阅读说明：本技术 一种利用基因工程获得重组人纤连蛋白的方法 (Method for obtaining recombinant human fibronectin by using genetic engineering ) 是由 项琪 黄亚东 曹苗苗 于 2019-09-20 设计创作，主要内容包括：本发明属于基因工程领域,更具体地公开了一种密码子优化的重组纤连蛋白基因,通过基因工程的方法在体外进行表达纯化。本发明提供的利用毕赤酵母作为表达宿主细胞,可以解决人工提取纤连蛋白量少并且生物活性低的技术缺陷。(The invention belongs to the field of genetic engineering, and particularly discloses a recombinant fibronectin gene optimized by codons, which is expressed and purified in vitro by a genetic engineering method. The invention provides a method for using pichia pastoris as an expression host cell, which can overcome the technical defects of low quantity of artificially extracted fibronectin and low biological activity.)

一种利用基因工程获得重组人纤连蛋白的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地公开了一种密码子优化的重组纤连蛋白基因，通过基因工程的方法在体外进行表达纯化。

背景技术

纤连蛋白(Fibronectin)，缩写为FN，是一种高分子量(220-250KD)胞外基质的糖蛋白，它通常是由两个亚基通过C末端的二硫键交联形成。主要包括三种类型，其中Ⅰ型和Ⅱ型主要通过二硫键进行稳定，Ⅲ型纤连蛋白缺乏二硫键，因此可在外力作用下使部分两个反向β-折叠施展。纤连蛋白不同的亚单位来自于同一基因的表达产物，基因转录后形成的mRNA可被不同的酶剪切，导致形成不同的纤连蛋白多肽。纤连蛋白的每个亚单位包含数个结构域，可与细胞表面受体、胶原、纤维蛋白以及硫酸蛋白多糖的亲和部位结合。RGD(Arg-Gly-Asp)三肽序列是细胞识别的最小亚单位。

纤连蛋白广泛参与细胞迁移、粘附、增殖、止血及组织修复等过程，调动单核吞噬细胞系统清除损伤组织处有害物质，具有生长因子样作用。纤连蛋白作为细胞培养的基质，可提高多种细胞的贴壁率、汇合率，缩短细胞汇合时间，使细胞形态结构良好，代谢率增强，DNA、RNA及蛋白质合成速度显著提高。将纤连蛋白涂到微球载体上作为细胞大量生产的介质，可以节省空间、原料，成为应用规模细胞培养技术生产新药品的基础物质。

目前国内研究使用的FN多购买于国外，或者从人体或动物血液和组织中提取的天然纤连蛋白，但这些方法获得的纤连蛋白数量有限且成本昂贵。另一方面，野生型FN分子量太大，基本无法重组表达。外源蛋白质表达是一项很复杂的工作，特定蛋白可否在大肠杆菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞、植物表达系统中按需要表达、是否具有活性都是无法预知的(张小霞等，外源蛋白质表达系统类型的研究进展，国外医学卫生学分册，2004年，第31卷，第4期，pp203-208)。

发明内容

为了解决现有技术中人工提取纤连蛋白量少并且生物活性低的技术缺陷，本发明人经过深入研究，选取特定的人纤连蛋白功能性片段，利用毕赤酵母表达系统，表达密码子优化的重组纤连蛋白，从而既可以解决大量生产的问题，同时也降低了成本，为纤连蛋白在医学和美容方面的应用提供了基础。

因此，本发明提供以下各项：

1.一种重组纤连蛋白，其包括如下氨基酸序列：

MHHHHHHNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGSEGSEGEGGSEGSEGEGGSEGSEGEGGSEGSEGEGGSEGSEGEGGSEGSEGEGITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEIDKP(SEQ ID NO:1)。野生型FN分子量太大，基本无法表达。本发明的上述氨基酸序列为发明人特别选取的纤连蛋白的功能性片段(即具有纤连蛋白生物学活性的片段)，不仅能够在酵母中大量重组表达，而且获得了活性重组FN蛋白，解决了现有技术中人工提取纤连蛋白量少并且生物活性低的技术问题。

2.根据以上1所述的重组纤连蛋白，其还包括Kex2蛋白酶序列、分泌信号肽序列、用于蛋白纯化的His标签、或它们的组合；和/或所述重组纤连蛋白具有选自以下的生物活性：促进细胞黏附、促进细胞增殖和促进伤口愈合。

3.编码根据以上1或2所述的重组纤连蛋白的核酸，其具有酵母偏好密码子优化的核苷酸序列，优选其核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示，更优选其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据以上3所述的核酸，其还包括编码Kex2蛋白酶序列、分泌信号肽序列、用于蛋白纯化的His标签、或它们的组合的核苷酸序列。

5.根据以上3或4所述的核酸，其还包括与SEQ ID NO:2或3所示的核苷酸序列可操作地连接的启动子，优选AOX1启动子。术语“可操作地连接”意思是指所述启动子能够启动后续编码目标蛋白的核苷酸序列(DNA)表达为RNA。

6.表达载体，其包括根据以上3-5中任一项所述的核酸，优选所述表达载体为pPICZαA-rhFN。重组质粒pPICZαA-rhFN序列如SEQ ID NO:6所示。

7.宿主细胞，其包括根据以上6所述的表达载体，优选所述宿主细胞为大肠杆菌或酵母细胞，更优选毕赤酵母，优选毕赤酵母菌株选自：GS115、X33和KM71，最优选GS115菌株。

8.一种制备根据以上1或2所述的重组纤连蛋白的方法，所述方法包括：(1)在宿主细胞中表达根据以上3-5中任一项所述的核酸；和(2)收集和/或纯化所述重组纤连蛋白。

9.根据以上8所述的方法，其还包括优选通过电转化法将根据以上3-5中任一项所述的核酸或根据以上6所述的表达载体导入所述宿主细胞中。

10.根据以上1或2所述的重组纤连蛋白在制备美容组合物或药物中的应用，所述美容组合物或药物用于促进细胞黏附、促进细胞增殖和/或促进伤口愈合。

附图说明

图1.重组表达质粒pPICZαA-rhFN的构建图；

图2.rhFN(重组人纤连蛋白)扩增图片(泳道1为DL2000 DNA marker；泳道2表示扩增的rhFN基因，约543bp；泳道3为阴性对照)；

图3.rhFN的诱导表达、筛选、纯化和Western blot鉴定rhFN蛋白(a.M:蛋白分子量标准，泳道1～3从左至右依次对应GS115/pPICZαA-rhFN-1(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)诱导24h、48h、72h后样品；泳道4～6从左至右依次对应GS115/pPICZαA-rhFN-2诱导24h、48h、72h后样品(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)；b.M:蛋白分子量标准；泳道2:rhFN表达诱导前样品；泳道1：rhFN表达诱导后样品；c.M:蛋白分子量标准，泳道1：rhFN纯化后样品；d.M:蛋白分子量标准，泳道1：Western blot鉴定rhFN蛋白)；

图4.FN蛋白对细胞的促粘附作用-给药5h后细胞形态显微镜观测图。a.空白对照组；b.0.2μM牛血浆FN蛋白；c.0.2μM植物源重组人FN蛋白；d.0.2μM根据本发明的rhFN蛋白；e.细胞黏附数量统计图。结果显示：牛血浆FN蛋白、植物源重组人FN蛋白与本发明的重组蛋白rhFN均可促进HaCaT(ATCC No:CM-1252)细胞贴壁，贴壁后的细胞生长状态良好，显微镜下观察各组间贴壁细胞数量及形态无显著性差异。细胞计数结果显示牛血浆FN蛋白(0.2μM)和植物源重组人FN蛋白(0.2μM)二者促细胞粘附效果相当，不存在统计学差异；本发明的重组蛋白rhFN(0.2μM)与上述二者比较无显著性差异；和

图5.细胞划痕愈合实验示意图。结果显示：给药24h后，与空白组相比，蛋白浓度为15ng/mL的EGF与根据本发明的rhFN促细胞划痕愈合效果相当。

具体实施方式

本发明提供了一种在毕赤酵母中高效表达重组人纤连蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：

1.构建重组表达人纤连蛋白的表达载体：人工合成重组人纤连蛋白FN(rh FN)的核苷酸序列(金唯智生物科技有限公司)，在所述rh FN核苷酸序列的5’端和3’端分别加入Xho1和Xba1酶切位点，利用Xho1和Xba1双酶切表达载体pPICZαA(BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)并进行回收，将回收的片段与合成产物用T4 DNA连接酶连接以构建重组质粒pPICZαA-rhFN；

2.用重组质粒pPICZαA-rhFN电转化毕赤酵母GS115(赛默飞世尔科技)：将重组质粒pPICZαA-rhFN的用Sal1酶线性化重组质粒，回收后电转入毕赤酵母GS115感受态细胞并筛选阳性转化子。

3.生物发酵表达人纤连蛋白。

4.所述人纤连蛋白FN核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。所示核苷酸序列经过宿主细胞密码子改编，优化人纤连蛋白表达。

5.优选地，所示核苷酸序列N端加入起始密码子ATG以及Kex2蛋白酶序列(保持蛋白的天然N端，促进蛋白的分泌表达)以及C端加入终止密码子TAA序列，优化目的蛋白的表达。

6.优选地，所述表达载体pPICZαA含有Xho1和Xba1酶切位点、AOX1启动子、α因子分泌信号序列。

7.优选地，所述步骤(2)中，电转化时使用的电比色皿宽0.4cm，电转化的条件为：电压1.5kv，电击4ms。

8.优选地，所述步骤(2)还包括将所述重组子涂布于YPD琼脂培养基平板上筛选，培养基的成分为1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％琼脂和100ug/ml博来霉素。

9.优选地，所述步骤(2)还包括用以下引物对所述平板上的克隆子进行PCR扩增筛选，筛选出阳性转化子；所述引物序列如下：

上游引物FN-F:5’-CCACCACAACTCTGACTC-3’(SEQ ID NO:4)

下游引物FN-R：5’-GTTAATAGAAATTGGCTTAG-3’(SEQ ID NO:5)。

10.优选地，生物发酵表达所述步骤3的生物发酵表达条件为：培养温度为30℃，甲醇诱导体积浓度为1％，pH值为6.0。

实施例

1.人工合成了一种重组人源纤连蛋白融合蛋白，重组纤连蛋白中的纤连蛋白功能性片段全长180个氨基酸。密码子优化后的重组人纤连蛋白核苷酸序列为：

SEQ ID NO:2

5’-ATGCACCACCACCACCACCACAATAGTGATTCCGAGTGCCCTCTTAGTCACGATGGCTATTGCCTTCACGATGGCGTCTGCATGTACATCGAAGCTTTGGACAAGTACGCTTGTAACTGTGTTGTTGGTTACATCGGTGAAAGATGTCAATACAGAGACTTGAAGTGGTGGGAATTGAGAGGTTCTGAAGGTTCTGAAGGTGAAGGTGGTTCTGAAGGTTCTGAAGGTGAAGGTGGCAGCGAAGGCAGCGAAGGCGAAGGCGGCAGCGAAGGCAGCGAAGGCGAAGGCGGTTCTGAAGGTTCTGAAGGTGAAGGTGGTTCTGAAGGTTCTGAAGGTGAAGGTATTACTTACGGTGAAACTGGTGGTAACTCTCCAGTTCAAGAATTTACTGTTCCAGGTTCTAAGTCTACTGCTACTATTTCTGGTTTGAAGCCAGGTGTTGATTACACTATTACTGTTTACGCTGTTACTGGTAGAGGTGACAGTCCTGCCAGTAGTAAACCTATCTCCATCAACTATAGGACCGAGATCGACAAACCTTAA-3’或

SEQ ID NO:3

5’-ATGCACCACCACCACCACCACAATAGTGATTCCGAGTGCCCTCTTAGTCACGATGGCTATTGCCTTCACGATGGCGTCTGCATGTACATCGAAGCTTTGGACAAGTACGCTTGTAACTGTGTTGTTGGTTACATCGGTGAAAGATGTCAATACAGAGACTTGAAGTGGTGGGAATTGAGAGGTTCTGAAGGTTCTGAAGGTGAAGGTGGTTCTGAAGGTTCTGAAGGTGAAGGTGGCAGCGAAGGCAGCGAAGGCGAAGGCGGCAGCGAAGGCAGCGAAGGCGAAGGCGGTTCTGAAGGTTCTGAAGGTGAAGGTGGTTCTGAAGGTTCTGAAGGTGAAGGTATTACTTACGGTGAAACTGGTGGTAACTCTCCAGTTCAAGAATTTACTGTTCCAGGTTCTAAGTCTACTGCTACTATTTCTGGTTTGAAGCCAGGTGTTGATTACACTATTACTGTTTACGCTGTTACTGGTAGAGGTGACAGTCCTGCCAGTAGTAAACCTATCTCCATCAACTATAGGACCGAGATCGACAAACCTTAA-3’。

在优化好的核苷酸序列5’端加入Xho1酶切位点(CTCGAG)以及Kex2核苷酸序列(AAAAGAGAGGCTGAAGCT)，在序列的3’加入Xba1酶切位点(TCTAGA)。

2.构建重组人纤连蛋白表达载体：人工合成重组人纤连蛋白核苷酸序列，所述核苷酸序列在合成前进行宿主细胞表达密码子优化后，如序列表中SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3所示，交由金唯智生物科技有限公司进行合成，其编码的蛋白序列不发生变化。所述核苷酸序列的的5’端和3’端分别加入Xho1和Xba1酶切位点，将获得的核苷酸序列和表达载体pPICZαA同时进行双酶切，并回收酶切产物，利用DNA连接酶将回收的目的产物进行连接，获得重组质粒pPICZαA-rhFN(序列如以下SEQ ID NO:6所示，其中包含本发明优选的SEQ IDNO:2)。同样可以构建包含SEQ ID NO:3的重组质粒pPICZαA-rhFN。

重组质粒pPICZαA-rhFN序列为SEQ ID NO:6

agatctaacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatccgacatccacaggtccattctcacacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgttgcaaacgcaggacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaaccagcccagttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttctattaggctactaacaccatgactttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgtttatttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaacatcactccagatgagggctttctgagtgtggggtcaaatagtttcatgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgctgtcttggaacctaatatgacaaaagcgtgatctcatccaagatgaactaagtttggttcgttgaaatgctaacggccagttggtcaaaaagaaacttccaaaagtcggcataccgtttgtcttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaataatctcattaatgcttagcgcagtctctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaacacccgctttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgcttccaagattctggtgggaatactgctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaacccctacttgacagcaatatataaacagaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatcatcattattagcttactttcataattgcgactggttccaattgacaagcttttgattttaacgacttttaacgacaacttgagaagatcaaaaaacaactaattattcgaaacgatgagatttccttcaatttttactgctgttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttactcagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTATGCACCACCACCACCACCACAATAGTGATTCCGAGTGCCCTCTTAGTCACGATGGCTATTGCCTTCACGATGGCGTCTGCATGTACATCGAAGCTTTGGACAAGTACGCTTGTAACTGTGTTGTTGGTTACATCGGTGAAAGATGTCAATACAGAGACTTGAAGTGGTGGGAATTGAGAGGTTCTGAAGGTTCTGAAGGTGAAGGTGGTTCTGAAGGTTCTGAAGGTGAAGGTGGCAGCGAAGGCAGCGAAGGCGAAGGCGGCAGCGAAGGCAGCGAAGGCGAAGGCGGTTCTGAAGGTTCTGAAGGTGAAGGTGGTTCTGAAGGTTCTGAAGGTGAAGGTATTACTTACGGTGAAACTGGTGGTAACTCTCCAGTTCAAGAATTTACTGTTCCAGGTTCTAAGTCTACTGCTACTATTTCTGGTTTGAAGCCAGGTGTTGATTACACTATTACTGTTTACGCTGTTACTGGTAGAGGTGACAGTCCTGCCAGTAGTAAACCTATCTCCATCAACTATAGGACCGAGATCGACAAACCTTAATCTAGAaaaagagaggctgaagctgaattcacgtggcccagccggccgtctcggatcggtacctcgagccgcggcggccgccagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatcccccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagcacagcatactaaattttccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaatttttttttttagtttttttctctttcagtgacctccattgatatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttgttctattacaactttttttacttcttgttcattagaaagaaagcatagcaatctaatctaaggggcggtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgacacgtccgacggcggcccacgggtcccaggcctcggagatccgtcccccttttcctttgtcgatatcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccgaaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtattaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaagctggagaccaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatc。序列中小写字母为载体pPICZαA序列，大写字母为纤连蛋白编码序列。

将重组质粒转化大肠菌株Top10(瑞真生物技术有限公司)，提取质粒。

3.重组质粒转染毕赤酵母GS115菌株：将经Sal1内切酶线性化的重组质粒pPICZαA-rhFN(10μg)与80μL毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，混合液转入0.2cm预冷的电转杯中，电击4-10毫秒，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液并混匀液体，涂布在YPD培养基平板上(含有1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％琼脂粉以及Zeocin 100μg/ml)，30℃倒置培养2天，待平板上长出单菌落。将使用序列SEQ ID NO:2的表达菌命名为GS115/pPICZαA-rhFN-1，使用序列SEQ ID NO:3的表达菌命名为GS115/pPICZαA-rhFN-2。GS115/pPICZαA-rhFN-1和GS115/pPICZαA-rhFN-2的诱导表达(方法如下文所述)结果如图3，a所示，结果显示，GS115/pPICZαA-rhFN-1的表达量稍高于GS115/pPICZαA-rhFN-2的表达量，且杂带很少，作为优选。后面实验使用的序列默认为SEQ ID NO:2。

4.重组表达菌的筛选：以YPD平板上的克隆子为模板，加入两端引物rhFN-F(SEQID NO:4)和rhFN-R(SEQ ID NO:5)(引物由华大基因合成)(引物浓度10μM)各0.5μL，再加入Premix Taq^TM(TaKaRa Taq^TM Version 2.0plus dye)预混酶，加水至总体积为20μL，按照PCR反应条件(95℃变性10min后进入循环，循环参数第一步为95℃变性60秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒，30个循环)进行目的片段的扩增。核酸电泳检测目的片段大小。结果如图2所示，获得了目标片段。

5.目的蛋白的诱导表达：将筛选到的阳性转化菌株接种于200ml BMGY培养基中，30℃250rpm条件下培养24h，作为一级种子转接于15L装有BMGY的发酵罐中进行培养，温度设定为30℃，pH为6.0，培养16-20h，待培养基中甘油耗尽，发酵罐溶氧上升，开始补加甲醇进行诱导，诱导72h后进行放罐。

6.重组人纤连蛋白的纯化：发酵液经离心后收集上清，先用平衡液对亲和层析柱进行平衡，通过镍柱亲和层析方法，分离纯化携带His-tag的重组蛋白，最后用2-3倍柱体积的洗脱缓冲液(20mmol/L Na₂HPO₄和NaH₂PO₄，0.2mol/L NaCl，pH 7.0)洗脱目的蛋白，把结合在填料上的融合蛋白洗脱下来并收集。通过SDS-PAGE蛋白胶(图3，a和b)以及Westernblotting(图3，d)对重组蛋白的分子量大小和免疫学验证(抗体为6X-His tag多克隆抗体，购自赛默飞生物世尔科技)。将纯化后的蛋白样经过G25柱进行脱盐处理，得到高纯度的融合蛋白。结果如图3，c所示，结果显示重组人蛋白rhFN得到纯化。

综上，本发明分别在人纤连蛋白基因序列在5’端和3’端加上Xho1和Xba1酶切位点，通过基因克隆技术将人纤连蛋白基因序克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA，获得重组表达载体pPICZαA-rhFN。通过电转方法转染酵母感受态细胞，获得重组表达菌株。利用甲醇对重组菌株进行诱导表达，并通过镍亲和层析得到纯化的融合蛋白，通过SDS-PAGE和Westernblot对重组蛋白的分子量大小和免疫学验证。

根据本发明的rhFN蛋白的生物活性检验。具体步骤如下：

rhFN蛋白对细胞的促粘附作用：将HaCaT细胞用含10％FBS的DMEM培养，37℃，CO₂浓度5％；首先用PBS清洗一次，然后添加0.25％Trypsin-EDTA胰酶液进行消化，离心收集细胞；用DMEM进行重悬，细胞密度控制在6×10⁴个/mL，将细胞悬液(细胞密度控制在1.5×10⁴个/mL)接种到底层铺有浓度为0.200、0.050、0.125μM rhFN蛋白膜低粘附96孔板中。37℃培养5h，维持CO₂浓度为5％；用PBS冲洗掉没有贴壁的细胞；在相差显微镜下计数以及用MTT法比较各组细胞数。阳性对照：牛血浆FN(广州景研生物科技有限公司，溶剂为pH 7.0的PBS，浓度0.2μM)，植物源重组人FN(武汉禾元生物科技股份有限公司，溶剂为pH 7.0的PBS，浓度0.2μM)。结果如图4所示。结果显示：牛血浆FN蛋白、植物源重组人FN蛋白与本发明的重组蛋白rhFN均可促进HaCaT(ATCC No:CM-1252)细胞贴壁，贴壁后的细胞生长状态良好，显微镜下观察各组间贴壁细胞数量及形态无显著性差异。细胞计数结果显示牛血浆FN蛋白(0.2μM)和植物源重组人FN蛋白(0.2μM)二者促细胞粘附效果相当，不存在统计学差异；本发明的重组蛋白rhFN(0.2μM)与上述二者比较无显著性差异。

rhFN蛋白对细胞的促增殖作用：BALB/c-3T3细胞株(中国食品药品检定研究院)用含10％FBS的DMEM的完全培养液于37℃、5％二氧化碳培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×10⁵～5.0×10⁶个细胞，传代后24～36小时用于生物学活性测定。弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞用完全培养液配成每1ml含5.0×10⁴～8.0×10⁴个细胞的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100ul，于37℃、5％二氧化碳条件下培养。24小时后换成维持培养液，即含0.4％FBS的DMEM培养液。置37℃、5％二氧化碳培养24小时。制备的细胞培养板弃去维持液，加入重组人表皮生长因子(EGF)(中国食品药品检定研究院，批号270013-9701)、植物源重组FN作为对照和rhFN蛋白供试品溶液(溶剂为pH 7.0的PBS)，rhFN蛋白浓度分别设置为100、25、6.250、1.563、0.391、0.098、0.024ng/mL，维持培养液作为空白对照组，每孔100μl。置37℃、5％二氧化碳培养48小时。每孔加入MTT溶液20ul，于37℃、5％二氧化碳培养4小时。以上操作在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后，向每孔中加入100ul DMSO，混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，570nm为试验波长测定吸光度，实验结果表1所示。植物源重组FN无促进BALB/c-3T3增殖的能力，而本发明重组表达的rhFN能促进BALB/c-3T3细胞增殖(EC50＝(2.285±0.85)ng/ml)，与EGF相当。

表1不同组别作用于细胞的半数有效浓度比较(n＝3)

rhFN蛋白对HaCaT细胞划痕愈合能力的检测：HaCaT细胞用胰蛋白酶消化后接入12孔板，数量以贴壁后铺满板底为宜。细胞长满板底后，用100μl枪头垂直于孔板，沿板背面划线的相同位置制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞碎片。加入含EGF、rhFN蛋白(浓度均为15ng/mL)的培养基(血清浓度为1％)，拍照记录。将培养板放入培养箱培养24h取出拍照，结果如图5。根据实验结果计算划痕愈合面积百分比，划痕愈合面积百分比的计算是根据最开始的划痕面积，跟某一时间愈合的那一部分面积(最开始面积-某时间点的面积)与最初面积的比值即可得到划痕愈合的百分比。结果显示给药24h后，与空白组相比，EGF与rhFN蛋白浓度为15ng/mL时促细胞划痕愈合效果相当(图5、表2)。

表2不同组别细胞划痕愈合率比较(n＝4)

本领域技术人员应该理解，尽管参照上述实施例对本发明进行了具体的描述，但是本发明并不限于这些具体的实施例。基于本发明所教导的方法和技术方案，在不背离本发明的精神的前提下，本领域技术人员能够进行适当的修改或改进，由此所得的等价实施方案都在本发明的范围内。