阅读说明：本技术 一种发酵液中γ-聚谷氨酸的提取方法 (A kind of extracting method of Gamma-polyglutamic acid from fermentation broth ) 是由 马霞 李敏 何艳 于 2019-09-17 设计创作，主要内容包括：本发明所公开了一种发酵液中γ-聚谷氨酸的提取方法,通过反胶束萃取发酵液中的γ-聚谷氨酸,真空冷冻干燥得到成品γ-聚谷氨酸。本发明操作简单、流程少、生产成本低,提取率高,产品质量好。(A kind of presently disclosed extracting method of Gamma-polyglutamic acid from fermentation broth, by the gamma-polyglutamic acid in inverse micelle abstraction fermentation liquid, vacuum freeze drying obtains finished product gamma-polyglutamic acid.Operation of the present invention is simple, process is few, production cost is low, and recovery rate is high, good product quality.)

一种发酵液中γ-聚谷氨酸的提取方法

技术领域

本发明属于γ-聚谷氨酸生产技术领域，涉及一种γ-聚谷氨酸的提取方法。

背景技术

γ-聚谷氨酸是由多种杆菌产生的一种胞外多肽，它是某些微生物荚膜的主要组分，是一种水溶性和可生物降解的高分子物质。它是由D-型或L-型谷氨酸通过γ酰胺键连接而成。γ-聚谷氨酸最早发现于1937年，研究人员在炭疽芽孢杆菌的细胞荚膜中以及糖化菌的细胞荚膜中发现了γ-聚谷氨酸，并证明其是某些微生物荚膜的主要成分之一。之后在枯草芽孢杆菌及纳豆杆菌中也发现γ-聚谷氨酸。γ-聚谷氨酸是由D-谷氨酸(D-GLu)和L-谷氨酸(L-GLu)单体以γ-羧基与α-氨基以肽键的形式缩合而成的一种多肽分子。γ-聚谷氨酸的分子链上具有大量活性较高的侧链羧基，具有极高的保湿性和吸水性(1∶3500，m/v)。易于和一些药物结合生成稳定的复合物，是一类理想的可生物降解的医药用高分子材料。γ-聚谷氨酸对环境无污染，为绿色生物产品。

γ-聚谷氨酸的应用领域由前所提及的优良的理化性质可广泛用做环保领域如生物絮凝剂、重金属吸附剂，食品工业如增稠剂，农业领域如保湿剂，医药工业如药物载体、医用生物粘合剂等等，一般认为它对人类和环境无毒害，甚至可食用。γ-聚谷氨酸及其衍生物潜在应用价值极大可发展出许多特殊用途是一种有极大开发价值和应用前景的多功能新型生物制品。

目前，提取的方法主要有：有机溶剂沉淀法、化学沉淀法、膜分离沉淀法获得γ-聚谷氨酸。但现有技术提取的方法存在生产成本高、提取工艺复杂的技术问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术中提取γ-聚谷氨酸生产成本高、提取工艺复杂的技术问题，提供一种提取工艺简单、生产成本低的γ-聚谷氨酸提取方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种发酵液中γ-聚谷氨酸的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：发酵液的制备：

(a)将枯草芽孢杆菌接种于斜面培养基中，在恒温培养箱中37℃培养12h，作为活化菌种；

(b)将(a)活化后的菌种挑取一环接种于种子培养基中，摇床转速为220r/min， 37℃振荡培养15h作为种子液；

(c)按5wt％的接种量将(b)所得的种子液接种到液体发酵培养基中，摇床转速为220r/min，37℃振荡培养24h得到含有产物的发酵液；

步骤2：发酵液预处理：

将步骤1得到的发酵液在5000r/min离心20min以去除菌体，取上清液；

步骤3：反胶束萃取：

(a)反胶束溶液的制备：前萃溶液为：100～150mmol/L十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)/80％(v/v)异辛烷/5％(v/v)正己醇/15％(v/v)正丁醇；反萃溶液为：含0.5mol/LKBr的p H为4.2的醋酸缓冲液；

(b)上清液预处理：将步骤2得到的含有γ-聚谷氨酸的上清液，加入0.1mol/LNaCl，用6mol/L的稀盐酸调节pH至6～8；

(c)反胶束萃取：将等体积的前萃溶液与预处理后的上清液混合，混合时间为5～15min；然后再加入反萃溶液，混合5～15min，待相分离(25℃)后，得到含有γ-聚谷氨酸的水相；

步骤4：对步骤3得到的水相进行透析，将透析得到的浓缩液进行真空冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸粗品；

步骤5：将步骤4得到的γ-聚谷氨酸粗品溶于蒸馏水中，再次进行透析，浓缩液进行真空冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸纯品。

优选地，所述步骤1中枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis GIM1.286。

优选地，所述步骤1中斜面培养基的成分包括：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，pH 7.5；灭菌条件：121℃，20min。

优选地，所述步骤1中种子培养基成分包括：蔗糖30g/L，牛肉膏10g/L，谷氨酸钠30g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L、K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L，pH 7.5；灭菌条件：121℃，20min。

优选地，所述步骤1中液体发酵培养基成分包括：蔗糖30g/L，牛肉膏8g/L，谷氨酸钠30g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L、K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L，pH 7.5；灭菌条件：121℃，20min。

优选地，所述步骤4与步骤5中透析的条件均为：在蒸馏水中透析48h，每隔4h换一次蒸馏水。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)传统的有机溶剂沉淀法提取γ-聚谷氨酸，用量大，增加了成本，本发明确定了一种提取率较高的提取方法，有机溶剂可回收，减少了对环境的污染。

(2)冷冻干燥或真空干燥，保证了产品质量。

(3)本发明确定了反胶束溶液制备工艺条件。

(4)浓缩可有效的降低工业化生产中干燥成本。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的γ-聚谷氨酸的纸层析实验结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明各实施例中检测上清液液中γ-聚谷氨酸含量：运用CTAB比浊法，测定250nm下的吸光度，具体步骤如下：

(a)精确称取γ-聚谷氨酸标准品0.1g，置于100mL容量瓶中，以蒸馏水溶解并定容，摇匀，得到1g/m L的γ-聚谷氨酸标准液，取该溶液10mL至另一个100mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，摇匀，得到100μg/m L的γ-聚谷氨酸标准液，用上述方法配制两份100mL的100μg/mL的γ-聚谷氨酸标准液。精密量取8、16、24、32、40、48mL上述溶液，分别置于1～6号容量瓶中，以蒸馏水定容至100mL，摇匀，得到8～48μg/mL的γ-聚谷氨酸标准液；

(b)配制2％的NaOH溶液，并以此为溶剂，加入CTAB，待CTAB溶解后(可适当升温加速溶解)配制成25g/L的CTAB试液；

(c)标准液或样液于试管中，准确加入2mL CTAB试液，自加入时开始计时，充分振荡，其间尽量避免反应液产生泡沫，静置至接近3min，然后将反应液倒入比色皿中，3min时测定波长在250nm下的吸光度(A₂₅₀)，以未接种的培养基经相应处取2mL理后作为空白。

本发明各实施中γ-聚谷氨酸精纯品的鉴定方法采用薄层层析实验，其中使用的试剂：6mol/L的盐酸、0.5mol/L谷氨酸标准液、显色剂(准确称量0.0400g茚三酮，溶于20mL丙酮中)、展层剂(正丁醇15mL、甲酸3mL、蒸馏水2mL)、谷氨酸样品(γ-聚谷氨酸120℃水解2h)

本发明各实施例中所使用试剂如下：

其他试剂均为分析纯试剂。

本发明各实施例中所使用仪器如下：

本发明所使用的枯草芽孢杆菌可以通过商业途径购买取得。

实施例1

本实施例提供了一种发酵液中γ-聚谷氨酸的提取方法，具体步骤如下：

步骤1：发酵液的制备：

(a)菌种选择：选择枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis GIM1.286)接种于斜面培养基中，在37℃下恒温培养12h，作为活化菌种；其中，斜面培养基(g/L)成分如下：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，琼脂15，pH 7.5；灭菌条件： 121℃，20min；

(b)将活化菌种挑取一环接种于种子培养基中，摇床转速为220r/min，37℃振荡培养15h作为种子液；其中，种子培养基(g/L)成分如下：蔗糖30，牛肉膏10，谷氨酸钠30，MgSO₄·7H₂O 0.25、K₂HPO₄·3H₂O 0.5，pH 7.5；灭菌条件： 121℃，20min；

(c)按5wt％的接种量将种子液接种到液体发酵培养基中，摇床转速为 220r/min，37℃振荡培养24小时得到含有产物的发酵液；其中，液体发酵培养基(g/L)成分如下：蔗糖30，牛肉膏8，谷氨酸钠30，MgSO₄·7H₂O 0.25、 K₂HPO₄·3H₂O 0.5，pH 7.5；灭菌条件：121℃，20min；

步骤2：将步骤1得到的发酵液在5000r/min离心20min以去除菌体，取上清液，检测得到，上清液液中γ-聚谷氨酸含量为12.04g/L；

步骤3：反胶束萃取：

(a)反胶束溶液的制备：前萃溶液为：100mmol/L十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)/80％(v/v)异辛烷/5％(v/v)正己醇/15％(v/v)正丁醇；反萃溶液为：含0.5mol/L KBr的p H为4.2的醋酸缓冲液；

(b)上清液预处理：将步骤2得到的含有γ-聚谷氨酸的上清液，加入0.1 mol/LNaCl，用6mol/L的稀盐酸调节pH至6；

(c)反胶束萃取：将等体积的前萃溶液与预处理后的上清液混合，混合时间为5min；然后再加入反萃溶液，混合10min，待相分离(25℃)后，得到含有γ-聚谷氨酸的水相；

步骤4：将步骤3得到的水相置于7000Dal透析袋中在蒸馏水中透析48h，每4h换一次蒸馏水，将透析的浓缩液进行真空干燥得到γ-聚谷氨酸粗品；

步骤5：将步骤4得到γ-聚谷氨酸粗品溶于蒸馏水，再将所得溶液放入透析袋中，用蒸馏水反复透析48h，去除小分子和有机溶剂，浓缩液进行真空冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸纯品，产量为9.44g/L，提取率78.40％。同条件下，运用三倍乙醇提取产物产量为7.73g/L，提取率提高了14.20％。

纸层析实验(鉴定γ-聚谷氨酸)：

比移值(R_f)用来表示被分离的物质展开后在薄层上的移动距离，它是样品在两相中吸附及解析程度不同而引起的溶质和溶剂的相对移动速率，可表示为： R_f＝a/b

a—原点至组分斑点中心的距离

b—原点至展开剂前沿的距离

如图1所示，图中左点为样品，右点为0.5％标准谷氨酸；

计算比移值：Rf(标品)＝a/b＝2/8.3＝0.241；

Rf(样品)＝a/b＝2/8.3＝0.241；

两种不同氨基酸的比移值至少相差0.05，根据上边计算可见，样品与标品的比移值相同，故视为同一种氨基酸，且由图可见，未出现杂色，故透析纯化后的γ-聚谷氨酸为纯品。

实施例2

本实施例提供了一种发酵液中γ-聚谷氨酸的提取方法，具体步骤如下：

步骤1：发酵液的制备：

(a)菌种选择：选择枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis GIM1.286)接种于斜面培养基中，在37℃下恒温培养12h，作为活化菌种；其中，斜面培养基(g/L)成分如下：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，琼脂15，pH 7.5；灭菌条件：121℃，20min；

(b)将活化菌种挑取一环接种于种子培养基中，摇床转速为220r/min，37℃振荡培养15h作为种子液；其中，种子培养基(g/L)成分如下：蔗糖30，牛肉膏10，谷氨酸钠30，MgSO₄·7H₂O 0.25、K₂HPO₄·3H₂O 0.5，pH 7.5；灭菌条件： 121℃，20min；

(c)按5wt％的接种量将种子液接种到液体发酵培养基中，摇床转速为 220r/min，37℃振荡培养24h得到含有产物的发酵液；其中，液体发酵培养基(g/L) 成分如下：蔗糖30，牛肉膏8，谷氨酸钠30，MgSO₄·7H2O 0.25、K₂HPO₄·3H₂O 0.5，pH 7.5；灭菌条件：121℃，20min；

步骤2：将步骤1得到的发酵液在5000r/min离心20min以去除菌体，取上清液，检测得到，上清液液中γ-聚谷氨酸含量为14.55g/L；

步骤3：反胶束萃取：

(a)反胶束溶液的制备：前萃溶液为：120mmol/L十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)/80％(v/v)异辛烷/5％(v/v)正己醇/15％(v/v)正丁醇；反萃溶液为：含0.5mol/L KBr的p H为4.2的醋酸缓冲液；

(d)上清液预处理：将步骤2得到的含有γ-聚谷氨酸的上清液，加入0.1 mol/LNaCl，用6mol/L的稀盐酸调节pH至8；

(b)反胶束萃取：将等体积的前萃溶液与预处理后的上清液混合，混合时间为5min；然后再加入反萃溶液，混合15min，待相分离(25℃)后，得到含有γ-聚谷氨酸的水相；

步骤4：将步骤3得到的水相置于7000Dal透析袋中在蒸馏水中透析48h，每4h换一次蒸馏水，将透析的导的浓缩液进行真空干燥得到γ-聚谷氨酸粗品；

步骤5：将步骤4得到γ-聚谷氨酸粗品溶于蒸馏水，再将所得溶液放入透析袋中，用蒸馏水反复透析48h，去除小分子和有机溶剂，浓缩液进行真空冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸纯品，产量为12.68g/L，提取率为87.15％。同条件下，运用三倍乙醇提取产物产量为8.92g/L，提取率为61.31％，提取率提高了25.84％。

实施例3

本实施例提供了一种发酵液中γ-聚谷氨酸的提取方法，具体步骤如下：

步骤1：发酵液的制备：

(a)菌种选择：选择枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis GIM1.286)接种于斜面培养基中，在37℃下恒温培养12h，作为活化菌种；其中，斜面培养基(g/L)成分如下：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，琼脂15，pH 7.5；灭菌条件： 121℃，20min；

(b)将活化菌种挑取一环接种于种子培养基中，摇床转速为220r/min，37℃振荡培养15h作为种子液；其中，种子培养基(g/L)成分如下：蔗糖30，牛肉膏10，谷氨酸钠30，MgSO₄·7H₂O 0.25、K₂HPO₄·3H₂O 0.5，pH 7.5；灭菌条件： 121℃，20min；

(c)按5wt％的接种量将种子液接种到液体发酵培养基中，摇床转速为 220r/min，37℃振荡培养24h得到含有产物的发酵液；其中，液体发酵培养基(g/L) 成分如下：蔗糖30，牛肉膏8，谷氨酸钠30，MgSO₄·7H₂O 0.25、K₂HPO₄·3H₂O 0.5，pH 7.5；灭菌条件：121℃，20min；

步骤2：将步骤1得到的发酵液在5000r/min离心20min以去除菌体，取上清液，检测得到，上清液液中γ-聚谷氨酸含量为11.03g/L；

步骤3：反胶束萃取：

(a)反胶束溶液的制备：前萃溶液为：130mmol/L十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)/80％(v/v)异辛烷/5％(v/v)正己醇/15％(v/v)正丁醇；反萃溶液为：含0.5mol/L KBr的p H为4.2的醋酸缓冲液；

(b)上清液预处理：将步骤2得到的含有γ-聚谷氨酸的上清液，加入0.1 mol/LNaCl，用6mol/L的稀盐酸调节pH至7；

(c)反胶束萃取：将等体积的前萃溶液与预处理后的上清液混合，混合时间为5min；然后再加入反萃溶液，混合10min，待相分离(25℃)后，得到含有γ-聚谷氨酸的水相；

步骤4：将步骤3得到的水相置于7000Dal透析袋中在蒸馏水中透析48h，每4h换一次蒸馏水，将透析的导的浓缩液进行真空干燥得到γ-聚谷氨酸粗品；

步骤5：将步骤4得到γ-聚谷氨酸粗品溶于蒸馏水，再将所得溶液放入透析袋中，用蒸馏水反复透析48h，去除小分子和有机溶剂，浓缩液进行真空冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸纯品，产量为9.08g/L，提取率为82.32％。同条件下，运用三倍乙醇提取产物产量为8.12g/L，提取率为73.62％，提取率提高了8.7％。

实施例4

本实施例提供了一种发酵液中γ-聚谷氨酸的提取方法，具体步骤如下：

步骤1：发酵液的制备：

(a)菌种选择：选择枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis GIM1.286)接种于斜面培养基中，在37℃下恒温培养12h，作为活化菌种；其中，斜面培养基(g/L)成分如下：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，琼脂15，pH 7.5；灭菌条件： 121℃，20min；

(b)将活化菌种挑取一环接种于种子培养基中，摇床转速为220r/min，37℃振荡培养15h作为种子液；其中，种子培养基(g/L)成分如下：蔗糖30，牛肉膏10，谷氨酸钠30，MgSO₄·7H₂O 0.25、K₂HPO₄·3H₂O 0.5，pH 7.5；灭菌条件： 121℃，20min；

(c)按5wt％的接种量将种子液接种到液体发酵培养基中，摇床转速为 220r/min，37℃振荡培养24h得到含有产物的发酵液；其中，液体发酵培养基(g/L) 成分如下：蔗糖30，牛肉膏8，谷氨酸钠30，MgSO₄·7H₂O 0.25、K₂HPO₄·3H₂O 0.5，pH 7.5；灭菌条件：121℃，20min；

步骤2：将步骤1得到的发酵液在5000r/min离心20min以去除菌体，取上清液，检测得到，上清液液中γ-聚谷氨酸含量为13.27g/L；

步骤3：反胶束萃取：

(a)反胶束溶液的制备：前萃溶液为：140mmol/L十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)/80％(v/v)异辛烷/5％(v/v)正己醇/15％(v/v)正丁醇；反萃溶液为：含0.5mol/L KBr的p H为4.2的醋酸缓冲液；

(b)上清液预处理：将步骤2得到的含有γ-聚谷氨酸的上清液，加入0.1 mol/LNaCl，用6mol/L的稀盐酸调节pH至6；

(b)反胶束萃取：将等体积的前萃溶液与预处理后的上清液混合，混合时间为5min；然后再加入反萃溶液，混合10min，待相分离(25℃)后，得到含有γ-聚谷氨酸的水相；

步骤4：将步骤3得到的水相置于7000Dal透析袋中在蒸馏水中透析48h，每4h换一次蒸馏水，将透析的导的浓缩液进行真空干燥得到γ-聚谷氨酸粗品；

步骤5：将步骤4得到γ-聚谷氨酸粗品溶于蒸馏水，再将所得溶液放入透析袋中，用蒸馏水反复透析48h，去除小分子和有机溶剂，浓缩液进行真空冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸纯品，产量为9.88g/L，提取率为74.45％。同条件下，运用三倍乙醇提取产物产量为7.91g/L，提取率为59.61％，提取率提高了14.84％。