阅读说明：本技术 一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法 (A kind of active fluorescent method of detection of alkaline phosphatase ) 是由 孙健 杨秀荣 刘国永 邢志财 于 2019-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法,将对氨基苯磷酸作为底物,在水溶液中,该底物分子经碱性磷酸酶的催化水解生成对氨基苯酚,对氨基苯酚可以与后续加入的乙二胺发生反应,生成强荧光发射的聚合物碳点。体系中的碱性磷酸酶活性越高,生成的荧光聚合物碳点就越多,荧光就越强,根据检测溶液的荧光强度变化,进行碱性磷酸酶活性的定量检测。本发明的方法能够对碱性磷酸酶活性进行荧光定量检测,检出限为0.1mU/mL,具有灵敏度高,抗干扰能力强,线性关系优异等优点。本发明所用试剂简单易得,操作简便,重复性好,为临床样品中碱性磷酸酶活性的定量检测提供了一种灵敏有效且准确度高的荧光方法。(The present invention relates to a kind of active fluorescent methods of detection of alkaline phosphatase, using p-APP as substrate, in aqueous solution, the substrate molecule generates para-aminophenol through the catalyzing hydrolysis of alkaline phosphatase, para-aminophenol can react with the ethylenediamine of subsequent addition, generate the polymer carbon dots of hyperfluorescence transmitting.Alkaline phosphatase activities in system are higher, and the fluorescent polymer carbon dots of generation are more, and fluorescence is stronger, according to the fluorescence intensity change of detection solution, carry out the quantitative detection of alkaline phosphatase activities.Method of the invention can carry out fluorogenic quantitative detection to alkaline phosphatase activities, and detection is limited to 0.1mU/mL, has the advantages that high sensitivity, strong antijamming capability, linear relationship is excellent.Agents useful for same of the present invention is simple and easy to get, easy to operate, reproducible, provides a kind of sensitive effective and high accuracy fluorescent method for the quantitative detection of clinical sample activity change of Alkaline phosphatase.)

一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法

技术领域

本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法。

背景技术

碱性磷酸酶(ALP)是一种广泛存在于人体、动物、植物及微生物体内的膜结合糖蛋白，它直接参与催化磷酸基团的转移和代谢等生理过程，在细胞生长凋亡进程中的信号传导和细胞内调节过程中扮演重要角色，对体内钙磷的吸收与代谢、维持体内适宜的钙磷比例和动物的骨化过程中有极其重要的作用。人体的肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织中普遍存在着碱性磷酸酶，同时，血浆中碱性磷酸酶的异常表达与多种疾病有关，如骨骼疾病，糖尿病，乳腺癌，***癌及肝功能异常等。另一方面，由于碱性磷酸酶的分子量较低、活性较稳定、易于提纯，因此从各种动物、植物、微生物中提取的商品化碱性磷酸酶，被广泛应用于酶联免疫分析、生物传感器、分子生物学等研究领域。因此，发展更简便灵敏、更优选择性的碱性磷酸酶活性检测方法不仅可以利于骨骼、肝胆系统等疾病的诊断和鉴别诊断，还可以结合抗体构建新颖的酶联免疫分析体系检测特定的疾病靶标。

截至目前，通过色谱法，比色法，化学发光法，电化学法，荧光法，表面增强共振拉曼散射等不同的分析技术已经发展了多种碱性磷酸酶活性的检测方法。其中，荧光检测技术由于其简单灵敏、实时性和在体检测等优点而受到了高度关注。尤其值得注意的是，基于荧光物质生成反应构建的荧光“点亮”型生物分析技术，通常操作更加简便，背景干扰更低，检测灵敏度更高，因此具有更好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法，该检测方法所用试剂简单易得，操作简便，重复性好，灵敏度高。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

本发明提供一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法，包括以下步骤：

步骤一：将对氨基苯磷酸(APP)水溶液分别与不同已知活性的碱性磷酸酶标准溶液在缓冲溶液中混合孵育；

步骤二：在步骤一制备的混合溶液中分别加入乙二胺水溶液，进一步混合孵育，进行荧光光谱测试；

步骤三：利用碱性磷酸酶标准溶液活性和荧光光谱强度的线性关系，绘制标准曲线；

步骤四：将对氨基苯磷酸(APP)水溶液与待测碱性磷酸酶溶液在缓冲溶液中混合孵育；

步骤五：在步骤四制备的混合溶液中加入乙二胺水溶液，进一步混合孵育，进行荧光光谱测试，得到待测碱性磷酸酶溶液的荧光光谱强度；

步骤六：利用步骤三的标准曲线及步骤五测得的荧光光谱强度，计算得到待测碱性磷酸酶活性。

在上述技术方案中，优选碱性磷酸酶标准溶液的活性为：0～70mU/mL。

在上述技术方案中，优选步骤一和四中对氨基苯磷酸水溶液的浓度为0.25～6.25mM。

在上述技术方案中，优选步骤一和四中缓冲溶液是pH＝8.0～11.0的10～100mMTris-HCl溶液，并含有MgCl₂浓度为0.1～5mM。

在上述技术方案中，进一步优选缓冲溶液是pH＝10.0，对氨基苯磷酸水溶液的浓度为2.5mM。

在上述技术方案中，优选步骤一和四中孵育温度为20～37℃，时间为10～90min。

在上述技术方案中，进一步优选步骤一和四中孵育温度为37℃，时间为60min。

在上述技术方案中，优选步骤二和五中乙二胺水溶液的浓度为100～1000

mM。

在上述技术方案中，优选步骤二和五中孵育温度为20～37℃，时间为20～180min。

在上述技术方案中，进一步优选步骤二和五中孵育温度为37℃，时间为120min。

本发明的有益效果是：

本发明提供的检测碱性磷酸酶活性的荧光方法，将对氨基苯磷酸作为底物，在水溶液中，该底物分子经碱性磷酸酶的催化水解生成对氨基苯酚，对氨基苯酚可以与后续加入的乙二胺发生反应，生成强荧光发射的聚合物碳点。体系中的碱性磷酸酶活性越高，生成的荧光聚合物碳点就越多，荧光就越强，根据检测溶液的荧光强度变化，进行碱性磷酸酶活性的定量检测。

本发明的方法能够对碱性磷酸酶活性进行荧光定量检测，检出限为0.1mU/mL，具有灵敏度高，抗干扰能力强，线性关系优异等优点。

本发明的方法能够在稀释人血清样品中进行检测，因此可用于临床样品中碱性磷酸酶活性的灵敏准确检测。

本发明所用试剂简单易得，操作简便，重复性好，为临床样品中碱性磷酸酶活性的定量检测提供了一种灵敏有效且准确度高的荧光方法。

本发明所需仪器设备普及程度较高，所需试剂均为商业化产品，过程简单、重复性好，对操作人员无特殊技术要求。

附图说明

下面结合附图和

具体实施方式

对本发明作进一步详细说明。

图1为本发明的碱性磷酸酶活性荧光检测方法示意图。

图2为本发明利用荧光光谱检测碱性磷酸酶可行性分析图(其中a为对氨基苯磷酸，b为对氨基苯磷酸+乙二胺，c为碱性磷酸酶+乙二胺，d为对氨基苯磷酸+碱性磷酸酶，e为对氨基苯磷酸+碱性磷酸酶+乙二胺，f为对氨基苯酚+乙二胺，均为溶液孵育后测试)。

图3为对氨基苯酚与乙二胺合成荧光聚合物碳点光谱图(左)和透射电镜图(右)(其中a,b,c分别为乙二胺、对氨基苯酚和碳点吸收光谱；d,e分别为碳点的荧光激发和发射光谱)。

图4为本发明中缓冲溶液pH值的优化测试图；控制pH分别为8,9,10,11。

图5为本发明中加入底物对氨基苯磷酸浓度的优化测试图；控制对氨基苯磷酸终浓度分别为0，0.1mM，0.25mM，0.5mM，1.0mM，1.5mM，2.0mM，2.5mM。

图6为本发明中对氨基苯磷酸与碱性磷酸酶溶液在缓冲溶液中混合酶解孵育时间的优化测试图；控制酶解孵育时间分别为10min，20min，30min，40min，50min，60min，70min，80min，90min。

图7为本发明中对氨基苯磷酸与碱性磷酸酶溶液在缓冲溶液中孵育后的混合溶液，再加入乙二胺混合荧光反应孵育时间的优化测试图；控制荧光反应孵育时间分别为20min，40min，60min，80min，120min，180min。

图8为本发明中溶液荧光光谱随碱性磷酸酶活性的变化曲线(A)及标准工作曲线(B,C)；控制碱性磷酸酶活性为0mU/mL，0.1mU/mL，0.5mU/mL，1mU/mL，2mU/mL，3mU/mL，4mU/mL，5mU/mL，6mU/mL，7mU/mL，8mU/mL，9mU/mL，10mU/mL，15mU/mL，20mU/mL，30mU/mL，40mU/mL，50mU/mL，60mU/mL，80mU/mL。

图9为本发明用于检测碱性磷酸酶活性的特异性测试图；选择的潜在干扰酶或蛋白质包括牛血清白蛋白BSA，核酸内切酶EcoR I，葡萄糖氧化酶GOx，人血清白蛋白HSA，溶菌酶Lysozyme，胰蛋白酶Trypsin。

具体实施方式

下面将结合实施例与附图对本发明作进一步阐述，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。所述方法均为常规方法，所述原料均能从公开商业途径获得。

实施例1

本发明方法的原理和可行性验证

本发明的碱性磷酸酶活性荧光检测方法示意图和原理如图1所示，首先验证本发明的可行性。如图2所示，对氨基苯酚和乙二胺的混合溶液(f)，37℃孵育120min，用荧光分光光度计测量体系的荧光，以400nm激发，在507nm处有明显的荧光发射；而对氨基苯磷酸(a)水溶液在507nm附近没有荧光发射；在其中单独加入乙二胺(b)或者碱性磷酸酶(d)，37℃孵育120min，也没有明显的荧光；孵育乙二胺和碱性磷酸酶的混合溶液(c)同样没有荧光；只有当对氨基苯磷酸和碱性磷酸酶共同孵育后，再加入乙二胺孵育后才有明显的荧光(e)，其荧光发射峰位置与f相同。对氨基苯磷酸作为底物，利用酶解产物对氨基苯酚与乙二胺特异性反应生成荧光产物的事实，证实了此发明的可行性。

实施例2

荧光聚合物碳点的合成与性质表征

将200mg对氨基苯酚溶解到40mL超纯水中，加入10mL乙二胺，混合均匀后在37℃孵育120min，得到的粗产品冷冻干燥后用丙酮洗三次，离心转速5000r/min，离心时间10min，去除上清后冷冻干燥后溶于超纯水放4℃冰箱待用。如图3所示，合成的聚合物碳点有明显区别于两种初始反应物的吸收光谱，且有明显的荧光，最大荧光激发峰和发射峰分别位于400nm和507nm附近。透射电镜显示聚合物碳点形貌为粒径在5～30纳米之间的球形。

实施例3

最佳检测条件的优化

为了使检测系统达到最佳的状态，本发明对体系的相关参数包括缓冲溶液的pH值、对氨基苯磷酸的浓度、对氨基苯磷酸与碱性磷酸酶溶液混合酶解孵育时间、再加入乙二胺溶液混合荧光反应孵育时间等进行了优化。具体操作如下：将45μL的碱性磷酸酶溶液，275μL的超纯水和400μL的对氨基苯磷酸加入到180μL的缓冲溶液中，37℃酶解孵育，之后加入100μL乙二胺溶液，37℃荧光反应孵育后用荧光分光光度计测量溶液的荧光。

如图4所示，优化缓冲溶液pH值时，上述具体操作中的45μL碱性磷酸酶溶液活性为40mU/mL，400μL对氨基苯磷酸的浓度为3mM，酶解孵育时间为60min，100μL乙二胺溶液的浓度为600mM，荧光反应孵育时间为120min，180μL缓冲溶液为Tris-HCl(50mM)含有0.1mMMgCl₂，pH值分别为8，9，10，11。结果表明pH 10附近时荧光最强，确定为优选的pH值。

如图5所示，优化对氨基苯磷酸的浓度时，上述具体操作中的45μL碱性磷酸酶溶液活性为40mU/mL，180μL缓冲溶液为Tris-HCl(50mM，pH 10)含有0.1mM MgCl₂，酶解孵育时间为60min，100μL乙二胺溶液的浓度为600mM，荧光反应孵育时间为120min，400μL的对氨基苯磷酸浓度分别为0，0.25mM，0.625mM，1.25mM，2.5mM，3.75mM，5.0mM，6.25mM。结果表明2.5mM的对氨基苯磷酸引起足够的荧光变化，同时避免原料的浪费，确定为优选的对氨基苯磷酸浓度。

如图6所示，优化对氨基苯磷酸与碱性磷酸酶溶液酶解孵育时间时，上述具体操作中的45μL碱性磷酸酶溶液活性为40mU/mL，400μL对氨基苯磷酸浓度为3mM，180μL缓冲溶液为Tris-HCl(50mM，pH 10)含有0.1mM MgCl₂，100μL乙二胺溶液的浓度为600mM，荧光反应孵育时间为120min，酶解孵育时间分别为10min，20min，30min，40min，50min，60min，70min，80min，90min。结果表明60min引起足够的荧光变化，同时避免时间的浪费，确定为优选的酶解孵育时间。

如图7所示，优化加入乙二胺混合后的荧光反应孵育时间时，上述具体操作中的45μL碱性磷酸酶溶液活性为40mU/mL，400μL对氨基苯磷酸浓度为3mM，180μL缓冲溶液为Tris-HCl(50mM，pH 10)含有0.1mM MgCl₂，酶解孵育时间为60min，100μL乙二胺溶液的浓度为600mM，荧光反应孵育时间分别为20min，40min，60min，80min，120min，180min。结果表明120min引起足够的荧光变化，同时避免时间的浪费，确定为优选的荧光反应孵育时间。

实施例4

一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法

首先将400μL的2.5mM对氨基苯磷酸，275μL的超纯水加入到180μL的Tris-HCl(50mM，pH 10)含有0.1mM MgCl₂的缓冲溶液中，之后将配制好的氨基苯磷酸混合溶液分别与45μL的不同活性的碱性磷酸酶标准溶液(0mU/mL，0.1mU/mL，0.5mU/mL，1mU/mL，2mU/mL，3mU/mL，4mU/mL，5mU/mL，6mU/mL，7mU/mL，8mU/mL，9mU/mL，10mU/mL，15mU/mL，20mU/mL，30mU/mL，40mU/mL，50mU/mL，60mU/mL，70mU/mL)、及待测碱性磷酸酶溶液，在37℃酶解孵育60min，之后分别加入100μL的600mM乙二胺溶液，继续37℃荧光反应孵育120min，之后用荧光分光光度计测量溶液的荧光。如图8所示，所得溶液的荧光发射光谱强度随碱性磷酸酶活性的增强而上升，利用507nm处的相对荧光强度随碱性磷酸酶活性的变化绘制标准曲线。在碱性磷酸酶活性范围0.1-6mU/mL之间，拟合的线性方程为I＝1.31+4.91C_ALP(mU/mL)，R²＝0.998；在碱性磷酸酶活性范围6-70mU/mL之间，拟合线性方程为I＝-233.96+341.31LogC_ALP(mU/mL)，R²＝0.996。

利用线性关系，根据待检测溶液的荧光强度值可以计算得到待测溶液碱性磷酸酶的活性值。该检测方法能特异性检出0.1mU/mL的碱性磷酸酶，能够满足测试血清中碱性磷酸酶含量的需求。

实施例5

一种检测碱性磷酸酶活性荧光方法的特异性

为了检测本发明方法检测碱性磷酸酶的特异性，选择的潜在干扰酶或蛋白质包括牛血清白蛋白BSA，人血清白蛋白HSA，核酸内切酶EcoR I，葡萄糖氧化酶GOx，溶菌酶Lysozyme，胰蛋白酶Trypsin。特异性的测试与实施例4中的碱性磷酸酶活性检测方法基本相同，不同之处在于用上述潜在干扰酶或蛋白质代替实施例4中的待测碱性磷酸酶溶液，其中，潜在干扰酶或蛋白质的终浓度是碱性磷酸酶的10倍，结果如图9所示，不论这些潜在干扰酶或蛋白质单独存在时或者与碱性磷酸酶共存时，都不影响体系的荧光，本发明方法对碱性磷酸酶活性的检测特异性很好。

实施例6

一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法检测人血清中的碱性磷酸酶活性

正常人的临床血清样本由吉林大学第二医院提供，血清中的碱性磷酸酶活性检测方法与实施例4中的碱性磷酸酶活性检测方法基本相同，不同之处在于用添加了碱性磷酸酶的稀释临床血清样品代替实施例4中的待测碱性磷酸酶溶液。

如表1所示，稀释临床血清样品中的检测结果表明，本发明的一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法能够在稀释血清样品中进行检测，因此可用于临床样品中碱性磷酸酶活性的灵敏准确检测。

表1.稀释血清(1％)中的碱性磷酸酶活性检测结果

还需要说明的是，本发明的具体实施例只是用来示例性说明，并不以任何方式限定本发明的保护范围，本领域的相关技术人员可以根据上述一些说明加以改进或变化，但所有这些改进和变化都应属于本发明权利要求的保护范围。