阅读说明：本技术 早熟禾半潜隐病毒作为vigs载体的应用 (Application of half cryptovirus of annual bluegrass as VIGS carrier ) 是由 张永亮 李召雷 李大伟 胡佳成 姜志豪 于嘉林 王献兵 韩成贵 王颖 于 2019-05-21 设计创作，主要内容包括：本发明提供早熟禾半潜隐病毒作为VIGS载体的应用。所述基因沉默载体系统包括含有早熟禾半潜病毒RNAα、RNAβ和RNAγ表达盒的质粒；其中,RNAα、RNAβ和RNAγ分别位于不同的表达盒中,这些表达盒位于同一质粒或位于不同质粒上；所述RNAγ表达盒中还含有靶标序列,所述靶标序列位于RNAγ中γb蛋白编码基因的3`端。本发明基于早熟禾半潜病毒的基因沉默载体系统可以对谷子等单子叶植物的基因组进行高效的基因沉默。(The present invention provides application of half cryptovirus of annual bluegrass as VIGS carrier.The gene silencing vector system includes the plasmid containing annual bluegrass viral RNA α partly latent, RNA β and RNA γ expression cassette；Wherein, RNA α, RNA β and RNA γ are located in different expression cassettes, these expression cassettes are located at same plasmid or are located on different plasmids；Also contain target sequence in the RNA γ expression cassette, the target sequence is located at the end 3` of γ b protein coding gene in RNA γ.The present invention is based on the gene silencing vector systems of half occult virus of annual bluegrass can carry out efficient gene silencing to the monocotyledonous genome such as millet.)

早熟禾半潜隐病毒作为VIGS载体的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及早熟禾半潜隐病毒作为VIGS载体的应用。

背景技术

病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)载体为功能基因组学的研究提供了有力的工具。在VIGS技术出现之前，对于某个基因的功能多依赖于传统的遗传转化方法，一般是利用T-DNA或转座子等随机***到植物的基因组中得到大量的突变体，通过筛选得到目标基因被敲除(knock-out)的突变体，进而通过观察该突变体的表型变化来确定靶标基因的功能。该方法可以使靶标基因完全失活，有着很好的效果，但是该方法也有明显的缺点，不仅需要进行遗传转化，同时需要筛选目的突变体，操作复杂，耗时长，而且如果靶标基因属于某一个基因家族，家族内的其他基因功能上的冗余可能在表型上掩盖这个基因的缺失。此外，对于某些发育致死型基因，该方法无法获得其相应的缺失突变体。这些都限制了这种方法在功能基因组研究中的应用。相反，VIGS操作比较简单，克服了常规遗传转化耗时长及难以操作等缺点，通过此技术可以快速而有效地分析某些靶标基因的功能，甚至可用于高通量的功能基因组研究，通过将文库中的大量cDNA片段***VIGS载体中，利用得到的这些重组病毒接种植株，通过观察表型来判断这些cDNA片段的功能。VIGS载体已被广泛用于植物功能基因的研究中。

虽然已有多种病毒被开发成VIGS载体，用于植物功能基因的研究中，但是针对单子叶(monocots)尤其是禾本科植物的基因功能研究，可选择的VIGS载体仍然是非常有限的，目前已报到的可用于单子叶植物的VIGS载体主要来源于以下七个病毒：大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus,BSMV)，雀麦花叶病毒(Brome mosaic virus,BMV)，建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)，水稻东格鲁杆状病毒(Rice tungrobacilliform virus,RTBV)，竹子花叶病毒及其卫星RNA(Bamboo mosaic virus togetherwith its associated satellite RNA,BaMV)，黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和狼尾草花叶病毒(Foxtail mosaic virus,FoMV)，它们各自均具有一些优点，但也同时存在一些不足之处。普遍存在的问题是病毒侵染后的症状往往会干扰靶标基因沉默表型的观察。有些病毒如BMV在整合有靶标基因后，侵染宿主过程中往往会发生靶标基因片段的丢失，使得靶标基因无法在整株植物中被持续沉默。此外，有些病毒如BSMV本身侵染宿主后会激发某种抗病反应，这限制了其在研究某些特定通路基因如抗病基因功能中的应用。虽然上述七种病毒被开发成了VIGS载体，但是对于某些特定的经济作物如谷子，可选择的VIGS工具目前只有FoMV，FoMV在谷子上的症状相对较重。基于此，不断开发新的可用于禾本科植物基因功能研究的VIGS载体，以避免或改善现有的禾本科植物VIGS载体的缺陷，具有重要的实践意义。

发明内容

本发明的目的是提供早熟禾半潜隐病毒作为VIGS载体的应用。

本发明构思如下：早熟禾半潜病毒(Poa semilatent virus,PSLV)属于植物杆状病毒科(Virgaviridae)大麦病毒属(Hordeivirus)的一员，已有的报道显示其可以侵染多种单子叶植物，该病毒具有开发成VIGS载体的先天优势，其侵染植物后为潜隐症状，症状很轻，这非常有利于沉默表型的观察。本发明将PSLV开发为VIGS载体，为重要单子叶植物如谷子的功能基因研究提供新的可选工具。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供早熟禾半潜隐病毒(Poa semilatentvirus)的以下任一应用：

1)用于VIGS载体；

2)用于基因沉默。

第二方面，本发明提供一种基于早熟禾半潜病毒的基因沉默载体系统，所述基因沉默载体系统包括含有早熟禾半潜病毒RNAα、RNAβ和RNAγ表达盒的质粒；

其中，RNAα、RNAβ和RNAγ分别位于不同的表达盒中，这些表达盒位于同一质粒或位于不同质粒上；

所述RNAγ表达盒中还含有靶标序列，所述靶标序列位于RNAγ中γb蛋白编码基因的3`端。

优选地，所述表达盒由T7启动子驱动表达。

更优选地，所述质粒为含有T7启动子的质粒，T7启动子可以使PSLV的基因组RNA得以正确转录出来，并具有侵染性，可以侵染相应的宿主植物。

所述质粒的出发载体选自pBluescript II SK(+)、pMD19-T等。这些质粒可通过商业途径购得。

早熟禾半潜隐病毒为多分体RNA病毒，基因组包含三条正义、单链基因组RNA，分别称为RNAα，RNAβ和RNAγ。

其中，RNAα编码的αa蛋白和RNAγ编码的γa蛋白构成病毒的复制酶；RNAβ编码病毒的外壳蛋白CP和三联体运动蛋白TGBs；RNAγ还编码一个小蛋白γb，它是病毒编码的基因沉默抑制子。当RNAα、RNAβ、RNAγ同时存在时，病毒可以在适当的环境下在宿主植物中复制和运动；当仅有RNAα和RNAγ同时存在时，病毒可以在适当的环境下在宿主植物中复制。PSLV可以侵染包括大麦，小麦，玉米，谷子等在内的多种单子叶植物。

研究发现，早熟禾半潜隐病毒的γb基因下游可以***外源片段而不影响病毒本身的复制和运动。因此，当将所需的靶标序列整合在RNAγ中时，为了使整合的靶标基因序列不影响病毒的系统运动，本发明选择在γb ORF的下游***所需靶标序列。

本领域技术人员应当理解，靶标序列的长度可以根据实验效果进行调整。在本发明技术方案中，靶标序列上游和/或靶标序列的下游除了早熟禾半潜隐病毒基因组上本身序列之外，还可以带有额外的序列，可以是另一个或者多个靶标序列和/或其他序列。

第三方面，本发明提供所述基因沉默载体系统在对植物进行基因沉默中的应用。

前述的应用，所述植物为单子叶植物，如谷子、大麦、小麦、玉米等。

在本发明的一个

具体实施方式

中，利用所述基因沉默载体系统对谷子PDS基因进行基因沉默。所述基因沉默载体系统包括：

(1)含有RNAα的pBluescript II SK(+)质粒；

(2)含有RNAβ的pMD19-T质粒；以及

(3)含有RNAγ且在γb蛋白编码基因3`端整合有谷子PDS基因靶标序列的pBluescript II SK(+)质粒。

质粒pBluescript II SK(+)和pMD19-T包含一个多克隆位点，并通过反向PCR和同源重组的方式将早熟禾半潜隐病毒的RNAα和RNAγ的基因组RNA分别克隆到pBluescriptII SK(+)上，将RNAβ克隆到pMD19-T上，产物分别称为pT7-PSLVα，pT7-PSLVγ和pT7-PSLVβ。

其中，用于扩增谷子PDS基因靶标序列的PCR引物为(SEQ ID NO:1-2)：

F10：5′-ctctgactgcagaggTCAATGTTCATATATGGTTTG-3′；

R10：5′-agtactcatatgaggGCAGCGATTTCATCTGGAAAC-3′。

第四方面，本发明提供含有所述基因沉默载体系统的生物材料，所述生物材料包括但不限于转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。

进一步地，本发明针对技术方案中所涉及到的靶标序列整合进行具体说明如下：

本发明通过PCR扩增或者合成所需靶标基因序列，并通过酶切连接或者同源重组等方法，将靶标序列克隆到上述特定位置。

具体来说，首先通过反向PCR将病毒载体线性化，通过扩增或者合成靶标基因序列并在其两端添加20bp左右的与病毒载体同源的序列，进而通过重组反应将靶标序列克隆到病毒载体上，其***位点在γb的ORF之后。靶标序列的两端还可以添加额外的序列，所谓额外的序列，可以是病毒载体上的序列，也可以是其他的序列。当然，也可以通过如酶切连接等方法将靶标序列克隆到病毒载体上。

本发明所述基因沉默载体系统可实现对单子叶植物的基因沉默，克服了现有技术中大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus,BSMV)，雀麦花叶病毒(Brome mosaicvirus,BMV)，建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)，水稻东格鲁杆状病毒(Ricetungro bacilliform virus,RTBV)，竹子花叶病毒及其卫星RNA(Bamboo mosaic virustogether with its associated satellite RNA,BaMV)，黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaicvirus,CMV)基因沉默载体不能应用于谷子的缺陷和不足；同时相较于基于FoMV的基因沉默载体，病毒自身仅引发不明显的症状，且不影响寄主植物自身的生长发育和正常表型，从而有利于靶标基因沉默之后的表型观察。

第五方面，本发明提供一种对植物进行基因沉默的方法，为利用本发明所述的基因沉默载体系统进行。

本发明所述基因沉默系统可以通过体外转录产物摩擦接种的方法导入植物组织细胞中，并可以在大麦、小麦，玉米，谷子等植物中复制和运动；所述基于早熟禾半潜隐病毒的基因沉默载体，其序列中包含靶标基因的序列，在接种寄主植物后，可以实现对谷子等植物中靶标基因的沉默。

实验证明，将本发明所述的基因沉默载体系统通过体外转录产物摩擦接种的方法侵染谷子后，可以对谷子的内源基因实现基因沉默，且效率可以达到50％以上。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供了一种基于早熟禾半潜隐病毒的基因沉默载体系统，可以将靶标序列克隆到γb的下游端而不影响其在宿主植物上的系统侵染；所述基于早熟禾半潜隐病毒的基因沉默载体可以对寄主植物中的靶标基因进行系统沉默。

相较已报道的基于大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus,BSMV)，雀麦花叶病毒(Brome mosaic virus,BMV)，建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)，水稻东格鲁杆状病毒(Rice tungro bacilliform virus,RTBV)，竹子花叶病毒及其卫星RNA(Bamboo mosaic virus together with its associated satellite RNA,BaMV)，黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的基因沉默载体，本发明所述载体系统可应用于谷子。

相较已报道的基于FoMV的基因沉默载体，本发明所述载体系统在宿主植物中引发的症状更温和，从而可以不干扰基因沉默引发的症状观察，也不影响寄主植物的正常生长和发育。

附图说明

图1为本发明实施例1中pT7-PSLVα载体结构示意图。

图2为本发明实施例1中pT7-PSLVβ载体结构示意图。

图3为本发明实施例1中pT7-PSLVγ载体结构示意图。

图4为本发明实验例2中PSLV侵染大麦、小麦和谷子的症状图及相应的Westernblot检测图。

图5为本发明实施例3中pT7-PSLVγMCS载体结构示意图。

图6为本发明实施例3中pT7-PSLVγMCS-GFP₂₅₅载体结构示意图。

图7为本发明实施例3中pT7-PSLVγMCS-HvPDS₂₄₇载体结构示意图。

图8为本发明实验例3中早熟禾半潜隐病毒的基因沉默载体系统应用于大麦和小麦的表型图和RT-qPCR检测图。

图9为本发明实验例3中早熟禾半潜隐病毒的基因沉默载体系统应用于谷子的表型图和RT-qPCR检测图。

图10为本发明实施例4中pT7-PSLVγMCS-HvIspH₂₀₅载体结构示意图。

图11为本发明实验例4中早熟禾半潜隐病毒的基因沉默载体系统应用于大麦和小麦的表型图和RT-qPCR检测图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本发明实施例1中所用早熟禾半潜隐病毒PSLV株系由加州大学伯克利分校的Andrew O.Jackson教授馈赠。参见Slykhuis,J.T.(1972).Poa semilatent virus fromnative grasses.Phytopathology 62,508-513.

实施例1基于早熟禾半潜隐病毒的基因沉默载体系统的构建

本实施例以PSLV侵染大麦、小麦和谷子造成的症状温和，说明PSLV具有开发成VIGS载体的潜力。

(一)重组载体的构建

1、设计引物F1和R1并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为(5′-3′)：

F1：ggtattcgagagagagttcgcgggctcattg；

R1:TGGTCTTCCTTGGAGGACCGAAGCTGAGCTTCGG；

以PSLV基因组的cDNA为模板，利用上述F1和R1引物扩增出PSLV的全长α链，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2、设计引物F2和R2并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为(5′-3′)：

F2：gctcagcttcggtcctccaaggaagaccaCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAG；

R2：gcccgcgaactctctctcgaataccTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGG；

以pBluescript II SK(+)(Promega)为模板利用上述F2和R2引物扩增出带有同源序列的载体片段。

3、以中美泰和公司的2×Master Assembly Mix将上述PSLV的全长α链和上述带有同源序列的载体片段进行重组反应，从而将PSLV的α链克隆到pBluescript II SK(+)，得到的产物称为pT7-PSLVα(图1)。pBluescript II SK(+)载体拥有T7promoter及Xho I等酶切位点，从而pT7-PSLVα质粒中，PSLVα的上游是T7promoter，下游是Xho I，其用于线性化pT7-PSLVα。

4、设计引物F3和R3并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为(5′-3′)：

F3：ggtattgcttttgcggcaacgcgtccagcaaag；

R3:TGGTCTTCCTTGGAGGACCGAAGCTGAGCTTCGG；

以PSLV基因组的cDNA为模板，利用上述F3和R3引物扩增出PSLV的全长γ链，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

5、设计引物F4和R4并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为(5′-3′)：

F4：gctcagcttcggtcctccaaggaagaccaCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAG；

R4：gacgcgttgccgcaaaagcaataccTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGG；

以pBluescript II SK(+)(Promega)为模板利用上述F4和R4引物扩增出带有同源序列的载体片段。

6、以中美泰和公司的2×Master Assembly Mix将上述PSLV的全长γ链和上述带有同源序列的载体片段进行重组反应，从而将PSLV的γ链克隆到pBluescript II SK(+)，得到的产物称为pT7-PSLVγ(图3)。pBluescript II SK(+)载体拥有T7promoter及Xho I等酶切位点，从而pT7-PSLVγ质粒中，PSLV的γ的上游是T7promoter，下游是Xho I，其用于线性化pT7-PSLVγ。

7、设计引物F5和R5(并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为(5′-3′)：

F5：ggaaaaacaaacagcgacctggtcgttgtg；

R5:TGGTCTTCCTTGGAGGACCGAAGCTGAGCTTCGG；

以PSLV基因组的cDNA为模板，利用上述F5和R5引物扩增出PSLV的全长β链，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

8、设计引物F6和R6并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为(5′-3′)：

F6：cagcttcggtcctccaaggaagaccaCTCGAGAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGC；

R6：cgaccaggtcgctgtttgtttttccAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCG；

以pMD19-T(TaKaRa)为模板利用上述F6和R6引物扩增出带有同源序列的载体片段，并在PSLVβ的下游添加Xho I酶切位点，后期通过Xho I线性化载体。

9、以中美泰和公司的2×Master Assembly Mix将上述PSLV的全长β链和上述带有同源序列的载体片段进行重组反应，从而将PSLV的β链克隆到pMD19-T，得到的产物称pMD19-T-PSLVβ。

10、设计引物F7和R7并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为(5′-3′)：

F7：TAATACGACTCACTATAGGAAAAACAAACAGCGACCTGG；

R7：AATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACC；

以上述pMD19-T-PSLVβ为模板，利用上述引物进行反向PCR后，以NEB公司生产的T4PNK激酶处理后以T4DNA ligase自连，从而将反向PCR线性化的产物环化，最终在PSLVβ的上游加入T7promoter，产物称为pT7-PSLVβ(图2)。

(二)应用

1、体外转录物接种实验的试剂配制

试剂配制及接种方法参考李正刚博士学位论文(大麦条纹花叶病毒TGB1蛋白的核质穿梭及其劫持核仁蛋白fibrillarin的功能分析，李正刚，中国农业大学博士学位论文，2017)。

所用试剂：

2×FES缓冲液：量取5mL的1M甘氨酸溶液,称取0.5g的焦磷酸四钠(Na₄P₂O₇),量取3mL的1M K₂HPO₄溶液,再加入0.5g皂土和0.5g硅藻土,调节pH至8.5,定容至50mL,

高温高压灭菌后分装为1ml/管,冻存于-20℃的冰箱；

20mM的磷酸buffer(pH 7.2)：1M Na₂HPO₄(68.4mL)和1M NaH₂PO₄(31.6mL)混成1M的PB buffer，使用时再进行稀释。

2、以体外转录物接种大麦和小麦的方法

加入3μl XhoI(TaKaRa)、3μl 10×H buffer和1.8μg的PSLV cDNA侵染性克隆和其衍生质粒,补水至30μl，37℃酶切6h，然后80℃失活酶10min。从而对质粒进行线性化。

取3μl左右线性化质粒,并加入3μl 10×RNA polymerase reaction buffer缓冲液,3μl 100mM DTT,30U HPRI,3μl rNTP(A、U和C均为10mM,G为1mM)(TaKaRa),2μl T7 RNA聚合酶(NEB),2μl 5mM Ribo m7G Cap Analog(Promega),最后用DEPC-ddH₂O补至30μl,37℃反应3-5h后，取2μl进行电泳检测,将剩余体外转录物与2×FES缓冲液等体积混合,摩擦接种二叶期大麦(Yangfu 4056)和小麦(Yangmai 11)叶片(每株接种20μl)。

3、用发病小麦的汁液转接谷子的方法

采集3-4片发病的小麦叶片，加入200μl 20mM的磷酸buffer(pH 7.2)，用研钵研磨均匀。蘸取汁液摩擦接种两叶或三叶期谷子(Yuyou 206)。

实施例2基因沉默载体系统能侵染大麦、小麦和谷子

本实验例用于说明实施例1构建的基因沉默载体系统能侵染大麦、小麦和谷子，并且引起温和的症状。

将体外转录出的PSLVα、β和γ按等摩尔比混合后，摩擦接种二叶期的大麦和小麦。在15天的时候，与对照相比，在接种PSLV的大麦和小麦的系统叶上观察到温和的症状，并且通过Western blot检测证明PSLV CP存在于大麦和小麦的系统叶中，说明PSLV能侵染大麦和小麦(图4)。

采集PSLV侵染的小麦叶片，加入一定体积的20mM的磷酸buffer(pH 7.2)，用研钵研磨均匀。蘸取汁液摩擦接种两叶或三叶期谷子。在接种后的18天，Western blot检测谷子的系统叶，发现谷子的系统叶中有PSLV的CP，证明PSLV能侵染谷子，并且PSLV在谷子上引起的症状同样温和(图4)。

实施例3基于早熟禾半潜隐病毒的基因沉默载体系统的构建与应用

本实施例以本生大麦PDS基因作为靶标基因，说明基于早熟禾半潜隐病毒的基因沉默载体系统的构建与应用。

(一)基因沉默载体系统的构建

1、设计引物F8和R8并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为(5′-3′)：

F8：AGGCCTCTGCAGTCAGAGTTTACTTAGTTTGAAAAAATCC；

R8：CATATGAGTACTTTAATTATCAAAACCCAAAAAG；

以上述pT7-PSLVγ为模板，利用上述引物进行反向PCR后，以NEB公司生产的T4PNK激酶处理后自连，从而将反向PCR线性化的产物环化，最终在pT7-PSLVγ的γb终止密码子下游加入酶切位点Pst I、Stu I和Nde I，产物称为pT7-PSLVγMCS(图5)。

2、设计引物F9和R9并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为(5′-3′)：

F9：ctctgactgcagaggGTGCAGTGCTTCAGCCGCTAC；

R9：agtactcatatgaggGATATAGACGTTGTGGCTGT；

以pSuper1300-GFP为模板，利用上述引物扩增出255bp的DNA片段。用Stu I线性化pT7-PSLVγMCS，然后以中美泰和公司的2×Master Assembly Mix将上述PCR扩增得到的255bp的GFP片段重组到线性化的pT7-PSLVγMCS，产物称为pT7-PSLVγMCS-GFP₂₅₅(图6)。

3、设计引物F10和R10并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为(5′-3′)：

F10：ctctgactgcagaggTCAATGTTCATATATGGTTTG；

R10：agtactcatatgaggGCAGCGATTTCATCTGGAAAC。

以大麦的cDNA为模板，利用上述引物扩增出247bp的大麦PDS片段(HvPDS)。用StuI线性化pT7-PSLVγMCS，然后以中美泰和公司的2×Master Assembly Mix将上述PCR扩增得到的247bp的大麦PDS片段，重组到线性化的pT7-PSLVγMCS，产物称为pT7-PSLVγMCS-HvPDS₂₄₇(图7)。

实际使用时，F10和R10可以根据需要进行设计，将PDS替换成需要的序列，以用于沉默不同的基因。

(二)应用

以体外转录物接种大麦和小麦：加入3μl Xho I(TaKaRa)、3μl 10×H buffer和1.8μg的PSLV cDNA侵染性克隆和其衍生质粒，补水至30μl，37℃酶切6h，然后80℃失活酶10min。从而对质粒进行线性化。

取3μl左右线性化质粒,并加入3μl 10×RNA polymerase reaction buffer缓冲液,3μl 100mM DTT,30U HPRI,3μl rNTP(A、U和C均为10mM,G为1mM)(TaKaRa),2μl T7 RNA聚合酶(NEB),2μl 5mM Ribo m7G Cap Analog(Promega),最后用DEPC-ddH₂O补至30μl,37℃反应3-5h后，取2μl进行电泳检测,将剩余体外转录物与2×FES缓冲液等体积混合,摩擦接种二叶期大麦(Yangfu 4056)和小麦(Yangmai 11)叶片(每株接种20μl)。

对照组：pT7-PSLVα，pT7-PSLVβ和pT7-PSLVγMCS-GFP₂₅₅的体外转录混合物。实验组：pT7-PSLVα，pT7-PSLVβ和pT7-PSLVγMCS-HvPDS₂₄₇的体外转录混合物。

实验例1：本实验例用于说明实施例2(基于PSLV的基因沉默载体系统对大麦和小麦PDS的沉默效果)。

体外转录出的RNA，PSLVα和β分别和来自pT7-PSLVγMCS-GFP₂₅₅、pT7-PSLVγMCS-HvPDS₂₄₇的RNA混合，然后接种二叶期的大麦和小麦。在注射的第15天，接种了PSLV::HvPDS₂₄₇的大麦和小麦的新生叶片出现了明显的白化表型，而接种了健康对照和PSLV::GFP₂₅₅的大麦和小麦系统叶片没有此表型。同时RT-qPCR检测发现，与对照相比，在白化的大麦和小麦叶片中的PDS mRNA下降了约80％。说明基于PSLV的基因沉默系统能很好地在大麦和小麦上使用。(图8)

实验例2：采集实例2中被PSLV::GFP₂₅₅和PSLV::HvPDS₂₄₇侵染的小麦叶片(一般采集小麦的第四片叶)。加入一定体积的20mM的磷酸buffer(pH 7.2)，用研钵研磨均匀。蘸取汁液摩擦接种两叶或三叶期谷子(Yuyou 206)。

实验例3：用小麦健康叶片及被PSLV::GFP₂₅₅和PSLV::HvPDS₂₄₇侵染的小麦叶片汁液转接两叶或三叶期谷子。转接18天后，转接PSLV::HvPDS₂₄₇的谷子出现白化表型，而转接PSLV::GFP₂₅₅的谷子没有白化，且与健康对照相比PSLV::GFP₂₅₅引起的症状温和(图9)。

RT-qPCR检测发现，转接PSLV::HvPDS₂₄₇的谷子叶片(白化的叶片)中的PDS mRNA水平相对于接种PSLV::GFP₂₅₅的谷子下降了约50％(图9)。说明基于PSLV的基因沉默载体系统适用于谷子。

实施例4基于早熟禾半潜隐病毒的基因沉默载体系统的应用

本实施例以大麦IspH基因作为靶标基因，进一步说明基于早熟禾半潜隐病毒的基因沉默载体系统的应用。

(一)基因沉默载体系统的构建

1、设计引物F11和R11并交由Invitrogen公司合成，引物序列为(5′-3′)：

F11：ctctgactgcagaggGGATTGACAGTGAACAAAG；

R11：agtactcatatgaggGCAACCTGCAAAACTTCTTG。

以大麦的cDNA为模板，利用上述引物扩增出205bp的大麦片段(HvIspH)。用Stu I线性化pT7-PSLVγMCS，然后以中美泰和公司的2×Master Assembly Mix将上述PCR扩增得到的205bp的大麦IspH片段，重组到线性化的pT7-PSLVγMCS，产物称为pT7-PSLVγMCS-HvIspH₂₀₅(图10)。

(二)应用

以体外转录物接种大麦和小麦：加入3μl Xho I(TaKaRa)、3μl 10×H buffer和1.8μg的PSLV cDNA侵染性克隆和其衍生质粒，补水至30μl，37℃酶切6h，然后80℃失活酶10min。对质粒进行线性化。

取3μl左右线性化质粒,并加入3μl 10×RNA polymerase reaction buffer,3μl100mM DTT,30U HPRI,3μl rNTP(A、U和C均为10mM,G为1mM)(TaKaRa),2μl T7 RNA聚合酶(NEB),2μl 5mM Ribo m7G Cap Analog(Promega),最后用DEPC-ddH₂O补至30μl,37℃反应3-5h后，取2μl进行电泳检测,将剩余体外转录物与2×FES缓冲液等体积混合,摩擦接种二叶期大麦(Yangfu 4056)和小麦(Yangmai 11)叶片(每株接种20μl)。

对照组：pT7-PSLVα，pT7-PSLVβ和pT7-PSLVγMCS-GFP₂₅₅的体外转录混合物。

实验组：pT7-PSLVα，pT7-PSLVβ和pT7-PSLVγMCS-HvIspH₂₀₅的体外转录混合物。

实验例4：本实验例用于说明实施例4(基于PSLV的基因沉默载体系统对大麦和小麦IspH的沉默效果)。

体外转录出的RNA，PSLVα和β分别和来自pT7-PSLVγMCS-GFP₂₅₅、pT7-PSLVγMCS-HvIspH₂₀₅的RNA混合，然后接种二叶期的大麦和小麦。在注射后第15天，接种了PSLV::HvIspH₂₀₅的大麦和小麦的新生叶片出现了明显的白化表型，而接种了健康对照和PSLV::GFP₂₅₅的大麦和小麦系统叶片没有此表型。同时，RT-qPCR检测发现，与对照相比，在白化的大麦叶片中的IspH mRNA下降了约80％。在白化的小麦叶片中IspH mRNA下降了约40％，见图11(由于pT7-PSLVγMCS-HvIspH₂₀₅中***的是大麦的IspH，其序列与小麦的IspH序列一致性较低，所以导致PSLV::HvIspH₂₀₅对小麦中IspH mRNA的下调不是很高效)。说明基于PSLV的基因沉默系统能很好地在大麦和小麦上使用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 早熟禾半潜隐病毒作为VIGS载体的应用

<130> KHP191112541.5

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctctgactgc agaggtcaat gttcatatat ggtttg 36

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agtactcata tgagggcagc gatttcatct ggaaac 36

<210> 3

<211> 3873

<212> DNA

<213> 早熟禾半潜病毒(Poa semilatent virus)

<400> 3

ggtattcgag agagagttcg cgggctcatt gaaatctcgg gtactcataa tcgtgaaatc 60

gattcggttc cttttaactt cacaacaaac ttttccagct tgtcatctcc gaggcgatgg 120

caagtgacga gattgtgcgc aatctggttt cccgggagga tgtgatgggt aatttgatta 180

gcacagcttc tagttctaca aggtcaccct tgcatgacac gctgtgctcg cacgtaaaga 240

ccgtcattga ttccgtggag cagaaggctg ccaatcgcaa gcgaatagac gtgaggcgca 300

acatctcatc tgaagagttg caggtgttga taaacgctta tcctgagtac gccatctcgt 360

cttccgcttg tgagtctgga acccatagca tggctgcttg ctttcgattc ctggagacag 420

aatatctctt agacatggta cctattaggg acaccttcgt gttcgacata ggaggcaatt 480

ggttttcaca tatgaaatat agatccgaca gatctattca ttgctgttgt ccaatcctgt 540

ctttgaggga cgctgaacgc ctggaaacgc gtatgatgaa catgcaaaga ttcatgcgcg 600

gttcgaacga caagaaatcc cttgctttgg aagcaaagta tcatggtatc cttcataacg 660

ctcaacgaaa acaggcagct tttgctgctc atgaggtgga tgcccacact cttgacgggg 720

acgttttttg cgagaatacg tttcaagagt gcgtacagaa agttcctgag ggattcttat 780

caactgccat ttctgtacac agtatatacg atattaagat agaggagttc gcccaggggc 840

tgagaaacaa gaatattcgc caagcatatg gctgttttct ttttcctcca gccctactta 900

ttggagttgc cgaaggagta atgccgtctg ttaatgggca ttacaaggtt gtagatggga 960

agataaaatt ctatttcgct aatgatccga atgctggtta tacccacgat cttaaagatt 1020

atctgaagta cgtggaacta actttcattg agatcaaaga tggtatcttc caagtggagc 1080

tgttacaaat gcgcggagac acaatgtttt tcaagatgac tgacgttacg gtaggtgcgc 1140

atcacttgtt ttacagaaac tttcgaggag atgaaaattt caagtgtgtg ccgatgctaa 1200

aaaacacttc agtcgtcgtg cctttatttt cgtggagcaa gggagagttg agtgttgaaa 1260

ctggttttct tcctcgcacc ctggttgaac agggagcttc ctatatcatg aaaaacaagg 1320

agaaagatct gaatgtggcc gtgctgaaga attatctttc ttcagtaaat aactcgtaca 1380

tcttcaacgg ttctcaagtt cgcgaaggcg tcaaggttgc gcccgacttg ttatctaagt 1440

tggctgtgac tttgtatttg cgagagaaag tctgccggag acgagagaac aaggtggtgg 1500

agcattttga gcatgaatta ctcagagatc cggggctagg ggatttattc agtagcctgg 1560

tctggtttgt gccggaaaag ataaagaatg catgggagaa tttcagaaaa gcactgcttc 1620

gctggtatgg gatggaattc gacgtgagtg tctttgacat ctgtgaccct ccgttgtgcg 1680

ttgaaatcga agatcgctat cgtatgagaa agaaattggg agttttctca gtcggagagt 1740

attttgactg tcatgacgaa tgtgctgctt atgaacgccg tgagcaagaa aagaaagatt 1800

tcgctaaagc aatggtcgat aaagtggtcg gtgccaccga accaaaggca agccaggcgc 1860

aggtaacggc taatcctgag ttaaagaaac tcttggctta cctagtcctc acgcaagctg 1920

catgcctacg tagtaagaag gaacctttga ccgccgatca accagctttg gcaatctcag 1980

gaccctctgg gtctgattct acgcccacag tttctgtggc tacttcgccg acttggtcag 2040

cgaaatccgg ttttgaaaac ttgcctccta ccctgatagg agacgaatat gcccacacgt 2100

gggaaattgc taacgaacct catttagctt tcaagaaagt aactgccgac ttgagtcaga 2160

gatcgaaaat gccgcccagg cctattgaag tggctgatta tgattataat tccaggtcag 2220

aatttctgta ctacctactt tgtaatgtta ttggagatcg cgctcagatt cttgaaatca 2280

ttcaagcttt tcgctcgtct ttgattttca cggaaaaggt cgtagctcct ttgaacggaa 2340

aaatctttag ttacaaagat ggtaatgcca aatggatctt tagggaacct acggcagcag 2400

atactggtca tgcttatgca gtgcactttg acttttatgg cgacgaacag gacattgaaa 2460

aatgcctgag ttattgtact atggtctcaa ttcattggga tcgtagtgat aagtacgtag 2520

caaaaattcc atttttccca agtaagactg gttactatgt tatttgtgat aataccaagt 2580

tgtgtaacaa ctggttaatc tataatatct tagtcgatgt cttcagggac tacaaaccca 2640

gacctattcg gtttgaactt gtagatgggg tgccaggctg cggaaagtca acaatgattc 2700

taaacacctg tgatttgcac agggaggctg ttattggaga gggccgcaac gccatggatg 2760

atctgagaaa taaatttcaa aagaagaaac ttgtgagcaa gaaattatcg ctttctagag 2820

ttcgcactat ggacagtctg cttttggcag acaaagataa tgtacctaag tgtcaaaagt 2880

ttcatttcga tgaggctttg aaagtgcact atggtgctat tctgttctgt gctgaccgat 2940

tgggggcgac tgagattatt gctcaagggg atcgtgctca actgccgatg atctgtagag 3000

tagaaggcat tgatttgcat tatactcgac cagacttttc aagaattgtg atttcaccga 3060

aactactttc gtacagaata ccaggtgatg tggcctttta cttaagtgca agaggttact 3120

acaaggtcaa cggagtagca caaactatca cgactaaaaa caaagtggaa cgctctatgt 3180

tcgctcgtgg agagacaaca cctgaacgtt tcattagtct tttagatgtg ccggtgagaa 3240

gagatgtaca gtatttgtgc ttcatgcagg ctgagaaaga atctttgata gcacacttgg 3300

taccaaaagg cgtaaaaaag gagagtatcg cgaccattca tgaatcccaa gggggaactt 3360

ttgatcacgt tatactggta cggcttcaac gcacacctca agagatctac ccaggtggac 3420

tcagaagcgc cagctacatg gtagtggctg tttcgaggca tactaagacc tttacttatt 3480

gtagcgttgt tgatgacaaa ttgttcatag atatagctga tgagaatggt attgctacca 3540

ctcccgtcag gactttccaa tcgcatattg tagagtagtt ttgaagttcc taaaaaccaa 3600

aaaatcaaaa agaaaagtgc cggtgtgaaa tccaccggaa ttgccactgt gaaattcagt 3660

gacggtatta tccaccaaag gataaagtgt tttcatgtcc acttaaatcg aacatgagca 3720

aatgccttat acggaaacta cagaaacctt acagtttcgt agagtgaagt atcgggaatt 3780

ggtatgtaag ctacttcttc cagtagctgc gtcataacat caaggttatg catactgagc 3840

cgaagctcag cttcggtcct ccaaggaaga cca 3873

<210> 4

<211> 3608

<212> DNA

<213> 早熟禾半潜病毒(Poa semilatent virus)

<400> 4

ggaaaaacaa acagcgacct ggtcgttgtg cgaaactcta ccagtttcgc gttcttttag 60

ctagtgtata tattaggatt agaatttgtt ttttcaaccc gtgcatttca ttatgccgaa 120

catctctctt actacgaaag gtggtggaca ctatgatgaa gatctttggt tttctcaagt 180

agtttctcaa gggctttatg cagaatggtg ggttctctca gataactggg aaaaatttct 240

cgacaatttg agaggcgtta acttcggagt ctcctcatcc agatctcaag tttctgacta 300

cgtagcagcg ttagatcgtg atctacctgc tgatgttgac agacgcttcg ctggaccgag 360

gggtcaactt gactcaccta actacgtatc agcacctata ttctaccgaa ttaatcgatc 420

tcttgttggg gacattacta ggttggctcg catcacggac caacccagta acaacagaga 480

cgttgaattg agtagagtca agaagctatc aggtcaaccg acaccaccgc ccggcactga 540

caaccaaatg gctatcagag atgtgcagtc gttgcgagat ggctctctca gcttctccta 600

cactctcatc aatgagctag ttggggctca gttggcggcg tatactgtga gacgttttga 660

gactgaattt gggctgcagt ggctaccagt gcaggctcaa ggtcagcggg tttgattttc 720

tttccctctt ttcctctttt ttacttttag ctttaaactt tgttttttta acatttcttt 780

tatttttaaa aagttctttt ttagggagtt acttttgatg tttatgtttt ttgctttcgg 840

ccatgtctga tgggttgcgg actaaccacc aaaacgaaac gcctggtgta caaagtgaaa 900

agatggagct tcgtcagact acttctgatg acacccagaa tcaagcagat tctggtgcga 960

aatctcatga tactaataca tcacgtgtgg atgagaccgc aaagacaacc gatgtcaaag 1020

aatctccttc gggagaatcg ttgtcgggag ttagtgctgt ttcgggggga accgacaagg 1080

gtgagaaatc agccgtaagg aaagaggcgg gagagagcaa agaatctcct aaatctgtgc 1140

ctagtgatgg tggagaagta aaacatgttg atacggaaac gaaagcgaag agtaagagaa 1200

agaagaaaaa taagaaaacg cctaaggagg gcacttctaa gactactagc gaatccagtt 1260

ctgccaagaa cgtggagtcg aaagaatcta agaagcaaac gaaaccaaag gcggtgtctc 1320

cttcatcgga cacttctaag attgctagcg aagttggttc tgcaaagaaa gcaactaaga 1380

aagaatctaa gaagcaaacg aaagataaag gttctgctga agacttaaat gcaaacacta 1440

aattaaaggc taaagctagt gagcagaaag gaccaacgat accaggaacc agtgcagagg 1500

cctcacgaat tgatttacta caaagttcta cagcggagaa attcactaag aacgatgtgc 1560

gcagaacggc tttggtcaat gagtttgtcg cacaaattca taagttttgc atcgaacagg 1620

gatttgaacc gacggggcga cagtacatga gagctagggc caacctcttt gagttggttg 1680

gtttaagaaa tctgtacatg gagcacttaa agaagacagc agcgaaggct tgtaatttca 1740

caaaggatcg gattcgtagg aaactgttcc taacgagtaa ccacaaacct tcagttgatt 1800

tcttggtcgg gatagtctct ggtgttccgg gttgtggaaa gtctacacta gtgcgtaaac 1860

tactcgattc acccatttca tgctatgtag cacttgcaaa tccagccacc gagcgtgatt 1920

accgagggac atctaatgtg atgaccctgg atgatctact tctagctaaa gtacctatga 1980

gttcggatct tttgatcgtc gacgagtata cactcgccga aagcgctgaa attctcttgc 2040

tgcaacgcag agtaagatct tcactagttc tactagtggg tgacgtcgct caagggagga 2100

gtaacaatgc ttcgaacata gagtacttga cactaccagt gatctacaga aaaatcactt 2160

cgcatcgaat tggcgaggaa acagcgaaag cgtgctctaa gcaaggaaat cggattagat 2220

ccgcgggtcg aaaagataag ttgatactag ttgactatga aggcgaaacg gaagagacag 2280

agaaaaatct ggcttttacg gaagaaacta gagatgacgt caaagactgc ggttatgact 2340

gttctctggt ctctgaagtg caaggtttag aatatgaatc tgtcactttg ttcttgcgaa 2400

acacggacag agctgcggcg tctgatcacc acaaaaggac agtctctatg acaagacata 2460

aaagtttact aatcatcagg gccgaacaag aaattggtca gccatttctg atgggtgaat 2520

tgagtgtgtc tagtaagcga ccgtcaaacg cacacgtgta ctcttctgag tgacgatgcc 2580

tgcaaaaacg acttctgtgg ggagtagacc taataagtat tggccaattg tagctggtat 2640

aggtgtagta ggtttatttg cttacttaat ttctgctaat cagaaacatt ctactgagtc 2700

tggagataat attcacaaat ttgccaacgg tgggagttat cgagacggtt ctaagtgtat 2760

ttcttacaat cgaaacaacc ctttcgccta tggcaatgcc tcatctcctg ggatgctctt 2820

gcccactctg ttcacaatca tcggaatcgt ttcctatcta tgggccacca gaggagagat 2880

tatgggagga aactcccccc tcctcggcca caattgtgga gaggaatgcg ccggagaatg 2940

tgttcgtggc ttggatcgac aggaattacc tcctaattct gtgtagtctg gctttgctta 3000

gtgtgagttt agcttatata tattttactt ctgggaataa taacccatat gtaaaaggag 3060

ggtattttta ccaagatctt aactccgtgg aggtgcgatt tggtgaacac cctgtagacc 3120

cgaaggttat agcgtccatt caccattggc agaagaaccc ttttggggtt tctccgctat 3180

gggagggatt aaataatcta gtgtctagtt tagtgagtgc tcttaagttt tatgtaggtt 3240

tattattctt actattacta atcataatct ttaagtaatt ttctttcaaa aatcacaaaa 3300

agaaaacttc tctaaggtga aattccttag taaaaacaac aaaaagaaaa gtgctggtgt 3360

gaaattcacc agagattgcc actgtggaaa tcagtgacgg ttttatctac cataagataa 3420

agtgttttca tgtccactta aatcgaacat gaacaaatgc cttacaccga aactacagag 3480

atcttacagt ctcgtagagt gaagtgttgg gaattggtat gtaagctact tcttccagta 3540

gctgcgtcat aacatcaagg ttatgcatac tgagccgaag ctcagcttcg gtcctccaag 3600

gaagacca 3608

<210> 5

<211> 3169

<212> DNA

<213> 早熟禾半潜病毒(Poa semilatent virus)

<400> 5

ggtattgctt ttgcggcaac gcgtccagca aagtacagca taccaacccc caaaacatta 60

acgcgtgtag cgttctttac cccaacaacc gatggctaac ttttcaagtt ggccgtcaac 120

cctagcctct ggtaggtctc acgctccttc aagaagagtc actctgaaag taggagtagc 180

aatctacgct ttatcacttg tgagacgtgt caagttaggt ggaagagtag tagatcatca 240

aagactttgc agttatgtgc gatgccggga aatgggtgag tattctgatg aagaaagctt 300

tagtacccga caggttcagg ctccaaaaga cgccgaaagg cccctgagga ggactgtaat 360

ttctaagatg agaagtcttg cgatagctgg ttcgaatgca tttattggaa atctctgtct 420

aagctcaact gctaagctca aagtgttgtt caaaaccaac aacagacctt tgtctgtggt 480

ggtaggctct gctattttag tggtgtcact gtgcaaatat cgagagctca agcggaaagt 540

agaagtccat cgttatggat tggcaaaggg aagggatgag tattccgcta tcctggaaga 600

aaatcttggt accgatgtgg ttcagtctcc aacagacgca cctgtgcctc ttaggagaac 660

ggaggatttt gaaaaaggtt tatacagaga tattttttcg gatccgcaaa taccgcaagt 720

catggaagag aaactgcaaa aacttttata ttctgaaggt gataagctta gaagaaggta 780

tcattttgaa tctttgacgg tgcaaagtag aaaagtaagg gtgccaaatg ttggctctgt 840

tgtggacatt caaagttggt ttgatgcgac tttccctggc aactctgtta gattctcgga 900

ctttgacggc tacactgtct cggtctctga tttgaacatt gatgtcaatg attgcaagat 960

caaattgggc aaggcgttta gaccttatga attcaaggat agtctacgac ctgcgttgag 1020

aacggctatg ccggagaaga gacaaggaag tttagcagaa agcgttttgg cgttgaagaa 1080

gagaaatctc gcggccccgc ggctgcaagg ttcactcaat gagtgggcta ccatcaagag 1140

agtcttggaa aagactctag acgtcttctt tttcaaagag atgattgacc gttctgatca 1200

taacacttac gagtcgagtt tgcggtggtg ggacaagcag tcagtttcag ctagagcaca 1260

aatacttgca gacactagag gttttagtga catcgatttt tgtacttaca acttcatgat 1320

caagaatgat gtaaagccaa agatggatct cacaccccaa ggagagtatg cggccctaca 1380

gactgttgtt tatcccgaca aaattgtaaa tgcgtttttt ggcccgatta tcaaagaggt 1440

taatgaacgt attatcagag ccctgcgacc tcacgtggtg tttaacacga gaatgacggc 1500

tgagcagctc aatgagagtg tggcgtattt gacgcctaag aagtacaaag cagtggaaat 1560

tgatttctca aaattcgaca agtcaaaaac cggattgcat atcaagatgg taattgcgct 1620

ttataagctt tttggtttcg acggactttt aaagaccctc tgggagaagt ctcagtttca 1680

gacatacgtt aaagaccgta actacggcct tgaagcgtat ctgctttttc agcagaagtc 1740

tggaaattgt gacacttacg gctcgaacac ttggtcggca gcactggctt tgctagattg 1800

tctccctctt gaggacgcac atttttgcat cttcgggggg gacgattctt tgattctatt 1860

tgaaagtggt taccctgtac ccgatccttg tacaaagttg gctggcacct ggaacttcga 1920

atgtaaggtc tttgatttca aatatcctct tttttgtgga aagtttatgt tgaacatcgg 1980

tggtaaatac atgtttgtac ctgatgccgc taagttcatc gttaagctag gtcgagcaga 2040

tataagagat gcagaagtat taagtgaaat tttcatctcc attaatgata actactgctc 2100

ttataaagat tataaggtgc ttgaagagtt agataaagcc ttagttgatc gttacagggc 2160

gccttacagc gctctgtcgg ctttgacttc gttgtgttac tatatcttcg attttcagaa 2220

gttcaagttg ttgttttcgt gtgatggaaa ttttgtagat aaaaagttaa gtaaggactt 2280

cgactggtaa agtctaggtc ctgaagtatt ttgaatctac tgtttttcct ttcgctcacg 2340

tcaacatgtc aaccgacttg tgttctgtgt gtggtaatgt caaggatgtt agtacttttg 2400

ttgaatctca ggaagatggt aagttctgta gtgcaaagtg ccttcgaaag gcgactttca 2460

ggagagttag aaagcagcta gccgaagagt atctgaaaca tgatcttatt cctgtttcat 2520

gccagctgaa ttccttccca ggttatcact gcggtatgat ctctgcttta gagatggacc 2580

cgtctggtaa gcctgttgtg atgaatttct gtggccagaa acacgaagcc ctcgccttag 2640

ccttgaaggc aaaagacggt gctaagctgc gacttgaata tctcgaaaga cgcttctatc 2700

agatgaagga tgtctacgca cggcgactag accggattgc agagaatctg aaagaggaac 2760

gcaaccgact aaccacctcg gggactatta cagtcaaacg agatggagag gagtctaagc 2820

aactagaagt tagtgtgcct atgactacgg cggatttttt caaactaagt aaactctgaa 2880

gtactttaat tatcaaaacc caaaaagaaa agtgccggtg tgaaatccac cggaaattgc 2940

cactgcgaaa ttcagtgacg gtattatcca ccaaaggata aagtgttttc atgtccactt 3000

aaatcgaaca tgaacaaatg ccttatacgg aaactacaga gaccttacag tctcgtagag 3060

tgaagtatcg ggaattggta tgtaagctac ttcttccagt agctgcgtca caacgtcaag 3120

gttgtgcata ctgagccgaa gctcagcttc ggtcctccaa ggaagacca 3169