阅读说明：本技术 用于治疗结核病的化合物 (For treating compound lungy ) 是由 G·格鲁贝尔 R·W·贝茨 A·霍特拉 T·迪克 K·派特 于 2018-02-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种用于治疗结核病的化合物和组合物。这些化合物可用于靶向F-ATP合酶的F<Sub>1</Sub>域,并且可与贝达喹啉或6-氯-2-乙基-N-[[4-[4-[4-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]苯基]甲基]咪唑并[1,2-a]吡啶-3-甲酰胺(Q203)或其组合。(The present invention relates to one kind for treating compound and composition lungy.These compounds can be used for targeting the F of F-ATP synthase 1 Domain, and quinoline or the chloro- 2- ethyl-N- of 6- [[4- [4- [4- (trifluoromethoxy) phenyl] piperidin-1-yl] phenyl] methyl] imidazo [1,2-a] pyridine-3-carboxamide (Q203) or combinations thereof can be reached with shellfish.)

用于治疗结核病的化合物

技术领域

本发明涉及一种用于治疗结核病的化合物和组合物。

背景技术

以下对本发明背景的讨论旨在促进对本发明的理解。但是应理解，此讨论并不是承认或认可所提及的任何材料在本申请的优先权日在任何司法管辖区均已出版、已知或为公知常识的一部分。

结核病(TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的传染病。需要新的治疗策略来应对结核病的大范围流行以及多药耐药性(MDR)和广泛耐药性(XDR)形式的结核病的传播，这仍然是世界范围内一项严重的公共卫生挑战。

贝达喹啉(BDQ；)是一种抗结核性化合物，在化学归类上属于二芳基喹啉。但是，尽管BDQ在临床上取得了成功，但相关报道表明，在广泛耐药性结核病(XDR-TB)患者体内发现了对BDQ的临床耐药性。

因此，需要开发一种用于治疗结核病的化合物或其组合物。

发明概述

在第一方面中，提供了一种具有下式表示的结构的化合物：

其中R¹和R^1a独立地为H、卤素、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、OH；

R²＝H、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷基醇、C₁-C₄烷氧基、-CH₂COOEt；

R³＝H、C₁-C₄烷基；

R⁴＝H、卤素、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基；

X、Y和Z独立地为C或N。

有利地，本发明化合物靶向F-ATP合酶。F₁F_O ATP合酶(F-ATP合酶)是满足分枝杆菌生命周期中增殖性需氧阶段以及低氧休眠阶段的能量需求所必需的酶之一。该酶由九个化学计量亚单位α₃:β₃:γ:δ:ε:a:b:b’:c₉构成，并且分为膜嵌入F_O域(a:b:b’:c₉)和水溶性F₁部分(α₃:β₃:γ:δ:ε)。所述F₁域含有形成α₃:β₃六聚物的三个催化性αβ-对，其中ATP合成或ATP水解在所述催化性αβ-对中发生。该催化性α₃:β₃-顶部通过两个中心柄亚单元γ、ε和***柄与离子泵送F_O部分相连。所述F_O域含有：亚单元a；以及一个由9个c亚单元组成的环结构。建议使用c环的旋转运动来触发中心亚单元γ和ε的旋转，从而致使核苷酸结合亚单元α和β发生连续构象变化，然后将ADP+Pi合成为ATP。

已经证明，F-ATP合酶对于耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)和结核杆菌(M.tuberculosis，Mt，其导致TB)的最佳生长而言至关重要。这在其他原核生物和真核生物(即人类)中是不同的，在这些原核生物和真核生物体内，该酶对于在可发酵碳源上的生长而言不是必要的，而糖酵解通量的增加可以补偿氧化磷酸化的损失。所述差异的原因在于，合成分枝杆菌细胞所需的ATP的量非常高。所述分枝杆菌F-ATP合酶的独特性还在于，其没有质子转位能力，以及其在快速或缓慢生长形式下的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性分别为低活性或潜在活性。

作为F₁F_OATP合酶的抑制剂，BDQ在临床上的成功证实，该酶复合体是抗结核药物开发中的要害靶标。

此外，F-ATP合酶属于形成电子传递链的酶的组合(orchestra)(ETC；图1)，其中细胞色素c氧化酶(cyt-bc1-aa3)和细菌特异性细胞色素bd型甲基萘醌氧化酶(cyt-bd)就归属于所述酶的组合，并且F-ATP合酶有助于ATP的生成。开发了咪唑并吡啶酰胺(IPA)化合物Q203(其靶向cyt-bc1-aa3)，并强调了ETC酶作为药物靶标的重要作用。

更有利地，本发明化合物靶向耐药性MDR和XDR-TB中分枝杆菌F₁F_O-ATP合酶的可溶性F₁部分。此概念的依据在于发明人对将能量固定在分枝杆菌内部的自然范例的新颖见解、关键催化剂内部负责ATP合成的新药物靶标，以及新化合物的开发。此外，本发明的化合物被发现有助于在多种药物组合中与BDQ和Q203的协同功效，从而解决了MDR和XDR-TB的挑战。重要的是，发明人已经确定了F₁域中的新靶标，并基于它们的F-ATP合酶的可溶性F₁部分的结构和生化数据进行了计算机模拟(in silico)化合物筛选练习，并随后鉴别了新的小分子抑制剂。在不受理论约束的前提下，据信，本发明化合物靶向F-ATP合酶的可溶性F₁部分，而BDQ在特定氨基酸残基处与c亚单位和ε亚单位相互作用，并且Q203靶向细胞色素c氧化酶cyt-bc1-aa3。因此，当与BDQ和/或Q203一起使用时，在存在本发明化合物的情况下，BDQ仍结合至F-ATP合酶的F_O部分和ε亚单位，并且Q203仍结合至细胞色素c氧化酶。

优选地，R²是乙基并且R³是H。在多种实施方案中，嘧啶环上存在双取代烷基胺部分例如化合物Br DE(表1)，以及R²上存在较大的取代基，将致使这两种抑制活性均下降(反映为相对较高的IC₅₀和MIC₅₀)。相反，当R²为乙基且R³为H时，观察到良好的抑制活性。活性最高的化合物是当R²为甲基或乙基时的化合物。例如，将R²为乙基且R³为H的Cpd 6与R²为乙基且R³为乙基的化合物Br DE进行比较，Cpd 6可实现显著较低的IC₅₀和MIC₅₀值。因此，这表明嘧啶环上的二取代烷基胺部分致使这两种抑制活性均下降(反映为相对较高的IC₅₀和MIC₅₀)。

优选地，X是N，并且Y和Z是C。

优选地，R¹选自3-Br、3-F、3-OH、4-Me和4-OMe。

优选地，R^1a选自5-Br、5-F和5-OH。

优选地，R^1a是氢。

优选地，R²选自-CH₂CH₂OH、-CH₂COOEt、甲基、乙基和异丙基。

在第二方面中，提供了一种具有以下结构之一的化合物或者其药学上可接受的盐：

在第三方面中，提供了一种组合物，所述组合物包含上述化合物以及贝达喹啉或Q203或其组合。贝达喹啉的化学名称是1-(6-溴-2-甲氧基-喹啉-3-基)-4-二甲基氨基-2-萘-1-基-1-苯基-丁烷-2-醇。它的分子式为C₃₂H₃₁BrN₂O₂，化学结构为：

Q203的化学名称为6-氯-2-乙基-N-[[4-[4-[4-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]苯基]甲基]咪唑并[1,2-a]吡啶-3-甲酰胺。它的分子式为C₂₉H₂₈ClF₃N₄O₂，化学结构为：

在第四方面中，提供了上述化合物，其用于治疗。

在第五方面中，提供了上述组合物，其用于治疗。

在第六方面中，提供了上述化合物在制备用于治疗结核病的药物中的用途。

在第七方面中，提供了上述组合物在制备用于治疗结核病的药物中的用途。

优选地，所述结核病是多药耐药性结核病或广泛耐药性结核病。

在第八方面中，提供了上述化合物，其用于治疗结核病。

在第九方面中，提供了上述组合物，其用于治疗结核病。

在第十方面中，提供了一种用于治疗肺结核的药盒，所述药盒包括上述化合物以及贝达喹啉或6-氯-2-乙基-N-[[4-[4-[4-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]苯基]甲基]咪唑并[1,2-a]吡啶-3-甲酰胺(Q203)或其组合。

在第十一方面中，提供了一种治疗患者的结核病的方法，其中所述方法包括向患者给药治疗有效量的上述化合物。

优选地，所述方法进一步包括添加贝达喹啉和/或6-氯-2-乙基-N-[[4-[4-[4-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]苯基]甲基]咪唑并[1,2-a]吡啶-3-甲酰胺(Q203)。

在第十二方面中，提供了一种合成上述化合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在第一碱的存在下将第一化合物与第二化合物偶联。

优选地，所述第一碱选自三乙胺、N,N-二乙基异丙基胺、Ν,Ν-二异丙基乙胺(DIPEA)、三丙胺和三辛胺。

优选地，所述方法进一步包括步骤(b)：通过在第一碱的存在下将胺或胺盐与2,4-二氯-6-甲基嘧啶混合以形成第一化合物来合成第一化合物。

优选地，所述方法进一步包括合成第二化合物的步骤(c)，并且其中步骤(c)包括将N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺或其衍生物氢化以形成N-(4-氨基苯基)苯甲酰胺或其衍生物。

优选地，步骤(c)进一步包括步骤(d)：在第二碱的存在下，将草酰氯、4-硝基苯胺和催化量的二甲基甲酰胺添加到苯甲酸衍生物中以形成N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺或其衍生物中。

优选地，所述第二碱选自碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠、氢氧化锂、氢氧化钾和氢氧化钠。

具体实施方式

现在将参考附图仅以示例方式来描述本发明，在附图中：

图1示出Mt中靶向cyt-bc1-aa3和F-ATP合酶的化合物Q203和BDQ的氧化磷酸化路径。

图2A示出，cpd 6以11μM的MIC₅₀值抑制了耻垢分枝杆菌的生长；图2B示出，cpd 6以0.3μM(或300nM)的IC₅₀值阻断了ATP的合成；

图2C示出，cpd 6以33μM的MIC₅₀值抑制了结核分枝杆菌H37Rv的生长；图2D示出，cpd 6以17μM的MIC₅₀值抑制了牛分枝杆菌BCG(M.bovis BCG)的生长。

图3A示出三磷酸腺苷酶(ATPase)抑制剂槲皮素、NBD-Cl和肽抑制素c(efrapeptinc)与cpd 6相比对IMV的分枝杆菌F-ATP合酶的ATP水解活性的影响，从而证明了其在ATP水解方向上的抑制特性；图3B示出TB药物BDQ和cpd 6对耻垢分枝杆菌IMV的ATP合成的协同作用。通过在含有100μl 7H9培养基的96孔板中进行两次随后的连续稀释，可以得到不同浓度的BDQ和cpd 6(分别为0-250nM和0-25μM范围)的组合。加入处于对数生长期的耻垢分枝杆菌mc² 155悬浮液，得到200μl的起始OD₆₀₀＝0.05。将板在37℃下孵育24小时；图3C示出在BDQ和cpd 6存在下用牛分枝杆菌BCG进行的全细胞ATP合成测定。单独的BDQ在200nM时将ATP合成从3.7x10⁴ RLU抑制到8x10³ RLU。值得注意的是，在存在37.5μM的cpd 6的情况下，仅需12.5nM的BDQ即可实现类似的抑制作用(6.5x10³ RLU)；图3D示出BDQ的IC₅₀值从单独BDQ的42nM降低到当与cpd 6结合使用时的2.36nM；并且图3E示出在cpd6存在下Q203的加和作用。

图4示出cpd 6对代表性人微生物组——金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大肠杆菌(Escherichia coli)的屏蔽。使用化合物莫西沙星(Moxiflocaxin)作为对照。

图5示出相对于不含本发明化合物或任何药物(即，不含药物)的对照而言，使用12.5nM的BDQ、0.5nM的Q203和12.5μM的cpd6的组合的牛分枝杆菌BCG中的全细胞ATP合成抑制作用；并且

图6A和6B示出BDQ对牛分枝杆菌BCG中的全细胞ATP合成抑制作用在与cpd 6类似物N-(4-((4-(乙基氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)苯基)-4-甲氧基苯甲酰胺(4OMe U Et)(图6A)或3-溴-N-(4-((4-(二乙基氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)苯基)苯甲酰胺(Br DE)(图6B)组合时显著上升。

发明详述

现在将参考附图描述本发明的具体实施方案。本文所使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围。此外，除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。为了清楚和一致，所有附图中尽可能使用相同的参考标号。

在整个说明书中，除非有相反指示，否则术语“包括/包含”、“由……组成”等应解释为非穷举性，或者换句话说，其含义是“包括但不限于”。

在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包含”或变型例如“包括”或“含有”将被理解为暗示包括所陈述的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。

在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括”或变型例如“包含”或“含有”将被理解为暗示包括所陈述的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。

本文所用的术语“约”通常是指所述值的+/-5％，更通常是所述值的+/-4％，更通常是所述值的+/-3％，更通常是所述值的+/-2％，甚至更通常是所述值的+/-1％，甚至更通常是所述值的+/-0.5％。

本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指由在药学上可接受的无毒碱或酸制备的盐。

本文所用的术语“治疗”、“处理”和“疗法”及其同义词是指治疗性治疗以及预防性或防止性措施，其中目的为预防或减慢(减轻)结核病。需要此类治疗的个体包括已经感染结核病的个体以及容易感染结核病的个体，或者需要预防结核病感染的个体。

本文所用的术语“化合物的治疗有效量”将是能够预防或至少减慢(减轻)结核病的活性剂的量。本发明的化合物、组合物和制剂的剂量和给药可以由临床药理学或药代动力学领域的普通技术人员来确定。例如，参见Mordenti和Rescigno(1992)，PharmaceuticalResearch，第9期，第17-25页；Morenti等人(1991)，Pharmaceutical Research，第8期，第1351-1359页；以及Mordenti和Chappell，“The use of interspecies scaling intoxicokinetics”，Toxicokinetics and New Drug Development中，Yacobi等人(eds)(Pergamon Press：NY，1989)，第42-96页。在治疗中使用的本发明化合物、组合物和制剂的有效量将取决于例如治疗目的、给药途径和患者状况。本文说明书中所使用的术语“患者”包括人和动物。因此，对于治疗师而言，有必要根据需要调节剂量并改变给药途径以获得最佳治疗效果。典型的每日剂量范围可以是患者体重的约1μg/kg/天至约50mg/kg/天或每天更多、约1mg/kg/天至约50mg/kg/天、约1mg/kg/天至约10mg/kg/天，优选约1μg/kg/天至约10mg/kg/天。

本文所用的术语“烷基”是具有1至10个碳原子的支链或无支链饱和烃基，例如甲基、乙基、正丙基(w-propyl)、异丙基、正丁基(w-butyl)、异丁基(isobutyl)、仲丁基、异丁基(i-butyl)、正戊基(w-pentyl)、异戊基、仲戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。所述烷基可以是环状或非环状的。所述烷基可以是支链或无支链的。所述烷基也可以是取代的或未被取代的。例如，所述烷基可被一个或多个基团取代，所述基团包括但不限于任选被取代的烷基、环烷基、烷氧基、氨基、醚、卤素、羟基、硝基、甲硅烷基、磺氧基(sulfo-oxo)或巯基，如本文中所述。“低级烷基”基团是含有1至6个(例如1至4个)碳原子的烷基。在一个优选实施方案中，术语“烷基”是具有1-4个碳原子的支链或无支链饱和烃基。

在整个说明书中，“烷基”通常用于指未被取代的烷基和取代的烷基；但是，取代烷基在本文中还通过确定烷基上的一个或多个特定取代基来特别提及。例如，术语“卤代烷基”特别指被一个或多个卤素例如氟、氯、溴或碘取代的烷基。术语“烷氧基烷基”特别指被一个或多个烷氧基取代的烷基。术语“烷基氨基”特别指被一个或多个氨基取代的烷基。术语“氮杂烷基”特别指其中的至少一个碳被氮替代的烷基。术语“氧杂烷基”特别指其中的至少一个碳被氧替代的烷基。

本文所用的术语“烷氧基”和“烷基氧基”是指通过醚键连接的烷基或环烷基；也就是说，“烷氧基”可以定义为-OA¹，其中A¹是以上定义的烷基或环烷基。“烷氧基”还包括刚刚描述的烷氧基的低聚物；也就是说，烷氧基可以是聚醚，例如-OA¹-OA²或-OA¹-(OA²)_a-OA³，其中“a”是1至200的整数，并且A¹、A²和A³是烷基和/或环烷基。

本文所用的术语“卤代杂环”是指具有至少两个不同元素的原子作为其环成员的环状化合物，并且其中环状化合物带有卤素原子作为取代基。所述卤素可以是氟、氯、溴或碘。卤代杂环的示例是氯杂环。例如，2-氯-N-乙基-5-甲基嘧啶-4-胺和PY6是氯杂环。即使在本文中使用卤代杂环例如氯杂环，也应理解，可以使用其他卤素例如溴、氟或碘，使得在GP4中可以使用溴杂环、氟杂环或碘杂环。

本文所用的术语“衍生物”或“类似物”是指与所用的术语相对应的化合物具有相似或相关结构的化合物。

在整个本公开中，可以以范围格式公开某些实施方案。应理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对所公开范围的范围的限制。因此，范围的描述应被视为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对例如1到6的范围描述应被视为已特别公开了子范围，例如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等，以及该范围内的各个数字，例如1、2、3、4、5和6。范围不限于整数，还可以包括小数测量值。无论范围的广度如何，这都适用。

通过结合附图阅读以下对本发明特定实施方案的描述，本发明的其他方面对于所属领域中的普通技术人员而言将变得显而易见。

在本发明的一个方面中，提供了一种具有下式表示的结构的化合物：

其中R¹和R^1a独立地为H、卤素、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、OH；

R²＝H、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷基醇、C₁-C₄烷氧基、-CH₂COOEt；

R³＝H、C₁-C₄烷基；

R⁴＝H、卤素、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基；

X、Y和Z独立地为C或N。

有利地，本发明化合物靶向F-ATP合酶。F₁F_O ATP合酶(F-ATP合酶)是满足分枝杆菌生命周期中增殖性需氧阶段以及低氧休眠阶段的能量需求所必需的酶之一。该酶由九个化学计量亚单位α₃:β₃:γ:δ:ε:a:b:b’:c₉构成，并且分为膜嵌入F_O域(a:b:b’:c₉)和水溶性F₁部分(α₃:β₃:γ:δ:ε)。所述F₁域含有形成α₃:β₃六聚物的三个催化性αβ-对，其中ATP合成或ATP水解在所述催化性αβ-对中发生。该催化性α₃:β₃-顶部通过两个中心柄亚单元γ、ε和***柄与离子泵送F_O部分相连。所述F_O域含有：亚单元a、b和b’，以及一个由9个c亚单元构成的环结构。建议使用c环的旋转运动来触发中心亚单元γ和ε的旋转，从而致使结合核苷酸的亚单元α和β发生连续构象变化，然后将ADP+Pi合成为ATP。

已经证明，F-ATP合酶对于耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌(Mt，其导致TB)的最佳生长而言至关重要。这在其他原核生物和真核生物(即人类)中是不同的，在这些原核生物和真核生物体内，该酶对于在可发酵碳源上的生长而言不是必要的，而糖酵解通量的增加可以补偿氧化磷酸化的损失。所述差异的原因在于，合成分枝杆菌细胞所需的ATP的量非常高。所述分枝杆菌F-ATP合酶的独特性还在于，其没有质子转位能力，以及其在快速或缓慢生长形式下的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性分别为低活性或潜在活性。

作为F₁F_O ATP合酶的抑制剂，BDQ在临床上的成功证实，该酶复合体是抗结核药物开发中的要害靶标。

此外，F-ATP合酶属于形成电子传递链的酶的组合(orchestra)(ETC；图1)，其中细胞色素c氧化酶(cyt-bc1-aa3)和细菌特异性细胞色素bd型甲基萘醌氧化酶(cyt-bd)就归属于所述酶的组合，并且F-ATP合酶有助于ATP的生成。开发了咪唑并吡啶酰胺(IPA)化合物Q203(其靶向cyt-bc1-aa3)，并强调了ETC酶作为药物靶标的重要作用。

更有利地，本发明化合物靶向耐药性MDR和XDR-TB中分枝杆菌F₁F_O-ATP合酶的可溶性F₁部分。此概念的依据在于发明人对将能量固定在分枝杆菌内部的自然范例的新颖见解、关键催化剂内部负责ATP合成的新药物靶标，以及新化合物的开发。此外，本发明的化合物被发现有助于在多种药物组合中与BDQ和Q203的协同功效，从而解决了MDR和XDR-TB的挑战。重要的是，发明人已经确定了F₁域中的新靶标，并基于它们的F-ATP合酶的可溶性F₁部分的结构和生化数据进行了计算机模拟化合物筛选，并随后鉴别了新的小分子抑制剂。在不受理论约束的前提下，据信，本发明化合物靶向F-ATP合酶的可溶性F₁部分，而BDQ在特定氨基酸残基处与c亚单位和ε亚单位相互作用，并且Q203靶向细胞色素c氧化酶cyt-bc1-aa3。因此，当与BDQ和/或Q203一起使用时，在存在本发明化合物的情况下，BDQ仍结合至F-ATP合酶的F_O部分和ε亚单位，并且Q203仍结合至细胞色素c氧化酶。

有利地，本发明的化合物与目前用于治疗结核病的任何化合物都不相似。

在多种实施方案中，R²是乙基并且R³是H。嘧啶环上存在双取代烷基胺部分例如化合物Br DE(表1)，以及R²上存在较大的取代基，将致使这两种抑制活性均下降(反映为相对较高的IC₅₀和MIC₅₀)。这样，当R²包含较长的碳链如C₅和更长时，观察到较弱的抑制活性。发明人发现，活性最高的化合物是当R²为甲基或乙基时的化合物。有利地，当R²为乙基且R³为H时，观察到良好的抑制活性。例如，将R²为乙基且R³为H的Cpd 6与R²为乙基且R³为乙基的化合物Br DE进行比较，Cpd 6可实现显著较低的IC₅₀和MIC₅₀值。因此，这表明嘧啶环上的二取代烷基胺部分致使这两种抑制活性均下降(反映为相对较高的IC₅₀和MIC₅₀)。

在多种实施方案中，X是N，并且Y和Z是C。

在多种实施方案中，R¹选自3-Br、3-F、3-OH、4-Me和4-OMe。

在多种实施方案中，R^1a选自5-Br、5-F和5-OH。

在多种实施方案中，R^1a是氢。

在多种实施方案中，R²选自-CH₂CH₂OH、-CH₂COOEt、甲基、乙基和异丙基。

在本发明的另一个方面中，提供了一种具有以下结构之一的化合物或者其药学上可接受的盐：

在本发明的另一个方面中，提供了一种组合物，所述组合物包含上述化合物和贝达喹啉或Q203或其组合。例如，BDQ与cpd 6类似物N-(4-((4-(乙基氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)苯基)-4-甲氧基苯甲酰胺(4OMe U Et)(图6A)或3-溴-N-(4-((4-(二乙基氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)苯基)苯甲酰胺(Br DE)(图6B)的组合致使牛分枝杆菌BCG中的全细胞ATP合成抑制增加。与不使用药物的对照(DF＝无药物)相比，当使用4OMe U Et或Br DE时，牛分枝杆菌BCG中的全细胞ATP合成抑制显著增加，如ATP合成的减少所证明(图6A和6B)。此外，12.5nm的BDQ、0.5nM的Q203以及12.5μM的cpd6的组合有效抑制了牛分枝杆菌BCG中的全细胞ATP合成。与不使用药物的对照相比，牛分枝杆菌BCG中的全细胞ATP合成抑制至少增加了两倍，如ATP合成减少至少两倍所证明。有利地，这些浓度低于单个化合物的IC₅₀值。

在本发明的另一方面中，上述化合物或上述组合物适用于治疗。

在本发明的另一个方面中，提供了上述化合物在制备用于治疗结核病的药物中的用途。

在本发明的另一个方面中，提供了上述组合物在制备用于治疗结核病的药物中的用途。

优选地，所述结核病是多药耐药性结核病或广泛耐药性结核病。

在本发明的另一个方面中，提供了上述化合物，其用于治疗结核病。

在本发明的另一个方面中，提供了上述组合物，其用于治疗结核病。

在本发明的另一个方面中，提供了一种用于治疗结核病的药盒，所述药盒包括上述化合物和BDQ或Q203或其组合。

在本发明的另一个方面中，提供了一种治疗患者的结核病的方法，其中所述方法包括向患者给药治疗有效量的上述化合物。

优选地，所述方法进一步包括添加BDQ和/或Q203。

在本发明的另一个方面中，提供了一种合成上述化合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在第一碱的存在下将第一化合物与第二化合物偶联。在多种实施方案中，所述第一化合物是氯杂环，并且所述第二化合物是N-(4-氨基苯基)苯甲酰胺或其衍生物。

在多种实施方案中，所述第一碱是叔胺。优选地，所述第一碱选自三乙胺、N,N-二乙基异丙基胺、Ν,Ν-二异丙基乙胺(DIPEA)、三丙胺和三辛胺。

优选地，所述方法进一步包括步骤(b)：通过在所述第一碱的存在下将胺或胺盐与2,4-二氯-6-甲基嘧啶混合以形成第一化合物来合成第一化合物。

优选地，所述方法进一步包括合成第二化合物的步骤(c)，并且其中步骤(c)包括将N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺或其衍生物氢化以形成N-(4-氨基苯基)苯甲酰胺或其衍生物。

优选地，步骤(c)进一步包括步骤(d)：在第二碱存在下，将草酰氯、4-硝基苯胺和催化量的二甲基甲酰胺添加到苯甲酸衍生物中以形成N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺或其衍生物。

在多种实施方案中，所述第二碱是碱金属盐，例如碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐或碱金属氢氧化物。优选地，所述第二碱选自碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠、氢氧化锂、氢氧化钾和氢氧化钠。

实施例

材料和方法

从耻垢分枝杆菌制备倒膜囊泡

选择耻垢分枝杆菌作为结核分枝杆菌的替代模型，因为使用它有很多优点。耻垢分枝杆菌是腐生性的，并且与结核分枝杆菌不同，它不是致病性的，可以在生物安全等级2(BSL2)的条件下安全地处理，而无生物安全等级3(BSL3)的要求。此外，耻垢分枝杆菌的生长速度(生成时间：约3小时)比结核分枝杆菌的生长(生成时间：约24小时)快得多。此外，结核分枝杆菌在琼脂平板上产生菌落需要几乎3至4周，而耻垢分枝杆菌在琼脂平板上产生菌落仅需要2至3天，从而减少了实验时间。重要的是，耻垢分枝杆菌IMV呈现出可检测到的ATP水解活性，这对于要使用或进行的酶测定而言至关重要。

为了纯化用于ATP合成和水解测定的耻垢分枝杆菌的IMV，将细胞在37℃下在补充有10％ADC、0.5％甘油和0.05％Tween80的7H9中生长过夜，直至OD₆₀₀值为0.4。将培养物在200ml补充7H9中扩增，并在滚瓶中(2rpm)生长直至OD₆₀₀＝0.4。此培养物用于接种5l培养物，所述培养物在滚瓶中生长过夜，直到OD₆₀₀＝0.4。将约5g(湿重)的耻垢分枝杆菌重悬于20ml膜制备缓冲液(50mM MOPS、2mM MgCl₂ pH 7.5)中，所述缓冲液中含有不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(1片置于20ml缓冲液中，Roche-USA)和1.2mg/ml溶菌酶。将悬浮液在室温下搅拌45分钟，并另外补充300μl 1M MgCl₂和50μl DNase I(Thermo Fischer，美国)，并在室温下继续再搅拌15分钟。所有后续步骤均在冰上进行。通过使用冰预冷的M-110L型微流化处理器(M-110L)在18,000psi下以三个通道对细胞进行破碎。将含有裂解细胞的悬浮液在4℃下于4200x g离心处理20分钟。将含有膜组分的上清液在4℃下以45000x g进一步超速离心处理1小时。弃去上清液，将沉淀的膜组分重悬在含有15％甘油的膜制备缓冲液中，等分、速冻并在-80℃下保存。通过BCA法确定囊泡中蛋白质的浓度。将倒置的膜囊泡在-80℃下储存。

ATP合成测定

在平底白色微量滴定96孔板(Corning USA)中测量ATP的合成。在含有10μM ADP、250μM Pi和1mM NADH的测定缓冲液(50mM MOPS，pH 7.5，10mM MgCl₂)中制得反应混合物。通过添加溶解在测定缓冲液中的100mM KH₂PO₄盐来调节Pi的浓度。通过添加耻垢分枝杆菌的倒囊泡至5μg/ml的最终蛋白浓度来开始ATP合成。将反应混合物在室温下孵育30分钟，然后添加50μl CellTiter-glow试剂，并将混合物在室温下于黑暗中再孵育10分钟。使用下列参数，通过Tecan板读数器Infinite 200Pro(Tecan USA)测量所产生的与合成ATP相关的发光：发光，积分时间500毫秒，无衰减。

抗分枝杆菌活性

针对耻垢分枝杆菌mc² 155、结核分枝杆菌H37Rv和牛分枝杆菌BCG筛选测试化合物和对照药物。在90％DMSO中将测试化合物的初始储备溶液制成10mM的浓度。使用环丙沙星(Ciprofloxacin)作为阳性对照，并且使用媒介物DMSO作为阴性对照。在第一种方法中，在固定浓度为50μM的微生物培养物上测试化合物。将上述每个菌株在补充有0.2％甘油和10％ADC(白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶(Albumin Dextrose Catalase))的Middlebrook 7H9液体培养基中于37℃下培养，直至达到对数生长(OD₆₀₀ 0.4-0.6)。通过在试管中将悬浮液相对于OD₆₀₀ 0.1稀释到最终体积为1ml来获得测试接种物，并将其在37℃下孵育24小时。选择与阳性和阴性对照相比无可见杆状菌生长的测试化合物作为命中物。

合成2-氯-嘧啶-4-胺(GP1)的一般操作

将2,4-二氯-6-甲基嘧啶(5.0g，30.7mmol)的相应胺或胺盐酸盐与2当量(eq)二异丙基乙胺在50℃下在乙醇中一起搅拌24小时。蒸发溶剂，并通过使用己烷:EtOAc＝8:2的柱色谱法来分离异构体。通过核奥弗豪泽效应谱(nuclear Overhauser effectspectroscopy，NOESY)来识别正确的异构体。

合成N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺(GP2)的一般操作

在催化量的二甲基甲酰胺的存在下，向在二氯甲烷(25ml)中的相应的苯甲酸(2g)中滴加草酰氯(1.5ml，1.2eq)。将混合物在室温(RT)下搅拌1小时，然后浓缩。将4-硝基苯胺(1当量)和K₂CO₃(2当量)添加至所得材料的THF(40ml)溶液中，并在室温搅拌16小时。过滤产物，用水和己烷洗涤。

氢化N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺(GP3)的一般操作

将相应的N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺(0.5-2g)与钯/碳(10重量％)的20ml乙酸乙酯溶液在50psi H₂下氢化，并在室温搅拌3小时。将烧瓶减压，将反应混合物通过硅藻土过滤，并将溶剂蒸发以获得产物。

合成N-(4-((4-氨基嘧啶-2-基)氨基)苯基)-苯甲酰胺(GP4)的一般操作

将相应的N-(4-氨基苯基)苯甲酰胺(200mg-2g)和含N,N-二异丙基乙胺(1当量)的氯杂环化合物(1当量)在二噁烷(4-20ml)中回流加热2-5天。过滤反应混合物中的沉淀物，得到产物。

化合物的表征

2,4-二氯-6-甲基嘧啶(PY1)

将6-甲基尿嘧啶(5g，39.65mmol)加入到磷酰氯(7当量，25ml)中，并将混合物回流加热3小时。将混合物倒在冰上，用氯仿萃取(3次，20ml)有机层，并用无水MgSO₄干燥有机层。蒸发溶剂，得到黄色晶体形式的二氯化物(3.77g，58％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.19(s,1H),2.55(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ171.8,162.4,160.4,119.5,23.8.。¹H NMR谱符合文献：Wang，H.，K.Wen，L.Wang，Y.Xiang，X.Xu，Y.Shen和Z.Sun(2012)，《分子》(Molecules)，2012，17(4)，4533-4544。

2,4-二氯-5-甲基嘧啶(PY2)

将6-甲基尿嘧啶(1g，7.93mmol)加入到磷酰氯(7当量，5ml)中，并将混合物回流加热3小时。将混合物倒在冰上，用氯仿萃取(3次，20ml)有机层，并用无水MgSO₄干燥所述有机层。蒸发溶剂，得到黄色晶体形式的二氯化物(0.62g，48％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.35(s,1H),2.39(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ162.5,160.0,158.2,129.1,15.8。¹H NMR谱符合文献：Wang，H.，K.Wen，L.Wang，Y.Xiang，X.Xu，Y.Shen和Z.Sun(2012)，《分子》(Molecules)，2012，17(4)，4533-4544。

(2-氯-5-甲基-嘧啶-4-基)-乙胺(PY3)

根据GP1，用乙胺盐酸盐(500mg，6.13mmol)和2,4-二氯-6-甲基嘧啶(1.0g，6.13mmol)制备产物。得到白色晶体形式的产物(575mg，56％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.80(s,1H),4.69(s,1H),3.56(qd,J＝7.2,5.5Hz,2H),2.00(s,3H),1.27(t,J＝7.3Hz,3H)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ162.2,158.8,154.6,111.7,36.1,14.7,13.0；MS(ESI⁺)172(³⁵Cl M⁺+H⁺,100),174(³⁷Cl M⁺+H⁺,37)；C₇H₁₁N₃Cl(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为172.0642；实测172.0638(-2.3PPM)；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 1244,1097,665；58-63℃。

2-氯-N-乙基-6-甲基-嘧啶-4-胺(PY4)

根据GP1，用乙胺盐酸盐(2.5g，30.67mmol)和2,4-二氯-6-甲基嘧啶(5.0g，30.67mmol)制备产物。获得黄色晶体形式的期望异构体(1.74g，33％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.07(s,1H),5.10(br,1H),3.33(br,2H),2.33(s,3H),1.30–1.21(m,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ166.7,162.2,160.2,99.3,42.4,23.9,12.6；MS(ESI⁺)m/z 172(35Cl M⁺+H⁺,100),174(³⁷Cl M⁺+H⁺,31)；C₇H₁₁N₃ ³⁵Cl(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为172.0642；实测172.0649(4.1PPM)；FTIR(nujol,cm-1)υ_max 3250,1600,968；mp:74℃ mp:74-75℃。

4-氯-N-乙基-6-甲基嘧啶-2-胺(PY5)

收率(0.74g，14％)

2-氯-N,N-二乙基-6-甲基嘧啶-4-胺(PY6)

根据GP1，用二乙胺(244mg，3.07mmol)和2,4-二氯-6-甲基嘧啶(500mg，3.07mmol)制备产物。获得黄色油状物形式的期望异构体(25mg，4％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.32(s,1H),3.57(q,4H),2.27(s,3H),1.16(t,J＝7.1Hz,6H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ168.9,161.0,160.7,107.2,41.8,24.,13.03(1.92)；MS(ESI⁺)m/z 200(³⁵Cl M⁺+H⁺,100),202(³⁷ClM⁺+H⁺,55)；C₉H₁₅N₃ ³⁵Cl(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为200.0955；实测200.0965(5.0PPM)；FTIR(纯，cm-1)υ_max 3427,1589,1047,445。

4-氯-N,N-二乙基-6-甲基嘧啶-2-胺(PY7)

收率65％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.11(s,1H),3.49(s,4H),2.32(s,3H),1.19(t,J＝7.1Hz,6H)。

(2-氯-6-甲基嘧啶-4-基)甘氨酸乙酯(PY8)

根据GP1，用甘氨酸乙酯盐酸盐(244mg，3.07mmol)和2,4-二氯-6-甲基嘧啶(500mg，3.07mmol)制备产物(己烷:EtOAc＝1:1)。通过X射线晶体学识别少量2-取代的异构体。获得黄色晶体形式的产物。得到无色晶体形式的期望异构体(338mg，48％)。¹H NMR(396MHz,CDCl₃)δ6.50(s,1H),5.59(br,1H),4.22(q,J＝7.1Hz,2H),4.18(d,J＝5.5Hz,1H),2.30(s,3H),1.28(t,J＝7.1Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ163.4,160.3,61.8,42.9,23.6,14.2；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 3250,1732,1622,543；mp:83-84℃。

(4-氯-6-甲基嘧啶-2-基)甘氨酸乙酯(PY9)

收率18％。¹H NMR(396MHz,CDCl₃)δ6.17(s,1H),5.42(s,1H),4.26(q,J＝7.1Hz,2H),4.16(s,2H),2.34(s,3H),1.31(t,J＝7.2Hz,3H)。

2-氯-N-异丙基-6-甲基嘧啶-4-胺(PY10)

根据GP1，用异丙胺(1.09g，1.58ml，18.40mmol)和2,4-二氯-嘧啶(3.0g，18.40mmol)制备产物。获得黄色油状物形式的期望异构体(1.81mg，53％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.05(s,1H),4.99(br,1H),3.92(br,1H),2.32(d,J＝7.0Hz,3H),1.24(t,J＝6.3Hz,6H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ163.2,160.3,43.1,23.7,22.5；MS(ESI⁺)m/z 186(³⁵ClM⁺+H⁺,100),188(³⁷Cl M⁺+H⁺,51)；C₈H₁₃N₃ ³⁵Cl(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为186.0798；实测186.0794(-2.1PPM)；FTIR(纯，cm^-1)υ_max 3263,1600,968。

4-氯-N-异丙基-6-甲基嘧啶-2-胺(PY11)

收率46％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.42(s,1H),5.06(s,1H),2.56(s,3H),2.30(s,3H),1.22(d,J＝6.4Hz,6H)；

2-((2-氯-6-甲基嘧啶-4-基)氨基)乙-1-醇(PY12)

根据GP1，用乙醇胺(374mg，6.13mmol)和2,4-二氯-6-甲基嘧啶(1.0g，6.13mmol)制备产物。得到白色晶体形式的期望异构体(311mg，27％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.16(s,1H),5.43(br,1H),3.87(dd,J＝9.9,4.9Hz,2H),3.58(br,2H),2.36(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ169.6,162.5,161.3,109.6,77.4,77.1,76.7,44.4,23.8；MS(ESI⁺)m/z188(³⁵Cl M⁺+H⁺,100),190(³⁷Cl M⁺+H⁺,30)；C₇H₁₀N₃ ³⁵ClO(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为188.0591；实测1588.0599(4.3PPM)；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 3251,1614,1041,765；mp:127-128℃。

2-((4-氯-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)乙-1-醇(PY13)

收率51％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.49(s,1H),5.59(s,1H),3.82(dd,J＝9.6,4.8Hz,2H),3.60(dd,J＝9.9,5.6Hz,2H),2.32(s,3H)。

2-氯-N,6-二甲基嘧啶-4-胺(PY14)

根据GP1，用甲胺(414mg，6.13mmol)和2,4-二氯-6-甲基嘧啶(1.0g，6.13mmol)制备产物。得到白色晶体形式的期望异构体(415mg，43％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.09(s,1H),5.05(br,1H),2.95(d,J＝5.0Hz,3H),2.35(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ168.1,165.0,159.8,98.4,28.5,23.9；MS(ESI⁺)m/z 158(³⁵Cl M⁺+H⁺,100),160(³⁷Cl M⁺+H⁺,34)；C₆H₉N₃ ³⁵Cl(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为158.0485；实测158.0483(-1.3PPM)；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 3257,1614,972,835；mp:134-135℃。

4-氯-N,6-二甲基嘧啶-2-胺(PY15)

收率30％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.45(s,1H),5.12(br,1H),3.03–2.97(m,3H),2.31(s,3H)；

2-氯-N-乙基嘧啶-4-胺(PY16)

根据GP1，用乙胺盐酸盐(414mg，5.08mmol)和2,4-二氯嘧啶(756mg，5.08mmol)制备产物。得到白色晶体形式的产物(332mg，63％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.00(s,1H),6.25(d,J＝6.0Hz,1H),5.50(br,1H),3.36(br,2H),1.25(t,J＝7.2Hz,3H)；¹³C NMR(100MHzCDCl₃)δ163.7,160.2,155.3,105.5,35.3,14.5；MS(ESI⁺)m/z 158(³⁵Cl M⁺+H⁺,100),160(³⁷Cl M⁺+H⁺,55)；C₆H₉N₃ ³⁵Cl(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为158.0485；实测158.0489(2.5PPM)；FTIR(纯，cm^-1)υ_max 3417,1660,149；mp:44-45℃。

4-氯-N-乙基嘧啶-2-胺(PY17)

收率17％(89mg)

3-溴-N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺(BA1)

根据GP2，用在二氯甲烷(25ml)中的3-溴苯甲酸(8.77g，43.63mmol)、4-硝基苯胺(6.0g，43.63mmol)和K₂CO₃(12.0g，2当量)制备产物。获得黄色固体形式的产物(13.74g，98％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.84(s,1H),8.24(d,J＝9.3Hz,2H),8.14(s,J＝1.8Hz,1H),8.02(d,J＝9.3Hz,2H),7.94(d,J＝7.9Hz,1H),7.81(d,J＝8.9Hz,1H),7.50(t,J＝7.9Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ165.6,147.6,142.5,137.7,134.9,131.1,127.7,125.2,122.1,120.8。FTIR(nujol,cm^-1)υ_max1685,1400,800,750,596；Mp:191-195℃。

N-(4-氨基苯基)-3-溴苯甲酰胺(BA2)

将3-溴-N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺(BA1)(2.5g，7.79mmol)在25ml的EtOAc中与硫毒化的铂碳(10重量％)在100℃、100psi H₂下氢化两天。通过硅藻土过滤反应混合物，并在减压下蒸发溶剂。获得灰色固体形式的产物(收率99％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.97(s,1H),8.10(s,1H),7.92(d,J＝7.8,0.9Hz,1H),7.75(d,1H),7.47(dd,J＝7.9Hz,1H),7.36(d,J＝8.7Hz,2H),6.61–6.43(m,2H),4.95(s,2H).13C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ163.5,145.9,138.0,134.3,131.0,130.5,128.2,127.1,122.7,122.1,114.1；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 1643,1262,821；MS(ESI⁺)m/z 291(⁷⁹Br M⁺+H⁺,100),293(⁸¹Br M⁺+H⁺,94)；C₁₃H₁₂ ⁷⁹BrN₂O(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为291.0133；实测291.0133(2.1PPM)；mp:145-146℃。

N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺(BA3)

根据GP2，由苯甲酰氯(1.1g，1.21ml，7.6mmol)和4-硝基苯胺(1.0g，7.2mmol)制备产物。获得黄色固体形式的产物(886mg，48％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.81(s,1H),8.28(d,J＝9.2Hz,2H),8.07(d,J＝9.3Hz,2H),7.98(d,J＝7.0Hz,2H),7.65(t,J＝7.3Hz,1H),7.57(t,J＝7.4Hz,2H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ166.8,146.2,142.9,134.8,132.6,129.0,128.4,125.3,120.3。¹H NMR谱符合文献：Panda，N.，R.Mothkuri和D.K.Nayak，《欧洲有机化学杂志》(European Journal of Organic Chemistry)，2014(8):1602-1605。

N-(4-氨基苯基)苯甲酰胺(BA4)

根据GP3，将N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺(BA3)(886mg)氢化。获得灰色固体形式的产物(765mg，99％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.87(s,1H),7.92(d,J＝7.0Hz,2H),7.62–7.44(m,3H),7.38(d,J＝8.7Hz,2H),6.56(d,J＝8.7Hz,2H),4.92(s,2H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ165.2,145.7,135.8,131.6,128.8(2C),128.6,127.9(2C),122.7(2C),114.2(2C)3。¹HNMR谱符合文献：Wang，J.，X.Yin，J.Wu，D.Wu和Y.Pan，《四面体》(Tetrahedron)，2013，69(48):10463-10469。

3-氟-N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺(BA5)

根据GP2，由3-氟苯甲酸(1.0g，7.14mmol)和对硝基苯胺(1.0g，7.2mmol)制备产物。获得黄色固体形式的产物(1.37g，69％)。¹H NMR(396MHz,DMSO-d₆)δ10.86(s,1H),8.24(d,J＝9.2Hz,2H),8.01(d,J＝9.3Hz,2H),7.85(d,J＝7.8Hz,1H),7.81(d,1H),7.60(td,J＝8.0,6.0Hz,1H),7.46(td,J＝8.4,2.2Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ165.88,163.65,161.19,148.33,146.28,142.40,138.07,131.08,125.28,124.73,120.87,119.23,119.02,115.41,115.18；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 1610,1344,1193,752；mp:175℃ mp:174-175℃。

N-(4-氨基苯基)-3-氟苯甲酰胺(BA6)

根据GP3，将3-氟-N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺(BA5)(857mg，3.29mmol)氢化。获得灰色固体形式的产物(754mg，99％)。¹H NMR(396MHz,DMSO-d₆)δ9.93(s,1H),7.78(d,J＝7.8Hz,1H),7.72(d,J＝9.9Hz,1H),7.55(td,J＝8.0,6.0Hz,1H),7.45–7.38(m,1H),7.36(d,J＝8.7Hz,2H),6.55(d,J＝8.8Hz,2H),4.95(s,2H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ163.74,163.71,163.68,161.25,145.95,138.21,138.15,131.01,130.93,128.28,124.16,124.13,122.81,118.61,118.40,115.96,114.86,114.64,114.18.FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 1847,1587,1519,1462,1377,1317,1244,1199,1097,1014,898,815,750,653,520,478；mp:113℃mp:112-114℃。

4-甲基-N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺(BA7)

根据GP2，由4-甲基苯甲酸(2g，14.69mmol)和对硝基苯胺(2.0g，14.49mmol)制备产物。获得黄色固体形式的产物(2.52g，67％)。¹H NMR(396MHz,DMSO-d₆)δ10.71(s,1H),8.26(d,J＝9.2Hz,2H),8.07(d,J＝9.3Hz,2H),7.90(d,J＝8.2Hz,2H),7.37(d,J＝8.1Hz,2H),2.40(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ166.5,146.1,142.9,131.8,129.5,128.5,125.3,120.3,21.5；MS(ESI⁺)m/z 257(M⁺+H⁺)；C₁₄H₁₃N₂O₃(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为257.0926；实测257.0945(7.4PPM)；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 1672,1336,1178,1109,848；mp:205℃。

N-(4-氨基苯基)-4-甲基苯甲酰胺(BA8)

根据GP3，将4-甲基-N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺(BA7)(2g，6.66mmol)氢化。获得黄色固体形式的产物(1.44g，98％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.77(s,1H),7.83(d,J＝8.1Hz,2H),7.36(d,J＝8.7Hz,2H),7.30(d,J＝8.0Hz,1H),6.54(d,J＝8.7Hz,1H),4.91(s,2H),2.37(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ164.9,145.6,141.4,132.8,129.3,128.6,127.9,122.7,114.1,21.5.；MS(ESI⁺)m/z 227(M⁺+H⁺)；C₁₄H₁₅N₂O(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为227.1184；实测227.1190(2.6PPM)；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 1639,1612,1327,833；mp:141-144℃。

4-甲氧基-N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺(BA9)

根据GP2，由4-甲氧基苯甲酸(2g，13.15mmol)和对硝基苯胺(1.81g，13.13mmol)制备产物。获得黄色固体形式的产物(2.76g，77％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.64(s,1H),8.25(d,J＝9.2Hz,1H),8.06(d,J＝9.2Hz,1H),7.99(d,J＝8.8Hz,1H),7.09(d,J＝8.9Hz,1H),3.85(s,3H).；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ166.0,162.9,146.3,142.7,130.5,126.9,126.6,125.3,120.2,114.3,112.9,56.0；MS(ESI⁺)m/z 273(M⁺+H⁺)；C₁₄H₁₃N₂O₄(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为273.0875；实测257.0905(11.0PPM)；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 1651,1184,848,455；mp:173-175℃。

N-(4-氨基苯基)-4-甲氧基苯甲酰胺(BA10)

根据GP3，将4-甲氧基-N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺(BA9)(1g，3.67mmol)氢化。获得灰色固体形式的产物(870mg，98％)。在EP 2 505 198A1中报道了BA10。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.71(s,1H),7.91(d,J＝8.7Hz,2H),7.35(d,J＝8.7Hz,2H),7.03(d,J＝8.8Hz,2H),6.53(d,J＝8.7Hz,2H),4.89(s,2H),3.83(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ164.6,162.0,145.5,129.7,128.7,127.9,122.8,114.1,113.9,55.9。

3-乙酰氧基苯甲酸(BA11)

将乙酸酐(10ml，105.79mmol)滴加到冷却的3-羟基苯甲酸(2g，14.48mmol)吡啶(20ml)溶液中，并将混合物在室温下搅拌过夜。将混合物冷却，倾倒在冰上，用***(50ml)萃取。获得无色固体形式的产物(2.29g，88％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.58(s,J＝4.1Hz,1H),7.83(d,J＝7.9Hz,2H),7.66(s,J＝2.0Hz,2H),7.55(t,J＝7.9Hz,2H),7.39(d,J＝6.7Hz,3H),2.29(s,J＝1.9Hz,6H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ169.7,167.0,151.0,132.7,130.3,127.1,126.9,123.1,21.34.。¹H NMR和¹³C NMR谱符合文献：Kesenheimer，C.，A.Kalogerakis，A.Meissner和U.Groth，《化学》(Chemistry)，2010，16(29):8805-8821。

3-((4-硝基苯基)氨基甲酰基)苯基乙酸酯(BA12)

根据GP2，由3-乙酰氧基苯甲酸(2.29g，12.71mmol)和4-硝基苯胺(1.75g，12.69mmol)制备产物。获得无色固体形式的产物(3.41g，90％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.86(s,1H),8.28(d,J＝9.3Hz,2H),8.07(d,J＝9.3Hz,2H),7.90(d,J＝7.9Hz,1H),7.75(s,1H),7.62(t,J＝7.9Hz,1H),7.42(d,J＝5.9Hz,1H),2.32(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ169.7,165.7,150.9,145.8,143.1,136.1,130.2,126.3,125.9,125.3,121.8,120.4,21.3；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 3562,1730,1674,752；mp:173℃。

3-((4-氨基苯基)氨基甲酰基)苯基乙酸酯(BA13)

根据GP3，将3-((4-硝基苯基)氨基甲酰基)苯基乙酸酯(BA12)(2g，6.66mmol)氢化。获得黄色固体形式的产物(1.44g，5.33mmol)，收率80％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.94(s,1H),7.85(d,J＝7.9Hz,1H),7.69(s,1H),7.55(t,J＝7.9Hz,1H),7.39(d,J＝8.7Hz,1H),7.33(d,J＝8.1Hz,1H),6.57(d,J＝8.7Hz,1H),4.93(s,2H),2.31(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ169.7,164.0,150.9,145.8,137.2,129.9,128.4,125.3,125.2,122.8,122.6,121.4,114.2,21.2,14.5.FTIR(nujol,cm^-1)υ_max1737,1651,823；mp:231-233℃.。

N-(4-氨基苯基)-3-羟基苯甲酰胺(BA14)

将3-((4-硝基苯基)氨基甲酰基)苯基乙酸酯(BA12)(635mg，2.35mmol)溶于30ml乙醇中，冷却至0℃。加入15ml 2M NaOH，然后搅拌溶液1小时，加入冰醋酸直至pH<7，蒸发溶剂，得到黄色固体形式的产物(491mg，92％)。¹H NMR(396MHz,DMSO-d₆)δ9.77(s,1H),9.67(s,1H),7.46–7.18(m,5H),6.93(d,J＝7.8Hz,1H),6.54(d,J＝6.9Hz,2H),4.92(s,1H)；¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ165.2,157.8,145.6,137.3,129.8,128.7,122.6,118.5,118.4,114.9,114.15。¹H NMR和¹³C NMR谱符合文献：Tran，A.T.，D.Wen，N.P.West，E.N.Baker，W.J.Britton和R.J.Payne，《有机与生物分子化学》(Org Biomol Chem)，2013 11(46):8113-8126。

3-溴-N-(4-((4-(乙基氨基)-5-甲基嘧啶-2-基)氨基)苯基)苯甲酰胺(Br T Et)

根据GP4，将N-(4-氨基苯基)-3-溴苯甲酰胺(BA2)(85mg，291μmol)与2-氯-N-乙基-5-甲基嘧啶-4-胺(50mg，291μmol)偶联。获得灰色固体形式的产物(82mg，66％))。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.41(s,1H),10.25(s,1H),8.40(s,1H),8.16(t,J＝1.7Hz,1H),7.98(d,J＝7.9Hz,1H),7.81(d,J＝8.9Hz,1H),7.69(s,1H),7.60–7.47(m,3H),3.55–3.44(m,1H),1.99(s,3H),1.20(t,J＝7.1Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ164.32,162.31,151.60,137.51,135.93,134.82,133.44,131.19,130.76,127.38,122.22,121.47,107.18,89.02,36.73,14.44,13.44；MS(ESI⁺)m/z 426(⁷⁹Br M⁺+H⁺,100),428(⁸¹Br M⁺+H⁺,94)；C₂₀H₂ ¹⁷⁹BrN₅O(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为426.0929，实测426.0922(-1.6PPM)；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 1666,1205,829,mp:>230℃。

3-溴-N-(4-((4-(二乙基氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)苯基)苯甲酰胺(Br DE)

根据GP4，将N-(4-氨基苯基)-3-溴苯甲酰胺(BA2)(644mg，2.21mmol)与2-氯-N,N-二乙基-6-甲基嘧啶-4-胺(PY6)(442mg，2.21mmol)偶联。得到黑色固体形式的产物(965mg，97％)；¹H NMR(396MHz,DMSO-d₆)δ9.97(s,1H),8.10(s,1H),7.92(d,J＝7.8Hz,1H),7.75(d,J＝8.0Hz,1H),7.47(t,J＝7.9Hz,1H),7.37(d,J＝8.7Hz,2H),6.59–6.51(m,3H),5.01(s,2H),3.60–3.47(m,J＝14.2,7.3Hz,4H),2.26(s,3H),1.10(t,J＝7.0Hz,6H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ170.0,163.5,160.8,160.4,145.9,138.0,134.3,131.0,130.5,128.3,127.1,122.7,122.1,114.1,107.6,100.0,41.8,24.2,13.3；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 3304,1645,1118,889,590；MS(ESI⁺)m/z 454(⁷⁹Br M⁺+H⁺,100),456(⁸¹Br M⁺+H⁺,88)；C₂₂H₂₅ ⁸¹BrN₅O(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为456.1222；实测456.1245(5.0PPM)；mp:97-101℃.。

3-溴-N-(4-((4-甲基-6-(甲基氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)苯甲酰胺(Br Me)

根据GP4，将N-(4-氨基苯基)-3-溴苯甲酰胺(BA2)(388mg，1.33mmol)与2-氯-N-甲基-6-甲基嘧啶-4-胺(210mg，1.33mmol)偶联。获得浅蓝色固体形式的产物(472mg，86％)。¹H NMR(396MHz,DMSO-d₆)δ10.42(s,1H),10.28(s,1H),8.96(s,1H),8.15(d,J＝1.5Hz,1H),7.97(d,J＝7.8Hz,1H),7.80(d,J＝7.9Hz,3H),7.59(d,J＝8.9Hz,2H),7.50(t,J＝7.9Hz,1H),6.04(s,1H),2.26(s,J＝25.6Hz,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ164.3,163.6,152.9,137.5,135.7,134.8,133.4,131.1,130.7,127.3,122.2,121.7,121.5,97.2,28.1,18.8；MS(ESI⁺)m/z 412(⁷⁹Br M⁺+H⁺,100),414(⁸¹Br M⁺+H⁺,74)；C₁₉H₁₉ ⁷⁹BrN₅O(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为412.0773；实测412.0786(3.2PPM)；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 3442,1658,1118,835；mp:301-303℃。

3-溴-N-(4-((2-(乙基氨基)-6-甲基嘧啶-4-基)氨基)苯基)苯甲酰胺(Br U Etiso)

根据GP4，将N-(4-氨基苯基)-3-溴苯甲酰胺(BA2)(300mg，1.03mmol)与4-氯-N-乙基-6-甲基嘧啶-2-胺(PY5)(177mg，1.03mmol)偶联。获得无色固体形式的产物(352mg，80％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.81(s,1H),10.45(s,1H),8.15(s,1H),7.97(d,J＝7.9Hz,1H),7.93–7.59(m,6H),7.50(t,J＝7.9Hz,1H),6.17(s,1H),2.28(s,3H),1.17(t,J＝7.1Hz,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ164.4,154.7,137.5,134.8,131.2,130.8,127.4,122.2,122.0,121.9,121.3,36.36,18.98,14.73；MS(ESI⁺)m/z 426(⁷⁹Br M⁺+H⁺,100),428(⁸¹Br M⁺+H⁺,88)；C₂₀H₁₁ ⁷⁹BrN₅O(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为426.0817；实测426.0838(4.9PPM)；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 3240,1666,842,524；mp:260-264℃。

3-溴-N-(4-((4-(乙基氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)苯基)苯甲酰胺(Cpd6)

根据GP4，将N-(4-氨基苯基)-3-溴苯甲酰胺(BA2)(300mg，1.03mmol)与2-氯-N-乙基-6-甲基嘧啶-4-胺(176mg，1.03mmol)偶联。获得浅灰色固体形式的产物(439mg，80％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.37(s,1H),10.28(s,1H),8.87(s,1H),8.14(d,J＝1.5Hz,1H),7.95(d,J＝7.8Hz,1H),7.83–7.70(m,J＝15.5,9.0Hz,3H),7.55(d,J＝8.9Hz,2H),7.46(t,J＝7.9Hz,1H),5.98(s,1H),3.46–3.30(m,2H),2.23(s,3H),1.15(t,J＝7.2Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ164.3,162.8,152.8,151.7,137.5,135.8,134.8,133.4,131.1,130.7,127.3,122.2,121.6,121.4,97.5,36.2,18.8,14.3；MS(ESI⁺)m/z 426(⁷⁹Br M⁺+H⁺,100),428(⁸¹Br M⁺+H⁺,85)；C₂₀H₂₁ ⁸¹BrN₅O(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为412.0909；实测412.0898(-2.6PPM)；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 1658,1116,869,599；mp:227℃。

商购CPD 6的参考波谱

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.36(s,1H),9.85(s,1H),8.34(s,1H),8.16(s,1H),7.98(d,J＝7.8Hz,1H),7.79(d,J＝8.4Hz,1H),7.74(d,J＝8.8Hz,2H),7.65(d,J＝8.8Hz,2H),7.50(t,J＝7.9Hz,1H),5.96(s,1H),2.22(s,3H),1.17(t,J＝7.2Hz,3H)。

(2-((4-(3-溴苯甲酰胺基)苯基)氨基)-6-甲基嘧啶-4-基)甘氨酸乙酯(Br Gly)

根据GP4，将N-(4-氨基苯基)-3-溴苯甲酰胺(BA2)(507mg，1.74mmol)与(2-氯-6-甲基嘧啶-4-基)甘氨酸乙酯(400mg，1.74mmol)偶联。获得浅灰色固体形式的产物(585mg，69％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.42(s,1H),10.02(s,1H),9.25(s,1H),8.15(s,1H),7.97(d,J＝7.8Hz,1H),7.86–7.76(m,J＝7.7,4.3,2.8Hz,3H),7.52(t,J＝7.9Hz,1H),7.48(d,J＝8.9Hz,2H),6.20(s,1H),4.18(s,J＝5.9Hz,2H),4.11(d,J＝7.1Hz,2H),2.32(s,3H),1.19(t,J＝7.1Hz,2H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ169.5,164.3,163.7,137.5,134.8,131.2,130.7,127.3,122.2,121.9,121.1,97.3,61.3,43.0,39.8,39.6,39.4,19.1,14.5；MS(ESI⁺)m/z 484(⁷⁹Br M⁺+H⁺,100),486(⁸¹Br M⁺+H⁺,94)；C₂₂H₂₃ ⁸¹BrN₅O₃(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为486.0964；实测486.0970(1.2PPM)；)；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 3331,1726,1668,642；mp:>230℃。

3-溴-N-(4-((4-((2-羟乙基)氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)苯基)苯甲酰胺(BrEt OH)

按照GP4，将N-(4-氨基苯基)-3-溴苯甲酰胺(BA2)(310mg，1.07mmol)与2-((2-氯-6-甲基嘧啶-4-基)氨基)乙-1-醇(PY12)(200mg，1.07mmol)偶联。获得浅蓝色固体形式的产物(86mg，18％)。H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.43(s,1H),10.25(s,1H),9.00(s,1H),8.16(s,1H),7.98(d,J＝8.0Hz,1H),7.80(d,J＝8.7Hz,3H),7.57(d,J＝8.3Hz,2H),7.50(t,J＝7.9Hz,1H),6.07(s,1H),4.93(s,1H),3.58(m,2H),3.48(m,2H),2.26(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ164.3,163.4,153.1,152.3,137.5,135.6,134.8,133.6,131.2,130.8,127.4,122.6,122.2,121.5,97.4,59.5,44.2,19.1；MS(ESI⁺)m/z(⁷⁹Br M⁺+H⁺,100),(⁸¹Br M⁺+H⁺,95)；C₂₀H₂₁BrN₅O₂(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为442.0879；实测442.0864(-3.4PPM)；mp:237-241℃。

3-溴-N-(4-((4-(异丙基氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)苯基)苯甲酰胺(Br iso)

根据GP4，将N-(4-氨基苯基)-3-溴苯甲酰胺(BA2)(300mg，1.03mmol)与2-氯-N-异丙基-6-甲基嘧啶-4-胺(PY10)(191mg，1.03mmol)偶联。得到黑色晶体形式的产物(240mg，53％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.40(s,1H),10.04(s,1H),8.75(s,1H),8.15(s,1H),7.97(d,J＝7.7Hz,1H),7.86–7.61(m,J＝7.1,4.9Hz,4H),7.68–7.35(m,J＝14.4,8.2Hz,4H),5.98(s,1H),4.14(s,1H),2.26(s,3H),1.20(d,J＝6.5Hz,6H)；MS(ESI⁺)m/z 440(⁷⁹BrM⁺+H⁺,100),442(⁸¹Br M⁺+H⁺,95)；C₂₁H₂₃ ⁷⁹BrN₅O(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为440.1086；实测440.1103(3.9PPM)；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 2320,1666,1573,1155,837,480；mp:183-185℃。

N-(4-((4-(乙基氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)苯基)苯甲酰胺(H U Et)

根据GP4，将N-(4-氨基苯基)苯甲酰胺(BA4)(300mg，1.41mmol)与2-氯-N-乙基-6-乙基-嘧啶-4-胺(243mg，1.41mmol)偶联。获得灰色固体形式的产物(204mg，42％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.38(s,1H),10.15(s,1H),8.91(s,1H),8.11(s,1H),7.93(d,J＝7.7Hz,1H),7.76(d,J＝8.0Hz,3H),7.53(d,J＝8.0Hz,2H),7.47(t,J＝7.9Hz,1H),5.97(s,1H),2.22(s,3H),1.13(t,J＝7.3Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ165.9,162.2,152.5,140.7,135.7,135.4,133.9,132.1,128.9,128.2,121.5,121.4,106.8,71.78,40.7,40.5,40.3,40.1,39.8,39.6,39.4,36.6,34.2,14.5,13.5；MS(ESI⁺)m/z 348(M⁺+H⁺)；C₂₀H₂₂N₅O(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为348.1824；实测348.1841(4.9PPM)；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 1658,1579,1255,835,476；mp:225-226℃。

N-(4-((4-(乙基氨基)-5-甲基嘧啶-2-基)氨基)苯基)苯甲酰胺(H T Et)

根据GP4，将N-(4-氨基苯基)苯甲酰胺(BA4)(74mg，350μmol)与2-氯-N-乙基-5-甲基嘧啶-4-胺(60mg，350μmol)偶联。获得无色固体形式的产物(78mg，64％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.31(s,1H),10.23(s,1H),8.33(s,1H),7.97(d,J＝6.9Hz,2H),7.81(d,J＝5.6Hz,2H),7.68(s,1H),7.63–7.56(m,1H),7.54(d,J＝7.7Hz,4H),3.58–3.36(q,J＝7.0Hz,2H),1.98(s,3H),1.20(t,J＝7.0Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ165.9,162.9,152.8,151.9,136.2,135.4,133.2,132.1,128.9,128.2,121.8,121.4,97.3,36.3,18.8,14.4；MS(ESI⁺)m/z 348(M⁺+H⁺)；C₂₀H₂₂N₅O(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为348.1824；实测348.1822(-0.6PPM)；mp>230℃。

N-(4-((4-(乙基氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)苯基)-3-氟苯甲酰胺(F U Et)

根据GP4，将N-(4-氨基苯基)-3-氟苯甲酰胺(BA6)(300mg，1.30mmol)与2-氯-N-乙基-6-甲基嘧啶-4-胺(223mg，1.30mmol)偶联。获得无色固体形式的产物(272mg，68％)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.41(s,1H),10.28(s,1H),9.02(s,1H),7.88–7.75(m,4H),7.68–7.49(m,3H),7.45(t,J＝7.3Hz,1H),6.03(s,1H),3.50–3.39(m,2H),2.27(s,3H),1.18(t,J＝7.2Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ164.5(d,J＝2.0Hz),162.5(d,J＝244.3Hz),,152.8,151.9,137.7(d,J＝6.7Hz),133.4,131.1(d,J＝8.0Hz),124.4,121.7,121.5,119.0(d,J＝20.7Hz),115.0(d,J＝22.8Hz).,97.2,36.2,18.8,14.3；MS(ESI⁺)m/z 366(M⁺+H⁺)；C₂₀H₂₁FN₅O(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为366.1730；实测366.1734(3.6PPM)；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max1660,1631,1236,1199,839；mp:259-263℃。

N-(4-((4-(乙基氨基)-5-甲基嘧啶-2-基)氨基)苯基)-3-氟苯甲酰胺(F T Et)

根据GP4，将N-(4-氨基苯基)-3-氟苯甲酰胺(BA6)(70mg，304μmol)与2-氯-N-乙基-5-甲基嘧啶-4-胺(52mg，304μmol)偶联。获得无色固体形式的产物(272mg，68％)。

获得无色固体形式的产物(45mg，41％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.27(s,1H),9.94(s,1H),7.96–7.47(m,5H),7.37(d,J＝8.7Hz,2H),6.57(d,J＝8.8Hz,2H),6.22(s,1H),5.40(s,1H),2.16(s,3H),1.09(t,J＝7.2Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ164.47,163.0,162.5(d,J＝244.4Hz),153.0,137.7,135.7,133.6,131.1(d,J＝8.3Hz124.4,122.2,121.6,121.5,118.9(d,J＝20.7Hz),115.0(d,J＝22.9Hz),97.2,,36.3,19.0,14.4；MS(ESI⁺)m/z 366(M⁺+H⁺)；C₂₀H₂₁FN₅O(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为366.1730；实测366.1754(6.6PPM)；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 13543,1660,1595,1265；mp>230℃。

N-(4-((4-(乙基氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)苯基)-3-羟基苯甲酰胺(3OH UEt)

根据GP4，将N-(4-氨基苯基)-3-羟基苯甲酰胺(BA14)(250mg，1.10mmol)与2-氯-N-甲基-6-乙基嘧啶-4-胺(187mg，1.10mmol)偶联。获得无色固体形式的产物(272mg，68％)。¹H NMR(396MHz,DMSO-d₆)δ10.22(s,2H),9.79(s,1H),8.99(s,1H),7.80(d,J＝8.8Hz,2H),7.53(d,J＝8.8Hz,2H),7.38(d,J＝7.8Hz,1H),7.35–7.26(m,J＝10.2,5.5Hz,2H),6.98(d,J＝6.2Hz,1H),6.01(s,1H),2.26(s,3H),1.17(t,J＝7.3Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ165.9,162.8,157.9,152.8,151.9,136.8,136.2,133.0,129.9,121.7,121.3,119.0,118.6,115.0,97.2,45.9,36.2,18.8,14.3,8.9；MS(ESI⁺)m/z 364(M⁺+H⁺)；C₂₀H₂₃N₅O₂(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为364.1174；实测364.1768(-1.6PPM)；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 1666,1531,1323,835,478；mp:283-285℃。

N-(4-((4-(乙基氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)苯基)-4-甲基苯甲酰胺(4Me UEt)

根据GP4，将N-(4-氨基苯基)-4-甲基苯甲酰胺(BA8)(250mg，1.10mmol)与2-氯-N-乙基-6-甲基嘧啶-4-胺(187mg，1.10mmol)偶联。获得无色固体形式的产物(272mg，68％)。¹H NMR(396MHz,DMSO-d₆)δ10.27(s,J＝14.1Hz,1H),10.23(s,1H),9.02(s,1H),7.89(d,J＝7.8Hz,2H),7.81(d,J＝8.6Hz,2H),7.54(d,J＝8.6Hz,2H),7.33(d,J＝7.9Hz,2H),6.02(s,1H),3.48–3.38(m,2H),2.39(s,3H),2.26(s,3H),1.17(t,J＝7.1Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ165.7,162.8,152.8,142.0,136.2,133.0,132.4,129.4,128.2,121.7,121.3,97.2,40.69,36.24,21.54,18.84,14.38；MS(ESI⁺)m/z 362(M⁺+H⁺)；C₂₁H₂₄N₅O(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为362.1981；实测362.1971(-2.8PPM)；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 3446,1662,1573,840,744；mp:297-300℃。

N-(4-((4-(乙基氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)苯基)-4-甲氧基苯甲酰胺(4OMeU Et)

根据GP4，将N-(4-氨基苯基)-4-甲氧基苯甲酰胺(BA10)(250mg，1.10mmol)与2-氯-N-甲基-6-乙基嘧啶-4-胺(187mg，1.10mmol)偶联。获得无色固体形式的产物(472mg，86％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.27(s,1H),10.17(s,1H),9.01(s,1H),8.08–7.91(m,2H),7.80(d,J＝8.4Hz,2H),7.54(d,J＝8.3Hz,2H),7.06(d,J＝7.7Hz,2H),6.02(s,1H),3.84(s,3H),2.26(s,J＝12.9Hz,3H),1.17(t,J＝7.6Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ165.27,162.89,162.42,152.91,151.96,136.35,132.98,130.11,127.38,121.71,121.36,114.13,100.41,97.21,45.91,36.23,23.77,14.39,8.98；MS(ESI⁺)m/z 378(M⁺+H⁺)；C₂₁H₂₄N₅O₂(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为378.1930；实测378.1941(2.9PPM)；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max3429,1633,1024,835；mp:285-288℃。

3-溴-N-(4-((4-(乙基氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)苯甲酰胺(Br desMe)

根据GP4，将N-(4-氨基苯基)-3-溴苯甲酰胺(BA2)(300mg，1.03mmol)与2-氯嘧啶-4-胺(162mg，1.03mmol)偶联。获得浅棕色固体形式的产物(306mg，72％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.07(s,1H),10.74(s,1H),10.48(s,1H),9.25(s,1H),8.17(s,1H),7.99(d,J＝7.7Hz,1H),7.90–7.69(m,J＝13.2,8.9Hz,4H),7.68–7.39(m,J＝15.7,11.6Hz,3H),6.23(d,J＝7.2Hz,1H),3.46–3.39(m,J＝6.9Hz,2H),1.18(t,J＝7.2Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ164.35,152.43,141.68,137.50,134.83,131.20,130.77,127.40,122.22,121.49,99.06,74.55,40.68,36.22,14.25；MS(ESI⁺)m/z 412(⁷⁹Br M⁺+H⁺,100),414(⁸¹Br M⁺+H⁺,95)；C₁₉H₂₀ ⁷⁹BrN₅O(M⁺+H⁺)的HRMS计算值为412.0773；实测412.0775(0.5PPM)；FTIR(nujol,cm^-1)υ_max 3417,1670,831；mp:229-231℃。

最小抑制浓度测定

使用液体培养基微量稀释法来确定测试化合物的最小抑制浓度(MIC)。使用7H9液体培养基来制备此化合物的两倍连续稀释液。每个浓度以三份试样进行测定。将耻垢分枝杆菌mc² 155(200μl)的稀释测试接种物添加到微孔板的所有孔中，并在37℃下孵育24小时。板中培养物的最终OD通过Tecan Infinite 200PRO板读数器测量。

在试管中用200-0.1μM的两倍连续稀释液对结核分枝杆菌H37Rv和牛分枝杆菌BCG的药物进行MIC测定。将稀释的测试接种物(1ml)添加到试管中，并在定轨振荡器上于37℃孵育5-8天。板中培养物的最终OD通过Tecan Infinite 200PRO板读数器测量。MIC₅₀定义为与无药培养基中的生长相比抑制50％细菌生长的药物浓度。

本发明提供了抑制F₁F_O-ATP合酶的化合物，以及所述化合物与或不与贝达喹啉(BDQ)或Q203一起在用于治疗MDR-TB和XDR-TB的多药方案中的用途。

基于酵母F-ATP合酶的同源性模型以及来自我们实验室的新型分枝杆菌亚单位γ延伸的结构信息(Priya,R.等人，“Solution structure of subunit gamma(gamma(1-204))of the M.tuberculosis F-ATP synthase and the unique loop of gamma(165-178),representing a novel TB drug target”，J.Bioenerg.Biomembr.,第45期第121-129页(2013))，生成了同源性模型。基于此模型，我们实际上对接了150万种化合物。通过测试了81种得分最高的化合物的生长抑制作用，化合物6(cpd 6)以11μM的MIC₅₀抑制耻垢分枝杆菌的生长(表1、图2A)，cpd 6以约300nM的IC₅₀值阻断ATP合成(图2B)并且以与已知牛分枝杆菌BCG的三磷酸腺苷酶(ATPase)抑制剂生长相当的方式，以17μM的MIC₅₀抑制ATP水解活性(图2D)，并且以33μM的MIC₅₀抑制结核分枝杆菌H37Rv的ATP水解活性(图2C)。这些数据证实，cpd 6影响分枝杆菌的中央生物能源转换器F-ATP合酶的活性。随后，在F-ATP合酶的对接化合物的模型引导下，合成一系列cpd 6的类似物。

所述cpd 6的类似物具有以下一般结构：

其中

R¹＝3-Br、3-F、3-OH、4-Me、4-OMe、H；

R²＝-CH₂CH₂OH、-CH₂COOEt、Me、Et、i-Pr；并且

R³＝H并且R⁴＝Me。

或者，所述类似物可以是cpd 6的尿嘧啶异构体(N位置不同)，其一般结构如下：

其中R¹＝H、卤素、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、OH；

R²＝H、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷基醇、C₁-C₄烷氧基、-CH₂COOEt；

R³＝H、Et；

R⁴＝H、卤素、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基；

X、Y和Z独立地为C或N。

表1：新合成的分子及其对ATP合成(IC₅₀)和细菌生长(MIC₅₀)的影响

所识别出的新化合物cpd 6以约300nM的IC₅₀值阻断了耻垢分枝杆菌倒膜囊泡(IMV)的ATP合成，这与最近报道的使用草分枝杆菌(M.phlei)的IMV的药物BDQ相当(20-25nM，[1])。此外，cpd 6还以与已知的ATPase抑制剂槲皮素NBD-Cl相当的方式，甚至比F-ATP合酶抑制剂依拉肽汀(efrapeptine)更好(图3A)的方式抑制ATP水解活性。ATP合成和ATP水解被cpd 6抑制的双重作用表明，与主要与疏水性和膜嵌入的c亚单位相互作用的亲脂性BDQ相比，cpd 6与酶的可溶性F₁部分相互作用，以便生成更易溶的化合物。

更进一步的主要步骤是，与BDQ(图3B)和Q203一起孵育时，cpd6呈现出累加效应。cpd 6和BDQ(图3C和3D)或Q203(图3E)的累加效应与ATP合成的显著减少同时出现。用BDQ和Q203对cpd 6进行耗氧率研究表明，在浓度约为500nM BDQ和cpd 6约400μM的浓度下，细胞外耗氧受到抑制。但是，当组合使用时，仅需50nm的BDQ和40μM的cpd 6即可达到相似的抑制效果。对于cpd 6和Q203的组合，观察到相似的累加效应，从而实现了通过100nM Q203和40μM cpd 6的完全抑制。这为高效多药组合开辟了一条新途径。

cpd 6针对代表性人类微生物组的***金黄色葡萄球菌和代表性革兰氏阴性细菌的筛查证实了cpd 6对结核病的特异性以及此化合物不会影响人类微生物组(图4)。这与此化合物具有很好的小鼠肝微粒体稳定性相符，T_1/2值为47.5分钟，Cl_int值为14.6μl/min/mg蛋白，T_1/2w/o NADPH值为68.0分钟。

最后，测试了cpd 6与BDQ和Q203在多药组合中的协同作用。

化合物的体内测试

根据Negatu等人(2017)，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，doi:10.1128/AAC.01571-17的描述进行所有体内实验。

动物和道德保证。小鼠研究是根据“美国国立卫生研究院实验动物照护及使用指南”进行的，并得到了新泽西州医学院(纽瓦克)的实验动物照护及使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee of the New Jersey MedicalSchool,Newark)(CD-1小鼠)、新加坡国立大学实验动物照护及使用委员会(NationalUniversity of Singapore’s Institutional Animal Care and Use Committee)(BALB/c小鼠)的批准。所有动物均保持在无特定病原体的条件下，随意喂食水和食物，并尽一切努力使痛苦或不适降至最低。结核分枝杆菌感染动物的研究在被批准节制结核分枝杆菌的3级生物安全设施中进行。

药代动力学(PK)分析。在以5mg/kg的剂量通过静脉(i.v.)途径并且以100mg/kg的剂量通过口服途径(p.o.)给药单次剂量化合物(例如Cpd 6及其类似物)或其组合物之后，在未感染CD-1小鼠中进行PK研究，如Lakshminarayan,S.B.,Huat,T.B.,Ho,P.C.,Manjunatha,U.H.,Dartois,V,Dick,T.Rao,S.P.S.(2015)，“Comprehensivephysicochemical,pharmacokinetic and activity profiling of anti-TB agents”，J.Antimicrob.Chemoth.，第70期，第857–867页中所述。静脉(i.v.)制剂可以是例如5％二甲基乙酰胺(DMA)/95％的4％克列莫佛(Cremophor)溶液。口服途径(p.o.)制剂可以是50％PEG400(聚乙二醇)/50％D5W(5％葡萄糖无菌水溶液)生成溶液，或0.5％CMC(羧甲基纤维素)和0.5％Tween 80在水中生成悬浮液。在静脉给药途径中，在有K₂EDTA涂层的试管中在给药之前，以及在给药后1分钟、15分钟、1小时、3小时、5小时、8小时和24小时收集血液。在口服途径(p.o.)中，在给药之前，以及在给药后15分钟、30分钟、1小时、3小时、5小时、8小时和24小时收集血液。通过以5000rpm离心处理10分钟获得血浆，并在-80℃下保存直至进行分析。药物浓度(包括化合物或其组合物的浓度)的测定如下所述。使用Microsoft Excel(Office 2010，微软公司，华盛顿州雷德蒙德)，以平均浓度来计算PK参数(曲线下的面积[AUC_0–t和AUC_0–24]、峰值血浆浓度[C_max]和半衰期[t_1/2])。使用线性梯形法则计算AUC。使用半对数浓度相对于时间数据的线性回归计算半衰期和消除速率常数。

分析方法。首先将纯净的1mg/ml DMSO药物储备溶液在50/50乙腈/水中连续稀释，然后在无药物的CD1小鼠血浆(K₂EDTA，Bioreclamation IVT，NY)中连续稀释，以创建标准曲线和质量控制(QC)掺加溶液。通过添加200μl含有内标(10ng/ml维拉帕米(Verapamil))的乙腈/甲醇50/50蛋白沉淀溶剂来萃取二十(20)μl标准品、QC样品、对照血浆和研究样品。将萃取物涡旋5分钟，然后以4000RPM离心处理5分钟。将一百(100)μl上清液转移至用于与串联质谱分析(LC/MS-MS)耦合的高压液相色谱中，并用100μl Milli-Q去离子水稀释。

在与Shimadzu 30ACMP HPLC系统耦合的AB Sciex Qtrap 6500+三重四极杆质谱仪上进行药物的LC/MS-MS定量分析，并在Agilent Zorbax SB-C8色谱柱(2.1x30 mm；粒径3.5μm)上使用反相梯度洗脱进行色谱分离。将含0.1％甲酸的Milli-Q去离子水用于含水流动相，将0.1％甲酸乙腈溶液用于有机流动相。使用在电喷雾正电离模式下对母体/子体转变的多反应监测对所有分子进行定量。如果质控样品和标准品的浓度在标称浓度的20％以内，则接受样品分析。使用Analyst软件(版本1.6.2；Applied Biosystems Sciex)进行数据处理。

动物耐受性和功效实验。在新加坡国立大学(National University ofSingapore)生物安全3级核心设施中，在无特定病原体的条件下，将8至10周龄的雌性BALB/c小鼠分为3组或4组，分别置于单独通风的笼子中。随意提供食物和水。可以在等体积的聚乙二醇400和5％葡萄糖中配制测试药物，然后通过200μl容积的经口管饲以100mg/kg的剂量给药。通过连续3天给3只小鼠给药，然后监测7天，评估急性毒性。随后用CO₂对动物实施无痛致死来评估总体病理变化。为了确定候选药物的体内功效，使用全身吸入暴露系统(GlasCol)将小鼠感染100-200CFU结核分枝杆菌H37Rv。14天后，每周6天开始化疗，持续4周。使用以0.25％甲基纤维素配制的剂量为25mg/kg的异烟肼(INH)作为对照。在指定时间点用CO₂对小鼠实施无痛致死。通过将器官匀浆的连续稀释液平板接种到补充了20μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml环己酰亚胺的Middlebrook 7H11琼脂上，来确定器官的细菌负担。在37℃孵育3-4周后对菌落计数。

所属领域中的技术人员应进一步认识到，上述特征的变化和组合并不是替代或取代，而是可以组合以形成落在本发明预期范围内的其他实施方案。