阅读说明：本技术 一种用于细胞微球制备的熔融沉积型3d打印芯片 (A kind of fusion sediment type 3D printing chip for cell microsphere preparation ) 是由 刘爱林 刘萌萌 刘辉 郭子珍 雷云 钟瑜 林新华 于 2019-07-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种用于细胞微球制备的熔融沉积型3D打印芯片。基于3D打印层层精确堆积、一次性成型和打印材料多元化的特点,结合模型切片时可设置不同的填充度,形成不同大小的网状结构,从而完成阵列细胞微球的制备与培养。本发明具有经济方便且细胞成球均匀等特点,在普通实验室即可制作,克服了超低黏附六孔板成球大小不均一的缺点及商业化阵列成球微孔板价格高昂的局限性。(The present invention discloses a kind of fusion sediment type 3D printing chip for cell microsphere preparation.Based on 3D printing accurately accumulation, disposal molding and the characteristics of printed material diversification layer by layer, binding model settable different compactedness when being sliced forms different size of reticular structure, to complete the preparation and culture of array cell microsphere.The present invention has the characteristics that economic convenient and cell balling-up is uniform, can make in common lab, overcomes and ultralow sticks the inhomogenous disadvantage of six orifice plate balling-up sizes and the commercialization expensive limitation of array balling-up microwell plate.)

一种用于细胞微球制备的熔融沉积型3D打印芯片

技术领域

本发明涉及一种用于细胞微球制备的熔融沉积型3D打印芯片，成功在利用熔融堆积成型技术制造的芯片中实现间充质干细胞3D微球的制备与培养，具有高通量、成球大小均一、芯片制作简单、成本低等特点。

背景技术

三维快速成型打印简称3D打印，又称增材制造，是快速成型技术的一种，综合了数字建模技术、机电控制技术、信息技术、材料科学与化学等诸多领域的前沿技术，被誉为“第三次工业革命”的核心技术。其基本原理为：数字分层-物理层积，即首先对被打印对象建立数字模型并进行数字分层，获得每层二维横截面信息、加工路径或轨迹；然后选择合适的打印材料及相应的工艺方式将上述数字信息转化为物理驱动，逐层打印，直至制造出模型实体。与传统的“去除”加工方法和“变性”加工方法相比，3D打印无需事先制造模具，无需在制造过程中取出大量材料，工艺简单，缩短了开发产品的时间，降低成本，被广泛应用于产品原型、模具制作、生物工程与医学以及航空航天等领域。

目前，3D快速成型打印领域中已有近20中不同的工艺系统，其中比较典型的有六种，分别是立体光刻（SLA），叠层实体制造（LOM），熔融沉积成型（FDM），选择性激光烧结（SLS），选择性激光熔化（SLM）和三维打印与胶黏（3DP）。FDM是应用最为广泛的打印技术，利用热塑性聚合物在熔融状态下从打印喷头挤出然后冷却凝固成薄层，再一层一层地叠加而成，具有打印设备价格低、打印材料品种多、打印材料利用率高及打印过程不涉及化学变化等优点。聚乳酸（PLA）是最常用的FDM型打印材料，具有可降解性、可加工性、生物相容性好等优良特性，是一种环境友好型热塑性材料。

与传统的单层培养技术相比，三维水凝胶细胞培养法能够提供更接近生理状态的组织微环境，促进细胞与细胞和细胞与微生物之间的相互作用，有利于进行对细胞行为、细胞基质与生物分子的产生的研究。但由于外源性人工基质可能会对细胞行为产生影响，比如诱导细胞分化方向、影响细胞增殖与细胞凋亡等，无支架的3D细胞球培养系统引发越来越多的关注。细胞微球成球的均一性程度、细胞球体积等均是影响生物实验的关键因素。对于精度要求较低的实验，利用超低吸附六孔板进行细胞球的培养即可达到实验目的。对于精度要求较高的实验，细胞球体积会对实验结果产生重大影响。尤其涉及重复性试验，细胞球成球均一性是决定实验能否成功的重要因素。基于以上问题，本发明设计的根据3D打印机切片时设置填充度不同，可形成不同孔径的网状芯片，成功实现对细胞微球的制备与培养，为癌症诊治、多功能干细胞分化及细胞与周围微环境关系等领域研究提供新的科学技术平台。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于细胞微球制备的熔融沉积型3D打印芯片及其制备方法和应用。

1.本发明的目的是这样实现的，一种用于细胞微球制备的熔融沉积型3D打印芯片，其特征在于，该芯片能根据填充度不同形成不同大小的网状结构，实现细胞微球的制备与培养。

所述的一种用于细胞微球制备的熔融沉积型3D打印芯片，其特征在于，利用3D打印技术获取芯片模型，3D打印材料选自聚乳酸（PLA），软性弹性橡胶体（Rubber）或仿玻璃纤维（P-glass）。

所述的一种用于细胞微球制备的熔融沉积型3D打印芯片，其特征在于，对打印规律和打印填充度的影响因素进行了考察，并进行3D打印规律总结。

所述的一种用于细胞微球制备的熔融沉积型3D打印芯片，其特征在于，采用离心的方法使细胞进入芯片内部，优化离心转速和细胞密度以达到最佳效果。

所述的一种用于细胞微球制备的熔融沉积型3D打印芯片，其特征在于，成功实现高通量细胞微球的制备与培养，且细胞微球大小均一。

本发明所述的一种用于细胞微球制备的熔融沉积型3D打印芯片的制作方法，包括建模、切片和打印；先通过计算机建模软件建模，再将建成的三维模型水平切割成逐层的截面，即切片，将切片得到的信息储存在gcode格式文件中，并发送到3D打印机中指导逐层打印过程，3D打印切片软件充当3D模型和3D打印机之间的中间驱动，负责喷头路径规划、耗材使用量计算以及运行时间计算，具体制作步骤如下：

（1）建模

利用123D Design软件构建芯片三维结构，芯片为六边形结构，尺寸为20.0 mm×23.09mm×11.55 mm；

（2）切片

用Cura 15.02.1软件将芯片模型进行分层切片，选择3D打印材料PLA；设置打印层厚0.1 mm；软件自动沿z轴切片得到各层截面的二维轮廓模型，对每层分别进行运算，规划喷头的合理运动路径，将切片所得信息以.gcode格式导入3D打印机；

（3）打印

3D打印机通过读取文件中的横截面信息，用3D打印材料PLA将这些横截面逐层打印出来，层与层之间紧密粘合，直到一个固态物体成型；具体操作为：开机，进料，调平热床；线材进入具有加热装置的金属喷头，选择需要打印的模型，待喷嘴温度升到190 ℃后，开始打印；软化了的聚合物材料熔丝从喷头喷出到底板上降温固化成型，每次生成0.1 mm厚度的薄层，然后再层层精确堆积粘合成三维实体，从底部逐层生成模型。

当打印材料为PLA时，参数设置如下：层高：0.1 mm；外壳的壁厚：2 mm；底部/顶部厚度：1.2 mm；打印温度：190 ℃；平台温度：50 ℃；打印速度：30 mm/s；填充度从10% ~100%。

本发明上述的方法制作的一种用于细胞微球制备的熔融沉积型3D打印芯片的应用，其特征在于，实现间充质干细胞3D微球的制备与培养，用于细胞成球实验。

2.本发明所述的细胞微球制备与培养3D打印芯片，根据填充度的不同，形成不同大小的网状结构，且机械重复性好，精密度高。

3.本发明所述的细胞微球制备与培养3D打印芯片，所用打印材料包括PLA，Rubber和P-glass。

4.本发明所述的细胞微球制备与培养3D打印芯片中的孔径影响因素包括模具大小，模具形状，层厚及所使用的打印材料。

5.本发明所述的细胞微球制备与培养3D打印芯片采用离心方法使细胞进入到芯片中各孔腔内部，并对离心转速与细胞密度进行优化。

6.本发明所述的细胞微球制备与培养3D打印芯片成功实现间充质干细胞3D微球的制备与培养。

本发明优点:

本发明克服了目前常用的细胞微球成球方法成球大小不均一、价格昂贵等特点，所用3D打印材料具有良好的生物相容性且价格低廉，能够实现高通量、大小均一的细胞微球成球实验。

附图说明

图1为本发明用于细胞微球制备的熔融沉积型3D打印芯片样品图。（图中：1为芯片边缘；2为芯片孔洞）。

图2A为六边形3D打印PLA芯片的孔径随填充度变化柱状图。

图2B为六边形3D打印PLA芯片的孔径随填充度变化柱状图。

图2C为六边形3D打印PLA芯片的孔径尺寸与填充度的线性关系图。

图3为本发明芯片孔径随填充度变化的显微镜实物对照图。

图4为本发明用于细胞微球制备的熔融沉积型3D打印芯片孔径影响因素研究图。

图5为本发明用于细胞微球制备的熔融沉积型3D打印芯片中离心转速与3D打印芯片孔内中细胞量关系比较图。

图6为填充度为60 %的3D打印芯片在不同细胞密度下细胞量的变化图。

图7为填充度为70 %的3D打印芯片在不同细胞密度下细胞量的变化图。

图8为本发明用于细胞微球制备的熔融沉积型3D打印芯片中超低黏附六孔板与芯片制备细胞微球的实验对照图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及效果更加清晰，以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。

如图1所示，本发明所述的用于细胞微球制备的熔融沉积型3D打印芯片装置图：芯片的加工制作过程主要包括建模、切片和打印三部分。先通过计算机建模软件建模，再将建成的三维模型水平切割成逐层的截面，即切片，将切片得到的信息储存在gcode格式文件中，并发送到3D打印机中指导逐层打印过程。3D打印切片软件充当3D模型和3D打印机之间的中间驱动，负责喷头路径规划、耗材使用量计算以及运行时间计算。

（1）建模

利用123D Design软件构建芯片三维结构，芯片为六边形结构，尺寸为20.0 mm ×23.09 mm ×11.55 mm。

（2）切片

用Cura 15.02.1软件将芯片模型进行分层切片，选择3D打印材料PLA；设置打印层厚0.1 mm；软件自动沿z轴切片得到各层截面的二维轮廓模型，对每层分别进行运算，规划喷头的合理运动路径，将切片所得信息以.gcode格式导入3D打印机。

（3）打印

3D打印机通过读取文件中的横截面信息，用3D打印材料PLA将这些横截面逐层打印出来，层与层之间紧密粘合，直到一个固态物体成型。具体操作：开机，进料，调平热床；线材进入具有加热装置的金属喷头，选择需要打印的模型，待喷嘴温度升到190 ℃后，开始打印；软化了的聚合物材料熔丝从喷头喷出到底板上降温固化成型，每次生成0.1 mm厚度的薄层，然后再层层精确堆积粘合成三维实体，从底部逐层生成模型。

实施例1：

利用123D Design软件构建芯片三维结构，芯片为六边形结构，尺寸为20.0 mm ×23.09 mm × 11.55 mm，用Cura 15.02.1软件将芯片3D模型进行分层切片，打印材料为PLA时，参数设置如下：层高：0.1 mm；外壳的壁厚：2 mm；底部/顶部厚度：1.2 mm；打印温度：190℃；平台温度：50 ℃；打印速度：30 mm/s；填充度从10% ~ 100%。

如图2A和2B为六边形3D打印PLA芯片的孔径随填充度变化柱状图，从图2可以看出，随着填充度的增大，3D打印芯片中孔的宽度逐渐越小，且两者呈良好的线性关系（如图2C所示，孔径尺寸与填充度的线性关系图），L = -6.7151 X + 608.1373，R² =0.9641。图3为芯片孔径随填充度变化的显微镜实物图，由图3可知，芯片实物图的孔径随填充度的变化与柱状图中趋势一致。

实施例2：

打印过程中发现，本次实验使用的FDM型3D打印机打印模型的芯片孔径受到模型尺寸、模型形状、层厚及材质等四个方面的影响。以六边形3D打印芯片为例，研究了x轴长分别为20， 30和40 mm时，不同填充度下3D打印芯片孔径的变化规律。同理，固定x轴长为20 mm，考察不同形状3D打印芯片模型的孔径随填充度的变化规律。打印层厚即打印机的打印精度对3D打印芯片孔径产生极大的影响，实验考察了0.02，0.05和0.1 mm层厚时，80 %填充度六边形3D打印芯片的孔径变化规律。由于打印材料本身的性质不同，本实验研究了相同条件下，对不同打印材料引起的芯片孔径变化情况进行了考察。

如图4中的A和图4中的B所示，为不同尺寸下3D打印芯片模型的孔径变化规律图。3D打印芯片尺寸为30 mm时，孔径变化并不明显，然而对比20 mm和40 mm的3D打印芯片孔径，发现自填充度50 %开始，3D打印芯片尺寸越大，同一填充度下形成的孔径越小。图4中的C和图4中的D为形状因素对3D打印芯片孔径的影响情况图，不同形状的3D打印芯片模型在同一填充度下的芯片孔径存在差异性，且该变化无规律可言。图4中的E为层厚因素对3D打印芯片孔径的影响情况图，层厚为0.2 mm时，所形成的3D打印芯片孔径明显变大；层厚为0.05和0.1 mm时，芯片孔径基本一致，无太大变化。图4中的F和图4中的G为材料对3D打印芯片孔径的影响情况图，P-glass刚性好，韧性出色，所需打印温度较高，其芯片孔径小于同一填充度下PLA和Rubber的芯片孔径。Rubber属于软弹性橡胶体，收缩稳定，弯曲性好，打印温度为200-220 ℃之间，其芯片孔径与同一条件下PLA芯片的孔径相一致。

实施例3：

离心转速与细胞密度是影响细胞能否进入3D打印芯片的关键性因素。取对数生长期的骨髓间充质干细胞（MSC）细胞，消化、离心后用完全培养液重悬，稀释至浓度2.5×10⁵ 细胞/mL，选取PLA芯片为实验用芯片模型，固定离心时间1 min，温度为常温，分别设置1000，1500和2000 rpm三种不同的转速，考察离心转速对进入芯片孔内的细胞量的影响。设置离心时间1 min，离心转速1500 rpm，温度为常温，稀释细胞密度为1×10⁵，2.5×10⁵ 和5×10⁵ 细胞/mL，考察细胞密度对进入芯片孔内的细胞量的影响。

如图5所示，离心转速为1000 rpm时，3D打印芯片孔内中细胞量较少，转速为1500rpm时，细胞量较多，细胞分布均匀，转速为2000 rpm时，细胞量与转速1500 rpm时相差无几。图6所示，为填充度为60 %的3D打印芯片在不同细胞密度下细胞量的变化。细胞密度为1×10⁵ 细胞/mL时，3D打印芯片孔内中仅可观察到少数几个细胞；细胞密度为2.5×10⁵ 细胞/mL时，3D打印芯片孔内中细胞数量明显增加；细胞密度为5×10⁵ 细胞/mL时，3D打印芯片孔内中细胞量几乎铺满孔径底部，达到饱和状态。图7所示，为填充度为70 %的3D打印芯片在不同细胞密度下细胞量的变化。由于填充度为70 %的3D打印芯片孔径较60 %的芯片小30μm，故在相同转速与细胞密度下，70 %3D打印芯片中细胞量比60 %3D打印芯片中的细胞量要少。

实施例4：

待细胞长至80 %汇合度时，胰蛋白酶消化后，台盼蓝染色，进行细胞计数。细胞存活率大于95 %时，以干细胞培养基重悬细胞，再细胞计数。以不超过5000个/孔的密度接种于超低吸附表面六孔板，加干细胞条件培养基于孵箱中培养。

将用培养液（不含胎牛血清）配置的琼脂糖水凝胶溶液均匀修饰到3D打印芯片表面，4 ℃密封保存。配制细胞密度为 5×10⁵ 细胞/mL的细胞悬液，所用培养液不加胎牛血清，1500 rpm，10 min离心。放在培养箱培养 3 d 后再利用倒置荧光显微镜进行观察。

如图8中的A所示，为在超低吸附表面六孔板中培养的MSC细胞微球，图8中的B为在60%填充度的3D打印芯片中培养的MSC细胞微球。六孔板成球方法与3D打印芯片成球方法对比发现，接种于六孔板中的细胞由于分布不均，故成球大小亦不均匀，体积相差最大者甚至有3倍的差距，不利于细胞球耐药性实验及干细胞微球分化实验的进行。3D打印芯片中微球大小基本一致，偶有体积较大或较小的差异者，且具有高通量的优点，为细胞成球实验提供了新方法。