一种通过热处理方式来提高cenh3介导的单倍体诱导率的方法
阅读说明：本技术 一种通过热处理方式来提高cenh3介导的单倍体诱导率的方法 (Method for improving CENH3 mediated haploid induction rate through heat treatment mode ) 是由 金春莲 王继华 李帆 杨春梅 于 2021-07-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种通过热处理方式来提高CENH3介导的单倍体诱导效率的方法,具体涉及生物育种领域。所述方法通过植株培养、单倍体杂交、热处理和幼苗鉴别的步骤最终获得想要的单倍体种子。本发明使用单倍体株系杂交后进行热处理,可以提高杂交后代单倍体植株比率,且该促进能力不受限于单倍体诱导株系的类型,那么这一非生物技术手段将会对CENH3介导的单倍体诱导生物技术在植物育种中的推广起到极大作用。(The invention discloses a method for improving CENH 3-mediated haploid induction efficiency by a heat treatment mode, and particularly relates to the field of biological breeding. The method finally obtains the desired haploid seeds through the steps of plant culture, haploid hybridization, heat treatment and seedling identification. The invention uses haploid strains to be crossed and then carries out heat treatment, can improve the rate of the haploid plants of the filial generation, and the promotion capability is not limited by the type of the haploid inducing strains, so that the non-biotechnology means can play a great role in popularizing the CENH 3-mediated haploid inducing biotechnology in plant breeding.)
技术领域
本发明涉及生物育种领域，具体涉及一种通过热处理方式来提高CENH3介导的单倍体诱导率的方法。
背景技术
单倍体诱导技术可以绕过传统育种由多代自交产生自交系的过程，缩短植物育种年限，提高杂交育种效率。在过去的几十年中，科学家和育种工作者致力于人工诱导单倍体的研究，建立了体外雌雄配子再生诱导体系、花粉射线诱导体系、种间杂交体系和诱导株系(haploid inducer)体内单倍体诱导体系。
经报道，在拟南芥里，通过编辑着丝粒特异组蛋白CENH3(Centromeric Histone3specific variant)可获得单倍体诱导株系。通过在CENH3功能缺失的突变体中转入一个蛋白氮端被H3.3替换的CENH3载体，可以获得tailswap株系，该株系与拟南芥Col-0野生型杂交，后代产生约1/3的单倍体、1/3的非整倍体和1/3的二倍体。此外，对拟南芥CENH3羧基端进行编辑获得的点突变体，亦具备单倍体诱导能力，其与野生型杂交获得的单倍体诱导率从2％到12％不等。由于CENH3在真核生物中的保守性，通过编辑该基因从而得到单倍体诱导株系的可行性在其他作物中也被广泛检验。但是目前仅在玉米和小麦中被成功报道，且单倍体诱导效率仅为3.6％(玉米)和7％(小麦)。
综上研究表明，单倍体诱导率在不同的CENH3编辑系统中存在差异，且作物单倍体株系的单倍体诱导效率远低于拟南芥，极大地限制了该单倍体诱导技术在植物育种生产中的应用。
发明内容
为此，本发明提供一种通过热处理方式来提高CENH3介导的单倍体诱导率的方法，以解决现有单倍体诱导率低，应用受限等问题。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
根据本发明提供的一种通过热处理方式来提高CENH3介导的单倍体诱导率的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤一，植株培养
选择tailswap单倍体母本株系种子在MS固体培养基上进行植株培养，4℃暗培养两天后，转至22℃，16小时光照/8小时黑暗培养室培养7天，取生长良好的幼苗转种土上，在22℃，16小时光照/8小时黑暗植物培养室进行培养至抽薹；
步骤二，单倍体诱导杂交
将抽薹后10天的单倍体诱导株系作为为母本材料，将本品种野生型作为父本材料，用镊子去除母本植株开放前一天花朵的花瓣雄蕊，摘取父本花朵轻扫去雄花朵柱头进行授粉，每个植株授粉5-10朵花；
步骤三，热处理
对授粉后的母本植株进行热处理培养，热处理培养后，转移回22℃的16小时光照/8小时黑暗植物培养室，继续培养至种子成熟后进行收种得F1代；
步骤四，鉴别
将F1代种子接种MS固体培养基培养后，流式细胞仪检测种子倍性，挑选出所需的单倍体植株。
进一步的，所述步骤一中，所述tailswap单倍体母本在CENH3功能缺失的突变体中转入一个蛋白氮端被H3.3替换的CENH3载体，即可获得tailswap株系。
进一步的，所述步骤一中，所述MS固体培养基包括MS盐2.21g/L、蔗糖10g/L、2-吗啉乙磺酸0.5g/L、肌醇100mg/L和植物琼脂8g/L，培养基的pH＝5.6。
进一步的，所述步骤三中，所述热处理培养的条件为日温度30℃/夜温度25℃，日温度时间为16小时光照，夜温度时间为8h黑暗。
进一步的，所述步骤三中，所述热处理培养的时间为7天。
进一步的，所述步骤三中，所述收种，同一种单倍体诱导株系的同一种处理条件下的植株种子统一收种保存。
进一步的，所述步骤四中，所述流式细胞仪检测种子倍性的方法是取F1代种子培养出的植株的叶片，加入300μL的缓冲液，切碎，再加入900μL所述缓冲液，混匀，用40μm细胞滤网过滤得过滤液；取400μL过滤液加入50μL，0.5mg/mL的碘化丙啶，涡旋振荡，用FACSVerse流式细胞仪测定细胞倍性，数据由BD FACSuiteTM软件分析。
进一步的，所述取F1代种子培养出的植株的叶片是培养3周的植株叶片。
进一步的，所述缓冲液包含45mM氯化镁,20mM 3-吗啉丙磺酸,30mM柠檬酸钠和0.1％(v/v)聚乙二醇辛基苯基醚。
本发明具有如下优点：
本发明使用单倍体株系杂交后进行热处理，可以提高单倍体诱导杂交后代的单倍体率，且该促进能力不受限于单倍体诱导株系的类型，那么这一非生物技术手段将促进非模式植物，如水稻、玉米等作物进行单倍体诱导时的效率，会对CENH3介导的单倍体诱导生物技术在植物育种中的推广起到极大作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例1所提供的一种流式细胞仪检测的植株倍性；其中，横坐标为细胞核表面积大小，纵坐标为流式细胞仪检测的细胞数量不同峰从左到右代表单倍体细胞、二倍体细胞、四倍体细胞、八倍体细胞和十六倍体细胞，其中图A中从左到右依次为2二倍体，4四倍体，8六倍体，16十六倍体；图B中从左到右依次为1单倍体，2二倍体，4四倍体，8八倍体。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Col-0野生型父本种子是从NASC种子库购买的cenh3-tailswap和G83E母本材料种子由UC Davis实验室获得
MS盐Labconsult
实施例1一种通过热处理方式来提高CENH3介导的单倍体诱导率的方法
1.植株培养
将拟南芥种子播种于MS固体培养基(MS盐2.21g/L、蔗糖10g/L、2-吗啉乙磺酸0.5g/L、肌醇100mg/L和植物琼脂8g/L，pH＝5.6)进行培养，4℃暗培养两天后，转至22℃，16小时光照/8小时黑暗培养室培养7天，取生长良好的幼苗转种土上，在22℃，16小时光照/8小时黑暗植物培养室进行培养。
2.单倍体诱导杂交
将抽薹后10天的两个拟南芥单倍体诱导株系cenh3-tailswap和G83E作为为母本材料，将拟南芥Col-0野生型作为父本材料。用镊子去除母本植株开放前一天花朵的花瓣雄蕊，摘取父本花朵轻扫去雄花朵柱头进行授粉。每个植株授粉5-10朵花。
3.热处理
将授粉后的母本植株在30℃日/25℃夜(16h日/8h夜)温度条件，同样光照条件下培养7天进行热处理，然后转移回22℃，16小时光照/8小时黑暗条件下继续培养至种子成熟进行收种，得F1代种子，同一种单倍体诱导株系的同一种处理条件下的植株种子统一收种保存。
4.杂交后代倍性鉴定
将杂交的F1代分别播种于MS固体培养基，培养条件如1所述。植株倍性通过流式细胞仪鉴定，取3周左右植株的一片叶片，加入300μL的缓冲液(缓冲液包含45mM的氯化镁，20mM的3-吗啉丙磺酸，30mM的柠檬酸钠和0.1％(v/v)聚乙二醇辛基苯基醚)，用刀片切碎，再加入900μL上述缓冲液，混匀，用40μm细胞滤网过滤，取400μL样品用于流式细胞仪检测倍性。如图1所示，横坐标为细胞核表面积大小，纵坐标为流式细胞仪检测的细胞数量不同峰从左到右代表单倍体细胞、二倍体细胞、四倍体细胞、八倍体细胞和16倍体细胞，其中图A中从左到右依次为2二倍体，4四倍体，8八倍体，16十六倍体；图B中从左到右依次为1单倍体，2二倍体，4四倍体，8八倍体。A为二倍体植株，不存在单倍体细胞，B为单倍体植株，可鉴定到单倍体细胞峰。也就是说二倍体植株中不存在单倍体细胞，而单倍体植株中可鉴定到单倍体细胞峰。在样品中加入50μL，0.5mg/mL的碘化丙啶，涡旋振荡，用FACSVerse流式细胞仪测定细胞倍性，数据由BD FACSuiteTM软件分析。
实施例2一种不同热处理时间来提高CENH3介导的单倍体诱导率的方法
1.植株培养
将拟南芥种子播种于MS固体培养基(MS盐2.21g/L、蔗糖10g/L、2-吗啉乙磺酸0.5g/L、肌醇100mg/L和植物琼脂8g/L，pH＝5.6)进行培养，4℃暗培养两天后，转至22℃，16小时光照/8小时黑暗培养室培养7天，取生长良好的幼苗转种土上，在22℃，16小时光照/8小时黑暗植物培养室进行培养。
2.单倍体诱导杂交
将抽薹后10天的两个拟南芥单倍体诱导株系cenh3-tailswap和G83E作为为母本材料，将拟南芥Col-0野生型作为父本材料。用镊子去除母本植株开放前一天花朵的花瓣雄蕊，摘取父本花朵轻扫去雄花朵柱头进行授粉。每个植株授粉5-10朵花。
3.热处理
将授粉后的cenh3-tailswap的母本植株，根据热处理的时间点不同，分成5组，
第一组于授粉当天进行热处理，即第0天进行热处理，热处理3天后拿回22℃，16小时光照/8小时黑暗进行培养；
第二组先进行22℃，16小时光照/8小时黑暗培养室培养1天后进行热处理3天，即第1天进行热处理，热处理3天后拿回22℃，16小时光照/8小时黑暗进行培养；
第三组先进行22℃，16小时光照/8小时黑暗培养室培养2天后进行热处理3天，即第2天进行热处理，热处理3天后拿回22℃，16小时光照/8小时黑暗进行培养；
第四组先进行22℃，16小时光照/8小时黑暗培养室培养3天后进行热处理3天，即第3天进行热处理，热处理3天后拿回22℃，16小时光照/8小时黑暗进行培养；
第五组先进行22℃，16小时光照/8小时黑暗培养室培养4天后进行热处理3天，即第4天进行热处理，热处理3天后拿回22℃，16小时光照/8小时黑暗进行培养；
上述热处理的条件是30℃日/25℃夜(16h日/8h夜)的光照温度条件。
所有经过热处理后的母本植株，热处理结束后拿回22℃，16小时光照/8小时黑暗进行培养，直至种子成熟进行收种，得F1代种子，同一种单倍体诱导株系的同一种处理条件下的植株种子统一收种保存。
4.杂交后代倍性鉴定
将杂交的F1代分别播种于MS固体培养基，培养条件如1所述。植株倍性通过流式细胞仪鉴定，取3周左右植株的一片叶片，加入300μL的缓冲液(缓冲液包含45mM的氯化镁，20mM的3-吗啉丙磺酸，30mM的柠檬酸钠和0.1％(v/v)聚乙二醇辛基苯基醚)，用刀片切碎，再加入900μL上述缓冲液，混匀，用40μm细胞滤网过滤，取400μL样品用于流式细胞仪检测倍性。在样品中加入50μL，0.5mg/mL的碘化丙啶，涡旋振荡，用FACSVerse流式细胞仪测定细胞倍性，数据由BD FACSuiteTM软件分析。
对照例
1.植株培养
将拟南芥种子播种于MS固体培养基(MS盐2.21g/L、蔗糖10g/L、2-吗啉乙磺酸0.5g/L、肌醇100mg/L和植物琼脂8g/L，pH＝5.6)进行培养，4℃暗培养两天后，转至22℃，16小时光照/8小时黑暗培养室培养7天，取生长良好的幼苗转种土上，在22℃，16小时光照/8小时黑暗植物培养室进行培养。
2.单倍体诱导杂交
将抽薹后10天的两个拟南芥单倍体诱导株系cenh-tailswap和G83E作为为母本材料，将拟南芥Col-0野生型作为父本材料。用镊子去除母本植株开放前一天花朵的花瓣雄蕊，摘取父本花朵轻扫去雄花朵柱头进行授粉。每个植株授粉5-10朵花。
3.热处理
将授粉后的母本植株分别于22℃，16小时光照/8小时黑暗植物培养室进行培养，至种子成熟进行收种，得F1代种子，同一种单倍体诱导株系的同一种处理条件下的植株种子统一收种保存。
4.杂交后代倍性鉴定
将杂交的F1代分别播种于MS固体培养基，培养条件如1所述。植株倍性通过流式细胞仪鉴定，取3周左右植株的一片叶片，加入300μL的缓冲液(缓冲液包含45mM的氯化镁，20mM的3-吗啉丙磺酸，30mM的柠檬酸钠和0.1％(v/v)聚乙二醇辛基苯基醚)，用刀片切碎，再加入900μL上述缓冲液，混匀，用40μm细胞滤网过滤，取400μL样品用于流式细胞仪检测倍性。在样品中加入50μL，0.5mg/mL的碘化丙啶，涡旋振荡，用FACSVerse流式细胞仪测定细胞倍性，数据由BD FACSuiteTM软件分析。
实验例1受精后的热处理方式胁迫提高了拟南芥单倍体诱导株系的单倍体诱导效率
通过杂交后代倍性鉴定，实验结果见表1，在对照例中，cenh3-tailswap的单倍体诱导效率为42.5％，而实施例1在进行7天热处理后，该诱导株系的单倍体诱导效率提高至96.4％。
类似的，在对照例中，G83E的单倍体诱导效率为5.2％，而实施例1中进行7天热处理后，该株系的诱导效率提高到62.5％。
表1对照与热处理单倍体株系的单倍体诱导效率
实验例2授粉后热处理的天数对单倍体诱导率的影响实验
在实施例2中，在进行热处理时间点的实验之前，先进行了预实验，测试热处理情况，发现cenh3-tailswap杂交后热处理3天，单倍体诱导效率即可达到100％，如表2的0DAP单倍体植株量可达100％。后又对不同时间点进行热处理，筛选出最佳热处理的时间点，如表2所示，在授粉不同天数(DAP，day after pollination)后进行热处理，获得的F1代种子的萌芽率和单倍体诱导效率是有所差异的。其中，种子萌芽率随着热处理天数的推迟先升高后下降，而单倍体诱导效率随着热处理时间点的推迟而下降。结合种子萌芽率和单倍体诱导效率，在授粉2天后进行3天的热处理是最佳处理方案，此时种子萌芽率高，能获得更多的后代，而且单倍体诱导的效率在90％以上。
表2不同热处理时间点对cenh3-tailswap单倍体诱导效率的影响
综上所述，利用本发明的方法进行热处理后再进行单倍体的诱导，不仅可以提高种子的萌芽率还能够提高单倍体的诱导率。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。