阅读说明：本技术 程序性死亡配体1的肠表达 (The intestines of programmed death ligand 1 are expressed ) 是由 S·M·道芬内 C·D·A·麦卡锡 J·杜鲍尔-驰寇内 E·许 G·驰克 A·张 于 2017-11-09 设计创作，主要内容包括：本文提供了用于改善炎性病症的方法和组合物,所述方法和组合物包括程序性死亡配体1的肠表达。(There is provided herein the method and composition for improving inflammatory conditions, the method and composition include the intestines expression of programmed death ligand 1.)

程序性死亡配体1的肠表达

发明领域

本公开涉及采用PD-L1的基因表达来改善炎性病症的方法和组合物。

发明背景

一般来讲免疫活化，具体地讲T细胞活化状态受到由T细胞上的共刺激分子(例如CD28、ICOS、OX40等)和共抑制分子(例如CTLA-4、程序性死亡蛋白-1(“PD-1”)等)的宿主介导的复杂的重叠调节机制的影响。程序性死亡配体-1(“PD-L1”，也称为B7H1)由树突状细胞和其他抗原递呈细胞组成型地表达，并且通过与PD-1的相互作用似乎介导T细胞下调。Patsoukis等人,Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulatemolecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation,Sci.Signal 5:ra46(2012)。

然而遗憾的是，人们对PD-L1与CD80的相互作用的影响尚不太清楚，对这两种途径之间的相互作用也不太清楚。在一些情形下，通过可溶性PD-L1阻断PD-1可有效增强T细胞反应，并增强移植物抗宿主病(“GvHD”)。Blazar等人,Blockade of Programmed Death-1Engagement Accelerates Graft-Versus-Host Lethality by an IFN-γ-DependentMechanism J.Immunol.171:1272-77(2003)。相反地，其他研究人员能够用可溶形式的PD-L1改善GvHD，但仅仅是在PD-L1敲除背景中才能如此。Deng等人B7H1/CD80InteractionAugments PD-1 Dependent T Cell Apoptosis and Ameliorates Graft-versus-HostDisease,J.Immunol.194:560-74(2105)。此外，外周树突状细胞对T细胞反应的作用似乎比以前认为的更复杂。例如，虽然未成熟的外周树突状细胞通常不引发T细胞分化，但已观察到在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型中树突状细胞群浸润中枢神经系统(CNS)并促进表位扩散。Spagnuolo等人,Involvement of Immune Regulation in MultipleSclerosis,Immunology and Immunogenetics Insights 9:1-10。

因此，本领域明确需要更好地理解PD-L1在免疫保护性环境中在T细胞活化中的作用，以更好地利用PD-L1在炎性病症中的治疗潜力。

发明内容

本发明通过在免疫保护性环境中成功地采用PD-L1多肽(包括可溶性PD-L1多肽)的局部肠表达解决了现有技术中的上述科学不确定性，用于治疗多种炎性病症，包括例如炎性肠病(例如溃疡性结肠炎、克罗恩病等等)以及由器官或骨髓移植诱导的移植物抗宿主病(GvHD)。因此，在一个方面，本发明提供了一种治疗有需要的患者的炎性病症的方法，所述方法包括向所述患者的肠道施用包含PD-L1核酸的表达载体。

在一个实施方案中，PD-L1多肽是膜结合的PD-L1多肽。在优选的实施方案中，PD-L1多肽是人PD-L1或其剪接变体。在一个这样的实施方案中，PD-L1核酸编码PD-L1多肽，所述PD-L1多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

在另选的实施方案中，PD-L1多肽是可溶性PD-L1多肽，例如包含PD-L1(且优选地人PD-L1)的信号序列、IgV结构域和IgC结构域(即SEQ ID NO:1的氨基酸1-239)。在一些实施方案中，可溶性PD-L1多肽可缺少全部或部分信号序列(例如，其可包含SEQ ID NO:1的氨基酸19-238)。

在一些实施方案中，PD-L1核酸通过胶囊包封在核酸递送媒介物中的表达载体来递送。优选的核酸递送媒介物包括脱乙酰壳多糖或脱乙酰壳多糖衍生物纳米颗粒。在一个这样的实施方案中，脱乙酰壳多糖衍生物纳米颗粒包含与精氨酸和/或葡糖酸偶联的脱乙酰壳多糖。在另一个这样的实施方案中，脱乙酰壳多糖衍生物纳米颗粒包含与精氨酸和亲水性多元醇偶联的脱乙酰壳多糖。在一个实施方案中，亲水性多元醇是葡萄糖。

在另一方面，本发明提供了包含PD-L1核酸的表达载体以治疗有需要的患者的炎性病症，其中所述表达载体被施用至所述受试者的肠。在一些实施方案中，PD-L1核酸包含SEQ ID NO:2。优选地，PD-L1核酸包含在SEQ ID NO:2中的至少一个同义突变。更优选地，PD-L1核酸包含多个这样的突变以帮助分化并任选地改善表达。在示例性实施方案中，PD-L1核酸包含SEQ ID NO:3。

在一些实施方案中，PD-L1核酸还包含异源序列。异源序列可包含Fc结构域、蛋白标签、缀合的治疗剂或它们的组合。在一个实施方案中，PD-L1多肽的N端区与人IgG1 Fc区或其部分融合。PD-L1多肽可以通过(GGGGS)n(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列与人IgG1 Fc区或其部分融合。在一些实施方案中，IgG1 Fc是通过改变Fc结构域中的以下氨基酸中的一个或多个而突变以降低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDCC)：E233P、L234V、L235A、G236缺失、A327G、A330S和P331S。在示例性实施方案中，PD-L1核酸包含SEQID NO:4。

可通过本发明得到有利治疗的炎性病症包括慢性疾患和急性疾患，包括与感染相关的炎症(例如败血性休克、败血症或全身性炎症反应综合征(SIRS))、缺血-再灌注损伤、内毒素致死、炎性肠病、克罗恩病、结肠炎、或由细胞因子(例如TNF或IL-1)过量产生引起的疾患以及GvHD。

以引用的方式并入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请以引用方式并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出以引用方式并入。

附图说明

参考附图公开了本公开，在附图中：

图1：pVax-hPD-L1载体(SEQ ID NO:6)。编码膜结合的人PD-L1多肽的载体的质粒序列，优化的人PD-L1 cDNA被突出显示。

图2：pVax-hPD-L1 Fc载体(SEQ ID NO:7)。编码可溶性人PD-L1 Fc多肽的载体的质粒序列，优化的人PD-L1 cDNA被突出显示。

图3A：人PD-L1质粒和体外表达。(A)克隆在pVax骨架中的优化的hPD-L1 DNA序列的质粒图谱，该序列含有质粒复制起点(pUC ori；)，该质粒复制起点受人巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV；)的控制且具有卡那霉素抗性基因。

图3B：体外PD-L1和PD-L1-Fc表达：使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用1μg或2.5μg的Fc对照(白色)、PD-L1-Fc(黑色)或PD-L1(灰色)质粒DNA转染HEK293T细胞。转染后48h定量细胞培养上清液或细胞裂解液中的PD-L1蛋白含量。

图4：来自聚合复合物转染的PD-L1-Fc的体外表达。(A-B)如所指出的那样，用含有增加浓度的pVAX-opt-hPD-L1-Fc DNA的PD-L1-Fc聚合复合物转染HEK-293T。(A)在转染后48小时收集上清液，并通过ELISA测定hPD-L1-Fc蛋白。将数据标准化为细胞总蛋白。(B)EC50和最大蛋白表达的表。

图5：体外产生的Fc融合的构建体的纯化和表达。(A)通过考马斯凝胶染色确认的蛋白表达：使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，用Fc对照或PD-L1-Fc质粒DNA转染HEK293T细胞。转染后24h将细胞培养基更换为无血清培养基。转染后72h收集细胞培养上清液，并使用Protein G HiTrap柱(GE)纯化Fc融合蛋白。使用PD-10脱盐柱(GE)将缓冲液更换为PBS，并以四个相等的级分(洗脱液1-4)洗脱蛋白质。(B)使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，用Fc对照或PD-L1-Fc质粒DNA转染HEK293T细胞。转染后24h将细胞培养基更换为无血清培养基。转染后72h收集细胞培养上清液，并使用Protein G HiTrap柱(GE)纯化Fc融合蛋白。使用PD-10脱盐柱(GE)将缓冲液更换为PBS，并以四个相等的级分(F1-4)洗脱蛋白质。通过ELISA测定PD-L1蛋白浓度。(C)在6孔板中使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用野生型PD-L1质粒DNA或对照(pVax)转染NIH/3T3细胞。洗涤细胞并将细胞在转染后24h重新接种在96孔平底板中。在第二天(第2天)和随后的3天，通过流式细胞术分析细胞表面上的PD-L1表达。(D)在6孔板中使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用野生型PD-L1质粒DNA或对照(pVax)转染NIH/3T3细胞。洗涤细胞并将细胞在转染后24h重新接种在96孔平底板中。在第二天(第2天)和随后的3天，通过流式细胞术分析细胞表面上的PD-L1表达水平。

图6：以剂量依赖性方式通过人PD-1受体表达PD-L1-Fc信号。将细胞用PD-L1-Fc转染并从细胞培养上清液中纯化。(A)用增加浓度的PD-L1-Fc(40min)刺激PathHunter PD-1信号传导测定细胞，并通过发光(RLU；相对发光单位)测量信号活化。(B)用含和不含抗PD-1(低：0.1μg/mL；高：1.0μg/mL)的重组IgG1-Fc或PD-L1-Fc(50μg/mL，40min)孵育PathHunterPD-1信号传导测定细胞，并通过发光(RLU；相对发光单位)测量信号活化。一式三份测定细胞活化，并将数据表示为相对于未刺激的对照的RLU。数据表示为平均值±标准偏差，并且代表4次独立实验。使用学生t检验分析数据，并且星号表示统计学上显著的差异(*，p≤0.05；**，p≤0.01；***，p≤0.001)。

图7：质粒DNA产生的PD-L1-Fc在体外抑制T细胞活化。(A)从三只C57BL/6小鼠中分离纯化的CD4+T细胞并合并。将细胞接种到96孔平底板中，该板预涂有单独的或含5μg/ml无血清培养基产生的PD-L1-Fc的抗CD3(0.2μg/ml)。重组IgG1-Fc和重组PD-L1-Fc用作对照。刺激细胞3天，并通过流式细胞术检测FSC-SSC门中的细胞尺寸来测量细胞活化。(B)在6孔板中用野生型PD-L1质粒DNA或对照(pVax；)转染NIH/3T3细胞。转染后48小时，将细胞重新接种在96孔v形底板中，并用不同浓度的重组人PD-1孵育。洗涤细胞并用APC缀合的抗人PD-1或同种型对照染色，并通过流式细胞术通过评定转染细胞上的APC检测分析PD-1结合。还评定了PE缀合的抗人PD-L1或同种型对照的结合。鉴于重组PD-1已与NIH/3T3细胞上表达的PD-L1结合，预测抗人PD-L1-PE结合的减少是抗体结合的空间位阻的结果。图7A公开了“GGGGS”作为SEQ ID NO:5，“(GGGGS)3”作为SEQ ID NO:8。

图8：疾病模型优化。(A)对雄性Rag1-/-小鼠腹膜内注射幼稚T细胞，定义为CD4+CD25-CD45RB高或未治疗的。如通过体重减轻所观察到的，幼稚T细胞转移诱导疾病。(B)为了诱导急性移植物抗宿主病(GvHD)，以700 cGY照射雌性BALB/c小鼠，并与同种异体C57Bl6/J骨髓(10M细胞)和2.5M脾细胞一起转移。如通过在前10天内观察到的初始体重减轻所观察到的，使用这些条件成功诱导GvHD。此外，大约在第20天开始观察到二次体重下降。无移植物组证实了成功照射并且BMT对照证实了同种异体骨髓的成功转移。

图9：PD-L1和PD-L1 Fc聚合复合物在GvHD中的治疗功效。(A)如先前在图8B中所展示的诱导GvHD。对小鼠不进行治疗或每周通过灌肠注射浓度为c1000的pVAX、PD-L1或PD-L1Fc聚合复合物，持续7周。将达到其初始体重的75％的动物安乐死。施用PD-L1和PD-L1 Fc聚合复合物拯救了动物的体重。(B)在PD-L1或PD-L1-Fc治疗的小鼠中疾病的临床征象减少，并且在PD-L1和PD-L1-Fc治疗的小鼠中在第21天观察到的平均临床征象也减少。(C)诱导GvHD后小鼠的存活曲线，所有未治疗的动物和pVAX治疗的动物都死于疾病，大约40％的PD-L1 Fc治疗的动物和30％的PD-L1治疗的动物(绿色)存活至第75天。

图10：PD-L1 Fc和PD-L1聚合复合物在GvHD中的治疗功效。(A)如先前在图8B中所展示的诱导GvHD。对小鼠不进行治疗或每周通过灌肠注射浓度为c1000的pVAX或PD-L1 Fc聚合复合物，持续7周。将达到其初始体重的75％的动物安乐死。施用PD-L1 Fc聚合复合物拯救了动物的体重。(B)如先前在图8B中所展示的诱导GvHD。对小鼠不进行治疗或每周通过灌肠注射浓度为c1000的pVAX或PD-L1聚合复合物，持续7周。将达到其初始体重的75％的动物安乐死。施用PD-L1聚合复合物拯救了动物的体重。(C)诱导GvHD后小鼠的存活曲线，所有pVAX治疗的动物都死于疾病，大约40％的PD-L1 Fc治疗的动物和30％的PD-L1治疗的动物存活至第75天。

图11：PD-L1和PD-L1 Fc在GvHD中的治疗效果。(A)如先前在图8B中所展示的诱导GvHD。对小鼠不进行治疗或每周通过灌肠注射浓度为c1000的pVAX、PD-L1或PD-L1 Fc聚合复合物，持续7周。与无治疗和第18天开始的pVAX治疗的动物相比，PD-L1治疗的动物和PD-L1 Fc治疗的动物的体重大大提高。(B)诱导GvHD后小鼠的存活曲线，所有pVAX治疗的动物以及未治疗的动物都死于疾病。在另一方面，50％的PD-L1 Fc治疗的动物和25％的施用PD-L1的动物存活至第45天。

图12：结肠炎DSS模型中重组PD-L1 Fc的施用。(A)图来自Song等人,Gut 2015。在Rag1-/-小鼠的饮用水中施用2％DSS，并在第2天腹膜内注射重组PD-L1 Fc蛋白或PBS。与注射PBS的动物相比，注射重组PD-L1 Fc引起的体重减轻不那么严重。(B)在Rag1-/-小鼠的饮用水中施用4％DSS，并在第3天和第6天腹膜内注射重组PD-L1 Fc或PBS。在整个研究中，动物的体重是等同的。然而，利用PD-L1-Fc可溶性蛋白未观察到治疗效果，因此Song等人的结果不可再现。

图13：PD-L1和PD-L1 Fc在T细胞结肠炎模型中的治疗功效。(A-B)根据图8A诱导T细胞结肠炎。从转移后第15天开始，在接下来的6周通过灌肠给小鼠每周注射pVAX或PD-L1c1000聚合复合物，或者不进行治疗。给死于疾病的动物为其初始体重的75％的固定评分。如通过整个研究中稳定的体重所观察到的，注射PD-L1聚合复合物抑制疾病进展。(B)诱导T细胞结肠炎后小鼠的存活曲线表明PD-L1治疗的动物均未死于疾病。在另一方面，必须将1只pVAX治疗的动物和2只未治疗的动物安乐死。(C-E)根据图8A诱导T细胞结肠炎。每周两至三次监测动物的体重(C)和临床征象(D)，并且将第0天的体重用作基线体重(100％；第0天是结肠内滴注的第一天，对应于转移后第19天)。从转移后第19天开始，动物每周接受结肠内滴注，持续7周。(E)诱导T细胞结肠炎后小鼠的存活。当动物达到其初始体重的75％时，或者当活性严重降低时，将动物安乐死。出于绘图目的，对于实验的剩余部分，将安乐死小鼠的体重表示为其初始体重的75％。类似地，将安乐死小鼠的临床评分表示为最大评分8，直至研究结束。对于(C-E)，蔗糖n＝8，pVAX n＝9，PD-L1-Fc n＝9。

图14：PD-L1聚合复合物的施用诱导调节性T细胞中FoxP3的表达。在肠系膜***和脾的终点，在调节性T细胞(定义为CD4+CD25+FoxP3+细胞)中检验FoxP3的平均荧光强度(MFI)。与pVax组相比，在(A)肠系膜***(MLN)和(B)脾中，PD-L1治疗的动物中的FoxP3的表达都更高。

具体实施方式

本发明设想了PD-L1核酸的肠表达，用于治疗炎性病症。

PD-L1蛋白质和多核苷酸

本文设想的PD-L1多肽包括全长序列、可溶性片段及其变体。

全长PD-L1蛋白通常包含信号序列、IgV结构域和IgC结构域、跨膜结构域以及细胞质结构域。公众可在GenBank数据库中在NM_014143.3和NP_054862.1下获得人序列。人PD-L1转录物变体1的序列是规范序列，关于已知同种型描述的所有位置信息均从该序列确定。在该同种型中，信号序列显示为约氨基酸1至约18，IgV结构域显示为约19至约134，IgC结构域显示为约135至约227，跨膜结构域显示为约239至约259，且细胞质结构域显示为约260至约290。编码不同人PD-L1同种型的至少五种转录物(即剪接)变体是已知的并且描述于例如美国专利公布号2016/0122829中，所述专利的公开内容以引用方式明确地并入本文。

多种物种中PD-L1的核酸和氨基酸序列信息在本领域中是众所周知的，并且容易在公共数据库中获得，这些PD-L1包括例如猴PD-L1(NM 001083889.1和NP_001077358.1)、黑猩猩PD-L1(XM_0011401705.2和XP_001140705.1)、小鼠PD-L1(NM 021893.3和NP_068693.1)、大鼠PD-L1(NM_001191954.1和NP_001178883.1)、鸡D-L1(XM_424811.3和XP_424811.3)、牛PD-L1(NM_001163412.1和NP_001156884.1)以及狗PD-L1(XM_541302.3和XP_541302.3。

本发明的PD-L1核酸将通常包含编码人PD-L1多肽的核酸序列，其中PD-L1多肽优选地包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，PD-L1多肽是膜结合的，即包括跨膜结构域和细胞质结构域的全长PD-L1。在另选的实施方案中，PD-L1多肽是可溶性PD-L1多肽，所述可溶性PD-L1多肽至少包含人PD-L1的IgV结构域和IgC结构域，并且任选地还包含信号序列。在一个实施方案中，PD-L1多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-239，这对应于全长cDNA序列的核苷酸1-717。在其他实施方案中，可溶性PD-L1多肽可缺少全部或部分信号序列(例如，其可包含SEQ ID NO:1的氨基酸19-239)。参见，例如美国专利公布号2017/0189476，其公开内容以引用方式明确地并入本文。

表1-人PD-L1的氨基酸序列

MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET(SEQ IDNO:1)

在一些实施方案中，PD-L1核酸与天然PD-L1核酸序列(SEQ ID NO:2)或其片段相同。优选地，进行至少一个同义核酸取代以允许在施用主题核酸之后从内源性人PD-L1核苷酸分化和检测所得转录物，并且更优选地进行多个这样的同义突变。在特别优选的实施方案中，PD-L1核酸序列经密码子优化以改善表达。在示例性实施方案中，PD-L1核酸优选地包含SEQ ID NO:3的核酸序列或与SEQ ID NO:3至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。

在一些实施方案中，本发明的PD-L1多肽可以与Fc区或其部分融合。在示例性实施方案中，PD-L1核酸包含SEQ ID NO:4的核酸序列或与SEQ ID NO:4至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。

本发明的PD-L1核酸可以整体包括外显子1-4，以及外显子5的前35个核苷酸。需注意，ATG位点(起始密码子)位于外显子2的第13位。因此，本发明的PD-L1核酸可包括外显子2的最后52个核苷酸、外显子3和4的全部，以及外显子5的前35个核苷酸。

表2-人PD-L1的核酸序列

ATGAGGATATTTGCTGTCTTTATATTCATGACCTACTGGCATTTGCTGAACGCATTTACTGTCACGGTTCCCAAGGACCTATATGTGGTAGAGTATGGTAGCAATATGACAATTGAATGCAAATTCCCAGTAGAAAAACAATTAGACCTGGCTGCACTAATTGTCTATTGGGAAATGGAGGATAAGAACATTATTCAATTTGTGCATGGAGAGGAAGACCTGAAGGTTCAGCATAGTAGCTACAGACAGAGGGCCCGGCTGTTGAAGGACCAGCTCTCCCTGGGAAATGCTGCACTTCAGATCACAGATGTGAAATTGCAGGATGCAGGGGTGTACCGCTGCATGATCAGCTATGGTGGTGCCGACTACAAGCGAATTACTGTGAAAGTCAATGCCCCATACAACAAAATCAACCAAAGAATTTTGGTTGTGGATCCAGTCACCTCTGAACATGAACTGACATGTCAGGCTGAGGGCTACCCCAAGGCCGAAGTCATCTGGACAAGCAGTGACCATCAAGTCCTGAGTGGTAAGACCACCACCACCAATTCCAAGAGAGAGGAGAAGCTTTTCAATGTGACCAGCACACTGAGAATCAACACAACAACTAATGAGATTTTCTACTGCACTTTTAGGAGATTAGATCCTGAGGAAAACCATACAGCTGAATTGGTCATCCCAGAACTACCTCTGGCACATCCTCCAAATGAAAGGACTCACTTGGTAATTCTGGGAGCCATCTTATTATGCCTTGGTGTAGCACTGACATTCATCTTCCGTTTAAGAAAAGGGAGAATGATGGATGTGAAAAAATGTGGCATCCAAGATACAAACTCAAAGAAGCAAAGTGATACACATTTGGAGGAGACGTAA(SEQ ID NO.2)

表3-膜结合PD-L1的经密码子优化的核酸序列

ATGAGAATCTTCGCGGTGTTCATCTTCATGACCTACTGGCACCTCCTGAACGCTTTCACTGTGACCGTGCCTAAGGACCTCTACGTCGTGGAATACGGCTCCAACATGACCATCGAGTGCAAATTCCCAGTGGAGAAGCAGCTGGACCTGGCTGCCCTGATCGTGTACTGGGAAATGGAGGACAAGAACATCATCCAATTCGTGCATGGGGAGGAGGACCTGAAGGTCCAGCATTCGTCATATCGGCAAAGAGCCAGGCTGCTGAAGGATCAGCTGTCCCTCGGCAATGCGGCACTGCAGATTACCGATGTGAAGCTGCAGGACGCCGGAGTCTACCGGTGCATGATTTCCTACGGCGGAGCAGACTACAAGCGCATTACCGTGAAGGTCAACGCTCCCTACAACAAGATCAACCAGCGGATTCTGGTGGTCGACCCTGTGACCTCCGAGCATGAGCTGACCTGTCAAGCCGAAGGTTACCCGAAAGCGGAAGTGATCTGGACGTCGAGCGACCACCAGGTCTTGAGCGGAAAGACGACCACTACTAACAGCAAGCGGGAAGAGAAACTGTTTAACGTGACCAGCACTCTTCGGATCAACACCACCACTAACGAGATTTTCTACTGTACCTTTCGCCGGCTTGACCCGGAAGAAAATCACACCGCCGAGCTCGTGATCCCCGAGCTGCCCCTCGCCCACCCTCCTAACGAAAGAACCCACCTGGTCATCTTGGGGGCCATCCTGCTGTGCCTGGGAGTGGCCCTGACCTTCATTTTTAGGCTCCGAAAGGGCCGCATGATGGACGTGAAGAAATGCGGAATCCAGGACACTAACTCCAAGAAGCAGTCCGATACTCACCTGGAAGAAACCTAG(SEQ ID NO.3)

表4-与Fc片段融合的可溶性PD-L1的经密码子优化的核酸序列

ATGAGAATCTTCGCGGTGTTCATCTTCATGACCTACTGGCACCTCCTGAACGCTTTCACTGTGACCGTGCCTAAGGACCTCTACGTCGTGGAATACGGCTCCAACATGACCATCGAGTGCAAATTCCCAGTGGAGAAGCAGCTGGACCTGGCTGCCCTGATCGTGTACTGGGAAATGGAGGACAAGAACATCATCCAATTCGTGCATGGGGAGGAGGACCTGAAGGTCCAGCATTCGTCATATCGGCAAAGAGCCAGGCTGCTGAAGGATCAGCTGTCCCTCGGCAATGCGGCACTGCAGATTACCGATGTGAAGCTGCAGGACGCCGGAGTCTACCGGTGCATGATTTCCTACGGCGGAGCAGACTACAAGCGCATTACCGTGAAGGTCAACGCTCCCTACAACAAGATCAACCAGCGGATTCTGGTGGTCGACCCTGTGACCTCCGAGCATGAGCTGACCTGTCAAGCCGAAGGTTACCCGAAAGCGGAAGTGATCTGGACGTCGAGCGACCACCAGGTCTTGAGCGGAAAGACGACCACTACTAACAGCAAGCGGGAAGAGAAACTGTTTAACGTGACCAGCACTCTTCGGATCAACACCACCACTAACGAGATTTTCTACTGTACCTTTCGCCGGCTTGACCCGGAAGAAAATCACACCGCCGAGCTCGTGATCCCCGAGCTGCCCCTCGCCCACCCTCCTAACGAAAGAACTCCCAAGTCTTGCGATAAGACCCACACATGCCCGCCATGCCCAGCCCCGCCCGTGGCGGGCCCCTCCGTGTTTCTTTTCCCGCCGAAGCCTAAGGATACCCTGATGATCTCCCGCACCCCCGAAGTCACTTGTGTGGTGGTGGACGTCAGCCACGAAGATCCGGAAGTCAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGGGTCGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGCGAGGAACAGTACAACTCAACGTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCATCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGGACTGCCGAGCTCGATCGAAAAGACCATTTCGAAGGCCAAGGGGCAGCCTAGGGAGCCACAGGTCTATACCCTCCCGCCCTCACGAGATGAACTGACCAAGAACCAAGTGTCATTGACTTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTGGAATGGGAATCCAACGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACTCCGCCCGTGCTTGACTCCGACGGTTCGTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGATAAGTCCCGCTGGCAACAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAAGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTCTCGTTGAGCCCTGGAAAATAG(SEQ ID NO.4)

如遗传密码所定义的，在特定蛋白质的氨基酸序列与可编码该蛋白质的核苷酸序列之间存在已知且确定的对应关系。同样地，如遗传密码所定义的，在特定核酸的核苷酸序列与由该核酸编码的氨基酸序列之间存在已知且确定的对应关系。

表3

遗传密码

丙氨酸(Ala，A)GCA，GCC，GCG，GCT

精氨酸(Arg，R)AGA，ACG，CGA，CGC，CGG，CGT

天冬酰胺(Asn，N)AAC，AAT

天冬氨酸(Asp，D)GAC，GAT

半胱氨酸(Cys，C)TGC，TGT

谷氨酸(Glu，E)GAA，GAG

谷氨酰胺(Gln，Q)CAA，CAG

甘氨酸(Gly，G)GGA，GGC，GGG，GGT

组氨酸(His，H)CAC，CAT

异亮氨酸(Ile，I)ATA，ATC，ATT

亮氨酸(Leu，L)CTA，CTC，CTG，CTT，TTA，TTG

赖氨酸(Lys，K)AAA，AAG

甲硫氨酸(Met，M)ATG

苯丙氨酸(Phe，F)TTC，TTT

脯氨酸(Pro，P)CCA，CCC，CCG，CCT

丝氨酸(Ser，S)AGC，AGT，TCA，TCC，TCG，TCT

苏氨酸(Thr，T)ACA，ACC，ACG，ACT

色氨酸(Trp，W)TGG

酪氨酸(Tyr，Y)TAC，TAT

缬氨酸(Val，V)GTA，GTC，GTG，GTT

遗传密码的一个重要的且众所周知的特征是其冗余，由此对于用于制备蛋白质的大多数氨基酸，可以采用多于一种编码核苷酸三联体。因此，多种不同的核苷酸序列可以编码给定的氨基酸序列。此类核苷酸序列被认为是功能等同的，因为它们导致在所有生物体中产生相同的氨基酸序列(尽管某些生物体可以比其他生物体更有效地翻译一些序列)。此外，偶尔可以在给定的核苷酸序列中发现嘌呤或嘧啶的甲基化变体。此类甲基化不影响三核苷酸密码子与相应的氨基酸之间的编码关系。

鉴于上述情况，编码本发明的融合蛋白或多肽(或其任何部分)的DNA或RNA的核苷酸序列可用于衍生融合蛋白或多肽氨基酸序列，使用遗传密码将该DNA或RNA翻译成氨基酸序列。同样地，对于融合蛋白或多肽氨基酸序列，可以从遗传密码(由于其冗余，对于任何给定氨基酸序列将产生多个核酸序列)推导出可以编码该融合蛋白或多肽的相应核苷酸序列。因此，本文对编码融合蛋白或多肽的多核苷酸序列的描述和/或公开应当理解为还包括对由该核苷酸序列编码的氨基酸序列的描述和/或公开。类似地，本文对融合蛋白或多肽氨基酸序列的描述和/或公开应当理解为还包括对可编码该氨基酸序列的所有可能的核苷酸序列的描述和/或公开。

在一些实施方案中，本发明的PD-L1蛋白不包含信号序列，因为这种序列通常在从细胞分泌多肽之前被切割。在其他实施方案中，PD-L1蛋白是可溶的，即由IgV结构域和IgC结构域(即，全长的膜结合的PD-L1的细胞外部分)组成，并且还可包含异源序列，诸如Fc结构域、蛋白标签、缀合的治疗剂等等。此类可溶性PD-L1同种型可以通过技术人员熟知的多种方式通过可变剪接产生。

在优选的实施方案中，如本文图2所示，可溶性PD-L1包括消除全长的膜结合的PD-L1 cDNA的外显子5的部分和外显子6和7的全部。可通过将PD-L1的N端区与人IgG1 Fc融合来产生可溶性PD-L1同种型，并且在一些实施方案中，可通过氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ IDNO:5)来连接。在优选的实施方案中，IgG1 Fc可通过改变Fc结构域中的以下氨基酸而突变以降低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDCC)：E233P、L234V、L235A、G236缺失、A327G、A330S和P331S。Fc结构域可以是人源的，并且还可以源自人IgG1的Fc。

核酸递送媒介物

施用包含PD-L1核酸的表达载体以实现有效的肠表达这一目的可以使用本领域已知的任何方法来实现。在优选的实施方案中，将主题核酸递送媒介物施用至肠的局部(即未全身性地施用)。在一个实施方案中，核酸递送媒介物包含病毒载体。在另一个实施方案中，核酸递送媒介物包含阳离子脂质体。在优选的实施方案中，核酸递送媒介物包含脱乙酰壳多糖。在另选的实施方案中，使用生物基因递送媒介物(BGV)，诸如例如肠细菌、噬菌体、病毒样颗粒、生物脂质体等，以将PD-L1多核苷酸递送至肠上皮。关于目前正在研究的BGV的综述，参见Seow和Wood Biological Gene Delivery Vehicles Beyond Viral Vectors,Molecular Therapy 17:767–777(2009)，其内容整体并入本文。

在特定实施方案中，核酸递送媒介物包含脱乙酰壳多糖衍生物，例如结合另外的官能化，例如具有附接的配体的脱乙酰壳多糖。如本文所用的“脱乙酰壳多糖”应理解为包括广泛类别的包含共价修饰的N-乙酰基-D-葡糖胺和/或D-葡糖胺单元的基于脱乙酰壳多糖的聚合物，以及结合其他单元或附接至其他部分的基于脱乙酰壳多糖的聚合物。衍生物在很多情况下是基于对葡糖胺的羟基或胺基的修饰，诸如用精氨酸官能化的脱乙酰壳多糖完成的修饰。脱乙酰壳多糖衍生物的实例包括但不限于三甲基化脱乙酰壳多糖、PEG化脱乙酰壳多糖、巯基化脱乙酰壳多糖、半乳糖基化脱乙酰壳多糖、烷基化脱乙酰壳多糖、结合PEI的脱乙酰壳多糖、糖醛酸修饰的脱乙酰壳多糖、乙二醇脱乙酰壳多糖等等。关于脱乙酰壳多糖衍生物的进一步教导，参见，例如K.Taira、K.Kataoka、T.Niidome(编辑),Springer-Verlag Tokyo,2005,ISBN 4-431-25122-7,“Non-viral Gene Therapy”的第63-74页；Zhu等人,Chinese Science Bulletin,2007年12月,第52(23)卷,第3207-3215页；和Varma等人,Carbohydrate Polymers 55(2004)77–93

在本发明中使用具有大于50％的任何脱乙酰度(DDA)的脱乙酰壳多糖，官能化在1％与50％之间。(相对于脱乙酰壳多糖聚合物上的游离氨基部分的数量确定官能化百分比。)脱乙酰和官能化的程度赋予官能化的脱乙酰壳多糖衍生物特定的电荷密度。所得的电荷密度影响溶解度、核酸结合和随后的释放，以及与哺乳动物细胞膜的相互作用。因此，根据本发明，必须优化这些特性以获得最佳功效。示例性的脱乙酰壳多糖衍生物描述于Baker等人于2007年1月24日提交的11/657,382中，该文献以引用方式并入本文。在一个实施方案中，本文所述的双重衍生化脱乙酰壳多糖包含脱乙酰度为至少50％的脱乙酰壳多糖。在一个实施方案中，脱乙酰度为至少60％，更优选为至少70％，更优选为至少80％，更优选为至少90％，最优选为至少95％。在优选的实施方案中，本文所述的双重衍生化脱乙酰壳多糖包含脱乙酰度为至少98％的脱乙酰壳多糖。

本文所述的脱乙酰壳多糖衍生物具有在中性和生理pH下可溶的平均分子量范围，并且出于本发明的目的包括3-110kDa的分子量范围。本文所述的实施方案的特征在于衍生化脱乙酰壳多糖的平均分子量较低(<25kDa，例如为约5kDa至约25kDa)，这些衍生化脱乙酰壳多糖具有期望的递送和转染特性，尺寸小且具有有利的溶解度。较低平均分子量的衍生化脱乙酰壳多糖通常比具有较高分子量的脱乙酰壳多糖更易溶解，前者因此产生核酸/脱乙酰壳多糖复合物，该复合物将更容易地释放核酸并提供增加的细胞转染。

在优选的实施方案中，使用脱乙酰壳多糖或脱乙酰壳多糖衍生物作为核酸递送媒介物，完成包含PD-L1核酸的表达载体的施用。本文所述的脱乙酰壳多糖衍生物是通过用带正电荷的和/或亲水性的部分官能化所得游离氨基而产生的。国际专利申请号PCT/CA2013/050218和PCT/CA2014/050921(其内容以引用方式整体并入本文)中描述的衍生化脱乙酰壳多糖具有许多有利于核酸递送媒介物的特性，包括：它们有效地结合并复合带负电荷的核酸，它们可以形成尺寸可控的纳米颗粒，它们可以被细胞吸收，并且它们可以在细胞内在适当时间释放核酸。

在优选的实施方案中，使用“双重衍生化脱乙酰壳多糖”或“DD-脱乙酰壳多糖”，其是指已被双重官能化的脱乙酰壳多糖(“双重官能化脱乙酰壳多糖”或“DF-脱乙酰壳多糖”)，例如与Arg和亲水性多元醇两者偶联，这两者都与脱乙酰壳多糖共价附接。Arg可以作为单一氨基酸或作为多肽与脱乙酰壳多糖共价附接。亲水性多元醇可以是糖诸如葡萄糖。“DD-脱乙酰壳多糖核酸聚合复合物”或其语法等同物意指包含多个DD-脱乙酰壳多糖分子和多个编码PD-L1的核酸分子或其片段的复合物。在优选的实施方案中，双重衍生化脱乙酰壳多糖与编码PD-L1多肽的所述核酸复合。

DD-脱乙酰壳多糖PD-L1核酸聚合复合物包含PD-L1核酸组分和DD-脱乙酰壳多糖组分。脱乙酰壳多糖和DD-脱乙酰壳多糖核酸聚合复合物可通过本领域已知的任何方法制备。例如，可以调整官能化的脱乙酰壳多糖和核苷酸原料浓度以适应各种胺与磷酸盐比(N/P)、混合比和靶核苷酸浓度。用于聚合复合物形成的优选方法公开在WO 2009/039657中，其以引用方式整体明确地并入本文。

表达载体和表达控制区

本发明涉及包含PD-L1核酸、启动子以及转录和翻译终止信号的表达载体。可以将各种核苷酸和控制序列连接在一起以产生表达载体，该表达载体可以包括一个或多个方便的限制性位点，以允许在这些位点***或取代编码PD-L1的核酸。另选地，可以通过将包含PD-L1核酸的多核苷酸或核酸构建体***适当的载体中进行表达来表达PD-L1核酸。在形成表达载体时，PD-L1的编码序列位于载体中，使得其与适当的控制序列可操作地连接以进行表达。

表达载体可以是可方便地进行重组DNA程序并且可引起核酸表达的任何载体(例如质粒或病毒)。载体的选择将通常取决于载体与将要引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性的或闭环的质粒。载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，这些载体例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含确保自我复制的任何构件。另选地，载体可以是这样的：当被引入宿主细胞中时，整合进基因组中并与整合进的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单个载体或质粒或共同含有待引入宿主细胞基因组或转座子的总核酸的两个或更多个载体或质粒。

载体可任选地包括一个或多个选择性标记物，所述一个或多个选择性标记物允许容易地选择转化的、转染的、转导的或类似的细胞。选择性标记物是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养型等的基因。对于自主复制，载体还可包含使得载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是介导在细胞中起作用的自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体在体内复制的多核苷酸。

在优选的实施方案中，本发明的表达载体包含编码PD-L1的核酸分子或其片段，所述核酸分子包含与本文所述的PD-L1多肽的编码区可操作地连接的表达控制区。在一些实施方案中，核酸是DNA或RNA，例如mRNA。在一些实施方案中，PD-L1核酸是人工核酸。优选的人工核酸包括但不限于肽核酸(PNA)、磷酰二胺吗啉代寡聚物(phosphorodiamidatemorpholino oligo,PMO)、锁核酸(LNA)、乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。

在一个具体的实施方案中，表达载体是如本文示例的pVAX_hPD-L1(图1)。在另一个具体的实施方案中，表达载体是pVax_hPD-L1 Fc(图2)。

在一些实施方案中，表达控制区具有组成型活性。在多个优选的实施方案中，表达控制区不具有组成型活性。这提供了PD-L1核酸的动态表达。“动态”表达是指随时间变化的表达。动态表达可以包括几个这样的低表达或无表达的时段，间隔有可检测表达的时段。在多个优选的实施方案中，PD-L1核酸与可调节的启动子可操作地连接。这提供了核酸分子的可调节表达。表达控制区包含影响可操作地连接的PD-L1核酸的表达的调节性多核苷酸(本文有时称为元件)，诸如启动子和增强子。

本文包括的表达控制元件可以来自细菌、酵母、植物或动物(哺乳动物或非哺乳动物)。表达控制区包括全长启动子序列，诸如天然启动子和增强子元件，以及保留全部或部分的全长或非变体功能(例如，保留一定量的营养调节或细胞/组织特异性表达)的子序列或多核苷酸变体。如本文所用，术语“功能性”及其语法变体，当用于提及核酸序列、子序列或片段时，意指该序列具有天然核酸序列(例如非变体或未修饰的序列)的一种或多种功能。如本文所用，术语“变体”意指序列取代、缺失或添加，或其他修饰(例如化学衍生物，诸如对核酸酶具有抗性的修饰的形式)。

如本文所用，术语“可操作的连接”是指所描述的组分的物理并置，以允许它们以其预期的方式发挥作用。在与核酸可操作连接的表达控制元件的实例中，该关系为使得控制元件调控核酸的表达。通常，调控转录的表达控制区并置在转录核酸的5’末端附近(即“上游”)。表达控制区还可以位于转录序列的3’末端(即“下游”)或位于转录物内(例如，内含子中)。表达控制元件可以位于远离转录序列的一定距离处(例如，距离核酸100至500个、500至1000个、2000至5000个或更多个核苷酸)。表达控制元件的具体实例是启动子，其通常位于转录序列的5’。表达控制元件的另一个实例是增强子，其可以位于转录序列的5’或3’，或位于转录序列内。

一些表达控制区赋予可操作地连接的PD-L1核酸可调节的表达。信号(有时称为刺激)可以增加或减少与这种表达控制区可操作地连接的PD-L1核酸的表达。响应于信号而增加表达的此类表达控制区通常被称为诱导型的。响应于信号而减少表达的此类表达控制区通常被称为抑制型的。通常，这些元件赋予的增加或减少的量与存在的信号量成比例；信号量越大，表达的增加或减少越大。

多种可调节的启动子在本领域中是已知的。优选的诱导型表达控制区包括含有用小分子化合物刺激的诱导型启动子的表达控制区。在一个实施方案中，表达控制区响应于可口服递送但通常不存在于食物中的化学物质。具体的实例可见于例如美国专利5,989,910；5,935,934；6,015,709；和6,004,941，所有这些专利均以引用方式整体并入本文。

在一个实施方案中，表达载体还包含整合序列。在一个实施方案中，表达载体包含单个整合序列。在另一个实施方案中，表达载体包含第一整合序列和第二整合序列，以用于将PD-L1核酸或其部分整合进靶细胞的基因组中。在优选的实施方案中，一个或多个整合序列与选自由以下组成的组的整合构件结合发挥作用：mariner、sleeping beauty、FLP、Cre、ФC31、R、λ，以及来自诸如AAV、逆转录病毒和慢病毒的整合病毒的整合构件。

在一个实施方案中，主题组合物除PD-L1构建体之外还包含非治疗性构建体，其中非治疗性构建体包含编码与第二表达控制区可操作地连接的整合构件的核酸序列。该第二表达控制区和与PD-L1核酸可操作地连接的表达控制区可以相同或不同。编码的整合构件优选地选自由以下组成的组：mariner、sleeping beauty、FLP、Cre、ФC31、R、λ，以及来自诸如AAV、逆转录病毒和慢病毒的整合病毒的整合构件。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域技术人员熟知的，参见例如Sambrook等人,1989，同上)。关于进一步的教导，参见WO2008020318，其以引用方式整体明确地并入本文。

药物制剂

本发明还提供了包含本发明的DD-脱乙酰壳多糖核酸聚合复合物组合物的“药学上可接受的”或“生理学上可接受的”制剂。此类制剂可以在体内施用于受试者以实施治疗方法。

如本文所用，术语“药学上可接受的”和“生理学上可接受的”是指可施用于受试者，优选地不产生过多的不良副作用(例如恶心、腹痛、头痛等)的载剂、稀释剂、赋形剂等等。用于施用的此类制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。

药物制剂可以由与受试者施用相容的载剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等制备。此类制剂可以包含在片剂(包覆的或未包覆的)、胶囊(硬的或软的)、微珠、乳液、粉末、粒料、晶体、悬浮液、糖浆或酏剂中。除了其他添加剂之外，还可以存在补充的活性化合物和防腐剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等等。

赋形剂可包括盐、等渗剂、血清蛋白、缓冲剂或其他pH控制剂、抗氧化剂、增稠剂、不带电荷的聚合物、防腐剂或冷冻保存剂。用于本发明组合物的赋形剂还可包括等渗剂和缓冲剂或其他pH控制剂。可以添加这些赋形剂以达到优选的pH范围(约6.0-8.0)和同渗容摩(约50-400mmol/L)。合适的缓冲剂的实例是乙酸盐、硼酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和磺化有机分子缓冲剂。这些缓冲剂可以以0.01％至1.0％(w/v)的浓度存在于组合物中。等渗剂可选自本领域已知的任何等渗剂，例如甘露糖醇、右旋糖、葡萄糖和氯化钠，或其他电解质。优选地，等渗剂是葡萄糖或氯化钠。可以使用使组合物具有与其所引入的生物环境相同或相似的渗透压的等渗剂量。组合物中等渗剂的浓度将取决于所用特定等渗剂的性质，并且可以在约0.1％至10％的范围内。当使用葡萄糖时，优选以1％至5％w/v，更特别地5％w/v的浓度使用。当等渗剂是氯化钠时，优选以达1％w/v，特别地0.9％w/v的量使用。本发明的组合物还可含有防腐剂。防腐剂的实例是聚六亚甲基-双胍、苯扎氯铵、稳定化的氧氯复合物(诸如称为的复合物)、乙酸苯汞、氯代丁醇、山梨酸、氯己定、苄醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。通常，此类防腐剂的浓度为约0.001％至1.0％。此外，本发明的组合物还可含有冷冻保存剂。优选的冷冻保存剂是葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、山梨糖醇、胶态二氧化硅、分子量优选低于100,000g/mol的葡聚糖、甘油和分子量低于100,000g/mol的聚乙二醇或它们的混合物。最优选的是葡萄糖、海藻糖和聚乙二醇。通常，此类冷冻保存剂的浓度为约0.01％至10％。

可以将药物制剂配制成与预期施用途径相容。例如，对于口服施用，可以将组合物与赋形剂掺合并以片剂、锭剂、胶囊(例如明胶)或包衣(例如肠溶衣(或))的形式使用。可以将药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料包含在口服制剂中。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等等可含有下列任何成分或具有类似性质的化合物：粘合剂，诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖；崩解剂，诸如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁或其他硬脂酸盐；助流剂，诸如胶态二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或调味剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯或调味料。

制剂还可以包含载剂以保护组合物免于快速降解或从体内消除，诸如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。例如，可以单独地使用或与蜡组合使用时间延迟材料诸如单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯。

还设想了栓剂和其他可直肠施用的制剂(例如可通过灌肠施用的制剂)。关于直肠递送的进一步信息，参见，例如Song等人,Mucosal drug delivery:membranes,methodologies,and applications,Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Syst.,21:195-256,2004；Wearley,Recent progress in protein and peptide delivery by noninvasiveroutes,Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Syst.,8:331-394,1991。

适于施用的其他药物制剂在本领域中是已知的，并且适于本发明的方法和组合物(参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences(1990)第18版,Mack PublishingCo.,Easton,Pa.；The Merck Index(1996)第12版,Merck Publishing Group,Whitehouse,N.J.；和Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms,Technonic PublishingCo.,Inc.,Lancaster,Pa.,(1993))。

肠施用

主题组合物可以经口服施用。口服施用可能涉及吞咽，使得化合物进入胃肠道。本发明的组合物还可以直接施用至胃肠道。注射器、内窥镜、套管、插管、导管和其他物品可用于这种施用。适于口服施用的制剂包括固体制剂，诸如片剂、胶囊、含颗粒或包覆颗粒的包覆胶囊、液体、或粉末、锭剂(包括填充液体的锭剂)、咀嚼物、多颗粒和纳米颗粒、凝胶、膜、珠形剂(ovule)和喷雾剂。液体制剂包括悬浮液、溶液、糖浆和酏剂。液体制剂可以通过重构固体来制备。

片剂剂型通常含有崩解剂。崩解剂的实例包括羧甲淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、微晶纤维素、低级烷基取代的羟丙基纤维素、淀粉、预胶化淀粉和海藻酸钠。一般来讲，崩解剂占剂型的1重量％至25重量％，优选5重量％至20重量％。

粘合剂通常用于赋予片剂制剂粘合性。合适的粘合剂包括微晶纤维素、明胶、糖、聚乙二醇、天然和合成树胶、聚乙烯吡咯烷酮、预胶化淀粉、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。片剂还可含有稀释剂，诸如乳糖(一水合物、喷雾干燥的一水合物、无水物等等)、甘露糖醇、木糖醇、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、微晶纤维素、淀粉和二水磷酸氢钙。

片剂还可任选地包含表面活性剂(诸如月桂基硫酸钠和聚山梨醇酯80)以及助流剂(诸如二氧化硅和滑石)。当存在时，表面活性剂可占片剂的0.2重量％至5重量％，并且助流剂可占片剂的0.2重量％至1重量％。

片剂通常还含有润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酰富马酸钠，以及硬脂酸镁与月桂基硫酸钠的混合物。润滑剂通常占片剂的0.25重量％至10重量％，优选0.5重量％至3重量％。

其他可能的成分包括抗氧化剂、着色剂、调味剂、防腐剂和掩味剂。片剂共混物可直接压制或通过辊压制成片。在制片之前，可将片剂共混物或共混物部分湿法粒化、干法粒化或熔融粒化、熔融凝固或挤出。最终制剂可包括一个或多个层且可以是包覆的或未包覆的；它甚至可以是胶囊包封的。

片剂制剂在H.Lieberman和L.Lachman的Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,第1卷(Marcel Dekker,New York,1980)中有所讨论。

用于人用途或兽医用途的可消耗口服膜通常是柔韧的水溶性或水溶胀性薄膜剂型，它们可快速溶解或粘附粘膜，并且通常包含成膜聚合物、粘合剂、溶剂、保湿剂、增塑剂、稳定剂或乳化剂、粘度改良剂和溶剂。制剂的一些组分可以执行多于一种功能。

本发明还包括含有本发明组合物的多颗粒珠粒。

其他可能的成分包括抗氧化剂、着色剂、调味料和增味剂、防腐剂、唾液刺激剂、凉爽剂、共溶剂(包括油)、润肤剂、增量剂、消泡剂、表面活性剂和掩味剂。

根据本发明的膜通常通过蒸发干燥涂布在可剥离的背衬支撑物或纸上的薄的水性膜来制备。这可以在干燥烘箱或隧道(通常是组合式涂布机干燥器)中完成，或通过冷冻干燥或抽真空来完成。用于口服施用的固体制剂可被配制成立即释放和/或修饰释放。修饰释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲式释放、控制释放、靶向释放和程序化释放。

其他合适的释放技术诸如高能分散体及渗透性和包覆颗粒是已知的。

直肠/***内施用

本发明的化合物可以经直肠或***施用，例如以栓剂、子宫套或灌肠剂的形式施用。可可油是传统的栓剂基质，但可以酌情使用各种替代品。

用于直肠/***施用的制剂可被配制成立即释放和/或修饰释放。修饰释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲式释放、控制释放、靶向释放和程序化释放。

用于治疗受试者的剂量或“有效量”优选地足以以可测量或可检测的程度改善疾患的一种、几种或所有症状，但预防或抑制炎性病症或疾患或症状的进展或恶化是令人满意的结果。因此，为改善可通过本发明方法治疗的疾患而产生的PD-L1蛋白的量将取决于疾患和所需的结果，并且可由技术人员容易地确定。适当的量将取决于所治疗的疾患、所需的治疗效果，以及个体受试者(例如受试者内的生物利用度、性别、年龄等)。通过测量相关的生理效应可以确定有效量。

本发明还设想了兽医应用。因此，在一个实施方案中，本发明提供了治疗非人哺乳动物的方法，所述方法包括将本发明的基于脱乙酰壳多糖的纳米颗粒施用于需要治疗的非人哺乳动物。

治疗方法

本发明的组合物和方法在调控炎症方面具有有利的用途。例如，治疗性多肽可以抑制参与炎症反应的细胞的增殖和分化。这些分子可用于治疗炎性疾患(慢性疾患和急性疾患)，包括与感染相关的炎症(例如败血性休克、败血症或全身性炎症反应综合征(SIRS))、缺血-再灌注损伤、内毒素致死、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、结肠炎、或由细胞因子(例如TNF或IL-1)过量产生引起的疾患。对于本发明的治疗来说特别感兴趣的炎性病症包括但不限于克罗恩病和炎性肠病。

本发明的治疗性组合物还可用于治疗和/或预防器官排斥或移植物抗宿主病(GvHD)。宿主免疫细胞通过免疫反应破坏移植的组织，因而发生器官排斥。类似地，GvHD中也涉及免疫反应，但是，在这种情况下，外来移植的免疫细胞破坏宿主组织。施用抑制免疫反应，特别是T细胞的增殖、分化或趋化性的本发明的治疗性组合物可以是预防器官排斥或GvHD的有效疗法。

本文阐述的实例示出了本公开的若干实施方案，但不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。

实施例

实施例1

质粒构建和产生

将优化的PD-L1和PD-L1-Fc DNA序列均克隆到pVAX骨架克隆载体中。质粒含有质粒复制起点(pUC ori)，该质粒复制起点受人巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV)控制且具有卡那霉素抗性基因(KAN)。设计的质粒由DNA 2.0(Newark,CA)定制合成。收到DNA后，根据制造商的建议进行重构。简而言之，将含有DNA的吸收纸放入具有穿孔底部(用23G针进行)的小的0.2mL管中。然后将小管放入较大的1.5mL管中。向吸收纸中添加200μL水，在室温下孵育1min后，将管以最大速度离心1min。在1.5ml管中回收溶解的DNA。然后使用DNA转化大肠杆菌DH5α(化学感受态细菌)。简而言之，在无菌条件下向100μl解冻的大肠杆菌DH5α细胞中添加10μL洗脱的DNA。在冰上孵育30min后，将细胞在42C下热激30秒并在冰上孵育2min。向DH5α转化的细胞中添加30μL的Luria-Bertani(LB)培养基，并在37C，180rpm振荡下孵育1小时。然后将培养物铺展在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂板上，并在37C下孵育16小时。第二天，使用单个分离的菌落接种6mL含有卡那霉素(50μg/ml)的LB肉汤。将培养物在37C下在振荡器(180rpm)上孵育5-6小时。随后将培养物用于接种2.5L LB培养基，将其在37C下在振荡器上孵育16小时。然后根据制造商的说明，使用EndoFree Plasmid Giga试剂盒(QIAGEN)从该大细菌培养物中分离质粒DNA。分离后，使用限制性酶验证质粒内的PD-L1和PD-L1-Fc DNA***物，并通过琼脂糖凝胶确认片段尺寸

实施例2

体外PD-L1和PD-L1-Fc表达

为了测量来自聚合复合物的体外表达，将HEK-293T细胞以每孔800,000个细胞的密度接种在6孔组织培养板中的高葡萄糖DMEM完全培养基(10％胎牛血清，50单位/ml青霉素，50μg/ml链霉素)中并在37℃和5％CO₂下孵育过夜。第二天，将PD-L1-Fc聚合复合物在37℃水浴中短暂解冻。将每种聚合复合物在无菌水中稀释至12.5-200μg/ml DNA的浓度，相当于每孔0.5-8μg DNA，并保持在冰上直至转染。从每个孔中取出HEK-293T上清液，并用2ml预热的OptiMEM轻轻洗涤细胞。向每孔中添加1ml预热的OptiMEM。向孔中加入40μl稀释的聚合复合物，并轻轻旋转板以确保适当混合。将细胞在37℃和5％CO₂下孵育3小时。孵育后，通过移液除去细胞培养基，用2ml预热的DMEM完全培养基替换，并将细胞在37℃和5％CO₂中孵育48小时。在转染后48小时，从用PD-L1-Fc聚合复合物转染的孔或作为对照的未转染的细胞的孔中除去细胞培养基。通过离心(1500rpm，5min，4℃)从上清液中除去细胞碎片，并将上清液储存在-80℃下直至分析。为了定量细胞总蛋白，从孔中取出细胞培养上清液，用冷PBS洗涤转染的细胞，并向孔中添加500μl裂解缓冲液(50mM Tris pH 8.0，1％TritonX-100，100mM NaCl，1mM EDTA，10％甘油加cOmplete蛋白酶抑制剂混合物)。将板在冰上放置2-3分钟，使用细胞刮刀收集细胞，将细胞转移至1.5ml微量离心管中并在冰上放置30min。通过离心(13000rpm，10min，4℃)从裂解液中除去细胞碎片，并通过Lowry测定测量总蛋白。

根据制造商的方案，通过ELISA测量PD-L1蛋白浓度。简而言之，将96孔板涂有抗人PD-L1捕获抗体并在25℃下孵育过夜。第二天，将板用0.05％20的PBS溶液洗涤，用1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液封闭1小时，之后进行另外的洗涤步骤。将样品或标准品添加到板中并在25℃下孵育2小时。将生物素化的山羊抗人PD-L1检测抗体添加到孔中保持2小时，然后洗涤并添加链霉抗生物素蛋白-HRP保持20min。洗涤孔并添加四甲基联苯胺溶液保持20min以检测HRP。通过添加2N硫酸终止反应，并使用SoftMax Pro软件在450nm下在SpectraMAX Plus(ENG0214)上读板。使用由制造商提供的冻干标准蛋白计算PD-L1蛋白水平。将蛋白质样品拟合至标准的4参数逻辑曲线。在一些实例中，将PD-L1蛋白水平标准化为转染细胞中的总蛋白，并表示为ng PD-L1-Fc/mg细胞总蛋白。

为了评定PD-L1-Fc聚合复合物的转染效力，用增加量的DD-X聚合物内所含的DNA转染HEK-293T。随着pVAX-opt-hPD-L1-Fc质粒DNA的量增加，PD-L1蛋白的定量显示出hPD-L1-Fc表达的剂量依赖性增加(图4A)。尽管在转染之间PD-L1-Fc的最大表达(ng/mg)显示出一些变异性，但在独立转染之间EC50是相似的(图4B)。

实施例3

Fc融合蛋白(PD-L1-Fc)的纯化

将HEK293T细胞以5x10⁶个细胞/烧瓶铺展在T75烧瓶中的DMEM(10％FBS，Multicell)中，并在37C下孵育。第二天，按照制造商的建议，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用PD-L1-Fc质粒DNA(9ug/烧瓶；每个烧瓶3ml)转染细胞，并在37℃下孵育。24h后，将DMEM培养基更换为12ml EXCELL无血清培养基(Sigma Aldrich)。48h后(转染后72h)，收集上清液并储存在-20℃下直至纯化。按照制造商的建议，使用Protein G HiTrap柱(GE)纯化Fc融合蛋白。然后使用PD-10脱盐柱更换缓冲液，并在4个PBS级分(Gibco)中洗脱蛋白质。通过考马斯染剂检测蛋白质的存在。按照制造商的建议，通过ELISA(Duoset，R&D)测量每个级分中的PDL1浓度。

实施例4

体外PD-L1-Fc功能性测定

为了评定Fc融合的PD-L1构建体的功能性，将含或不含5μg/ml体外无血清培养基产生的PDL1-Fc或商业rhPDL1-Fc(Adipogen)的抗小鼠CD3(0.2μg/ml，eBioscience)和/或抗小鼠CD28(1μg/ml，eBioscience)添加到96孔平底板的孔中的PBS(50μl/孔)中。rhIgG1-Fc(Adipogen)用作阴性对照。

将板以中速放在板振荡器上1h，然后在4C下孵育过夜。第二天，从3只小鼠(Jackson Laboratories)中取出脾。通过在显微镜载片的磨砂末端上研磨脾来分离脾细胞。将红细胞在5ml内部制备的ACK裂解缓冲液中裂解1min，并通过添加45ml PBS(10％FBS)来终止裂解。离心和倾析后，将来自3只小鼠的细胞重悬于补充的RPMI培养基(10％FBS，NEAA，L-谷氨酰胺，2-ME；Multicell)中，合并，计数并调整至适当的浓度。按照制造商的建议，将一部分细胞用CellTrace Violet(Life Technologies)染色。通过移液小心地从aCD3/aCD28 96孔板中取出PBS。然后将细胞接种到孔中的RPMI培养基中(200,000个细胞/孔)，并在37C下孵育3或4天。在任一时间点，将细胞转移到新的96孔v形底板中，并在黑暗中在冰上用可固定的活力染料(eBioscience)染色30min。用冷FACS缓冲液(PBS 2％FBS)洗涤细胞两次，并在流式细胞仪(BD LSR II)上获取。通过监测CellTrace Violet信道中的细胞***峰来测量细胞增殖。通过检测FSC-SSC门中的细胞尺寸来测量细胞活化。

为了确定opt-hPD-L1-Fc是否结合人PD-1受体并活化细胞内信号，使用PathHunter Jurkat PD-1(SHP2)信号传导测定(DiscoverX)。在测试该测定之前，产生大批量纯化的PD-L1-Fc蛋白。简而言之，通过用PD-L1-Fc质粒DNA转染HEK-293T细胞，从构建体表达PD-L1-Fc。简而言之，将3.9x10⁵个HEK-293T细胞铺展在T175烧瓶中的30ml DMEM(Multicell)完全培养基(10％FBS，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)中，并在37℃和5％CO₂下孵育过夜。第二天，从烧瓶中吸出培养基，将细胞用10ml PBS(Multicell)洗涤一次。使用Lipofectamine 2000(Life Technologies；每个烧瓶100μl)在5.5mlOptiMEM(Gibco)中用49μg的PD-L1-Fc质粒转染细胞。将细胞(37℃和5％CO₂)孵育2h，然后将40ml DMEM完全培养基添加到烧瓶中。将细胞孵育24h，吸出培养基，并用10ml PBS洗涤细胞。将EXCELL无血清培养基(45ml；Sigma)添加到烧瓶中，并将细胞在37℃和5％CO₂下孵育。24h后(转染后48h)，取出上清液并以1500rpm离心5min以除去细胞碎片。将上清液转移到新的50ml管中并储存在-80℃下。按照制造商的建议，使用Protein G HiTrap柱(GE)纯化PD-L1-Fc。按照制造商的建议，使用PD-10脱盐柱(GE)将缓冲液更换为PBS。将PD-L1-Fc储存在-80℃下直至蛋白质浓缩并定量。按照制造商的建议，使用Amicon Ultra-4离心过滤器(Millipore Sigma)浓缩PD-L1-Fc蛋白。通过PD-L1ELISA(R&D)立即定量蛋白质。在一些情况下，将PD-L1-Fc浓度在PBS中稀释至1mg/mL并储存在-80℃下。

为了评定通过人PD-L1受体的细胞内活化，按照制造商的建议培养PathHunter细胞。将细胞离心并重悬于预热的AssayComplete细胞铺板试剂中。将细胞接种到白色96孔平底组织培养板的孔中(50μl/孔；20,000个细胞/孔)，并在室温下孵育15min。将AssayComplete细胞铺板试剂(10μl/孔)添加到含或不含抗PD-1(克隆NAT105，Abcam)的孔中。在AssayComplete铺板试剂中制备纯化的PD-L1-Fc蛋白或重组非裂解性人IgG1-Fc(Adipogen)并添加到细胞中(50μl/孔)。将细胞在37℃和5％CO₂下孵育40min。将PathHunter生物测定试剂1添加到细胞中(10μl/孔)，并将板置于板振荡器上以350rpm振荡1min。将细胞在室温和黑暗中孵育15min。将PathHunter生物测定试剂2(40μl)添加到每个孔中，并将细胞在室温和黑暗中孵育1小时。在光度计(enSpire-Perkin Elmer)上读取发光。相对于未刺激的对照，将数据分析为发光(RLU；相对荧光单位)。数据表示为平均值±标准偏差。使用学生t检验分析数据，并且星号表示统计学上显著的差异(*，p≤0.05；**，p≤0.01；***，p≤0.001)。

此处总结了前述的结果。为了确定从pVAX-opt-hPD-L1-Fc质粒表达的蛋白质是否将结合人PD-1受体并启动细胞内信号传导，使用PathHunter Jurkat PD-1(SHP2)信号传导测定(DiscoverX)。通过PD-1受体的信号传导随着纯化的PDL1-Fc剂量的增加而增加，并且在最大剂量为14.7μM时出现平台期(783μg/ml；图6A)。为了确保这种剂量依赖性的发光诱导是由PDL1-PD1特异性相互作用引起的，利用竞争测定(图6B)。用纯化的PDL1-Fc而非重组IgG1-Fc刺激PathHunter细胞导致发光增加，这表明信号诱导不是由PD-1与融合至PD-L1蛋白的Fc片段结合引起的。此外，在用PD-L1-Fc刺激细胞之前用抗人PD-1孵育细胞时，PDL1-Fc诱导的发光被抑制，这表明通过PD-1受体的结合和信号传导是由PDL1-PD1特异性相互作用引起的。

实施例5

野生型膜结合PD-L1体外表达和功能性测定

为了确定细胞表面的hPD-L1表达动力学，将NIH/3T3细胞接种(400,000个细胞/孔；2ml；DMEM 10％FBS)到6孔板中并在37C下孵育过夜。第二天，按照制造商的建议，使用Lipofectamine 2000用野生型PD-L1构建体质粒或pVax对照转染细胞。转染后24小时，将细胞用PBS洗涤，并通过添加无酶解离缓冲液(EFDB，Gibco；2ml/孔)重悬，在37C下孵育5min，并轻轻地将细胞从板移出。将细胞以1500rpm离心5min并重悬于DMEM(10％FBS)中。将细胞重新接种(10,000个细胞/孔)到96孔平底板中，并培养2-5天。在每个时间点，取出上清液，如上所述将细胞重悬于EFDB中，并将细胞分配到96孔v形底板中用于FACS染色。按照供应商的建议，将细胞用抗人PD-L1-PE(BioLegend)(0.2ng/孔)和可固定活力染料eFluor 780(eBioscience)在冰上在黑暗中染色30min。将细胞洗涤两次，重悬于FACS缓冲液中，并在流式细胞仪上获取。

为了测试在NIH/3T3细胞表面上表达的hPD-L1的功能性，采用PD-1结合测定。如上所述，在6孔板中转染NIH/3T3细胞。转染48小时后，如上所述将细胞重悬于EFDB中，离心，重悬于FACS缓冲液中，并接种到96孔v形底板中。将细胞以1500rpm离心5min，倾析，用或不用各种浓度的rhPD-1(R&D)重悬(50μl)，并在37℃下孵育30min。将细胞离心，用FACS缓冲液洗涤两次，并用抗人PDL1-PE(0.2ng/孔)或同种型对照、抗人PD-1-APC(eBioscience)(0.8ng/孔)或同种型对照以及活力染料在冰上在黑暗中染色30min。然后将细胞洗涤两次，重悬于FACS缓冲液中，并使用BD LSR II流式细胞仪获取。使用FlowJo 10.2[软件(Tree Star,Or.CA)分析数据

实施例6

体内功效研究

GvHD模型

10周龄雌性BALB/c SPF小鼠(Charles River)以2x350 cGy分次剂量接受总共700cGy的全身照射(RS2000生物研究X射线源)，在第-1天下午给予第一次照射，在第0天早上给予第二次照射。将8-10周龄雄性C57Bl6/j小鼠(Charles River)用于供体细胞。

研究包括3个对照组(n＝5)：非照射组、无移植物组、仅1000万个BMT的组；以及接受1000万个BMT和250万个脾细胞的4个治疗组(n＝8)。从第1天开始，在接下来的6周每周一次通过灌肠治疗小鼠(总共7次给药)或不进行治疗。每天监测动物的体重和临床征象。终止体重减轻超过25％和或临床评分为8或更高的动物。

与pVAX对照治疗的动物相比，每周结肠内施用PD-L1或PD-L1-Fc聚合复合物降低了体重减轻(图9A、图10A、图10B和图11A)。相对于未治疗的动物和pVAX对照治疗的动物，接受PD-L1或PD-L1-Fc的小鼠还显示出与GvHD相关的临床征象的减少(图9B)，并且具有提高的存活率(图9C、图10C和图11B)。不受理论束缚，本文设想到当T细胞通过肠道时，它们暴露于PD-L1多肽并变得“耐受”。离开肠道后，T细胞进入循环并可抑制效应T细胞功能。耐受的T细胞可导致调节性T细胞亚群的上调和/或致病性效应细胞的减少或抑制。此外，已显示PD-L1上调对上皮修复而言重要的分子。不受理论束缚，本文还设想到鉴于在照射和疾病之后胃肠道的屏障功能受损，那么增加上皮修复的PD-L1的增加也可以帮助恢复肠屏障功能。

实施例7

T细胞结肠炎模型

使用磁性活化细胞分选仪(MACS)CD4T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)通过阴性选择从6-8周龄雌性C57BL/6小鼠的脾中分离总CD4+T细胞。随后使用FACS(FACSAriaTM,BD Biosciences,San Jose,CA)针对CD4+CD25-CD45RB高幼稚T细胞对富集的细胞进行分选。将5×105个CD4+CD25-CD45RB高细胞腹膜内(IP)转移至受体6-8周龄雌性B10-RAG2缺陷型小鼠(Jackson)。

每周2-3次监测动物的体重和临床征象。在第14天，通过针对CD4的流式细胞术染色确认CD4T细胞的存在。在T细胞转移后第15或19天开始每周灌肠治疗(总共6或7次治疗)。每周两次监测动物的体重和临床征象。终止体重减轻超过25％或有严重临床征象的动物。

与pVAX和蔗糖对照小鼠相比，通过结肠内滴注每周施用PD-L1-Fc聚合复合物降低了PD-L1-Fc治疗的小鼠的体重减轻并减少了疾病临床征象(图13C-图13D)。此外，相对于对照组，用PD-L1-Fc聚合复合物治疗提高了小鼠的存活率(图13E)。

虽然已经参考优选实施例描述了本公开，但是本领域技术人员将理解，在不脱离本公开的范围的情况下，可以进行各种改变并且可以用等同物替换本发明的元件以适应特定情况。因此，意图是本公开不限于作为实施本公开的最佳方式公开的特定实施方案，而是本公开将包括落入所附权利要求范围和精神内的所有实施方案。