芳酰基哌嗪类化合物及其制备方法和在抗病毒中的应用
阅读说明：本技术 芳酰基哌嗪类化合物及其制备方法和在抗病毒中的应用 (Aroyl piperazine compound, preparation method thereof and application thereof in antivirus ) 是由 李艳萍 李卓荣 岑山 彭宗根 李健蕊 王宜轩 全彦妮 周睿 于 2019-09-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一类芳酰基哌嗪类化合物及其制备方法和在抗病毒中的应用。所述的芳酰基哌嗪类化合物具有如下式I或式II所示的结构。本发明还提出了该类芳酰基哌嗪化合物的制备方法。研究发现该类化合物不仅对丙型肝炎病毒(HCV)具有抑制活性,并且对寨卡病毒复制也显示出抗病毒活性,本发明的提出为抗病毒药物的研究提供了一种新的技术手段。<Image he="181" wi="700" file="DDA0002213219960000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention discloses aroyl piperazine compounds, a preparation method thereof and application thereof in antivirus. The aroylpiperazine compound has a structure shown as a formula I or a formula II. The invention also provides a preparation method of the aroyl piperazine compound. Researches find that the compound is not only p-typeThe hepatitis virus (HCV) has inhibitory activity and also shows antiviral activity on replication of Zika virus, and the proposal of the invention provides a novel technical means for research of antiviral drugs.)
技术领域
本发明涉及一类新型芳酰基哌嗪类化合物及其制备方法，还涉及该类化合物在抗病毒药物中的应用，特别是抗HCV、寨卡、登革热等黄病毒药物的应用。
背景技术
病毒性疾病作为最常见的感染性疾病，由于其高传染和高变异的特点，已经成为全球性公共卫生问题。现有抗病毒药物的作用靶点多是病毒酶，病毒酶抑制剂类药物具有作用靶点明确、特异性高、疗效强的优点，但抗病毒谱窄，以及病毒的高变异倾向导致的耐药问题也很快成为这类药物的明显不足，新的病毒变种和未知病毒不断出现，更是让频现耐药问题的现有抗病毒药物无能为力。因此，新抗病毒药物研发迫在眉睫。寨卡病毒属于黄病毒科黄病毒属，可由虫媒传染，1948年首次被报道证实，由于引起的症状多数轻微，因此病例记载并不多见。但近十年里不断出现较大规模的寨卡病毒感染流行，并且有从太平洋地区向全球蔓延的趋势。虽然寨卡病毒感染不会引起严重后果，但近年的研究发现孕妇感染寨卡病毒后会引起婴儿小头症等出生缺陷问题，因此，2016年WHO将寨卡病毒感染列为威胁全球健康问题。到目前为止，还没有针对寨卡病毒的特异性抗病毒药物或疫苗上市，据报道有疫苗研究已经进入临床试验阶段，但抗病毒药物研究还处于临床前研究阶段。
发明人曾进行了大量的抗HCV药物研究，在此基础上，通过结构衍生和活性测试，我们进一步发现并证实了一类新型的芳酰基哌嗪化合物不仅对HCV具有抑制活性，并且对寨卡病毒复制也显示出抗病毒活性，由于早期的作用机制研究表明这类化合物的类似物并非直接作用于病毒复制的关键酶，与目前的直接抗病毒药物作用机制不同，因此，我们推测本发明所述类似化合物可能同样具有新颖的抗病毒机制。而且，本发明所述化合物及其作用，迄今为止未见有国内外相关文献的报道。
发明内容
本发明的主要目的在于，通过对新型芳酰基哌嗪类化合物的药物化学研究，发现了一系列新型抗病毒化合物及其药用盐，该类化合物对HCV复制显示出抑制作用的同时，也具有明显的抗寨卡病毒活性。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种芳酰基哌嗪类化合物或其药用盐，其具有如下式I或式I所示的结构：
其中，式I中：
X为羰基或砜基；
R1为含有1-4个碳的烷基或经烷氨基、二烷氨基、含有一个氮或两个氮的饱和或不饱和杂环基团取代的含有1-4个碳的烷基；
R2为氢或含有1-4个碳的烷基；
或者R1、R2和它们所连接的氮原子共同形成含有1或2个氮原子的环状结构或经取代基取代的环状结构，所述取代基选自含有1到6个碳的烷基、烷氨基、二烷氨基、环烷基或杂环基团；
R3为芳基、杂芳基或经1、2或3个取代基取代的芳基或杂芳基，其中，所述取代基选自烷基、氨基或取代的氨基、环烷基、烷氧基、卤素、氰基、卤代烷基或卤代烷氧基；
其中，式II中：
R4为含有1-4个碳的烷基或经烷氨基、二烷氨基、含有一个氮或两个氮的饱和或不饱和杂环基团取代的含有1-4个碳的烷基；
R5为氢或含有1-4个碳的烷基；
R6为氢、芳基取代的含有1-4个碳的烷基、1，2，3，4-四氢萘基或经含有1-3个碳的烷基或取代的烷基、卤素、氰基取代的1，2，3，4-四氢萘基。
其中，优选的，R1为其中，n＝1-3，R7和R8为H或含有1-4个碳的烷基或取代的烷基，或R7和R8与它们所键合的氮原子一起形成环状基团或取代的环状基团，取代基选自烷基、烷氨基、二烷基氨基或杂环基，所述环状基团是含有1或2个氮原子的三、四、五、六或七元饱和或不饱和环状基团，优选的，所述三元环状基团选自氮杂环丙烷，四元环状基团选自氮杂环丁烷，所述五元环状基团选自吡咯、吡咯烷、咪唑或噁唑基团，六元环状基团选自吗啉、哌嗪、哌啶、吡啶或嘧啶基团，七元环状基团选自1,4-二氮杂环庚烷基。
其中，优选的，R1和R2和它们所连接的氮原子共同形成饱和杂环或经被取代基取代的饱和杂环，所述杂环为含有一或两个氮原子的五、六或七元杂环，所述取代基选自含有1-6个碳原子的烷基、烷氧基、烷氨基、二C1-C4烷基氨基、含有3到5个碳原子的环烷基或含一个或两个氮的饱和或不饱和的杂环基团或经取代的上述基团；
其中，优选的，R1和R2和它们所连接的氮原子共同形成其中n＝1或2，R9为含有1-4个碳的烷基或烷氧基；
或者R1、R2与它们所键合的氮原子共同形成其中n＝1或2，R10和R11为含有1-4个碳的烷基；
或者R1、R2与它们所键合的氮原子共同形成其中R12为二C1-C4烷基氨基或经取代或非取代的含有一个或两个氮的不饱和杂环；所述的不饱和杂环为吡唑。
其中，优选的，R1为甲基、乙基、二甲基氨基乙基、二乙氨基乙基、(2-吡咯烷-1-基)乙基、(1H-咪唑-1-基)丙基、3-(1H-吡咯-1-基)丙基、2-(吗啉-4-基)乙基、2-(吡咯-1-基)乙基；
R2为氢或含有1-4个碳的烷基；
或者R1与R2与它们所键合的氮原子共同形成4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷、4-(二甲氨基)哌啶-1-基、1,4-二氮杂环庚烷-1-基、4-(4-甲基-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-基、4-(5-氨基-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-基、4-(2-(3-甲基-3H-二氮杂环丙烷-3-基)乙基)-1，4-二氮杂环庚烷-1-基、3-氨甲基吡咯烷-1-基、5-(3-(N,N-二甲氨基甲酰基)-1H-吡唑)氮杂环庚烷-1-基、(二甲氨基)甲基吡咯烷-1-基、4-甲基哌嗪-1-基、(二甲基氨基)吡咯烷-1-基、1,4-二氮杂环庚烷-1-基、4-乙酰基哌嗪-1-基；
R3为3,4-二氯苯基、5-氯苯并呋喃-2-基、3,4,5-氟苯基、4-氯苯基、4-叔丁基苯基、4-溴苯基、5-氯噻唑、2-氰基呋喃基、4-氟苯基、4-(三氟甲氧基)苯基、3-氯-4-氟苯基、4-甲氧基苯基、2，4-二氯苯基、4-乙酰基苯基、4-氰基苯基、5-硝基呋喃-2-基、苯基、4-(三氟甲氧基)苯基、4-叔丁基苯基、5-氯呋喃、嘧啶-4-基、吡啶-4-基、4-(二甲氨基)苯基、4-氯苯基、4-(三氟甲基)苯基、4-(3-氯-4-氟)苯基、呋喃基、4-硝基苯基、4-三氟甲基苯基、2-氰基苯基、5-氯苯并呋喃基；
R4为二甲基氨基乙基、3-(咪唑-1-基)丙基、(1-甲基氮杂环丁烷-3-基)甲基、
R5为氢或含有1-4个碳的烷基；
R6为氢、苯基乙基、四氢萘基-2-基、6-(三氟甲基)-1，2，3，4-四氢萘基-2-基、6-氰基-1，2，3，4-四氢萘-2-基、2-(4-氯苯基)乙基或6-氯-1，2，3，4-四氢萘-2-基。
其中，优选的，所述的化合物选自以下化合物：
4-[(2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基]-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈
2-((4-((3,4-二氯苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)苄腈；
2-((4-((5-氯苯并呋喃-2-基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)苄腈；
2-((4-((3,4,5-氟苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)苄腈；
2-((4-((4-氯苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)苄腈；
2-((4-((5-硝基呋喃-2-基)酰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)苄腈；
2-((4-(苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)苄腈；
4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((哌嗪-1-基)甲基)苄腈
4-(1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((哌嗪-1-基)甲基)苄腈
4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(4-(三氟甲氧基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(4-甲氧基-苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(4-(叔丁基)苯磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(4-三氟甲基苯磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(4-甲氧基苯磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈
4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(4-溴苯磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-((5-氯呋喃-2-基)甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-((5-氯噻吩-2-基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(4-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(嘧啶-4-基-甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(吡啶-4-基-甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(2-氯-4-氟苯磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈
4-(二甲氨基)2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈
4-(二甲氨基)-2-((4-(4-二甲氨基苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-(二甲氨基)-2-((4-(4-氯苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈
4-(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)-2-((4-(4-(三氟甲基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)-2-((4-(3-氯-4-氟苯磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-(双(2-(二甲氨基)乙基)氨基)-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈
4-(双(2-(二甲氨基)乙基)氨基)-2-((4-)4-甲氧基苯酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-((2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈
4-(甲基(2-(吡咯-1-基)乙基)氨基)-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈
4-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈
4-(3-(二甲氨基)吡咯烷-1-基)-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈
4-((2-(二乙氨基)乙基)(乙基)氨基)-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈
4-((2-(二甲氨基)乙基)(乙基)氨基)-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈
4-(哌嗪-1-基)-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈
5-((4-(2-氰基-5-((2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨基)苄基)哌嗪-1-基)磺酰基)呋喃-2-氰；
5-((4-(2-氰基-5-(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)苄基)哌嗪-1-基)磺酰基)呋喃-2-氰；
4-(甲基(2-吡咯烷-1-基)乙基)氨基)-2-((4-(噻吩-2-羰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
2-((4-((4-氟苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苄腈；
4-(3-(二甲基氨基)吡咯烷-1-基)-2-((4-((4-(三氟甲氧基)苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
2-((4-((3-氯-4-氟苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-((2-(二乙氨基)乙基)(乙基)氨基)苄腈；
4-((2-(二甲氨基)乙基(乙基)氨基)-2-((4-((4-甲氧基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-(1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(呋喃-2-酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氨基)-2-((4-(4-氰基苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-((2-(1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-2-((4-(4-氰基苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-((2-(1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-2-((4-(4-氯苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
2-((4-(4-氰基苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-(4-(4-甲基-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-基)苄腈；
2-((4-(4-氰基苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-(4-(5-氨基-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-基)苄腈；
4-((3-(1H-吡咯-1-基)丙基)氨基)-2-((4-(4-硝基苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-((3-(1H-吡咯-1-基)丙基)氨基)-2-((4-(4-三氟甲基苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-((2-(吗啉-4-基)乙基)氨基)-2-((4-(4-三氟甲基苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-(1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(2，4-二氯苯磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-(4-乙酰基哌嗪-1-基)-2-((4-(4-乙酰基苯磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-((4-(1，2，3，4-四氢萘-2-基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-((4-(2-苯基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-((4-(6-(三氟甲基)-1，2，3，4-四氢萘-2-基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-((4-(6-氰基-1，2，3，4-四氢萘-2-基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-((4-(2-(4-氯苯基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-(3-(咪唑-1-基)丙氨基)-2-((4-(2-(4-氯苯基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-(甲基((1-甲基氮杂环丁烷-3-基)甲基)氨基)-2-((4-(6-氯-1，2，3，4-四氢萘-2-基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-(4-(2-(3-甲基-3H-二氮嗪-3-基)乙基)-1，4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(4-氯苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-(3-氨甲基吡咯烷-1-基)-2-((4-(4-氯苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氨基)-2-((4-(2-氯苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-((2-(吡咯-1-基)乙基)氨基)-2-((4-(2-氰基苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氨基)-2-((4-(4-氰基苯磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)(甲基)氨基)-2-((4-(4-氰基苯磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈
1-(1-(4-氰基-3-((4-(4-氰基苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)氮杂环庚烷-4-基)-N,N-二甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺；
4-(3-((二甲氨基)甲基)吡咯烷-1-基)-2-((4-(4-氯苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氨基)-2-((4-(5-氯苯并呋喃-2-羰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈；
4-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)(甲基)氨基)-2-((4-(5-氯苯并呋喃-2-羰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈。
进一步的，本发明还提出了一种制备所述的芳酰基哌嗪类化合物或其药用盐的方法，按照以下两种方法的任意一种进行：
方法一：
其中，Y为N，X、R1、R2、R3的定义如权利要求1-5任一项所述；
第一步：在极性溶剂中，以2-(溴甲基)-4-氟苄腈(A)为原料，与1-Boc-哌嗪反应，采用碳酸钾作敷酸剂，得到相应的中间体B；其中，优选的，所述的极性溶剂为丙酮、乙腈或DMSO；
第二步：在碱的存在下，在极性溶剂中，B与相应的胺缩合，脱除HF得到中间体C；其中，优选的，所述的碱为碳酸钾或三乙胺；
第三步：在盐酸或三氟乙酸存在下，中间体C在甲醇或二氯甲烷中脱除Boc保护基得到中间体D；
第四步：中间体D在碱的存在下，在二氯甲烷中与相应的酰氯或磺酰氯发生取代反应，或与酸通过缩合反应得到式I所示的化合物，其中，优选的，所述的碱为N,N-二异丙基乙胺；
方法二：
其中，X、R1、R2、R3、R4、R5、R6的定义如权利要求1-5任一项所述；
即以4-氟-2-溴甲基苄腈为原料，在乙腈或丙酮中，以碳酸钾作为缚酸剂，室温条件下与取代的哌嗪反应得到中间体E或中间体F，然后以DMSO为溶剂，碳酸钾存在的条件下，中间体再与相应的胺反应得到式I或式II所示的化合物。
更进一步的，本发明还提出了所述的芳酰基哌嗪类化合物或其药用盐在制备抗病毒药物中的用途。其中，优选的，所述的病毒为寨卡病毒。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明提出了一类新型的芳酰基哌嗪化合物及其制备方法，研究发现该类化合物不仅对HCV具有抑制活性，并且对寨卡病毒复制也显示出抗病毒活性，本发明的提出为抗病毒药物的研究提供了一种新的技术手段。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1：4-(2-氰基-5-氟苄基)哌嗪-1-甲酰叔丁基酯(B)的合成
取2-(溴甲基)-4-氟苄腈(A)(856mg,4.00mmol)溶于10毫升丙酮，加入碳酸钾(1104mg)、1-Boc-哌嗪(4.8mmol)室温反应，直至TLC显示2-(溴甲基)-4-氟苄腈完全消失，过滤反应液，滤液减压蒸除溶剂，残余物用乙酸乙酯和水萃取，有机层经食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤后经过柱分离纯化得到B(收率：85％)，ESI-MS:320(M+H)+。
实施例2：4-(2-氰基-5-[(2-二甲基氨基)乙基](甲基)氨基]苄基)哌嗪-1-甲酰叔丁基酯(C1)的合成
将4-(2-氰基-5-氟苄基)哌嗪-1-甲酰叔丁基酯(B)(1.0mmol)，无水碳酸钾(3.0mmol)和N，N，N’-三甲基-1，2-乙二胺(1.5mmol)加入到3.0毫升DMSO中，密闭加热120℃反应，直到B消失，反应液用水和乙酸乙酯萃取，有机相经干燥后上硅胶柱(甲醇/二氯甲烷洗脱)分离得到产物C1(收率：44％)，ESI-MS:402(M+H)+。
实施例3：4-[(2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基]-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈(D1)的合成
将4-(2-氰基-5-[(2-二甲基氨基)乙基](甲基)氨基]苄基)哌嗪-1-甲酰叔丁基酯(C1)(100mg，0.25mmol)溶于二氯甲烷(6mL)中，加入10倍当量的2M氯化氢***溶液(1.2mL)，室温反应至C消失，反应液经减压蒸除溶剂得到粗品D1的盐酸盐，经***分散后过滤得到D1类白色固体56mg，ESI-MS:302(M+H)+。
实施例4：2-((4-((3,4-二氯苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)苄腈(I-1)
取4-[(2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基]-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈(D1)(30mg)分散于二氯甲烷(5mL)中，加入三乙胺(50微升)搅拌0.5小时后，缓慢滴入3，4-二氯苯磺酰氯(17微升，1.5当量)，升温搅拌2.0小时，TLC显示原料消失，反应液用水洗后，无水硫酸钠干燥，过滤后经柱色谱分离得到化合物I-1(27mg)，ESI-MS:510(M+H)+。
实施例5：2-((4-((5-氯苯并呋喃-2-基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)苄腈(I-2)的合成
按照I-1类似的方法，由中间体D1与5-氯苯并呋喃-2-磺酰氯反应得到，ESI-MS:516(M+H)+。
实施例6：2-((4-((3,4,5-氟苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)苄腈(I-3)的合成
按照I-1类似的方法，由中间体D1与3,4,5-三氟苯磺酰氯反应得到，ESI-MS:496(M+H)+。
实施例7：2-((4-((4-氯苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)苄腈(I-4)的合成
按照I-1类似的方法，由中间体D1与3,4,5-三氟苯磺酰氯反应得到，ESI-MS:476(M+H)+。
实施例8：2-((4-((5-硝基呋喃-2-基)酰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)苄腈(I-5)的合成
按照I-1类似的方法，由中间体D1与5-硝基呋喃-2-甲酰氯反应得到，ESI-MS:441(M+H)+。
实施例9：2-((4-(苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)苄腈(I-6)的合成
按照I-1类似的方法，由中间体D1与苯甲酰氯反应得到，ESI-MS:406(M+H)+。
实施例10：4-(2-氰基-5-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(C2)合成
采用与C1合成类似的方法，由B1与1-甲基-1,4-二氮杂环庚烷得到中间体C2，ESI-MS:414(M+H)+。
实施例11：叔丁基-4-(3-((4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-氰基苯基)-1，4-二氮杂环庚烷-1-碳酸酯(C2-1)的合成
采用与C1类似的方法，由B1与4-Boc-1，4-二氮杂环庚烷反应得到中间体C2-1，ESI-MS:500(M+H)+。
实施例12：叔丁基-4-(3-((4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-氰基苯基)-哌嗪-1-碳酸酯(C2-2)的合成
采用与C1类似的方法，由B1与4-Boc-哌嗪反应得到中间体C2-2，ESI-MS:486(M+H)+。
实施例13：4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((哌嗪-1-基)甲基)苄腈(D2)的合成
采用与D1合成类似的方法，由4-(2-氰基-5-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯脱除Boc保护得到中间体D2，ESI-MS:314(M+H)+。
实施例14：4-(1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((哌嗪-1-基)甲基)苄腈(D2-1)的合成
采用与D1合成类似的方法，由C2-1脱除Boc保护基得到D2-1,ESI-MS:300(M+H)+。
实施例15：4-(哌嗪-1-基)-2-((哌嗪-1-基)甲基)苄腈(D2-2)的合成
采用与D1合成类似的方法，由C2-2脱除Boc保护基得到D2-2,ESI-MS:290(M+H)+。
实施例16：4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(4-(三氟甲氧基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(I-7)合成
按照I-1类似的方法，由4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((哌嗪-1-基)甲基)苄腈(D2)与4-三氟甲基苯甲酰氯反应得到，ESI-MS:502(M+H)+。
化合物4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(4-甲氧基-苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(I-26)是按照与I-1类似的方法，由4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((哌嗪-1-基)甲基)苄腈(D2)与4-甲氧基苯甲酰氯反应得到，ESI-MS:448(M+H)+。
实施例17：4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(4-(叔丁基)苯磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(I-8)合成
采用I-7类似的合成方法，由D2与4-叔丁基苯磺酰氯合成得到I-8，ESI-MS:510(M+H)+。
4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(4-甲氧基苯磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(I-27)合成
采用I-7类似的合成方法，由D2与4-甲氧基苯磺酰氯合成得到I-27，ESI-MS:484(M+H)+。
4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(2-氯-4-氟苯磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(I-28)合成
采用I-7类似的合成方法，由D2与2-氯-4-氟苯磺酰氯合成得到I-28，ESI-MS:506(M+H)+。
实施例18：4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(4-溴苯磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(I-9)合成
采用I-7类似的合成方法，由D2与4-溴苯磺酰氯合成得到I-9，ESI-MS:532(M+H)+。
实施例19：4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-((5-氯呋喃-2-基)甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(I-10)合成
采用I-7类似的合成方法，由D2与5-氯呋喃-2-甲酰氯合成得到I-10，ESI-MS:442(M+H)+。
实施例20：4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-((5-氯噻吩-2-基)磺酰)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(I-11)合成
采用I-7类似的合成方法，由D2与5-氯噻吩-2-磺酰氯合成得到I-11，ESI-MS:494(M+H)+。
实施例21：4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(4-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(I-12)合成
采用I-7类似的合成方法，由D2与4-氟苯甲酰氯合成得到I-12，ESI-MS:436(M+H)+。
实施例22：4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(嘧啶-4-基-甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(I-13)合成
采用I-7类似的合成方法，由D2与嘧啶-4-甲酰氯合成得到I-13，ESI-MS:420(M+H)+。
实施例23：4-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(吡啶-4-基-甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(I-14)合成
采用I-7类似的合成方法，由D2与吡啶-4-甲酰氯合成得到I-14，ESI-MS:419(M+H)+。
实施例24：4-(二甲氨基)2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈(D3)的合成
采用D1类似的合成方法，由中间体B先与二甲胺连接，随后脱除Boc保护得到中间体D3，ESI-MS:245(M+H)+。
实施例25：4-(二甲氨基)-2-((4-(4-二甲氨基苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(I-15)合成
采用I-7类似的合成方法，由D3与4-二甲氨基苯甲酰氯合成得到I-15，ESI-MS:392(M+H)+。
实施例26：4-(二甲氨基)-2-((4-(4-氯苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(I-16)合成
采用I-7类似的合成方法，由D3与4-氯苯甲酰氯合成得到I-16，ESI-MS:383(M+H)+。
实施例27：4-(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈(D4)合成
采用D1类似的合成方法，由中间体B先与4-二甲胺基哌啶连接，再脱除Boc保护得到中间体D4，ESI-MS:328(M+H)+。
实施例28：4-(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)-2-((4-(4-(三氟甲基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(I-17)合成
采用I-7类似的合成方法，由4-(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈(D4)与4-三氟甲基苯甲酰氯合成得到I-17，ESI-MS:500(M+H)+。
实施例29：4-(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)-2-((4-(3-氯-4-氟苯磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(I-18)合成
采用I-7类似的合成方法，由D4与3-氯-4-氟苯磺酰氯合成得到I-18，ESI-MS:520(M+H)+。
实施例29：4-(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)-2-((4-(5-氰基呋喃-2-磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(I-29)合成
采用I-7类似的合成方法，由D4与5-氰基-呋喃-2-磺酰氯合成得到I-29，ESI-MS:483(M+H)+。
实施例30：4-(双(2-(二甲氨基)乙基)氨基)-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈(D5)的合成
采用D1类似的合成方法，由中间体B先与N-(2-二甲氨基)乙基-N’-二甲氨基-1,2-乙二胺连接，再脱除Boc保护得到中间体D5，ESI-MS:359(M+H)+。
实施例31：4-(双(2-(二甲氨基)乙基)氨基)-2-((4-)4-甲氧基苯酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(I-19)的合成
采用I-7类似的合成方法，由4-(双(2-(二甲氨基)乙基)氨基)-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈(D5)与4-甲氧基苯酰氯合成得到I-19，ESI-MS:493(M+H)+。
实施例32：D6-D11的合成
4-((2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈(D6)的合成
采用D1类似的合成方法，由中间体B先与N’-(2-二甲氨基)乙基-N’-甲基-N-甲基-1,2-乙二胺连接，再脱除Boc保护得到中间体D6，ESI-MS:359(M+H)+。
中间体D7-D11也是以D1-D6类似的方法合成得到：
4-(甲基(2-(吡咯-1-基)乙基)氨基)-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈(D7)，ESI-MS:328(M+H)+。
4-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈(D8)，ESI-MS:300(M+H)+。
4-(3-(二甲氨基)吡咯烷-1-基)-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈(D9)，ESI-MS:314(M+H)+。
4-((2-(二乙氨基)乙基)(乙基)氨基)-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈(D10)，ESI-MS:344(M+H)+。
4-((2-(二甲氨基)乙基)(乙基)氨基)-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈(D11)，ESI-MS:316(M+H)+。
实施例33：5-((4-(2-氰基-5-((2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨基)苄基)哌嗪-1-基)磺酰基)呋喃-2-氰(I-20)的合成
采用I-7类似的合成方法，由4-((2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-(哌嗪-1-基甲基)苄腈(D6)与5-氰基呋喃-2-磺酰氯合成得到I-20，ESI-MS:514(M+H)+。
化合物I-21到I-25是按照I-7类似的合成方法分别由中间体D8到D11与相应的酰氯反应得到：
4-(甲基(2-吡咯烷-1-基)乙基)氨基)-2-((4-(噻吩-2-羰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(I-21)，ESI-MS:438(M+H)+。
2-((4-((4-氟苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苄腈(I-22)，ESI-MS:458(M+H)+。
4-(3-(二甲基氨基)吡咯烷-1-基)-2-((4-((4-(三氟甲氧基)苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(I-23)，ESI-MS:538(M+H)+。
2-((4-((3-氯-4-氟苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-((2-(二乙氨基)乙基)(乙基)氨基)苄腈(I-24)，ESI-MS:536(M+H)+。
4-((2-(二甲氨基)乙基(乙基)氨基)-2-((4-((4-甲氧基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(I-25)，ESI-MS:486(M+H)+。
实施例34：D12～D27的合成
4-氟-2-((4-(呋喃-2-碳基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈中间体(D12)的合成：
取呋喃-2-基(哌嗪-1-基)甲酮(168mg)溶于5mL乙腈中，加入碳酸钾(195mg)，搅拌片刻后加入4-氟-2-溴甲基-苄腈(200mg)，室温反应3-4小时，过滤反应液后，滤液减压蒸除溶剂，残余物用乙酸乙酯和水萃取，有机相经过干燥后浓缩用***分散后过滤得到中间体D12 160mg，ESI-MS:314(M+H)+。
中间体D13～D27也是按照与D12类似的方法，由4-氟-2-溴甲基-苄腈与相应的取代哌嗪反应得到：
实施例35：4-(1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(呋喃-2-酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-1)的合成
取D12(50mg)，碳酸钾(45mg)及1，4-二氮杂环庚烷(34μL)混合于DMSO(2mL)中，密封120℃反应至D12消失，将反应液倾倒入5毫升冰水中，再用二氯甲烷提取，有机相经干燥后浓缩，经硅胶柱分离纯化得到II-1类白色固体28mg，ESI-MS:394(M+H)+。
化合物II-2～II-5是采用与II-1类似的方法，由D12与不同的胺反应得到的：
4-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氨基)-2-((4-(4-氰基苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-2)由D13与3-(咪唑-1-基)丙胺反应得到，ESI-MS:454(M+H)+。
4-((2-(1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-2-((4-(4-氰基苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-3)由D13与2-(吡咯-1-基)乙胺反应得到,ESI-MS:439(M+H)+。
2-((4-(4-氰基苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-(4-(4-甲基-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-基)苄腈(II-4)由D13与4-(4-甲基-1H-吡唑-1-基)哌啶反应得到,ESI-MS:494(M+H)+。
2-((4-(4-氰基苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-(4-(5-氨基-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-基)苄腈(II-5)由D13与4-(5-氨基-1H-吡唑-1-基)哌啶反应得到,ESI-MS:495(M+H)+。
4-((3-(1H-吡咯-1-基)丙基)氨基)-2-((4-(4-硝基苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-6)由D14与3-(吡咯-1-基)丙胺反应得到,ESI-MS:473(M+H)+。
4-((3-(1H-吡咯-1-基)丙基)氨基)-2-((4-(4-三氟甲基苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-7)由D15与3-(吡咯-1-基)丙胺反应得到,ESI-MS:496(M+H)+。
4-((2-(吗啉-4-基)乙基)氨基)-2-((4-(4-三氟甲基苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-8)由D15与2-(吗啉-4-基)乙胺反应得到,ESI-MS:502(M+H)+。
4-(1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(2，4-二氯苯磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-9)由D16与高哌嗪反应得到,ESI-MS:508(M+H)+。
4-(4-乙酰基哌嗪-1-基)-2-((4-(4-乙酰基苯磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-10)由D17与1-乙酰基哌嗪反应得到,ESI-MS:510(M+H)+。
4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-((4-(1，2，3，4-四氢萘-2-基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-11)由D18与N，N’,N‘-三甲基-1，2-乙二胺反应得到，ESI-MS:432(M+H)+。
4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-((4-(2-苯基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-12)由D19与N，N’,N‘-三甲基-1，2-乙二胺反应得到，ESI-MS:406(M+H)+。
4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-((4-(6-(三氟甲基)-1，2，3，4-四氢萘-2-基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-13)由D20与N，N’,N‘-三甲基-1，2-乙二胺反应得到，ESI-MS:450(M+H)+。
4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-((4-(6-氰基-1，2，3，4-四氢萘-2-基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-14)由D21与N，N’,N‘-三甲基-1，2-乙二胺反应得到，ESI-MS:457(M+H)+。
4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-((4-(2-(4-氯苯基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-15)由D22与N，N’,N‘-三甲基-1，2-乙二胺反应得到，ESI-MS:440(M+H)+。
4-(3-(咪唑-1-基)丙氨基)-2-((4-(2-(4-氯苯基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-16)由D22与3-(咪唑-1-基)丙胺反应得到，ESI-MS:463(M+H)+。
4-(甲基((1-甲基氮杂环丁烷-3-基)甲基)氨基)-2-((4-(6-氯-1，2，3，4-四氢萘-2-基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-17)由D23与N，N’,N‘-三甲基-1，2-乙二胺反应得到，ESI-MS:478(M+H)+。
4-(4-(2-(3-甲基-3H-二氮嗪-3-基)乙基)-1，4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-((4-(4-氯苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-18)由D24与4-(2-(3-甲基-3H-二氮杂环丙烷-3-基)乙基)-1，4-二氮杂环庚烷反应得到,ESI-MS:520(M+H)+。
4-(3-氨甲基吡咯烷-1-基)-2-((4-(4-氯苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-19)由D24与3-氨甲基吡咯烷反应得到,ESI-MS:438(M+H)+。
4-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氨基)-2-((4-(2-氯苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-20)由D25与3-(咪唑-1-基)丙胺反应得到，ESI-MS:463(M+H)+。
4-((2-(吡咯-1-基)乙基)氨基)-2-((4-(2-氰基苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-21)由D26与2-(吡咯-1-基)乙胺反应得到，ESI-MS:439(M+H)+。
4-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氨基)-2-((4-(4-氰基苯磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-22)由D27与3-(咪唑-1-基)丙胺反应得到，ESI-MS:490(M+H)+。
1-(1-(4-氰基-3-((4-(4-氰基苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)氮杂环庚烷-4-基)-N,N-二甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(II-23)由D13与1-(氮杂环庚烷-4-基)-N,N-二甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺反应得到,ESI-MS:565(M+H)+。
4-((2-(吡咯-1-基)乙基)氨基)-2-((4-(4-氯苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-28)由D24与2-(吡咯-1-基)乙胺反应得到，ESI-MS:448(M+H)+。
采用本领域技术人员熟知的方法，由II-19与碘甲烷反应得到4-(3-((二甲氨基)甲基)吡咯烷-1-基)-2-((4-(4-氯苯甲酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-24),ESI-MS:466(M+H)+。
实施例36：2-((4-(5-氯苯并呋喃-2-羰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-氟苄腈(D28)的合成
将N-Boc-哌嗪(500mg)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)，冰水浴下搅拌均匀后，缓慢滴加5-氯苯并呋喃-2-甲酰氯(690mg)的DCM溶液3mL。反应液缓慢恢复室温搅拌2小时，加入水萃取后，有机相经干燥和蒸除溶剂，残余物用***分散后过滤得到类白色固体(720mg)。将上述固体溶于甲醇中，加入浓盐酸溶液0.5mL，室温反应4小时，蒸除溶剂后，残余物用***分散，过滤后得到淡黄色固体经干燥后，取200mg溶于乙腈(5mL)中，加入无水碳酸钾(278mg)和4-氟-2-溴甲基苄腈(150mg)，室温搅拌过夜，次日过滤反应液，滤液蒸除溶剂后加入乙酸乙酯和水萃取，有机相经干燥后，硅胶柱分离纯化得到中间体D28(230mg)，ESI-MS:454(M+H)+。
实施例37：4-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氨基)-2-((4-(5-氯苯并呋喃-2-羰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-25)的合成
采用与合成II-1类似的方法，由D25与3-(咪唑-1-基)丙胺反应得到，ESI-MS:503(M+H)+。
实施例38：4-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)(甲基)氨基)-2-((4-(5-氯苯并呋喃-2-羰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-26)的合成
采用本领域技术人员熟知的方法，由II-25与碘甲烷反应得到II-26,ESI-MS:517(M+H)+。
实施例39：4-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)(甲基)氨基)-2-((4-(4-氰基苯磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苄腈(II-27)由II-22与碘甲烷反应得到，ESI-MS:504(M+H)+。
实施例39：抗寨卡病毒活性测定方法：
研究选用Vero E6细胞建立基于CPE的抗寨卡病毒药物筛选模型。利用CCK-8法测定寨卡病毒感染后细胞活性，间接反应胞内病毒复制水平。具体方法为：
(1)寨卡病毒的制备：在细胞培养瓶中接种Vero E6细胞，在细胞汇合度达80％左右时，按MOI＝0.5感染细胞。将细胞培养瓶置于5％CO2、37℃恒温培养，待细胞病变度达70％左右收集细胞培养液上清。收集的上清4℃、1000×g离心5min，分装，–80℃冻存备用。
(2)质粒构建：使用TRIzol提取寨卡病毒RNA，随后用随机引物进行逆转录。以病毒cDNA为模，将编码寨卡病毒NS2A蛋白的基因克隆到T载体上。该质粒用以RT-qPCR绘制标准曲线，定量计算寨卡病毒基因组拷贝数。
(3)细胞活性测定：使用CCK-8试剂盒测定细胞活性，具体方法参考产品说明书。感染病毒后96h，以无血清的DMEM更换细胞培养上清，并加入10μl CCK-8试剂WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐]，于5％CO2、37℃培养箱孵育1.5h，使用多功能酶标仪检测450nm处光密度(OD)。
(4)活性样品筛选：寨卡病毒(MOI＝1)感染细胞后，直接加入预先配置好的10μmol/L化合物溶液1μl/孔。加入1μl DMEM培养基为Vero E6细胞阴性对照(未感染病毒)；只感染寨卡病毒孔为病毒对照；感染病毒孔加入利巴韦林80μmol/L作为阳性对照，通过计算抑制率考察化合物对寨卡病毒的抑制活性。
病毒抑制率(％)＝[1–(OD样品–OD无感染对照)/(OD病毒感染–OD无感染对照)]×100％。
部分化合物结果如表1所示。a化合物在给药浓度为10μM时对病毒的抑制水平，+表示抑制率为25％-50％范围内，++表示抑制率在50％-75％范围内，+++表示抑制率在75％以上。
实施例40：本发明化合物抗HCV活性测定
以1×105/mL密度将Huh7.5细胞接种100μL于96孔细胞培养板内，于37℃、5％CO2和饱和湿度条件下的培养箱内培养6hrs后，用含HCV病毒颗粒的病毒液感染Huh7.5细胞的同时，分别加浓度为2μM的本发明化合物(包括本文列举的所有具体化合物)，继续培养96hrs后，分别提取细胞内总RNA，用一步法定量RT-PCR测定细胞内HCVRNA的含量，与病毒对照组RNA水平相比较，计算化合物对HCV的抑制率。部分化合物结果如表1所示。b化合物在给药浓度为2μM时对HCV复制的抑制水平，+表示抑制率为25％-50％范围内，++表示抑制率在50％-75％范围内，+++表示抑制率在75％以上。
表1化合物对病毒的抑制活性