阅读说明：本技术 一种同时沉默小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK和整合素β1亚基基因Pxβ的RNAi载体 (A kind of RNAi carrier of while silencing diamondback moth arginine kinase gene PxAK and integrin β_1 subunit gene Px β ) 是由 杨广 傅淑 刘昭霞 陈金芝 孙庚晓 尤民生 于 2019-08-28 设计创作，主要内容包括：本发明属于农业生物技术领域,涉及一种可以在转基因植物中同时表达小菜蛾精氨酸激酶基因<I>PxAK</I>和整合素β<Sub>1</Sub>亚基基因<I>Pxβ</I>双链RNA(dsRNA)结构的RNAi载体,通过农杆菌介导的方法将该RNAi载体导入植物基因组,从而获得抗小菜蛾的转基因植株。本发明通过接虫试验,表明转基因植株可以同时沉默小菜蛾<I>PxAK</I>和<I>Pxβ</I>基因26.6%-30.9%的转录表达水平,且小菜蛾幼虫发育历期显著延长,化蛹率降低,从而导致死亡率升高了22.5%,为小菜蛾的防治提供了一种新方法,也为害虫防治提供了新策略。(The invention belongs to agricultural biological technical field, being related to one kind in transgenic plants while can express diamondback moth arginine kinase gene PxAK And integrin beta 1 Subunit gene Pxβ The RNAi carrier is imported Plant Genome by the method for mediated by agriculture bacillus, to obtain the transgenic plant of anti-diamondback moth by the RNAi carrier of double-stranded RNA (dsRNA) structure.The present invention by connect worm test, show transgenic plant can simultaneously silencing diamondback moth PxAK With Pxβ The transcriptional expression of gene 26.6%-30.9% is horizontal, and diamondback moth larvae development duration significantly extends, and percentage of pupation reduces, and increases 22.5% so as to cause the death rate, provides a kind of new method for the prevention and treatment of diamondback moth, also provide new strategy for control of insect.)

一种同时沉默小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK和整合素β1亚基基 因Pxβ的RNAi载体

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及一种可以在转基因植物中同时表达小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK和整合素β₁亚基基因Pxβ靶标序列双链RNA（dsRNA）结构的RNAi载体，通过农杆菌介导的方法将该RNAi载体导入植物基因组，从而获得抗小菜蛾的转基因植株，为小菜蛾的防治提供一种新的策略。

背景技术

小菜蛾(Plutella xylostella L.)是十字花科蔬菜上的全球性重要害虫之一，据估计小菜蛾对我国的经济损失和防治费用每年高达7.7亿美元(Li et al., 2016)。目前，防治小菜蛾的手段依然是以化学农药为主，但大量使用农药不仅对其它生物甚至人类造成危害，而且对环境也会造成污染，更严重的是会对小菜蛾形成抗药性定向选择。已有报道表明小菜蛾对绝大部分农药已经产生了抗药性，并且是第一个被报道在田间对Bt蛋白毒素产生抗性的昆虫(Furlong et al., 2013)。因此，防治小菜蛾的新技术研发已是迫在眉睫。

RNA干扰（RNAi）指外源或内源的双链RNA（double strand RNA，dsRNA）引起生物体内与之互补配对的信使RNA（mRNA）的裂解或抑制其蛋白的表达，这一现象于1998年在线虫中首次报道(Fire et al., 1998)。RNAi技术作为一种基因调控的有效手段，目前已被广泛的应用于昆虫功能基因组学和害虫防治等的研究(胡少茹等, 2019)。在早期的RNAi研究中，一般是通过注射、混合食料饲喂等方式实现基因沉默的效果，但是这些方式在田间害虫防治中的应用比较困难，2007年首次出现了利用转基因植物表达害虫基因dsRNA来防治棉铃虫的报道，即植物介导昆虫RNAi防治害虫(Mao et al., 2007)。通过转基因植物表达害虫靶标基因dsRNA的方式为田间害虫治理提供了一种有效的解决思路。

精氨酸激酶（Arginine kinase，AK）是一种磷酸激酶，可以催化昆虫体内的ATP转化为ADP，从而释放生长发育所需的能量，是昆虫体内唯一提供能量的方式(Zhou et al.,2000)。有报道表明喂食黄曲条跳甲精氨酸激酶基因的dsRNA后，黄曲条跳甲出现了发育延迟、死亡率升高和繁殖力下降等症状(Zhao et al., 2008)。整合素（Integrin）是一类由α和β亚基通过非共价键组成的异二聚体的跨膜蛋白家族，可由18个α亚基和8个β亚基组成24种不同的整合素(Hynes, 2002)。其中β₁整合素是由β₁亚基和α亚基组成，占到了整合素蛋白家族数量的一半，是生物体组织和器官发育的必需蛋白(Schnittert et al., 2018)。有报道表明喂食小菜蛾整合素β ₁亚基基因的dsRNA后，小菜蛾的死亡率可以显著的提高(Mohamed and Kim, 2011)。这些结果说明了精氨酸激酶基因和整合素β₁亚基基因具有作为植物介导昆虫RNAi防治害虫的靶标基因的潜力。此外，也有报道表明同时表达多个靶标基因dsRNA的烟草可以提高对桃蚜的RNAi效率(Tzin et al., 2015)。因此，我们以精氨酸激酶基因PxAK和整合素β₁亚基基因Pxβ的融合序列作为靶标构建了植物表达RNAi载体，以期为小菜蛾的防治提供新的策略。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种可以在转基因植物中同时表达小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK和整合素β₁亚基基因Pxβ融合序列dsRNA结构的RNAi载体，通过农杆菌介导的方法将该RNAi载体导入植物基因组，从而获得抗小菜蛾的转基因植株，为小菜蛾的防治提供一种新的策略。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明同时选择了小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK中的一段保守序列和整合素β₁亚基基因Pxβ中的一段保守序列，通过无缝组装技术获得这两个保守序列的融合序列，以该融合序列为靶标，通过Gateway同源重组技术将该融合靶标序列以正反两个方向***植物表达载体pHellsgate-4中，构建可以表达PxAK和Pxβ靶标融合序列dsRNA的植物表达RNAi载体；通过农杆菌介导转化的方法，将该RNAi载体***植株的基因组内，获得可以同时表达小菜蛾靶标基因PxAK和Pxβ靶标序列dsRNA的转基因植株。通过接虫喂养试验，分析取食该转基因植株的小菜蛾靶标基因PxAK和Pxβ的转录表达水平，幼虫发育历期、虫体的化蛹率和死亡率等，评价转基因植株对小菜蛾的抗虫效果。

申请人提供了一种快速构建PxAK基因和Pxβ基因靶标融合序列的植物表达RNAi载体，并提供了该载体在植物遗传转化中的应用，具体应用步骤如下所示：

（1）提取小菜蛾RNA，反转录为cDNA，以该cDNA为模板，分别以PxAKF / PxAKR和PxβF /PxβR为引物对扩增精氨酸激酶基因PxAK和整合素β₁亚基基因Pxβ全长，并分别***克隆载体pEASY-blunt中获得重组克隆载体pEASY-PxAK和pEASY-Pxβ。在小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK和整合素β₁亚基基因Pxβ内分别选取了长为384 bp和497 bp的保守区域，利用无缝组装技术快速获得了这两个基因靶标序列的融合序列，再用PCR（Ploymerase ChainReaction）方法对该融合序列进行了基因克隆，利用引物对attB₁-AKF / attB₂-βR在克隆序列的两端分别添加了序列attB₁和attB₂用于Gateway同源重组；利用Gateway同源重组技术将该靶标序列片段与植物表达载体pHellsgate-4反应，使融合序列靶标以正反两个方向分别***载体中，其中两个序列片段之间包含一个PDK内含子序列，从而获得可以表达该靶标序列片段dsRNA的植物表达RNAi载体，命名为pHells-dsAK-β载体。

PxAKF：5’- ATG GTG GAC GCT GCA ACT CTT G -3’；

PxAKR：5’- TTA CAG GGA CTT CTC GAT CTT GAT GAG C -3’；

PxβF：5’- ATG TCG GCG ACG AGG GGT CTA G -3’；

PxβR：5’- TTA CTT GCC AGC GTA CGT CGG GTT C -3’；

attB₁-AKF：5’- ggg gac aag ttt gta caa aaa agc agg ctc a - GCC AAC GCT TGCCGC TTC TGG -3’；

attB₂-βR：5’- ggg gac cac ttt gta caa gaa agc tgg gtc - GAT GTC GTA CACGCC GCC CTC -3’。

（2）采用冻融法将植物表达RNAi载体pHells-dsAK-β导入农杆菌GV3101感受态细胞内，再通过农杆菌浸染拟南芥花蕾的遗传转化方法导入拟南芥种子基因组内，获得转基因拟南芥种子；收集这些种子播种于含有50 mg/L卡那霉素的筛选培养基中，种子发芽生长一周后，依然保持绿色状态的拟南芥被认为是转基因拟南芥。

（3）提取转基因拟南芥的基因组，以该基因组为模板，用特异性的引物进行PCR扩增小菜蛾的靶标基因PxAK和Pxβ的靶标序列片段，对转基因植株进行PCR阳性分子鉴定，并且通过RT-PCR和RT-qPCR技术分析转基因植株转录表达其靶标基因PxAK和Pxβ的dsRNA的能力。

（4）转基因植株的接虫喂养试验：表达了小菜蛾基因PxAK和Pxβ靶标序列dsRNA的转基因植株和正常野生型的植株长至第四周后进行试验，分别将小菜蛾初孵幼虫挑至这两种植株叶片上，罩上透明的塑料杯，并盖上具有滤网的盖子防止其逃逸，保持植株的生长。分析小菜蛾靶标基因PxAK和Pxβ被沉默水平，同时比较其发育历期、化蛹率和死亡率，评估转基因植株抗小菜蛾的能力。

本发明的积极效果如下：本发明创造的表达小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK和整合素β₁亚基基因Pxβ融合序列dsRNA的转基因植株，同时抑制了小菜蛾靶标基因PxAK和Pxβ转录水平的23.3% - 24.7%，延长了幼虫发育历期，减少了化蛹率，并提高了小菜蛾22.5%的死亡率，为小菜蛾的防治提供了新的策略。

附图说明

图1：含有小菜蛾精氨酸激酶PxAK基因和整合素β₁亚基基因Pxβ融合序列的植物表达RNAi载体pHells-dsAK-β的T-DNA区段图谱；图中LB和RB为T-DNA的左右边界；CaMV 35S为启动子，PDK intron为内含子，OCS terminator为终止子，NPTII为卡那霉素抗性基因。

图2：农杆菌介导的RNAi载体pHells-dsAK-β转化拟南芥；图2中A图为待转化的拟南芥；图2中B图为农杆菌转化的拟南芥的种子收集；图2中C图为正常拟南芥种子播种于不含卡那霉素抗生素的培养基中生长；图2中D图为正常拟南芥种子播种于含50 mg/L 卡那霉素抗生素的培养基中生长；图2中E图为农杆菌转化后拟南芥的种子播种于含50 mg/L卡那霉素抗生素的培养基中生长，其中箭头指示的是具有卡那霉素抗性的转基因拟南芥。

图3：表达小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK和整合素β₁亚基基因Pxβ融合序列dsRNA的转基因拟南芥PCR阳性检测示意图；图中1-15为转基因拟南芥，C为正常对照拟南芥，P为含有靶标基因序列的阳性质粒，18s rDNA为拟南芥内参基因。

图4：同时表达小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK靶标序列dsRNA和整合素β₁亚基基因Px β靶标序列dsRNA的转基因拟南芥RT-PCR检测示意图；图中数字301、302、303、305、310、31、317、32、330、374、380、384、395和398均为不同转基因拟南芥株系，C为正常对照拟南芥，P为含有靶标基因序列的阳性质粒，18s rRNA为拟南芥内参基因。

图5：同时表达小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK靶标序列dsRNA和整合素β₁亚基基因Px β靶标序列dsRNA的转基因拟南芥RT-qPCR检测示意图；图中数字302、303、317、32、380、384、395和398均为不同转基因拟南芥株系，PxAK基因相对表达量采用拟南芥Sand基因为内参。

图6：同时表达小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK靶标序列dsRNA和整合素β₁亚基基因Px β靶标序列dsRNA的转基因拟南芥398株系喂饲小菜蛾的方法。

图7：同时表达小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK靶标序列dsRNA和整合素β₁亚基基因Px β靶标序列dsRNA的转基因拟南芥398株系对小菜蛾的抗性评价；图7中的A图为转基因拟南芥398株系对小菜蛾幼虫发育历期的影响；图7中的B图为转基因拟南芥398株系对小菜蛾化蛹率的影响；图7中的C图为转基因拟南芥398株系对小菜蛾死亡率的影响。图中WT为正常对照拟南芥。

图8：同时表达小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK靶标序列dsRNA和整合素β₁亚基基因Px β靶标序列dsRNA的转基因拟南芥398株系对小菜蛾靶标基因PxAK和Pxβ基因mRNA表达水平的抑制；图8中的A图为取食了转基因拟南芥后小菜蛾四龄幼虫PxAK基因的相对表达水平；图8中的B图为取食了转基因拟南芥后小菜蛾一日蛹PxAK基因的相对表达水平；图8中的C图为取食了转基因拟南芥后小菜蛾四龄幼虫Pxβ基因的相对表达水平；图8中的D图为取食了转基因拟南芥后小菜蛾一日蛹Pxβ基因的相对表达水平。

具体实施方式

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在构建小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK和整合素β₁亚基基因Pxβ靶标融合序列的植物表达RNAi载体，创造能够同时表达基因PxAK和Pxβ融合序列dsRNA的转基因拟南芥，并对其抗小菜蛾能力进行评价的方法。根据以下的描述和实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。

实施例1：小菜蛾基因PxAK和Pxβ的CDS全长扩增

提取单头4龄幼虫小菜蛾总RNA，用DNA酶去除残留的基因组DNA，再用反转录酶反转录1μg RNA成第一链cDNA。分别以PxAKF / PxAKR和PxβF / PxβR为引物对（PxAKF：5’- ATG GTGGAC GCT GCA ACT CTT G -3’； PxAKR：5’- TTA CAG GGA CTT CTC GAT CTT GAT GAG C -3’；PxβF：5’- ATG TCG GCG ACG AGG GGT CTA G -3’；PxβR：5’- TTA CTT GCC AGC GTACGT CGG GTT C -3’），用高保真聚合酶扩增靶标基因小菜蛾基因PxAK（Genbank登入号：HQ327310.1，1068 bp）和Pxβ（Genbank登入号：GQ178290.1，2487 bp）。反应体系为50 μl：1μl DNA聚合酶，1 μl cDNA，上下游引物各2 μl，1 μl dNTP，25 μl 缓冲液，ddH₂O补充至50μl。PCR反应程序：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸90秒，35个循环；72℃延伸5分钟。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，利用胶回收试剂盒对正确大小的条带进行胶回收，并分别与平末端克隆载体pEASY-Blunt连接构建重组质粒pEASY-PxAK和pEASY-Pxβ，将重组质粒分别转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，再经氨苄抗生素筛选后，利用质粒提取试剂盒分别提取其质粒，送测序公司进行靶标基因的测序验证。

实施例2：小菜蛾基因PxAK和Pxβ靶标序列的融合

利用引物对TA-AKF / Aβ-AKR和Aβ-βF / βT-βR分别从质粒pEASY-PxAK和pEASY-Pxβ中扩增基因PxAK和Pxβ靶标区域AKR（384 bp）和βR（497 bp），并在其两端分别添加相应的TA /Aβ和Aβ/ βT序列，即形成片段TA-AKR-Aβ和Aβ-βR-βT（TA-AKF：5’- AGT GTG CTG GAA TTGCCC TT-gcc aac gct tgc cgc ttc tgg -3’； Aβ-AKR：5’- cac aga agg ttc cgg agtacg atg tcg tac acg ccg ccc tc -3’； Aβ-βF：5’-gta ctc cgg aac ctt ctg tga gaagtg ccc ggc ttg -3’； βT-βR：5’- ATA TCT GCA GAA TTG CCC TT - acg tcg cct gcttgt aga tc -3’，其中TA与βT分别为靶标区域AKR和βR与pEASY-T线性化载体上重复的序列，Aβ为靶标区域AK和β的重复序列）。PCR反应体系为50 μl：1 μl DNA聚合酶，1 μl 质粒模板，上下游引物各2 μl，1 μl dNTP，25 μl buffer缓冲液，ddH₂O补充至50 μl。PCR反应程序：95℃预变性30秒；95℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃延伸5分钟。将PCR产物凝胶电泳检测，胶回收后即可用于靶标区域AKR和βR的无缝组装，反应体系为20 μl：10 μl GBclonart无缝组装反应液（购买自苏州神洲基因有限公司），30 ng pEASY-T线性化载体，9 ng PCR的TA-AKR-Aβ胶回收产物，11 ng PCR的Aβ-βR-βT胶回收产物，ddH₂O补充至20 μl。将反应体系混匀后在45℃中放置30分钟，然后转移至冰上，之后转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经氨苄抗生素筛选后，用PCR酶进行菌液PCR验证，成功获得了含有两个基因靶标区域AKR和βR融合序列AKR-βR（881 bp，SEQ ID NO：1）的重组质粒的菌液，提取菌液的重组质粒pEASY-AK-β用于融合序列的植物表达RNAi载体构建。

实施例3：小菜蛾基因PxAK和Pxβ靶标融合序列的植物表达RNAi载体构建

利用引物对attB₁-AKF / attB₂-βR从质粒pEASY-AK-β中扩增融合序列AKR-βR，并在其两端分别添加attB₁和attB₂序列，即attB₁-AKR-βR-attB₂（attB₁-AKF：5’- ggg gac aag tttgta caa aaa agc agg ctc a - GCC AAC GCT TGC CGC TTC TGG -3’； attB₂-βR：5’- ggggac cac ttt gta caa gaa agc tgg gtc - GAT GTC GTA CAC GCC GCC CTC -3’）。PCR反应体系为50 μl：1 μl DNA聚合酶，1 μl质粒模板，上下游引物各2 μl，1 μl dNTP，25 μlbuffer缓冲液，ddH₂O补充至50 μl。PCR反应程序：95℃预变性30秒；95℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸5分钟。将PCR产物电泳检测并且胶回收后用于Gateway BP同源重组反应，反应体系及程序为：胶回收产物50 ng，1 μl载体pHellsgate-4，TE缓冲液补至8 μl；2 μl BP聚合酶混合液；25 ℃反应1小时后，加入1 μl 蛋白酶K后37℃孵育10分钟。获得了可以表达融合序列AKR-βR的dsRNA的植物表达载体pHells-dsAK-β后，将重组载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经壮观霉素素筛选后，获得含有重组质粒的大肠杆菌单克隆菌落，经大肠杆菌扩繁后，提取其质粒即为小菜蛾基因PxAK和Pxβ的靶标融合序列的植物表达RNAi载体pHells-dsAK-β（图1）。

实施例4：农杆菌介导的载体pHells-dsAK-β转化拟南芥

利用冻融法将构建好的重组质粒pHells-dsAK-β转入根癌农杆菌GV3101感受态细胞，均匀涂布至含有终浓度25 mg/L利福平、50 mg/L庆大霉素和100 mg/L壮观霉素的LB固体培养基后，于28℃暗培养60小时，得到单克隆菌落，用无菌牙签接种单克隆菌落于4 mL的LB液体培养基内，在28℃ 180 rpm 振荡培养15小时进行扩繁培养，获得农杆菌菌液。同时将拟南芥种子播种于23℃、16小时光照2000 lux和8小时黑暗的光周期和湿度为60%-70%的环境下，待拟南芥长出花蕾后进行农杆菌的转染。即分别在100 mL LB液体培养基中加入0.1 mL的农杆菌菌液，28℃ 180 rpm 振荡培养15小时。将培养后的农杆菌于室温下5000 rpm 离心10分钟，弃上清，用1/2 MS 液体培养基稀释至OD₆₀₀ = 0.8，再加入0.02vol%表面活性剂Silwet-L77用于拟南芥花蕾的浸染。用准备好的农杆菌菌液浸染拟南芥的花蕾3 - 5秒后，再用薄膜覆盖拟南芥保湿避光48小时，然后正常培育，收集浸染后的拟南芥种子。将收集到的种子于0.2 wt% NaClO浓度中灭菌10分钟，播种于含有终浓度50 mg/L卡那霉素的筛选培养基中（4.43 g/L MS + 30 g/L蔗糖 + 8 g/L琼脂粉）生长，成功转化的拟南芥可以对卡那霉素形成抗性，保持绿色，而未转化苗则会出现白化死亡（图2）。因此，拟南芥生长一周后，依然保持绿色状态的正常拟南芥被认为是转基因T₁代拟南芥。

实施例5：转基因拟南芥同时表达小菜蛾PxAK和Pxβ基因dsRNA的检测

（1）转基因拟南芥的PCR阳性检测

利用植物基因组提取试剂盒提取转基因T₁代拟南芥叶片基因组，以该基因组为模板分别扩增小菜蛾基因PxAK和Pxβ的靶标序列片段，同时扩增拟南芥的基因18s rDNA作为对照基因。引物对分别为AKF / AKR、βF / βR和18sF / 18sR（AKF：5’- GCC AAC GCT TGC CGCTTC TGG -3’；AKR：5’- GAT GTC GTA CAC GCC GCC CTC -3’； βF：5’- GTA CTC CGG AACCTT CTG TG -3’； βR：5’- ACG TCG CCT GCT TGT AGA TC -3’；18sF：5’- CTA GTG GTACAC AGA AGT CAT GG -3’； 18sR：5’- GTG GGG AAT CTT GGA CAA T -3’）。PCR反应体系为25 μl，含有转基因植株基因组50 ng，上下游引物各1 μM，Taq聚合酶混合物12.5 μl，添加相应的蒸馏水至25 μl。PCR反应程序为95℃ 3分钟；95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分钟，进行35个循环；72℃ 10分钟。之后将PCR产物进行电泳检测扩增出的条带是否与靶标序列片段长度一致，一致则认为扩增到了相应的基因，获得了转基因植株（图3）。将获得的T₁代转基因拟南芥进行自交获得T₂代转基因拟南芥，T₂代再自交获得纯合体T₃代转基因拟南芥。

（2）转基因拟南芥的RT-PCR检测dsRNA的表达

利用植物RNA提取试剂盒提取转基因T₃代纯合体拟南芥叶片RNA，用DNA酶去除残留的基因组DNA，再用反转录酶反转录1 μg RNA成第一链cDNA。以该cDNA为模板分别扩增小菜蛾基因PxAK和Pxβ靶标序列相应片段和拟南芥的基因18s rRNA作为对照基因。RT-PCR反应引物、体系和程序与PCR阳性检测的一致，之后将PCR产物进行电泳检测扩增出的条带是否与靶标序列相应片段长度一致，一致则认为表达了其dsRNA（图4）。

（3）转基因拟南芥的RT-qPCR检测dsRNA的相对表达量

以cDNA为模板，分别以AKqF / AKqR和βqF / βqR为引物对，拟南芥自带基因Sand为参照基因（ATqF / ATqR为参照基因的引物），利用RT-qPCR的方法检测不同转基因植株对靶标基因PxAK和Pxβ的dsRNA相对表达量（AKqF：5’- TCC ACA ACG AGA ACA AGA C -3’；AKqR：5’- TTC AGG TCA CCA CCC ATC -3’；βqF：5’- GCT GAT GCT GTG GAA GAT -3’；βqR：5’-CCT GCT TGT AGA TCG GAT T -3’；ATqF：5’- AAC TCT ATG CAG CAT TTG ATC CAC T -3’；ATqR：5’- TGA TTG CAT ATC TTT ATC GCC ATC -3’）。RT-qPCR反应体系为20 μl：含cDNA模板2 μl，上下游引物各0.4 μl，qPCR Master Mix酶10 μl，添加无RNA酶蒸馏水至20 μl；RT-qPCR反应程序为95°C 3分钟；95°C 15秒, 56°C 15 秒，72°C 15秒，进行45个循环。分析比较不同转基因植株的dsRNA相对表达量，挑选相对表达量高的转基因植株进行下一步的接虫喂食试验（图5）。

实施例6：同时表达基因PxAK和Pxβ的dsRNA的转基因拟南芥抗小菜蛾能力的检测

（1）转基因拟南芥对小菜蛾生长发育的影响

同时表达小菜蛾PxAK和Pxβ基因dsRNA的转基因拟南芥和正常拟南芥生长至第四周后进行接虫喂食试验，将小菜蛾初孵幼虫挑至拟南芥叶片上，用透明的塑料杯罩住，再用带滤网的盖子盖住塑料杯，防止小菜蛾逃逸，并保持拟南芥的正常生长外，这样还能方便观察小菜蛾的取食情况（图6）。试验分为5个重复，每个重复8头幼虫。小菜蛾羽化后，比较其化蛹率和最终死亡率。结果表明取食了转基因植株株系398的小菜蛾的化蛹率显著下降，并且死亡率达到了25.0%，显著的高于对照7.5%的死亡率（图7）。

（2）转基因拟南芥对小菜蛾基因PxAK和Pxβ转录表达水平的抑制

分别取喂食了转基因拟南芥株系398和正常对照拟南芥叶片的小菜蛾四龄幼虫和蛹，利用RT-qPCR技术分别检测其靶标基因PxAK和Pxβ的相对表达水平，评估转基因拟南芥对小菜蛾靶标基因mRNA表达水平的影响。提取单头小菜蛾总RNA，用DNA酶去除残留的基因组DNA，再用反转录酶反转录1 μg RNA成第一链cDNA。以AKqF / AKqR和βqF / βqR为引物对，小菜蛾基因RPS13和EF1a为双内参基因（RPS13F：5’- TCA GGC TTA TTC TCG TCG -3’；RPS13R：5’- GCT GTG CTG GAT TCG TAC -3’；EF1aF：5’- GCC TCC CTA CAG CGA ATC- 3’；EF1aR：5’- CCT TGA ACC AGG GCA TCT -3’）。RT-qPCR反应体系为20 μl：含cDNA模板2 μl，上下游引物各0.4 μl，qPCR Master Mix酶10 μl，添加无RNA酶蒸馏水至20 μl；RT-qPCR反应程序为95°C 3分钟；95°C 15秒, 56°C 15秒，72°C 15秒，进行45个循环。结果表明小菜蛾幼虫和蛹的基因PxAK和Pxβ的表达水平被沉默了26.6% - 30.9%（图8）。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种同时沉默小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK和整合素β1亚基基因Pxβ的RNAi

载体

<130> 27

<160> 27

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 881

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gccaacgctt gccgcttctg gccctctgga cgtggtatct tccacaacga gaacaagacc 60

ttcctggtgt ggtgcaacga ggaggaccac ctccgcctga tctccatgca gatgggtggt 120

gacctgaagg ccgtatacgc caggctggtg gccgccgtca acgacattga gaagcgcgtg 180

ccgttctcgc accacgaccg tctcggtttc ctgaccttct gccccaccaa cctgggcacc 240

accgtgcgcg cctccgtgca catcaagctg cccaagctgg ccgccgacaa gaccaagctg 300

gaggaggtgg cgtccaagta ccacctgcag gtgcgcggca cccgcggcga gcacacggag 360

gccgagggcg gcgtgtacga catcgtactc cggaaccttc tgtgagaagt gcccggcgtg 420

caccggcaaa tgcaaggagt acaaggactg cgtgctatgc gaggtgcaca agcgcgggcc 480

gatgttcgac atggaggcgc cgccggggct cgagtgcggc aactgctcgc tcaaccctgt 540

cattgaagag gggaagattg aagcgaacga gacgcgcggc gagtacctgt gcagtttcta 600

cgacgacgag gactgtctgt acgtgtacgt gtactcctac tcgtacacgc aacacctgaa 660

tgtgcgcgcg cagaaggacc gggactgccc gcctaaggtg ttcatcctgg gcatcgtgct 720

gggcgtgatc gcggcgatcg tgctggtggg gctggcgctg ctgatgctgt ggaagatggt 780

caccaccatc cacgaccgcc gcgagttcgc gcgcttcgag aaggaacgca tgatggccaa 840

gtgggacacg ggtgaaaatc cgatctacaa gcaggcgacg t 881

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggtggacg ctgcaactct tg 22

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttacagggac ttctcgatct tgatgagc 28

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgtcggcga cgaggggtct ag 22

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttacttgcca gcgtacgtcg ggttc 25

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc agccaacgct tgccgcttct gg 52

<210> 7

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc gatgtcgtac acgccgccct c 51

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agtgtgctgg aattgccctt gccaacgctt gccgcttctg g 41

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cacagaaggt tccggagtac gatgtcgtac acgccgccct c 41

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtactccgga accttctgtg agaagtgccc ggcttg 36

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atatctgcag aattgccctt acgtcgcctg cttgtagatc 40

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gccaacgctt gccgcttctg g 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gatgtcgtac acgccgccct c 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gtactccgga accttctgtg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

acgtcgcctg cttgtagatc 20

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctagtggtac acagaagtca tgg 23

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gtggggaatc ttggacaat 19

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tccacaacga gaacaagac 19

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttcaggtcac cacccatc 18

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gctgatgctg tggaagat 18

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cctgcttgta gatcggatt 19

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

aactctatgc agcatttgat ccact 25

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tgattgcata tctttatcgc catc 24

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tcaggcttat tctcgtcg 18

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gctgtgctgg attcgtac 18

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gcctccctac agcgaatc 18

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ccttgaacca gggcatct 18