一种富集油脂中n-3多不饱和脂肪酸甘油酯的方法
阅读说明：本技术 一种富集油脂中n-3多不饱和脂肪酸甘油酯的方法 (Method for enriching n-3 polyunsaturated fatty acid glyceride in grease ) 是由 王小三 杨壮壮 程昕祎 高亮 邹硕 金青哲 王兴国 于 2019-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种富集油脂中n-3多不饱和脂肪酸甘油酯的方法,包括,取油脂、脂肪酶和缓冲溶液于反应器中,反应一定的时间后,得混合物,将混合物通过碱液中和脱酸,得到富含n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯。本发明提供一种富集油脂中n-3多不饱和脂肪酸甘油酯的方法,脂肪酶催化水解法直接将鱼油作为原料,反应过程中不添加其他有机溶剂,反应原料为鱼油和缓冲溶液,催化剂为脂肪酶,与传统化学法相比,反应条件温和、副产物少、环保；与酶法酯交换和酯化相比,更加安全和成本更低,工艺更加简单,方法成熟,更适于工业化生产。(The invention discloses a method for enriching n-3 polyunsaturated fatty acid glyceride in grease, which comprises the steps of putting the grease, lipase and buffer solution into a reactor, reacting for a certain time to obtain a mixture, and neutralizing and deacidifying the mixture by alkali liquor to obtain the glyceride rich in n-3 polyunsaturated fatty acid. The invention provides a method for enriching n-3 polyunsaturated fatty acid glyceride in grease, a lipase catalytic hydrolysis method directly takes fish oil as a raw material, no other organic solvent is added in the reaction process, the reaction raw materials are the fish oil and a buffer solution, and the catalyst is lipase; compared with the enzymatic transesterification and esterification, the method is safer, has lower cost, simpler process and mature method, and is more suitable for industrial production.)
技术领域
本发明涉及油脂深加工领域，具体涉及一种富集油脂中n-3多不饱和脂肪酸甘油酯的方法。
背景技术
n-3型多烯酸(n-3PUFAs)对人体具有重要的生物学意义，国内外对其中二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)生理功能方面的研究长盛不衰，作为人体不能自身合成的必需脂肪酸，DHA和EPA能够显著地防治心血管疾病，抑制癌细胞的生长，炎症修复，促进婴幼儿感官器官的正常发育，一定程度上能达到预防、治疗老年痴呆症，因此现在被广泛地应用于健康食品中。
n-3PUFAs主要来源于深海鱼油，藻油等原料中，且主要以甘油酯的形式存在，但其含量相对较低，在30％左右，不能满足人们的保健及药用需求。因此，提高鱼油甘油酯中n-3PUFAs含量，可以提升鱼油的保健价值，具有重要的经济意义。富集n-3PUFAs的方法主要有超临界流体萃取、分子蒸馏等物理法，尿素络合低温溶剂结晶等化学法和脂肪酶催化水解、脂肪酶催化酯交换等酶法，目前，以物理和化学法为主富集的鱼油产品占市场的多数。
市面上的鱼油产品主要有乙酯型、甘油酯型和游离脂肪酸型三种形式，又以容易通过尿素包埋等物理化学方法得到的乙酯型鱼油居多。但据研究报道，乙酯型鱼油在人体中消化和吸收都较为困难，另外，化学法所需的反应条件往往会出现一些副反应，降低产品的质量。相比传统化学法，酶法富集n-3PUFAs具有绿色、安全、副产物少等优点。但是现有技术中酶法富集n-3PUFAs主要通过酶法酯化、酯交换法合成n-3PUFAs乙酯和甘油酯型，脂肪酶催化酯交换法和脂肪酶催化酯化法成本较高，且反应过程中添加其他有机溶剂，不符合绿色安全理念，同时，工艺复杂，不适于工业化生产，因此，本领域亟需一种适用于工业化生产、符合绿色安全理念的酶法富集n-3PUFAs的方法。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有富集油脂中n-3多不饱和脂肪酸甘油酯的方法中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种富集油脂中n-3多不饱和脂肪酸甘油酯的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种富集油脂中n-3多不饱和脂肪酸甘油酯的方法，包括，取油脂、脂肪酶和缓冲溶液于反应器中，反应一定的时间后，碱液中和脱酸，得到富含n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯。
作为本发明所述富集油脂中n-3多不饱和脂肪酸甘油酯的方法的一种优选方案，其中：所述油脂，包括鱼油。
作为本发明所述富集油脂中n-3多不饱和脂肪酸甘油酯的方法的一种优选方案，其中：所述脂肪酶来源于圆筒状假丝酵母(Candida cylindracea)和米根霉(Rhizopusoryzea)中的一种或多种。
作为本发明所述富集油脂中n-3多不饱和脂肪酸甘油酯的方法的一种优选方案，其中：所述来源于圆筒状假丝酵母的脂肪酶为AY"Amano"400SD、AY"Amano"30SD中一种或多种，所述来源于米根霉的脂肪酶为DF"Amano"15。
作为本发明所述富集油脂中n-3多不饱和脂肪酸甘油酯的方法的一种优选方案，其中：所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液中的一种，其中，缓冲溶液浓度为0.05～0.5mol/L，缓冲溶液的pH值范围为5～8。
作为本发明所述富集油脂中n-3多不饱和脂肪酸甘油酯的方法的一种优选方案，其中：所述缓冲溶液和油脂的质量比为0.2～3:1。
作为本发明所述富集油脂中n-3多不饱和脂肪酸甘油酯的方法的一种优选方案，其中：所述反应时间为4～48h，反应温度为10～60℃。
作为本发明所述富集油脂中n-3多不饱和脂肪酸甘油酯的方法的一种优选方案，其中：所述脂肪酶，其添加量占油脂的质量百分比为0.04％～1％。
作为本发明所述富集油脂中n-3多不饱和脂肪酸甘油酯的方法的一种优选方案，其中：所述碱液中和脱酸，包括，将所述混合物转移至分液漏斗，加入正己烷，使鱼油与水分层，加入酚酞指示剂，用KOH-乙醇水溶液滴定直至体系变为红色，静置分层，除去下层的水相，蒸馏水洗，取上层澄清油相，蒸去溶剂得到富含n-3多不饱和脂肪酸甘油酯。
作为本发明所述富集油脂中n-3多不饱和脂肪酸甘油酯的方法的一种优选方案，其中：所述碱液为KOH-乙醇水溶液或NaOH-乙醇水溶液。
本发明有益效果：
(1)本发明提供一种富集油脂中n-3多不饱和脂肪酸甘油酯的方法，脂肪酶催化水解法直接将鱼油作为原料，反应过程中不添加其他有机溶剂，反应原料为鱼油和缓冲溶液，催化剂为脂肪酶，与传统化学法相比，反应条件温和、副产物少、环保；与酶法酯交换和酯化相比，更加安全和成本更低。
(2)本发明选用的AY"Amano"400SD脂肪酶在水解速度方面，具有底物“歧视性”，对含有饱和脂肪酸和低不饱和脂肪酸甘油三酯的水解速率远高于含多不饱和脂肪酸的甘油三酯，利用此特性通过适度水解来达到EPA和DHA在甘油酯中的富集。
(3)本发明提供一种富集油脂中n-3多不饱和脂肪酸甘油酯的方法，相比现有的酶法富集n-3PUFAs的工艺，工艺更加简单，方法成熟，更适于工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明实施例1中鱼油反应前的脂肪酸组成分析气相色谱图。取50mg鱼油于10mL刻度管，加入2mL 0.5mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液，65℃皂化30min，冷却后加入2mL25％体积分数的三氟化硼-甲醇溶液，70℃水浴5min；加入2mL正己烷振荡3-4min提取脂肪酸甲酯，加入4mL饱和NaCl溶液，取上层溶液加入无水硫酸钠振荡(10000rpm离心5min)，注射器吸取过膜，气相色谱检测，计算n-3PUFAs含量。
图2为本发明实施例1中鱼油水解之后得到的油相产物的组成分析液相色谱(示差检测器)图。取水解后的混合鱼油产物20mg，加入1mL流动相(正己烷：异丙醇：甲酸＝15:1:0.003)溶解，过膜，液相色谱检测，计算水解下的游离脂肪酸的含量。
图3为本发明实施例1中鱼油水解去酸后得到的甘油酯型鱼油产品的脂肪酸组成分析气相色谱图。取制备得到的富含n-3PUFAs的甘油酯50mg于10mL刻度管，制样步骤同图1的操作方式，计算n-3PUFAs含量。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明中脂肪酶AY"Amano"400SD，400000U/g，购自日本天野生物酶制剂有限公司；AY"Amano"30SD，400000U/g，购自日本天野生物酶制剂有限公司；DF"Amano"15，400000U/g，购自日本天野生物酶制剂有限公司。
本发明中精制鱼油样品中EPA％＝6.06％，DHA％＝24.23％。其他试剂无特殊说明，均为市售。
实施例1
准确称取精制鱼油样品(鱼油样品的脂肪酸组成如图1，其中EPA％＝6.06％，DHA％＝24.23％)3.0g、柠檬酸缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝7)1.5g和AY"Amano"400SD、AY"Amano"30SD(两者质量比为2:3)混合脂肪酶2.4mg，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温37℃，保持12h。所得水解产物油相中甘油酯质量分数为58.21％，游离脂肪酸质量分数为40.54％(如图2)。
反应结束后，将所得混合物转移至分液漏斗，并向其中加入30mL正己烷，使鱼油与水分层。加入酚酞指示剂，此时用KOH-乙醇水溶液滴定直至体系变为红色，静置分层，除去下层的水相，之后用蒸馏水洗去油相中可能残留的脂肪酸盐和KOH，取上层澄清油相，蒸去溶剂得到富含n-3PUFAs的鱼油甘油酯。甘油酯产品的脂肪酸组成中，n-3PUFAs占比由原油的34.11％提高到水解后的60.98％，其中EPA和DHA总量由30.29％提高到56.11％(如图3)。
图1、图3为鱼油水解前后的脂肪酸组成气相色谱图，可看出DHA质量分数明显增加。图2显示水解后油相体系中甘油三酯、甘油二酯、单甘酯、脂肪酸的质量比，从而可看出水解程度。
实施例2
准确称取精制鱼油样品3.0g、磷酸缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝7)1.5g和AY"Amano"400SD脂肪酶2.4mg，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温37℃，保持12h。所得水解产物油相中甘油酯质量分数为59.46％，游离脂肪酸质量分数为40.54％。
反应结束后，将所得混合物转移至分液漏斗，并向其中加入30mL正己烷，使鱼油与水分层。加入酚酞指示剂，此时用KOH-乙醇水溶液滴定直至体系变为红色，静置分层，除去下层的水相，之后用蒸馏水洗去油相中可能残留的脂肪酸盐和KOH，取上层澄清油相，蒸去溶剂得到富含n-3PUFAs的鱼油甘油酯。甘油酯产品的脂肪酸组成中，n-3PUFAs占比由原油的34.11％提高到水解后的62.36％，其中EPA和DHA总量由30.29％提高到55.33％。
实施例3
准确称取精制鱼油样品3.0g、磷酸缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝6)3.0g和AY"Amano"30SD脂肪酶2.4mg，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温37℃，保持12h。所得水解产物油相中甘油酯质量分数为73.25％，游离脂肪酸质量分数为26.75％。
反应结束后，将所得混合物转移至分液漏斗，并向其中加入30mL正己烷，使鱼油与水分层。加入酚酞指示剂，此时用KOH-乙醇水溶液滴定直至体系变为红色，静置分层，除去下层的水相，之后用蒸馏水洗去油相中可能残留的脂肪酸盐和KOH，取上层澄清油相，蒸去溶剂得到富含n-3PUFAs的鱼油甘油酯。甘油酯产品的脂肪酸组成中，n-3PUFAs占比由原油的34.11％提高到水解后的54.12％，其中EPA和DHA总量由30.29％提高到46.89％。
实施例4
准确称取精制鱼油样品3.0g、柠檬酸缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝6)1.5g和AY"Amano"400SD、AY"Amano"30SD(2:3)混合脂肪酶3.6mg，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温50℃，保持6h。所得水解产物油相中甘油酯质量分数为75.69％，游离脂肪酸质量分数为24.31％。
反应结束后，将所得混合物转移至分液漏斗，并向其中加入30mL正己烷，使鱼油与水分层。加入酚酞指示剂，此时用KOH-乙醇水溶液滴定直至体系变为红色，静置分层，除去下层的水相，之后用蒸馏水洗去油相中可能残留的脂肪酸盐和KOH，取上层澄清油相，蒸去溶剂得到富含n-3PUFAs的鱼油甘油酯。甘油酯产品的脂肪酸组成中，n-3PUFAs占比由原油的34.11％提高到水解后的50.83％，其中EPA和DHA总量由30.29％提高到44.23％。
实施例5
准确称取精制鱼油样品3.0g、柠檬酸缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝6)3.0g和AY"Amano"400SD脂肪酶3.6mg，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温37℃，保持12h。所得水解产物油相中甘油酯质量分数为65.49％，游离脂肪酸质量分数为34.51％。
反应结束后，将所得混合物转移至分液漏斗，并向其中加入30mL正己烷，使鱼油与水分层。加入酚酞指示剂，此时用KOH-乙醇水溶液滴定直至体系变为红色，静置分层，除去下层的水相，之后用蒸馏水洗去油相中可能残留的脂肪酸盐和KOH，取上层澄清油相，蒸去溶剂得到富含n-3PUFAs的鱼油甘油酯。甘油酯产品的脂肪酸组成中，n-3PUFAs占比由原油的34.11％提高到水解后的57.21％，其中EPA和DHA总量由30.29％提高到51.29％。
实施例6
准确称取精制鱼油样品3.0g、磷酸缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝5)6.0g和AY"Amano"400SD、AY"Amano"30SD(2:3)混合脂肪酶1.2mg，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温20℃，保持24h。所得水解产物油相中甘油酯质量分数为72.23％，游离脂肪酸质量分数为27.77％。
反应结束后，将所得混合物转移至分液漏斗，并向其中加入30mL正己烷，使鱼油与水分层。加入酚酞指示剂，此时用KOH-乙醇水溶液滴定直至体系变为红色，静置分层，除去下层的水相，之后用蒸馏水洗去油相中可能残留的脂肪酸盐和KOH，取上层澄清油相，蒸去溶剂得到富含n-3PUFAs的鱼油甘油酯。甘油酯产品的脂肪酸组成中，n-3PUFAs占比由原油的34.11％提高到水解后的52.29％，其中EPA和DHA总量由30.29％提高到46.87％。
实施例7
准确称取精制鱼油样品3.0g、柠檬酸缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝5)0.6g和AY"Amano"30SD脂肪酶1.2mg，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温50℃，保持6h。所得水解产物油相中甘油酯质量分数为80.01％，游离脂肪酸质量分数为19.99％。
反应结束后，将所得混合物转移至分液漏斗，并向其中加入30mL正己烷，使鱼油与水分层。加入酚酞指示剂，此时用KOH-乙醇水溶液滴定直至体系变为红色，静置分层，除去下层的水相，之后用蒸馏水洗去油相中可能残留的脂肪酸盐和KOH，取上层澄清油相，蒸去溶剂得到富含n-3PUFAs的鱼油甘油酯。甘油酯产品的脂肪酸组成中，n-3PUFAs占比由原油的34.11％提高到水解后的46.98％，其中EPA和DHA总量由30.29％提高到40.19％。
实施例8
准确称取精制鱼油样品3.0g、磷酸缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝8)6.0g和AY"Amano"400SD脂肪酶2.4mg，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温37℃，保持24h。所得水解产物油相中甘油酯质量分数为71.55％，游离脂肪酸质量分数为28.45％。
反应结束后，将所得混合物转移至分液漏斗，并向其中加入30mL正己烷，使鱼油与水分层。加入酚酞指示剂，此时用KOH-乙醇水溶液滴定直至体系变为红色，静置分层，除去下层的水相，之后用蒸馏水洗去油相中可能残留的脂肪酸盐和KOH，取上层澄清油相，蒸去溶剂得到富含n-3PUFAs的鱼油甘油酯。甘油酯产品的脂肪酸组成中，n-3PUFAs占比由原油的34.11％提高到水解后的62.86％，其中EPA和DHA总量由30.29％提高到56.02％。
实施例9
准确称取精制鱼油样品3.0g、柠檬酸缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝7)0.6g和AY"Amano"30SD脂肪酶3.6mg，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温20℃，保持6h。所得水解产物油相中甘油酯质量分数为78.93％，游离脂肪酸质量分数为21.07％。
反应结束后，将所得混合物转移至分液漏斗，并向其中加入30mL正己烷，使鱼油与水分层。加入酚酞指示剂，此时用KOH-乙醇水溶液滴定直至体系变为红色，静置分层，除去下层的水相，之后用蒸馏水洗去油相中可能残留的脂肪酸盐和KOH，取上层澄清油相，蒸去溶剂得到富含n-3PUFAs的鱼油甘油酯。甘油酯产品的脂肪酸组成中，n-3PUFAs占比由原油的34.11％提高到水解后的49.96％，其中EPA和DHA总量由30.29％提高到43.06％。
实施例10
准确称取精制鱼油样品3.0g、磷酸缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝8)1.5g和AY"Amano"400SD脂肪酶2.4mg，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温20℃，保持24h。所得水解产物油相中甘油酯质量分数为72.13％，游离脂肪酸质量分数为27.87％。
反应结束后，将所得混合物转移至分液漏斗，并向其中加入30mL正己烷，使鱼油与水分层。加入酚酞指示剂，此时用KOH-乙醇水溶液滴定直至体系变为红色，静置分层，除去下层的水相，之后用蒸馏水洗去油相中可能残留的脂肪酸盐和KOH，取上层澄清油相，蒸去溶剂得到富含n-3PUFAs的鱼油甘油酯。甘油酯产品的脂肪酸组成中，n-3PUFAs占比由原油的34.11％提高到水解后的53.09％，其中EPA和DHA总量由30.29％提高到46.59％。
实施例1～实施例10的反应条件见表1。
表1
实施例1～实施例10不同反应条件对应的反应结果，包括水解后油相中甘油酯的质量分数、脱酸后n-3PUFAs含量和脱酸后EPA+DHA含量，见表2。
表2
从表2可以看出，不同的反应条件下油脂脱酸后n-3PUFAs含量和脱酸后EPA+DHA含量不一样，实施例1条件下，脱酸后EPA+DHA含量最优，也即此反应条件最佳。
实施例11-23
参照实施例1和2的步骤，分别改变所述中的一个反应条件，其余步骤、参数均不变，改变的条件见表3。
表3
实施例11～实施例23不同反应条件对应的反应结果，包括水解后油相中甘油酯的质量分数、脱酸后n-3PUFAs含量和脱酸后EPA+DHA含量，见表4。
表4
对比例1
准确称取精制鱼油样品3.0g、磷酸缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝7)1.5g和2.4mg的Lipozyme 435脂肪酶，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温37℃，保持12h。所得水解产物油相中甘油酯质量分数为71.76％，游离脂肪酸质量分数为28.24％。
反应结束后，将所得混合物转移至分液漏斗，并向其中加入30mL正己烷，使鱼油与水分层。加入酚酞指示剂，此时用KOH-乙醇水溶液滴定直至体系变为红色，静置分层，除去下层的水相，之后用蒸馏水洗去油相中可能残留的脂肪酸盐和KOH，取上层澄清油相，蒸去溶剂得到富含n-3PUFAs的鱼油甘油酯。甘油酯产品的脂肪酸组成中，n-3PUFAs占比由原油的34.11％提高到水解后的40.09％，其中EPA和DHA总量由30.29％提高到35.12％。
对比例2
准确称取精制鱼油样品3.0g、磷酸缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝7)1.5g和2.4mg的G"Amano"50脂肪酶，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温37℃，保持12h。所得水解产物油相中甘油酯质量分数为94.12％，游离脂肪酸质量分数为5.88％。
反应结束后，将所得混合物转移至分液漏斗，并向其中加入30mL正己烷，使鱼油与水分层。加入酚酞指示剂，此时用KOH-乙醇水溶液滴定直至体系变为红色，静置分层，除去下层的水相，之后用蒸馏水洗去油相中可能残留的脂肪酸盐和KOH，取上层澄清油相，蒸去溶剂得到富含n-3PUFAs的鱼油甘油酯。甘油酯产品的脂肪酸组成中，n-3PUFAs占比由原油的34.11％提高到水解后的40.12％，其中EPA和DHA总量由30.29％提高到35.65％。
对比例3
准确称取精制鱼油样品3.0g和2.4mg的AY"Amano"400SD脂肪酶，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温37℃，保持12h。所得水解产物油相中甘油酯质量分数为90.89％，游离脂肪酸质量分数为9.11％。
反应结束后，将所得混合物转移至分液漏斗，并向其中加入30mL正己烷，使鱼油与水分层。加入酚酞指示剂，此时用KOH-乙醇水溶液滴定直至体系变为红色，静置分层，除去下层的水相，之后用蒸馏水洗去油相中可能残留的脂肪酸盐和KOH，取上层澄清油相，蒸去溶剂得到富含n-3PUFAs的鱼油甘油酯。甘油酯产品的脂肪酸组成中，n-3PUFAs占比由原油的34.11％提高到水解后的37.79％，其中EPA和DHA总量由30.29％提高到33.59％。
对比例4
准确称取精制鱼油样品3.0g、磷酸缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝9)1.5g和2.4mg的AY"Amano"400SD脂肪酶，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温37℃，保持12h。所得水解产物油相中甘油酯质量分数为95.36％，游离脂肪酸质量分数为4.64％。
反应结束后，将所得混合物转移至分液漏斗，并向其中加入30mL正己烷，使鱼油与水分层。加入酚酞指示剂，此时用KOH-乙醇水溶液滴定直至体系变为红色，静置分层，除去下层的水相，之后用蒸馏水洗去油相中可能残留的脂肪酸盐和KOH，取上层澄清油相，蒸去溶剂得到富含n-3PUFAs的鱼油甘油酯。甘油酯产品的脂肪酸组成中，n-3PUFAs占比由原油的34.11％提高到水解后的39.98％，其中EPA和DHA总量由30.29％提高到35.43％。
对比例1～对比例4的反应条件见表5。
表5
对比例1～对比例4不同反应条件对应的反应结果，包括水解后油相中甘油酯的质量分数、脱酸后n-3PUFAs含量和脱酸后EPA+DHA含量，见表6。
表6
从表6可以看出，不同的酶对脱酸后EPA+DHA含量较大，选用酶Lipozyme435，脱酸后EPA+DHA含量较低。同时，不同的pH均对酶解效果产生较大影响。
对比例5
在实施例1的其他条件不变的前提下，探讨不同的酶添加比例(AY"Amano"400SD和AY"Amano"30SD)对脱酸后EPA+DHA含量的影响，试验设计见表7。
表7
根据实施例中的实验和数据可以看出AY"Amano"400SD有较好的水解效果(水解下饱和和低不饱和脂肪酸)，但对EPA也有一定的水解性，添加量减小会大大削弱其水解效果。而AY"Amano"30SD也有不错的水解效果，且对EPA的水解性弱很多。将两株酶混合用于水解，从对比例5中的几个试验中也可看出，AY"Amano"400SD：AY"Amano"30SD为2:3时效果较好，AY"Amano"30SD比例过高会影响整体的水解效果，而AY"Amano"400SD比例过高会降低EPA的含量。
本发明不需要将脂肪酸水解下打乱重组，避免氧化和顺反异构化的产生，可以得到更为的天然的甘油酯产品。同时，发明人发现，酶对饱和和低不饱和脂肪酸具有水解优先选择性，对EPA和DHA具有底物歧视性，尤其是DHA含量更高。采用AY"Amano"400SD：AY"Amano"30SD为2:3的混合水解酶，减小了EPA的损失，使工艺更加完善。
现有技术多为先将甘油三酯用化学法全部水解成游离脂肪酸，再用尿素络合、分子蒸馏、低温结晶等物化法富集n-3PUFAs游离脂肪酸型，或者酶法酯化、酯交换法合成n-3PUFAs乙酯和甘油酯型。本方案直接对甘油三酯进行酶法水解，选用的酶有特异性：对饱和和低不饱和脂肪酸具有水解优先选择性，对EPA和DHA具有底物歧视性，尤其是DHA。选用混合酶可以扩大对饱和和低不饱和脂肪酸的选择范围，从而达到更好的水解效果。
化学水解可能部分破坏天然的全顺式n-3PUFAs，本方案不需要将脂肪酸水解下打乱重组，避免氧化和顺反异构化的产生，可以得到更为天然的n-3PUFAs甘油酯。在工艺方面，本技术方案操作流程简单，效果良好，工业化可行性程度较高。另外，本技术方案可以将市场上常见的鱼油得到60％以上n-3PUFAs的甘油酯。本发明提供一种富集油脂中n-3多不饱和脂肪酸甘油酯的方法，相比现有的酶法富集n-3PUFAs的工艺，工艺更加简单，方法成熟，更适于工业化生产。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。