阅读说明：本技术 一种新骨架大环混合肽聚酮化合物及其制备方法和用途 (Novel framework macrocyclic mixed peptide polyketide and preparation method and application thereof ) 是由 邓赟 李鸿翔 谭玉柱 刘海峰 但小梅 郭大乐 彭腾 于 2018-08-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种新骨架大环混合肽聚酮化合物及其制备方法和用途。本发明提供了式Ⅰ所示化合物或其立体异构体、晶型或药学上可接受的盐：其中,R选自氢、羟基、卤素、C<Sub>1</Sub>～C<Sub>4</Sub>的烷氧基、C<Sub>1</Sub>～C<Sub>6</Sub>的烷基。本发明还提供了上述化合物的制备方法以及用途。实验结果证明,本发明提供的化合物能够抑制神经细胞的凋亡,具有神经保护作用,可作为防治神经退行性疾病的潜在药物,为临床提供了一种新的用药选择。(The invention discloses a novel skeleton macrocyclic mixed peptide polyketide, a preparation method and application thereof. The invention provides a compound shown as a formula I or a stereoisomer, a crystal form or a pharmaceutically acceptable salt thereof: wherein R is selected from hydrogen, hydroxyl, halogen and C 1 ～C 4 Alkoxy group of (C) 1 ～C 6 Alkyl group of (1). The invention also provides a preparation method and application of the compound. Experimental results prove that the compound provided by the invention can inhibit apoptosis of nerve cells, has a neuroprotective effect, can be used as a potential drug for preventing and treating neurodegenerative diseases, and provides a new drug choice for clinic.)

一种新骨架大环混合肽聚酮化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种新骨架大环混合肽聚酮化合物及其制备方法和用途。

背景技术

伏康树(Voacanga africana Stapf.)，又名非洲马铃果，为夹竹桃科(Apocynaceae)马铃果属(Voacanga)植物，主产于西非、刚果、坦桑尼亚等地。在非洲传统医药领域中占有重要地位，常用于治疗麻风病、痢疾、全身性水肿、小儿惊厥、癫痫、利尿剂、小孩补药。茎和树皮的煎液被用于治疗精神障碍，树胶被用于制粒齿历。树皮的煎液被认为是止痛剂而被添加于跌打损伤药之中。树皮和根汤剂也被用来治疗心脏痉挛。树皮和根的煎液还被用于治疗噎隔，果实煎液还被当作消毒剂使用，叶的煎液被用于治疗小儿咳喘。另外，含有伏康树成分的煎液是热带地区治疗腹泻的首选良药。

从已有报道来看，从伏康树中分离的化合物主要为生物碱类、黄酮类、单宁、类固醇和萜类、挥发油等，其中吲哚型生物碱为伏康树的主要生物活性成分，对多种细胞肿瘤细胞株有良好的抑制活性。CN106243078A公开了从伏康树中提取得到具有抗肿瘤、降压作用的一系列化合物。但小梅(但小梅.伏康树树皮化学成分及抗肿瘤活性研究[D].成都中医药大学,2014)从伏康树树皮中分离出了一系列具有抗肿瘤活性的化合物。

目前，未见从伏康树中分离出本发明化合物的报道。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了式Ⅰ所示化合物或其立体异构体、晶型或药学上可接受的盐：

其中，R选自氢、羟基、卤素、C₁～C₄的烷氧基、C₁～C₆的烷基。

进一步地，所述式Ⅰ化合物具有式Ⅱ所示结构：

进一步地，所述式Ⅱ化合物的结构如下：

本发明还提供了上述化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)取伏康树树皮，乙酸乙酯提取，即得乙酸乙酯浸膏；

(2)取乙酸乙酯浸膏，用硅胶柱色谱分离，以石油醚：乙酸乙酯＝3:1v/v为洗脱剂进行洗脱，得Fr1；

(3)取Fr1，用硅胶柱色谱分离，以石油醚：丙酮＝5:1v/v为洗脱剂进行洗脱，得Fr1-1、 Fr1-2、Fr1-3三个组分；

(4)取含有目标化合物的组分Fr1-2，用反向硅胶色谱柱分离，依次以甲醇：水＝65:35、 70:30v/v为洗脱剂进行梯度洗脱，得Fr1-2-1、Fr1-2-2两个组份；

(5)取含有目标化合物的组分Fr1-2-2，用MCI柱分离，依次以甲醇：水＝80:20、85:15v/v为洗脱剂进行梯度洗脱，得Fr1-2-2-1、Fr1-2-2-2、Fr1-2-3三个组份，检测后即可确定Fr1-2-2-2为目标化合物。

进一步地，步骤(1)中，所述伏康树树皮与乙酸乙酯的重量比为1:10～15，优选为1:14。

进一步地，步骤(1)中，所述提取为渗滤提取。

本发明还提供了上述化合物或其立体异构体、晶型或药学上可接受的盐在制备神经保护药物中的用途。

进一步地，所述药物是治疗和/或预防神经退行性疾病的药物。

本发明还提供了一种具有神经保护作用的药物，它是以上述的化合物或其立体异构体、晶型或药学上可接受的盐为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

实验结果证明，本发明提供的化合物能够抑制神经细胞的凋亡，具有神经保护作用，可作为防治神经退行性疾病的潜在药物，为临床提供了一种新的用药选择。

关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。

“取代”是指分子中的氢原子被其它不同的原子或分子所替换。

碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀(C_a～C_b)烷基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。因此，例如，(C₁～C₆)烷基是指包含1～6个碳原子的烷基。

所述C₁～C₆烷基是指C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆的烷基，即具有1～6个碳原子的直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、己基等等。

所述烷氧基是指环状烷基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等等。

所述卤素是指氟原子、溴原子、氯原子、碘原子。

术语“药学上可接受的盐”是指上述化合物或其立体异构体，与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将上述化合物，或其立体异构体，与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的

具体实施方式

，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为本发明实施例1所制备的化合物的质谱图。

图2为本发明实施例1所制备的化合物的紫外可见吸收光谱图。

图3为本发明实施例1所制备的化合物的红外光谱图。

图4为本发明实施例1所制备的化合物的¹H-NMR图。

图5为本发明实施例1所制备的化合物的¹³C-NMR图。

图6为本发明实施例1所制备的化合物的DEPT图。

图7为本发明实施例1所制备的化合物的¹H-¹H-COSY图。

图8为本发明实施例1所制备的化合物的HSQC图。

图9为本发明实施例1所制备的化合物的HMBC图。

图10为本发明实施例1所制备的化合物的单晶模型。

图11为本发明实施例1所制备化合物¹H-¹H COSY谱中不同位置H的相关关系图。

图12为本发明实施例1所制备化合物HMBC谱中不同位置H的相关关系图。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，均可通过市场购买得到。

实施例1、本发明化合物的制备

1、实验材料

1.1实验试剂

柱层析硅胶，200～300目(试验级)，青岛海洋硅胶干燥剂厂。

MCI gel CHP 20P，75～150μm，日本三菱化学公司。

gel ODS-A，50μm，日本YMC公司。

石油醚、乙酸乙酯、丙酮等分析纯试剂，均购于成都科龙化工试剂厂。

1.2实验仪器

Q-TOFII高分辨飞行时间质谱仪(美国Bruker)；

Bruker-AV-800核磁共振仪(瑞士Bruker)；

傅里叶变换红外光谱仪(Perkin-Elmer)；

V-650紫外光谱仪(JASCO)；

RE-2000B旋转蒸发仪(上海亚荣仪器公司)；

Perkin-Elmer 341旋光测定仪(美国Perkin-Elmer)；

十万分之一万分之一天平(瑞士Sartorius)；

DZF-6050型真空干燥箱(上海琅玕实验设备有限公司)。

1.3实验药材

伏康树药材，购自非洲加纳，经四川大学刘海峰博士鉴定为夹竹桃科植物伏康树(Voacanga Africana Stapf.)的树皮。

2实验方法

(1)称取伏康树树皮14.5kg，粉碎，加入14倍量的乙酸乙酯渗滤提取后，减压干燥渗滤液，得乙酸乙酯浸膏546g；

(2)采用硅胶柱色谱对乙酸乙酯浸膏分离，以石油醚：乙酸乙酯＝3:1v/v为洗脱剂(5 个柱体积)进行洗脱，减压回收溶剂，得Fr1组分；

(3)取Fr1，用硅胶柱色谱分离，以石油醚：丙酮＝5:1v/v为洗脱剂(4个柱体积) 进行洗脱，得Fr1-1、Fr1-2、Fr1-3三个组分；

(4)取含有目标化合物的组分Fr1-2，用反向硅胶色谱柱分离，依次以甲醇：水＝65:35、 70:30v/v为洗脱剂(5个柱体积)进行梯度洗脱，得Fr1-2-1、Fr1-2-2两个组份；

(5)取含有目标化合物的组分Fr1-2-2，用MCI柱分离，依次以甲醇：水＝80:20、85:15v/v为洗脱剂(5个柱体积)进行梯度洗脱，得Fr1-2-2-1、Fr1-2-2-2、Fr1-2-3三个组份，在Fr1-2-2-2得到目标化合物。

3目标化合物的鉴定

目标化合物为无色针状晶体，熔点为141-142℃，HR-ESI(+)-MS正离子模式显示该化合物的准分子离子峰为m/z 434.3209([M+Na]⁺,C₂₄H₄₅NO₄Na，计算值为434.3241(见图1)，确定其分子式为C₂₄H₄₅NO₄，不饱和度为3。

UV中λ_max(ACN)＝199nm(见图2)，推测该化合物没有共轭双键。

IR(KBr)显示化合物中存在缔合的羟基峰(ν_OH＝3418cm^-1,δ_OH＝1459cm^-1)；仲胺基(ν_N-H＝3318cm-¹,ν_C＝O＝1649cm^-1,δ_N-H＝1536cm-¹)；酯基(ν_C＝O＝1731cm^-1,ν_O-C(O)-C＝1189cm^-1)；甲基与亚甲基(ν_CH3＝2964cm^-1,ν_CH2＝2933cm^-1)；721cm^-1的峰显示结构中存在4个以上直接相连的亚甲基，具体数据见图3。

¹H-NMR(见图4)谱共显示44个氢信号，与分子式中45个氢原子相差1，推测为羟基的质子信号由于交换而甄没在谱图中；谱图中共存在6组甲基信号(δ_H 0.85,0.88,0.89,0.91,0.92,0.98)，一组酰胺质子信号(δ_H 6.06)；¹³C-NMR(见图5)和DEPT谱(见图6) 显示结构中存在2个羰基，7个次甲基，9个亚甲基，6个甲基，由于化合物的不饱和度为3，2个羰基的不饱和度为2，又由于结构中没有共轭结构，推测另外一个不饱和度由环构成；¹H-¹H COSY谱(见图7)显示N-H＝δ_H 6.06,H₁₅＝δ_H 4.66,H₁₆＝δ_H 2.19,H₁₇＝δ_H 0.89,H₁₈＝δ_H 0.98为一个偶合系统，他们相关关系如图11所示。

HSQC谱(见图8)得到与氢直接相连的碳的化学位移；HMBC谱(见图9)显示N-H＝δ_H6.06,H₁₅＝δ_H 4.66和δ172.99,δ172.90存在相关信号，综合以上信息我们得到片段 1：

同理，H₉＝δ_H 3.26,H₁₀＝δ_H 1.57,H₂₄＝δ_H 0.89,H₁₁＝δ_H 0.88/1.15,H₁₂＝δ_H 1.79,H₂₁＝δ_H 0.85,H₁₃＝δ_H 4.81,H₁₉＝δ_H 1.70,H₂₂＝δ_H 0.91,H₂₀＝δ_H 1.19/1.26,H₂₁＝δ_H 0.92,为一个偶合系统，他们的相关关系如图12所示。

HSQC谱得到与氢信号直接相连的碳的化学位移；综合以上信息我们得到片段2：

剩余的7个亚甲基只能按照片段3进行连接：

HMBC谱显示H₂＝δ_H 2.19,H₂＝δ_H 2.35与C₁＝δ_C 172.99存在相关关系，推测C-2与C-1位相连接；H₁₃＝δ_H 4.81与C₁₄＝δ_C 172.90存在相关关系，推测H₁₃＝δ_H 4.81与C-14 的酯键直接相连，剩余两个片段C-8、C-9连接形成一个17元环的大环内酯，加上羰基的 2个不饱和度，总不饱和度与计算值正好吻合，最终推测该化合物结构如式Ⅲ所示，¹H-NMR和¹³C-NMR数据见表1。

表1

4相对构型的确定

由于式Ⅲ化合物的谱图之间有重叠以及碳链的转动，无法利用NOE确定化合物的相对构型，通过单晶的培养，利用X单晶衍射确定了该化合物的相对构型，单晶衍射参数如表2所示，单晶模型如图10所示。

表2

5绝对构型的确定

取1mg式Ⅲ化合物加入1ml 6N的HCl，封管后在115℃的烘箱中孵化24h，在氮气的保护下除去HCl，加入100μL的丙酮和20μL 1M浓度的NaHCO₃和100μL的1％FDAA (丙酮)，密封后在45℃环境下反应1h，用2N HCl 10μL终止反应，样品加入500μL的 50％的乙腈-水溶液，取5μL利用高效液相进行分析(RP-18色谱柱，Inertsil ODS-3,5μm,4.6 mm×250mm)，柱温为30℃，检测波长为340nm，流速为1ml/min，流动相为乙腈-0.1％甲酸水，梯度变化为30min有机相从35％变化为55％。L-缬氨酸与D-缬氨酸采用同样的方式处理，结果为L-缬氨酸与-D缬氨酸的衍生物的保留时间为17.696min与22.107min，样品水解后的保留时间为17.750min，推测样品中的氨基酸为L-缬氨酸，最终确定了式Ⅲ化合物的绝对构型。

以下通过试验例的方式来说明本发明的有益效果。

试验例1

1实验材料

1.1实验药物

实施例1制备的式Ⅲ化合物；

尼莫地平，拜耳医药保健有限公司

1.2实验细胞

PC-12细胞，上海细胞库干细胞所

1.3样品配制

样品母液浓度为20mM，稀释100，200倍，即200，100μM应用液(加药体积20μL，总体系200μL，即样品终浓度为母液稀释1000，2000倍，20，10μM)。

2实验方法

①取对数生长期细胞10000个/孔，160μL/孔，接种于96孔板；

②培养24h后，分别加入待测样品20μL，每个浓度设置4个复孔；同时设置空白组，模型组，阳性药(尼莫地平20μM)组；加药预处理1h后，加入谷氨酸(15mM)，每孔 20μL。

③作用24h后，吸弃上清，补加含10％MTT新培养基，37℃孵育4h，加入三联液 (三联溶解液：SDS 10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml用双蒸水溶解配成100ml溶液) 孵育过夜，震荡溶解10min，570nm测定各孔吸光值。

计算方法：抑制率％＝(OD空白组-OD实验组)/OD空白组*100％

3实验结果

上述实验结果说明，本发明的化合物能够抑制谷氨酸诱导的PC-12细胞的凋亡，具有神经保护作用。

综上所述，本发明提供的化合物能够抑制神经细胞的凋亡，具有神经保护作用，可作为防治神经退行性疾病的潜在药物，为临床提供了一种新的用药选择。