阅读说明：本技术 一种基于氧化细菌纤维素的用于局部急性止血的可吸收复合材料及其制备方法 (A kind of absorbable composite material and preparation method for topical acute hemostasis based on oxidizing bacteria cellulose ) 是由 洪枫 袁海彬 陈琳 于 2019-09-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种基于氧化细菌纤维素的用于局部急性止血的可吸收复合材料及其制备方法,通过以细菌纤维素为底物制备氧化细菌纤维素,再与多聚阳离子电解质进行复合；或者通过以细菌纤维素为底物制备氧化细菌纤维素,再与多聚阳离子电解质进行静电吸附自组装,并对凝血促愈因子进行包裹负载而得。本发明同时具备急性止血、广谱抗菌、促进愈合及体内吸收的特性；制备方法绿色环保,复合均匀高效,得到的复合材料安全性高,在高级功能敷料领域具有良好的市场应用前景。(The absorbable composite material and preparation method for topical acute hemostasis that the present invention relates to a kind of based on oxidizing bacteria cellulose, substrate prepares oxidizing bacteria cellulose by being using bacteria cellulose, then compound with the progress of polycation electrolyte；Or by preparing oxidizing bacteria cellulose using bacteria cellulose as substrate, then with polycation electrolyte carry out Electrostatic Absorption self assembly, and promotees to be cured the factor to blood coagulation and carry out package load and obtain.The present invention is provided simultaneously with acute hemostasis, broad-spectrum antiseptic, the characteristic for promoting healing and body absorption；Preparation method is environmentally protective, and compound uniform high-efficiency, obtained composite material is highly-safe, has good market application prospect in Premium Features dressing field.)

一种基于氧化细菌纤维素的用于局部急性止血的可吸收复合 材料及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医用复合材料技术领域，特别涉及一种基于氧化细菌纤维素的用于局部急性止血的可吸收复合材料及其制备方法。

背景技术

可吸收止血材料是一种用于伤口出血部位，能够快速止血，并且在一定时间内能被人体吸收的生物医用材料。其最大特点在于：应用于人体或动物体内局部难缝合伤口止血，在实现快速止血的同时，可在体内降解、无需取出，从而避免止血完成后去除敷料的二次伤害。目前常用的可吸收止血材料有纤维蛋白胶类止血材料、明胶海绵类止血材料、氧化纤维素类止血材料及壳聚糖类止血材料等。这些止血材料的止血机理和使用方法各不相同，其止血效果也有很大差别。

氧化再生纤维素(Oxidized Regenerated Cellulose,ORC)在1960年首次制备成功，是植物纤维素经再生后氧化处理成为纤维素酸的薄纱状或棉布状可吸收止血材料，具有棉纱的外观和质地，柔软而菲薄，易于包、敷、填塞等操作。其止血机制是将手术创面血液中的血小板聚集在网眼纱布上，以止血纱布作为止血基质，遇血后迅速形成凝胶状黑色物质，凝结血块从而达到止血的目的。它不依赖于人体内正常的凝血机制，而是通过物理作用迅速促使血液凝固，有效控制小血管出血。目前，只有美国和英国能生产该类产品，临床上使用的可吸收止血纱布Surgicel(速即纱)就是美国强生公司的产品。速即纱的主要成分就是氧化再生纤维素。氧化再生纤维素将纤维素中的C6伯羟基高度选择性氧化成为羧基而得到的纤维素的一种衍生物，目前已被应用于各行各业，且市场销售的产品主要依赖于进口，国内仅有几家公司生产出了类似的止血纱布。虽然氧化再生纤维素有很多优异的性能，但也存在一些弊端，如止血效率不高，不能适用于大量出血，抗菌性能弱以及组织相容性低等。

目前，在一些公开或授权的发明专利中，已经使用天然/合成高分子材料或者无机材料对氧化再生纤维素进行改性来提高其抗菌和止血性能。如胶原蛋白(CN105079886A)、藻酸盐(CN104013991A)和碳纳米管(CN105056284A)等。虽然以上复合止血材料对氧化再生纤维素性能有了一定的提升，但是改善效果较差，只能提升其部分性能，并且会对材料的生物可吸收性能造成负面影响。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于氧化细菌纤维素的用于局部急性止血的可吸收复合材料及其制备方法，解决了氧化再生纤维素抗菌性能弱、组织相容性低、止血速度慢的问题。

本发明提供了一种基于氧化细菌纤维素的用于局部急性止血的可吸收复合材料，通过以细菌纤维素为底物制备氧化细菌纤维素，再与多聚阳离子电解质进行复合；或者通过以细菌纤维素为底物制备氧化细菌纤维素，再与多聚阳离子电解质进行静电吸附自组装，并对凝血促愈因子进行包裹负载而得。

所述氧化细菌纤维素通过以细菌纤维素为基材，经碱纯化并用去离子水漂洗至中性后获得。

所述多聚阳离子电解质包括壳聚糖、聚赖氨酸、季铵盐类中的一种或几种；凝血促愈因子包括凝血酶、胶原蛋白中的一种或几种。

本发明还提供了一种基于氧化细菌纤维素的用于局部急性止血的可吸收复合材料的制备方法，包括：

(1)以细菌纤维素为底物，制备氧化细菌纤维素悬浊液；

(2)将多聚阳离子电解质溶液逐滴加入到氧化细菌纤维素悬浊液中进行静电吸附自组装反应，然后取出，漂洗，冻干，得到局部急性止血可吸收材料；

或者，将凝血促愈因子加入到氧化细菌纤维素悬浊液中浸渍吸附，再将多聚阳离子电解质溶液逐滴加入到氧化细菌纤维素悬浊液中进行静电吸附自组装反应，然后取出，漂洗，冻干，得到局部急性止血可吸收材料。

所述步骤(1)中的氧化细菌纤维素悬浊液的制备步骤如下：将细菌纤维素膜打散，经TEMPO/NaBr/NaClO混合氧化体系于室温下氧化，离心清洗和透析后得到。

所述步骤(2)中的多聚阳离子电解质溶液为1-5％的壳聚糖/稀酸溶液、0.1-1％的聚赖氨酸水溶液或者1-10％的有机硅季铵盐水溶液。

所述步骤(2)中的凝血促愈因子为0.1-10mg/mL胶原蛋白水溶液或者0.01-1mg/mL的凝血酶。

所述步骤(2)中的凝血促愈因子与氧化细菌纤维素的质量比为1:1-10:1。

所述步骤(2)中的浸渍吸附时间为0.5-5小时。

所述步骤(2)中的静电吸附自组装反应时间为1-60分钟。

本发明以细菌纳米纤维素为底物制备氧化细菌纤维素(OBC)，利用其高纯度和大比表面积特性，加快凝血过程。同时利用OBC和多聚阳离子电解质相反的电荷性，进行静电吸附自组装反应进行复合，还可以在其中引入凝血促愈因子，制备得到同时具有急性止血、抗菌和促愈功能的可吸收复合材料。

有益效果

(1)本发明材料以细菌纤维素为底物制备氧化细菌纤维素，其羧基含量更高，纳米尺度纤维，比表面积更大，聚合度更低，止血效果更好，生物可降解性能更好，更容易被人体吸收。

(2)本发明利用氧化细菌纤维素与多聚阳离子电解质相反的电荷性进行静电吸附自组装制备，无需使用额外交联剂；同时，多聚阳离子电解质的加入提高了材料促凝血和抗菌特性。

(3)本发明通过利用氧化细菌纤维素大的比表面积，在充分吸附凝血促愈因子之后再与多聚阳离子电解质进行静电吸附自组装反应，最终得到的材料同时具备急性止血、抗菌、促愈和可吸收的特性。

(4)本发明原料均为绿色环保生物材料，不含对人体有害的化学物质，可根据实际情况和特点制备成各种形状，安全环保，丢弃后在环境中能迅速降解，可作为一种性能良好且绿色环保的功能性材料。

(5)本发明制备方法简单易行，复合均匀高效，不使用交联剂，不会对合成物质的原有结构造成破坏，绿色环保，可工业化生产，具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1为本发明制备方法的流程示意图；

图2为实施例1-6所制备材料的产品图；其中，1为氧化细菌纤维素(OBC)，2为氧化细菌纤维素/壳聚糖(OBC/CS)，3为氧化细菌纤维素/胶原蛋白/壳聚糖(OBC/COL/CS)，4为氧化细菌纤维素/聚赖氨酸(OBC/PL)，5为氧化细菌纤维素/有机硅季铵盐(OBC/SQA)，6为氧化细菌纤维素/凝血酶/聚赖氨酸(OBC/TB/PL)；

图3是实施例1-6所制备材料的体外全血凝固时间测试结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)以木醋杆菌为菌种，经液体培养基恒温静置培养10天后，取出细菌纤维素膜置于氢氧化钠溶液中，在80℃下处理2h后取出，用去离子水漂洗至中性后获得细菌纤维素膜；浸泡于透明质酸溶液中6h，得到透明质酸浸泡后的细菌纤维素膜。

(2)称取4g纯化后的细菌纤维素膜，将其剪碎后在高速匀浆机中打散，成为细菌纤维素悬浊液。

(3)将步骤(2)中得到的细菌纤维素悬浮液(固含量为1-10g/L)经TEMPO/NaBr/NaClO混合氧化体系于室温下进行氧化，TEMPO用量为0.1mmol/g，NaBr为1mmol/g。加入一定量的10％NaClO溶液开始反应，通过滴加0.5M NaOH溶液来维持反应体系的pH＝10±0.5，至不再消耗NaOH溶液时，加入乙醇终止反应。得到的氧化产物经离心、漂洗和高压灭菌后置于4℃环境下保存。由电导滴定法测得TEMPO氧化细菌纤维素悬浮液的羧基含量为23％。

(4)将步骤(3)得到的氧化细菌纤维素悬浊液进行冷冻干燥，最后得到氧化细菌纤维素止血材料。

实施例2

(1)以木醋杆菌为菌种，经液体培养基恒温静置培养10天后，取出细菌纤维素膜置于氢氧化钠溶液中，在80℃下处理2h后取出，用去离子水漂洗至中性后获得细菌纤维素膜；浸泡于透明质酸溶液中6h，得到透明质酸浸泡后的细菌纤维素膜；

(2)称取4g纯化后的细菌纤维素膜，将其剪碎后在高速匀浆机中打散，成为细菌纤维素悬浊液。

(3)将步骤(2)中得到的细菌纤维素悬浮液(固含量为1-10g/L)经TEMPO/NaBr/NaClO混合氧化体系于室温下进行氧化，TEMPO用量为0.1mmol/g，NaBr为1mmol/g。加入一定量的10％NaClO溶液开始反应，通过滴加0.5M NaOH溶液来维持反应体系的pH＝10±0.5，至不再消耗NaOH溶液时，加入乙醇终止反应。得到的氧化产物经离心、漂洗和高压灭菌后置于4℃环境下保存。由电导滴定法测得TEMPO氧化细菌纤维素悬浮液的羧基含量为23％。

(4)称取2g壳聚糖充分溶解于100mL 3％的醋酸溶液中，形成终浓度为2％的壳聚糖稀酸溶液。

(5)取5mL步骤(4)制备的壳聚糖稀酸溶液逐滴加入50mL步骤(3)制备的氧化细菌纤维素悬浊液中，反应60分钟后将产物反复离心漂洗，最后进行冷冻干燥，得到氧化细菌纤维素/壳聚糖复合止血材料。

实施例3

(1)以木醋杆菌为菌种，经液体培养基恒温静置培养10天后，取出细菌纤维素膜置于氢氧化钠溶液中，在80℃下处理2h后取出，用去离子水漂洗至中性后获得细菌纤维素膜；浸泡于透明质酸溶液中6h，得到透明质酸浸泡后的细菌纤维素膜；

(2)称取4g纯化后的细菌纤维素膜，将其剪碎后在高速匀浆机中打散，成为细菌纤维素悬浊液。

(3)将步骤(2)中得到的细菌纤维素悬浮液(固含量为1-10g/L)经TEMPO/NaBr/NaClO混合氧化体系于室温下进行氧化，TEMPO用量为0.1mmol/g，NaBr为1mmol/g。加入一定量的10％NaClO溶液开始反应，通过滴加0.5M NaOH溶液来维持反应体系的pH＝10±0.5，至不再消耗NaOH溶液时，加入乙醇终止反应。得到的氧化产物经离心、漂洗和高压灭菌后置于4℃环境下保存。由电导滴定法测得TEMPO氧化细菌纤维素悬浮液的羧基含量为23％。

(4)称取30mg的鱼源胶原蛋白充分溶解于10mL无菌水中，形成终浓度为3mg/mL的蛋白溶液。

(5)取10mL步骤(4)制备的蛋白溶液加入40mL步骤(3)制备的氧化细菌纤维素悬浊液中，充分搅拌吸附1小时，得到吸附有胶原蛋白的氧化细菌纤维素悬浊液。

(6)称取2g壳聚糖充分溶解于100mL 3％的醋酸溶液中，形成终浓度为2％的壳聚糖稀酸溶液。

(7)取5mL步骤(6)制备的壳聚糖稀酸溶液逐滴加入50mL步骤(5)制备的吸附有胶原蛋白的氧化细菌纤维素悬浊液中，反应60分钟后将产物反复离心漂洗，最后进行冷冻干燥，得到氧化细菌纤维素/胶原蛋白/壳聚糖复合止血材料。

实施例4

(1)以木醋杆菌为菌种，经液体培养基恒温静置培养10天后，取出细菌纤维素膜置于氢氧化钠溶液中，在80℃下处理2h后取出，用去离子水漂洗至中性后获得细菌纤维素膜；浸泡于透明质酸溶液中6h，得到透明质酸浸泡后的细菌纤维素膜；

(2)称取4g纯化后的细菌纤维素膜，将其剪碎后在高速匀浆机中打散，成为细菌纤维素悬浊液。

(3)将步骤(2)中得到的细菌纤维素悬浮液(固含量为1-10g/L)经TEMPO/NaBr/NaClO混合氧化体系于室温下进行氧化，TEMPO用量为0.1mmol/g，NaBr为1mmol/g。加入一定量的10％NaClO溶液开始反应，通过滴加0.5M NaOH溶液来维持反应体系的pH＝10±0.5，至不再消耗NaOH溶液时，加入乙醇终止反应。得到的氧化产物经离心、漂洗和高压灭菌后置于4℃环境下保存。由电导滴定法测得TEMPO氧化细菌纤维素悬浮液的羧基含量为23％。

(4)称取0.2g壳聚糖充分溶解于100mL无菌水中，形成终浓度为0.2％的聚赖氨酸水溶液。

(5)取5mL步骤(4)制备的聚赖氨酸水溶液逐滴加入50mL步骤(3)制备的氧化细菌纤维素悬浊液中，反应60分钟后将产物反复离心漂洗，最后进行冷冻干燥，得到氧化细菌纤维素/聚赖氨酸复合止血材料。

实施例5

(1)以木醋杆菌为菌种，经液体培养基恒温静置培养10天后，取出细菌纤维素膜置于氢氧化钠溶液中，在80℃下处理2h后取出，用去离子水漂洗至中性后获得细菌纤维素膜；浸泡于透明质酸溶液中6h，得到透明质酸浸泡后的细菌纤维素膜；

(2)称取4g纯化后的细菌纤维素膜，将其剪碎后在高速匀浆机中打散，成为细菌纤维素悬浊液。

(3)将步骤(2)中得到的细菌纤维素悬浮液(固含量为1-10g/L)经TEMPO/NaBr/NaClO混合氧化体系于室温下进行氧化，TEMPO用量为0.1mmol/g，NaBr为1mmol/g。加入一定量的10％NaClO溶液开始反应，通过滴加0.5M NaOH溶液来维持反应体系的pH＝10±0.5，至不再消耗NaOH溶液时，加入乙醇终止反应。得到的氧化产物经离心、漂洗和高压灭菌后置于4℃环境下保存。由电导滴定法测得TEMPO氧化细菌纤维素悬浮液的羧基含量为23％。

(4)称取0.1g有机硅季铵盐充分溶解于100mL无菌水中，形成终浓度为0.1％的有机硅季铵盐水溶液。

(5)取5mL步骤(4)制备的有机硅季铵盐水溶液逐滴加入50mL步骤(3)制备的氧化细菌纤维素悬浊液中，反应60分钟后将产物反复离心漂洗，最后进行冷冻干燥，得到氧化细菌纤维素/有机硅季铵盐复合止血材料。

实施例6

(1)以木醋杆菌为菌种，经液体培养基恒温静置培养10天后，取出细菌纤维素膜置于氢氧化钠溶液中，在80℃下处理2h后取出，用去离子水漂洗至中性后获得细菌纤维素膜；浸泡于透明质酸溶液中6h，得到透明质酸浸泡后的细菌纤维素膜；

(2)称取4g纯化后的细菌纤维素膜，将其剪碎后在高速匀浆机中打散，成为细菌纤维素悬浊液。

(3)将步骤(2)中得到的细菌纤维素悬浮液(固含量为1-10g/L)经TEMPO/NaBr/NaClO混合氧化体系于室温下进行氧化，TEMPO用量为0.1mmol/g，NaBr为1mmol/g。加入一定量的10％NaClO溶液开始反应，通过滴加0.5M NaOH溶液来维持反应体系的pH＝10±0.5，至不再消耗NaOH溶液时，加入乙醇终止反应。得到的氧化产物经离心、漂洗和高压灭菌后置于4℃环境下保存。由电导滴定法测得TEMPO氧化细菌纤维素悬浮液的羧基含量为23％。

(4)称取10mg的凝血酶充分溶解于10mL无菌水中，形成终浓度为1mg/mL的凝血酶溶液。

(5)取10mL步骤(4)制备的凝血酶溶液加入40mL步骤(3)制备的氧化细菌纤维素悬浊液中，充分搅拌吸附1小时，得到吸附有凝血酶的氧化细菌纤维素悬浊液。

(6)称取0.2g聚赖氨酸充分溶解于100mL无菌水中，形成终浓度为0.2％的聚赖氨酸水溶液。

(7)取5mL步骤(6)制备的聚赖氨酸水溶液逐滴加入50mL步骤(5)制备的吸附有凝血酶的氧化细菌纤维素悬浊液中，反应60分钟后将产物反复离心漂洗，最后进行冷冻干燥，得到氧化细菌纤维素/凝血酶/聚赖氨酸复合止血材料。

表1实施例1-6所制备材料对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抗菌测试结果

注：无菌纱布为对照组，测试方法依据ISO-20743—2007。

由表1可知，氧化细菌纤维素自身的确具有一定的抑菌作用，这主要是由于氧化细菌纤维素中大量羧基形成的低pH环境抑制了细菌的增殖和繁殖。但是其抑菌效果是非常有限的，无法完全避免细菌尤其耐酸性细菌和真菌对伤口的感染。相反，复合有多聚阳离子的实验组的抗菌性能较氧化细菌纤维素而言得到显著提升，并且对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌具有相同抑菌趋势。优异的广谱抗菌性使得这一系列材料具有应用于临床的潜力。

由图3可知，OBC的全血凝固时间分别为248s，而其他组复合材料的全血凝固时间都显著低于单一的OBC。尤其是复合有凝血促愈因子的实验组(实施例3和实施例6)凝血时间显著缩短，最短可至110s。其机理可能是由于氧化细菌纤维素，多聚阳离子以及凝血促愈因子三者的协同作用。本发明在不破坏原有结构的情况下将这三种功能材料巧妙地结合在一起，形成一种新的复合材料并获得优异的止血性能，有应用于临床作为急性止血材料的潜力。