一种利用抗赤霉病种质sf7el9改良小麦赤霉病抗性的育种方法
阅读说明：本技术 一种利用抗赤霉病种质sf7el9改良小麦赤霉病抗性的育种方法 (Breeding method for improving wheat scab resistance by using scab resistant germplasm SF7EL9 ) 是由 戴毅 陈建民 李海凤 石俊涛 高勇 于 2021-08-03 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种利用抗赤霉病种质SF7EL9改良小麦赤霉病抗性的育种方法,1个7EL特异性分子标记Th7EL-46可有效地鉴定出是否含有长穗偃麦草7EL染色体片段,便于分子标记辅助选择育种。利用该标记扩增的产物经凝胶电泳后,450bp的条带为7EL染色体片段特异带。另外,结合荧光原位杂交鉴定可以有效地区分易位染色体是纯合还是杂合,如果只含有1条易位染色体,表明材料为杂合易位系；若含有2条FISH核型一样的易位染色体,表明材料为纯合易位系。主要是通过远缘杂交手段,利用抗赤霉病小麦-长穗偃麦草7EL小片段易位系SF7EL9与栽培小麦杂交,并在杂交后代中选育出抗赤霉病的小麦种质。本发明提出的Th7E-46可作为生物标志物应用于实时鉴定抗病种质中含有的长穗偃麦草7EL染色体片段。(The invention relates to a breeding method for improving wheat scab resistance by utilizing a scab resistant germplasm SF7EL9, 1 7EL specific molecular marker Th7EL-46 can effectively identify whether a thinopyrum elongatum 7EL chromosome segment is contained, and molecular marker-assisted selective breeding is facilitated. After the product amplified by the marker is subjected to gel electrophoresis, a 450bp band is a 7EL chromosome fragment specific band. In addition, the identification combined with fluorescence in situ hybridization can effectively distinguish whether the translocation chromosome is homozygous or heterozygous, and if only 1 translocation chromosome is contained, the material is a heterozygous translocation line; if the material contains 2 translocation chromosomes with the same FISH karyotype, the material is a homozygous translocation line. Mainly utilizes a distant hybridization means to hybridize the scab resistant wheat-elytrigia elongata 7EL small fragment translocation line SF7EL9 with cultivated wheat, and breeds the scab resistant wheat germplasm in the hybridization offspring. The Th7E-46 provided by the invention can be used as a biomarker to be applied to real-time identification of the elytrigia elongata 7EL chromosome segment contained in disease-resistant germplasm.)
技术领域
本发明涉及一种利用抗赤霉病种质SF7EL9改良小麦赤霉病抗性的育种方法，属于植物育种技术领域。
背景技术
小麦赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是由亚洲镰刀菌(Fusariumasiaticum)和禾谷镰刀菌(Fusarium graminearium)等病原菌引起的主要世界性病害，严重影响小麦产量和品质。小麦感染赤霉病后，除造成产量显著降低外，还在籽粒中积累毒素-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)，给食品安全带来极大隐患。随着全球气候变暖及耕作制度和方式的改变，我国小麦赤霉病的发生区域有不断扩大趋势，2005-2010年小麦赤霉病年均发生面积约6196万亩，2011-2018年年均发生面积增加至8632万亩，2019-2020年发生面积则上升至9000万亩左右。如何防控赤霉病是目前小麦生产面临的一项重大挑战。利用小麦抗赤霉病基因选育抗病品种是控制小麦赤霉病危害最经济有效的途径之一。但小麦中抗赤霉病遗传资源较为匮乏，目前只有4个位点被明确为小麦抗赤霉病基因(Fhb1、Fhb2、 Fhb4、Fhb5)，并在小麦遗传育种中使用。而在小麦近缘物种中同样也发现了抗赤霉病基因，如Fhb3来自于大赖草、Fhb6来源于日本披碱草、Fhb7来自于十倍体长穗偃麦草。因此，从小麦近缘物种中的抗赤霉病基因转入小麦中，有利于丰富和拓展小麦抗赤霉病遗传基础，同时也是提高小麦抗赤霉病的有效途径之一。
长穗偃麦草(Thinopyrum elongatum)是小麦的一个重要近缘种，蕴藏着许多对小麦改良极为有用的基因，如抗病、抗寒、抗旱、耐盐碱、抗蚜虫等，其中 1E、7E染色体上携带着抗赤霉病基因(见参考文献：刘登才，郑有良，王志容，侯永翠，兰秀锦，魏育明.影响小麦赤霉病抗性的Lophopyrum elongatum染色体定位.四川农业大学学报,2001,19:200-205)，这为小麦赤霉病抗性遗传改良提供了优良基因资源。
经过多年的研究，我们利用普通小麦-二倍体长穗偃麦草代换系与普通小麦杂交，并通过电离辐射的方法获得了小麦-长穗偃麦草7EL整臂易位系 (T7BS.7EL)，经鉴定该易位系赤霉病抗性优异(见参考文献：张璐璐，陈士强，李海凤，刘慧萍，戴毅，高勇，陈建民.小麦-长穗偃麦草7E抗赤霉病易位系培育.中国农业科学，2016，49(18)：3477-3488)。但该材料都为整臂易位系，其农艺性状并不突出，在育种中并没有被直接应用。为进一步转移利用长穗偃麦草 7EL染色体上抗赤霉病基因，我们将电离辐射后的T7BS.7EL花粉授予扬麦158，并利用扬麦158多次回交，在辐射回交后代中利用7EL染色体分子标记和基因组荧光原位杂交(GISH)鉴定，创制了大量的小麦-长穗偃麦草7EL小片段易位系。通过多年的赤霉病抗性鉴定，发现易位系SF7EL9赤霉病抗性优异，为小麦抗赤霉病育种提供了新种质。本发明专利在此基础上公开一个利用该易位系改良小麦赤霉病抗性的育种方法。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种利用抗赤霉病种质SF7EL9改良小麦赤霉病抗性的育种方法，即以SF7EL9为亲本之一，在滚动回交的基础上，利用长穗偃麦草7EL染色体特异分子标记Th7EL-46及基因组荧光原位杂交(GISH) 鉴定易位染色体，通过赤霉病抗性试验，获得抗赤霉病小麦新种质。抗赤霉病种质SF7EL9在提高小麦赤霉病抗性的分子育种中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：一种利用抗赤霉病种质SF7EL9改良小麦赤霉病抗性的育种方法，其特征是，包括以下步骤：
步骤1)、以抗赤霉病种质SF7EL9为亲本，即父本或母本，与育种中丰产性较好的品种杂交，F1代再回交或与另一个丰产性较好的品种杂交，获得BC1F1种子100粒；
步骤2)、分单株种植BC1F1，在苗期利用分子标记Th7EL-46对BC1F1植株进行选择，保留含有Th7EL-46标记的植株，并单株收获籽粒，获得BC1F2种子；
步骤3)、分单株种植BC1F2，在苗期利用分子标记Th7EL-46及基因组荧光原位杂交GISH进行选择，并分单株收获含有Th7EL-46标记以及易位染色体的植株的籽粒，获得BC1F3种子；
步骤4)、分单株种植BC1F3株系，每隔10个BC1F3株系种植对照亲本1和亲本2，亲本1为SF7EL9或扬麦23或安农8455，亲本2位为扬麦23或SF7EL9 安农8455；在苗期选择株系内含有Th7EL-46标记以及易位染色体的植株，再在籽粒灌浆期、落黄期，选择株高、株型及赤霉病抗性均优于对照亲本的株系，并分单株收获其籽粒，获得BC1F4种子；
步骤5)、分单株种植BC1F4株系，每隔10个BC1F4株系种植对照亲本1和亲本2，亲本1为SF7EL9或扬麦23或安农8455，亲本2位为扬麦23或SF7EL9 安农8455；在苗期选择含有Th7EL-46标记以及一对易位染色体的植株，再在籽粒灌浆期、落黄期，选择株高、株型及赤霉病抗性均优于对照亲本的株系，分单株收获其籽粒，获得BC1F5种子；
步骤6)、分单株种植BC1F5株系，每隔10个BC1F5株系种植对照亲本1和亲本2，亲本1为SF7EL9或扬麦23或安农8455，亲本2位为扬麦23或SF7EL9 安农8455；在苗期选择含有Th7EL-46标记以及一对易位染色体的植株，再在籽粒灌浆期、落黄期，选择株高、株型及赤霉病抗性均优于对照亲本的株系，并混收种子，获得BC1F6种子；
步骤7)、分小区种植BC1F6种子，三个小区，并同时种植对照亲本1和亲本 2，亲本1为SF7EL9或扬麦23或安农8455，亲本2位为扬麦23或SF7EL9安农 8455；在开花期鉴定赤霉病抗性，混收BC1F6种子，晒干后称量重量，保留产量显著高于对照亲本1和亲本2家系，即可获得丰产性较好的抗赤霉病小麦新品系。
用于追踪抗赤霉病小麦新品系中长穗偃麦草7EL染色体片段的1个特异性标记Th7EL-46，该分子标记引物为Th7EL-46F：TTACACTAACCCATGGTGTT，Th7EL-46R：GCAGAGAATGAAGCAAAATC，利用该引物对杂交后代系进行PCR扩增，能够扩增出 7EL 450bp的特异条带，通过该标记可以有效追踪7EL易位染色体。
本发明方法先进科学，通过本发明，一种利用抗赤霉病种质SF7EL9改良小麦赤霉病抗性的育种方法，以SF7EL9为亲本(父本或母本)，与育种中丰产性较好的品种杂交，F1代再回交或与另一个丰产性较好的品种杂交，获得BC1F1种子 100粒左右，分单株种植BC1F1，在苗期利用分子标记Th7EL-46对BC1F1植株进行选择，保留含有Th7EL-46标记的植株，并单株收获种子；分单株种植BC1F2，在苗期利用分子标记Th7EL-46及基因组荧光原位杂交(GISH)进行选择，并分单株收获其籽粒，获得BC1F3种子；分单株种植BC1F3株系，每隔10个BC1F3株系种植对照亲本1和2，分别在籽粒灌浆期、落黄期，先选择株高、株型及赤霉病抗性均优于对照亲本1和2的株系，再在株系内选择含有Th7EL-46标记以及易位染色体的植株，并分单株收获其籽粒，获得BC1F4种子；分单株种植BC1F4株系，每隔10个BC1F4株系种植对照亲本1和2，分别在籽粒灌浆期、落黄期，先选择株高、株型及赤霉病抗性均优于对照亲本1和2的株系，选择含有Th7EL-46标记以及一对易位染色体的植株，并分单株收获其籽粒，获得BC1F5种子；分单株种植BC1F5株系，每隔10个BC1F5株系种植对照亲本1和2，在播种前取BC1F5植株根尖，利用基因组荧光原位杂交(GISH)进行鉴定，保留含有一对长穗偃麦草7EL易位染色体片段的株系，并混收种子，获得BC1F6种子；分小区种植BC1F6种子，三次重复，并同时种植对照亲本1和2，混收BC1F6种子，晒干后称量重量，保留产量显著高于对照亲本1和2家系，即可获得丰产性较好的抗赤霉病小麦新品系。
用于追踪本发明所述抗赤霉病小麦新品系中长穗偃麦草7EL染色体片段的1 个特异性标记Th7EL-46，该分子标记引物为Th7EL-46F：TTACACTAACCCATGGTGTT， Th7EL-46R：GCAGAGAATGAAGCAAAATC，利用该引物对杂交后代系进行PCR扩增，能够扩增出7EL约450bp的特异条带，通过该标记可以有效追踪7EL易位染色体。另外，荧光原位杂交(GISH和FISH)鉴定可以有效地区分易位染色体是纯合还是杂合，便于分子标记辅助选择育种。
本发明的有益效果为：普通小麦-长穗偃麦草7EL易位系SF7EL9是抗赤霉病小片段易位系，遗传稳定，携带长穗偃麦草7EL染色体片段，赤霉病抗性突出(图 1)，将其用于分子育种，能够显著提高普通小麦的赤霉病抗性，便于培育出抗赤霉病小麦新品系。
本发明公开的1个7EL特异性分子标记Th7EL-46可有效地鉴定出是否含有长穗偃麦草7EL染色体片段，便于分子标记辅助选择育种。利用该标记扩增的产物经凝胶电泳后，450bp的条带为7EL染色体片段特异带(图2)。另外，结合荧光原位杂交(GISH和FISH)鉴定可以有效地区分易位染色体是纯合还是杂合，如果只含有1条易位染色体，表明材料为杂合易位系；若含有2条FISH核型一样的易位染色体，表明材料为纯合易位系(图3)。
综上，本发明公开了一种改良小麦赤霉病抗性的育种方法。主要是通过远缘杂交手段，利用抗赤霉病小麦-长穗偃麦草7EL小片段易位系SF7EL9与栽培小麦杂交，并在杂交后代中选育出抗赤霉病的小麦种质。本发明提出的Th7E-46 可作为生物标志物应用于实时鉴定抗病种质中含有的长穗偃麦草7EL染色体片段。
附图说明
图1为小片段易位系SF7EL9田间表型及赤霉病抗性表现；
a：小片段易位系SF7EL9田间抽穗之后的表型；b：小片段易位系SF7EL9、感病品种安农8455(AN8455)、Roblin及抗病品种苏麦3号(SU3)单花接种禾谷镰刀根据21天后穗部表型。
图2为特异分子标记Th7EL-46在小片段易位系SF7EL9中的PCR扩增结果； M：DNAMarker；1：7EL小片段易位系SF7EL9；2：7EL整臂段易位系T7BS.7EL；3：附加系DA7E；4：二倍体长穗偃麦草2X；5：普通小麦中国春(CS)；6：普通小麦扬麦158。
图3为小片段易位系SF7EL9根尖细胞有丝分裂中期染色体基因组原位杂交(GISH)结果；图中发出绿色荧光信号的为长穗偃麦草7EL染色体片段，小麦染色体为红色。
图4为SF7EL9与安农8455杂交回交后代PCR、GISH鉴定结果；
a:特异分子标记Th7EL-46在杂交回交后代中的PCR扩增结果。M：DNA Marker；1：7EL小片段易位系SF7EL9；2：7EL整臂段易位系T7BS.7EL；3：杂交回交后代；4：二倍体长穗偃麦草2X；5：普通小麦中国春(CS)；6：普通小麦安农8455.b:杂交回交后代根尖细胞有丝分裂中期染色体基因组原位杂交 (GISH)结果。图中红色箭头处发出绿色荧光信号的为长穗偃麦草7EL染色体片段，小麦染色体为红色。
图5为小片段易位系SF7EL9与安农8455杂交回交后代赤霉病抗性表现；
小片段易位系SF7EL9、感病品种安农8455(AN8455)、Roblin杂交回交后代(×AN8455)、及抗病品种苏麦3号(SU3)单花滴注禾谷镰刀菌21天后穗部表型。
图6小片段易位系SF7EL9与扬麦23杂交回交后代PCR鉴定及赤霉病抗性表现；
a:特异分子标记Th7EL-46在杂交回交后代中的PCR扩增结果；M：DNA Marker；1：7EL小片段易位系SF7EL9；2：7EL整臂段易位系T7BS.7EL；3：杂交回交后代；4：二倍体长穗偃麦草2X；5：普通小麦中国春(CS)；6：普通小麦扬麦23.b:小片段易位系SF7EL9、感病品种安农8455(AN8455)、Roblin、亲本扬麦23(Y23)、杂交回交后代(YZU-7EL049)及抗病品种苏麦3号(SU3) 单花滴注禾谷镰刀菌21天后穗部表型。
具体实施方式
下面结合实施例、附图以及附图说明对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
为了了解小片段易位系SF7EL9抗赤霉病的效应，明确其利用价值，以SF7EL9 为父本，感病品种安农8455为母本杂交，之后以安农8455为母本回交1代后自交，利用分子标记Th7EL-46和基因组荧光原位杂交(GISH)鉴定(图4)，从而获得改良新种质。经多年赤霉病抗性鉴定发现，获得的新种质高抗赤霉病(图5)。
实施例2
以SF7EL9为亲本之一(父本或母本)与丰产品种扬麦23杂交。首先SF7EL9 与扬麦23杂交，F1代再与扬麦23回交，获得BC1F1种子，单株种植BC1F1，在苗期利用分子标记Th7EL-46选择，保留含有Th7EL-46标记植株并单株收获，获得 BC1F2种子；分单株种植BC1F2，每个单株种6行，每行5株，利用分子标记和GISH 对每个单株进行选择，保留含有Th7EL-46标记植株及长穗偃麦草染色体的单株，同时在开花期利用单花滴注法进行赤霉病抗性鉴定，单株收获赤霉病抗性好的植株获得BC1F3种子；分单株种植BC1F3，每个单株种6行，每行5株，利用分子标记和GISH对每个单株进行选择，保留含有Th7EL-46标记植株及一对易位染色体的植株，在开花期利用单花滴注法进行赤霉病抗性鉴定，农艺性状统计，单株收获赤霉病抗性和农艺性状好的植株，获得BC1F4种子；分单株种植BC1F4，每个单株种6行，每行5株，利用分子标记和GISH对每个单株进行选择，保留含有 Th7EL-46标记植株及一对易位染色体的植株，在开花期利用单花滴注法进行赤霉病抗性鉴定，农艺性状统计，混收赤霉病抗性和农艺性状好的植株，获得BC1F5种子；分小区种植BC1F5和亲本扬麦23，3个重复，统计农艺性状，最终获得抗赤霉病新种质YZU-7EL049(表1，图6)。
表1新种质YZU-7EL049与其背景亲本扬麦23主要农艺性状比较
注：表中不同字母表示差异显著水平为0.05 。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种利用抗赤霉病种质SF7EL9改良小麦赤霉病抗性的育种方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttacactaac ccatggtgt 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagagaatga agcaaaatc 19
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