刘程 王锦艳 张守海 翁志焕 于 2019-08-02 设计创作，主要内容包括：本发明属于医用高分子生物材料领域,具体涉及一种表面抗菌改性的含二氮杂萘酮联苯结构聚芳醚腈抗菌材料及其制备方法。所述材料为杂萘联苯聚芳醚腈平面表面或三维表面化学键接抗菌活性涂层,抗菌活性涂层包括具有抗菌活性的阳离子抗菌多肽层；阳离子抗菌多肽以化学键接的方法固定在杂萘联苯聚芳醚腈表面。本发明在不影响聚芳醚腈力学性能的前提下,能够改善聚芳醚腈材料的生物相容性,并使其具有抗菌性能,制备方法简单,适于应用于生物医用材料领域。(The invention belongs to the field of medical polymer biomaterials, and particularly relates to a surface antibacterial modified polyarylether nitrile antibacterial material containing a phthalazinone biphenyl structure and a preparation method thereof. The material is a naphthalene-doped biphenyl poly (arylene ether nitrile) planar surface or three-dimensional surface chemically bonded antibacterial active coating, and the antibacterial active coating comprises a cationic antibacterial polypeptide layer with antibacterial activity; the cationic antibacterial polypeptide is fixed on the surface of the heteronaphthalene biphenyl poly (arylene ether nitrile) by a chemical bonding method. The invention can improve the biocompatibility of the poly (arylene ether nitrile) material without influencing the mechanical property of the poly (arylene ether nitrile), and enables the poly (arylene ether nitrile) material to have antibacterial property.)

一种具有抗菌性能的杂萘联苯聚芳醚腈及其表面改性方法

技术领域

本发明属于医用高分子生物材料领域，具体涉及一种表面抗菌改性的含二氮杂萘酮联苯结构聚芳醚腈抗菌材料及其制备方法。

背景技术

抗菌材料是解决由植入器械引发的细菌感染的有效途径。在医疗领域中，口腔，骨科，皮肤科等每年都需要大量的抗菌材料。通常情况，一种抗菌材料在将细菌杀死的同时，也会对细胞有一定的破坏作用，所以在生物安全性与抗菌活性之间有很大的争论。因此，得到一种既可以抑制细菌不断增殖，又具有很高的生物相容性的材料，具有很好的应用前景。

杂萘联苯聚芳醚腈是一类性能优异的高性能热塑性树脂，力学性能与骨的力学性能相匹配。但是，杂萘联苯聚芳醚腈的生物相容性及抗菌性能限制了其作为骨植入材料的应用，本发明拟在杂萘联苯聚芳醚腈表面固定具有抗菌性能的阳离子多肽，以避免因材料植入后，产生的细菌感染，导致骨植入失败。

发明内容

为解决现有技术中杂萘联苯聚芳醚腈的生物相容性及抗菌性能的问题，本发明的目的是提供一种具有抗菌性能的杂萘联苯聚芳醚腈及其表面改性方法。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明一方面提供了一种改性聚芳醚腈抗菌材料，所述抗菌材料为杂萘联苯聚芳醚腈平面表面或三维表面化学键接抗菌活性涂层；所述涂层包括具有抗菌活性的阳离子抗菌多肽层；

所述杂萘联苯聚芳醚腈的结构表达式为：

其中，Ar₁为双卤单体的主体结构，是含有氰基结构的双卤单体：

Ar₂为双酚单体的主体结构，是下列结构中的任意一种或两种以上组合：

其中，R₁、R₂、R₃、R₄是氢、卤素取代基、苯基、苯氧基、含有至少1个碳原子的直链烷基、含有至少1个碳原子的带支链的烷基或含有至少1个碳原子的带支链的烷氧基，R₁、R₂、R₃和R₄的结构相同或不同；

m是正整数；

n是0或正整数。

上述含二氮杂萘酮联苯结构的聚芳醚腈的玻璃化转变温度不低于150℃，热失重5％分解温度不低于300℃，所述聚芳醚特性粘度为0.1-0.9dL/g。上述一种改性聚芳醚腈抗菌材料，所述阳离子抗菌多肽为天然抗菌多肽和人工合成的阳离子多肽中的一种。

上述一种改性聚芳醚腈抗菌材料，所述人工合成的阳离子多肽为结构中巯基作为端基的含有或不含有聚乙二醇结构的胺引发赖氨酸与苯丙氨酸的开环聚合得到的嵌段阳离子多肽或者端基为羧基或者氨基的阳离子抗菌多肽。

本发明另一方面提供了一种改性聚芳醚腈抗菌材料的制备方法，所述方法包括将阳离子抗菌多肽以化学键接的方法固定在杂萘联苯聚芳醚腈表面。

上述一种改性聚芳醚腈抗菌材料的制备方法，所述化学键接方法包括利用点击化学反应，完成对阳离子多肽的固定或EDC/NHS偶联剂的方法,将含有氨基或者羧基的抗菌多肽化学键接到杂萘联苯聚芳醚腈表面。

所述点击化学反应为含二氮杂萘酮联苯结构聚芳醚腈经羧基改性表面带有羧酸基团，再经表面氨基化和表面碘化，将碘化后的聚芳醚腈浸入阳离子抗菌多肽溶液中反应，即得所需改性聚芳醚腈抗菌材料。

更为具体的，所述点击化学反应具体包括以下步骤：

(1)将带有平面结构或三维表面结构的含二氮杂萘酮联苯结构的聚芳醚腈(PPENK)置于1～6mol/L的KOH溶液中，在84～105℃下冷凝回流并进行磁力搅拌，水解反应时间为6小时～3天，反应结束后，将水解得到的材料置于浓度小于2mol/L的盐酸溶液中，再对材料进行水洗及烘干，备用；

或利用等离子体处理装置对杂萘联苯聚芳醚腈制件进行表面处理，在表面引入羧酸功能基团；

(2)以1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧酸基团，活化至少2小时，冲洗、干燥后浸入体积分数为0.8～2％(v/v)的乙二胺的PBS溶液，室温搅拌12～24小时，放入PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中洗涤，再用清水冲洗，在氮气流中干燥；其中EDC与NHS的摩尔比为大于2:1；

(3)氨基化的聚芳醚腈浸入到0.5～2mg/mL的碘乙酸N-琥珀酰亚胺的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，室温反应3～12小时后，依次用N，N-二甲基甲酰胺，乙醇清洗，再用清水冲洗，在氮气流中干燥；

(4)碘化后的聚芳醚腈浸入到含有0.5～2mg/mL的多肽的PBS溶液中，室温反应12～24小时，结束后，用PBS反复冲洗并烘干，再浸入含有3％～6％的三氟乙酸的水溶液中，冰水浴中反应1～5小时，用清水冲洗，在氮气流中干燥，即得所需改性聚芳醚腈抗菌材料。

所述EDC/NHS偶联剂的方法为含二氮杂萘酮联苯结构聚芳醚腈经羧基改性表面带有羧酸基团，再在其表面化学键接带有氨基的抗菌多肽；或对聚芳醚表面的羧基改性为氨基，再在其表面化学键接带有羧基的抗菌多肽，即得所需改性聚芳醚腈抗菌材料。

更为具体的，所述EDC/NHS偶联剂的方法具体包括以下步骤：

(1)将带有平面结构或三维表面结构的含二氮杂萘酮联苯结构的聚芳醚腈(PPENK)置于1～6mol/L的KOH溶液中，在84～105℃下冷凝回流并进行磁力搅拌，水解反应时间为6小时～3天，反应结束后，将水解得到的材料置于浓度小于2mol/L的盐酸溶液中，再对材料进行水洗及烘干，备用；或

利用等离子体处理装置对杂萘联苯聚芳醚腈制件进行表面处理，在表面引入羧酸功能基团；

(2)以1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧酸基团，活化至少2小时；

(3)将多肽浸入三氟乙酸溶液中，冰水浴反应1～5小时，清洗干燥；

(4)活化后的聚芳醚腈浸入到含有0.5～2mg/mL的多肽溶液中，室温反应12～24小时，清洗干燥，即得所需改性聚芳醚腈抗菌材料。

本发明第三方面提供了所述改性聚芳醚腈抗菌材料在生物医用材料中的应用。

本发明的有益效果：

1.本发明的改性聚芳醚腈抗菌材料，在杂萘联苯聚芳醚腈表面制备具有抗菌活性的涂层，改性后的材料具有较好的生物相容性和抗菌活性，在不影响聚芳醚腈力学性能的前提下，能够改善聚芳醚腈材料的生物相容性和抗菌活性，在生物医用材料方面有着广阔的应用前景。

2.本发明的改性方法简单，无需设备，成本低，可对复杂形状的生物医用器件进行表面改性。

3.通过在聚芳醚腈基底材料表面化学键接阳离子抗菌多肽可有效控制细菌滋生。

附图说明

图1是合成的多肽1和多肽2的核磁氢谱图；

图2是PPENK表面固定抗菌多肽的衰减全反射红外光谱图；

图3是MTT法测试材料细胞毒性；

图4是合成的多肽3的核磁氢谱图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明做进一步说明。

PPENK结构式如下：

实施例1制备改性聚芳醚腈抗菌材料

第一步，将粉末热压成型后，依次用去离子水、乙醇、丙酮及去离子水来清洗PPENK板，烘干备用。将PPENK板放入4mol/L的KOH溶液中，在102℃下冷凝回流并进行磁力搅拌，反应时间为24小时，反应结束后，将产物HPPENK片放入1mol/L的盐酸溶液中，超过5分钟后对材料进行水洗及烘干，备用；

第二步，将HPPENK放入10mL水中，加入0.7668g的EDC和0.1151gNHS,在室温下磁力搅拌2小时，以活化HPPENK样片表面的羧基，反应完后，用去离子水将样品清洗三次。将经过表面活化的HPPENK片浸入体积分数为1％(v/v)的乙二胺的PBS溶液，室温搅拌24小时后，放入PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中洗5分钟，再用清水冲洗3～5遍，在氮气流中干燥；

第三步，聚芳醚腈的表面碘化

将氨基化的聚芳醚腈浸入到1mg/mL的碘乙酸N-琥珀酰亚胺的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，室温反应6小时后，依次用N，N-二甲基甲酰胺，乙醇清洗5分钟，再用清水冲洗3～5遍，在氮气流中干燥；

第四步，合成多肽1和多肽2

准确称取1.192g(4.38mmol)Boc-L-Lys-NCA加入到50mL史莱克瓶中，再加入15mL无水DMF中，待溶解后加入0.292g(0.146mmol)SH-PEG₂₀₀₀-NH₂作为引发剂，在真空下室温搅拌72h后加入0.8366g(4.38mmol)Phe-NCA，补加5mL DMF，继续在真空下室温搅拌48h，反应结束后将反应液在搅拌下缓慢滴入无水***中。抽滤，烘干，得到多肽1。

准确称取1.192g(4.38mmol)Boc-L-Lys-NCA加入到50mL史莱克瓶中，再加入15mL无水DMF中，待溶解后加入0.016g(0.146mmol)半胱胺盐酸盐作为引发剂，在真空下室温搅拌72h后加入0.8366g(4.38mmol)Phe-NCA，补加5mL DMF，继续在真空下室温搅拌48h，反应结束后将反应液在搅拌下缓慢滴入无水***中。抽滤，烘干，得到多肽2。

第五步，制备聚芳醚腈抗菌材料

将碘化后的聚芳醚腈浸入到含有1mg/mL的多肽的PBS溶液中(多肽1或多肽2)，室温反应24小时，结束后，用PBS反复冲洗并烘干，再浸入含有5％的三氟乙酸的水溶液中，冰水浴中反应1～5小时，用清水冲洗3～5遍，在氮气流中干燥；即得到所需聚芳醚腈抗菌材料。

通过核磁氢谱确定合成的多肽结构的正确性。通过水接触角测量仪表征样品表面的亲疏水性，利用反射红外技术分析PPENK改性前后表面基团结构情况。采用X射线光电子能谱仪(XPS)分析PPENK表面改性前后的主要元素含量的变化情况。以MC3T3-E1小鼠胚胎成骨细胞前体细胞为测试细胞来表征材料的生物相容性。以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌来测试材料的抗菌性能。

上述方法制备的表面带有阳离子抗菌多肽的PPENK板，其性能如下：

测试例一

对所合成的多肽进行核磁氢谱测试，结果如图1所示。在核磁氢谱中的各个峰的位置，在多肽结构中均有归属。从多肽的核磁氢谱可以确认所合成的多肽结构正确。

测试例二

对得到的表面含有阳离子多肽的PPENK材料进行接触角测试，以及计算其表面能，结果如表1所示：

表1

PPENK-I为表面碘化的PPENK；PPENK/多肽1为多肽1固定到PPENK；PPENK/阳离子抗菌多肽1为PPENK/多肽1经过三氟乙酸处理后，裸露出阳离子；PPENK/多肽2为多肽2固定到PPENK；PPENK/阳离子抗菌多肽2为PPENK/多肽2经过三氟乙酸处理后，裸露出阳离子。

从材料的接触角数据可以看出，当在PPENK表面固定多肽以后，材料的接触角降低，亲水性增加，说明通过表面改性的方法，改善了材料表面的亲水性。

当在表面固定多肽后，PPENK的表面极性部分明显增大，而分散部分减小，说明由于多肽的固定，改变了PPENK表面的极性，使其亲水能力增强，为材料作为生物材料发挥作用提供了基础。

测试例三

对得到的表面含有阳离子抗菌多肽的PPENK进行表面红外测试，测试结果如图2所示。

从表面红外光谱图中可以看到，当表面固定了多肽以后，在3500cm^-1处左右出现了一个明显的氨基峰，同时在3080cm^-1处，饱和C-H的伸缩振动吸收峰的强度也明显增加，说明表面已成功固定多肽。

测试例四

对材料进行X-射线光电子能谱进行测试，结果如表2所示：

表2

从材料的XPS谱的数据可以看出，对比PPENK材料，当表面固定了阳离子抗菌多肽以后，N/C的含量明显增加，而O/C的含量减少，说明表面固定了阳离子多肽。

测试例五

采用MTT法对所得到的材料进行细胞毒性实验，将材料浸泡在细胞培养基中，得到材料的浸提液后，使用不同浓度的浸提液与小鼠前成骨细胞共同培养一天，结果如图3所示：

细胞毒性的结果显示，所得到的材料，细胞相对增殖率均达到90％以上，符合国标ISO10993对细胞毒性的要求，所得到的材料均无毒性。

测试例六

采用平板菌落计数法，以PPENK抑制细菌的菌落数为对照组计算，材料对抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效率如表3所示：

表3

通过计算，材料对细菌的抑制效率均达到75％以上，说明有较好的抑制效果。两种材料对大肠杆菌的抑制效率要好于对金黄色葡萄球菌的抑制效率。

实施例2

第一步，将PPENK粉末热压成型后，依次用去离子水、乙醇、丙酮及去离子水来清洗PPENK板，烘干备用。将PPENK片放入4mol/L的KOH溶液中，在102℃下冷凝回流并进行磁力搅拌，反应时间为24小时，反应结束后，将产物HPPENK片放入1mol/L的盐酸溶液中，超过5分钟后对材料进行水洗及烘干，备用；

第二步，将HPPENK放入10mL水中，加入0.7668g的EDC和0.1151gNHS,在室温下磁力搅拌2小时，以活化HPPENK样片表面的羧基，反应完后，用去离子水将样品清洗三次。

第三步，合成多肽3

准确称取1.192g(4.38mmol)Boc-L-Lys-NCA加入到50mL史莱克瓶中，再加入15mL无水DMF中，待溶解后加入0.292g(0.146mmol)Boc-PEG₂₀₀₀-NH₂作为引发剂，在真空下室温搅拌72h后加入0.8366g(4.38mmol)Phe-NCA，补加5mL DMF，继续在真空下室温搅拌48h，反应结束后将反应液在搅拌下缓慢滴入无水***中。抽滤，烘干，然后将合成的多肽，加入到含有500uL三氟乙酸的15mL氢溴酸/冰醋酸(33％)的溶液中，冰水浴下反应2h后，将反应液在搅拌下缓慢滴入无水***中。抽滤，烘干。

第四步，制备聚芳醚腈抗菌材料

将活化后的PPENK浸入到1mg/mL阳离子抗菌多肽的溶液中，室温反应24h后，将PPENK片取出，干燥，备用。

测试例七

合成的抗菌多肽的核磁氢谱图中，各个氢的出峰位置如图4所示。核磁氢谱可以确定多肽的结构正确。

测试例八

采用平板菌落计数法，以PPENK抑制细菌的菌落数为对照组计算，材料对抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效率如表所示：

PPENK/阳离子抗菌多肽3为多肽3固定到PPENK，经过三氟乙酸处理后，裸露出阳离子。

通过计算，材料对细菌的抑制效率均达到75％以上，说明有较好的抑制效果。两种材料对大肠杆菌的抑制效率要好于对金黄色葡萄球菌的抑制效率。

对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。