阅读说明：本技术 一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法及应用 (It is a kind of Huang the rose of Sharon in anti-tumor effective component preparation method and application ) 是由 陈德力 马国需 刘洋洋 李光 李宜航 许旭东 孙晓波 于 2019-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法及应用,本发明方法包括粉碎、有机溶剂提取、浓缩、硅胶柱层析、大孔吸附树脂洗脱以及干燥等步骤。该方法简单、易于操作,所得有效部位中杂质明显减少,UPLC检测结果显示药效物质的含量达70％以上,符合国家五类新药规定的50％的含量标准。本发明还对所得有效部位进行了药效学研究,结果显示该有效部位对多种肿瘤细胞均具有抗增殖活性,提示其在抗肿瘤药物或保健品中具有良好的应用前景。(The present invention relates to a kind of preparation method and application of anti-tumor effective component in yellow rose of Sharon, the method for the present invention includes crushing, organic solvent extraction, concentration, silica gel column chromatography, macroporous absorbent resin elution and drying and other steps.This method is simple, easily operated, and impurity significantly reduces in gained active component, and UPLC testing result shows that the content of effective substance up to 70% or more, meets as defined in national five kind new medicines 50% content standard.The present invention has also carried out pharmacodynamic study to gained active component, and the active component all has antiproliferative activity to kinds of tumor cells as the result is shown, it is prompted to have a good application prospect in anti-tumor drug or health care product.)

一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法及应用，属于医药生物技术领域。

背景技术

黄槿(Hibiscus tiliaceus)属锦葵科(Malvaceae)木槿属(Hibiscus)，是一种具有重要生态、药用和观赏价值的半红树植物，广泛分布于中国、越南、柬埔寨、缅甸、印度、印度尼西亚、马来西亚、菲律宾及老挝等热带地区，我国主产于海南、广西、台湾、广东、福建等省，现已广泛种植栽培。据《全国中草药汇编》记载，黄槿具有清热止咳、解毒消肿等功效，在海南沿海居民地区作为药物用于毒蛇咬伤、痈疮肿毒、支气管炎等。因其既能在潮间带生存，并可在海滩上成为优势种，又能在陆地环境自然繁殖的两栖木本植物，具有重要的生态功能和独特的生境适应性，导致黄槿含有大量的结构新颖，特异性强，具有显著药用的活性分子。

1980年，国外学者从黄槿中发现报道了12个Furanosteroid族倍半萜类化合物。近40年间，国外学者对黄槿中该类化合物的报道较少。而国内学者对黄槿的化学成分研究较为肤浅，仅从中得到少量三萜、甾体类、苯丙素、黄酮、酰胺类等化学成分。在药理活性研究方面，国外的研究报道较少，而国内仅简单的针对黄槿提取物进行筛选，发现黄槿具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗氧化等药理活性。在有效成分的提取工艺方面，尚且缺乏一种可同时提取多种有效成分的方法。

发明内容

本发明提供一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法及应用。

本发明采取的技术方案如下：

一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法，包括以下步骤：

(1)取黄槿药材树干，粉碎；

(2)使用有机溶剂加热回流或冷浸提取；所述有机溶剂为二氯甲烷或丙酮；

(3)过滤得到黄槿总提取液，减压浓缩至流体膏状物密度为0.9～1.2g/ml，得总浸膏；

(4)取所得总浸膏，使用硅胶干法拌样，待有机溶剂挥发干后，磨细，使用硅胶柱层析，以石油醚为洗脱剂，得到石油醚部位，再使用二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，洗脱3～10个柱体积至红色变浅为止，收集洗脱液；

(5)使用大孔吸附树脂洗脱，以体积分数70～90％的乙醇溶液为洗脱剂，收集洗脱液，减压浓缩，真空冷冻干燥，获得干粉状有效部位。

优选的，二氯甲烷-甲醇的体积比为(38～42):1。

优选的，所述大孔吸附树脂为D101、D201和D411型大孔吸附树脂，三者质量比为(4～5):1:(1～2)。

优选的，回流时间为6～12h，回流提取3次，冷浸提取时间为24h，冷浸提取3次。

优选的，步骤(5)中，去除体积分数70％乙醇溶液洗脱后的洗脱液，收集体积分数80～90％乙醇溶液洗脱后的洗脱液；洗脱速度为1.8～2mL/min，洗脱时间1.5～2h。

本发明分析确定，通过本发明方法所得黄槿中抗肿瘤有效部位的主要成分为Hibiscone A、Hibiscone B和Hibiscone C，三者的化合物结构如下所示：

检测结果显示：有效部位中Hibiscone A、Hibiscone B和Hibiscone C的质量比为(4.2～5.8)：(2.1～3.7)：(70.3～77.6)。

本发明还对所得黄槿有效部位进行药效学研究，结果显示该有效部位对肝癌细胞、腹水瘤细胞、肺腺癌细胞、***细胞或胃腺癌细胞等具有抑制作用，特别是对小鼠肝癌细胞H22具有明显抑制作用，提示本发明有效部位具有抗肿瘤活性。

基于药效学研究结果，本发明所得有效部位可在制备预防或***疾病的药物中应用，或在制备预防肿瘤疾病的保健品中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

A.采用本发明方法，经过一系列的提取富集工艺步骤获得显著抗肿瘤活性的有效部位。所得有效部位中杂质明显减少，UPLC检测结果显示药效物质的含量达70％以上，符合国家五类新药规定的50％的含量标准。

B.本发明的黄槿有效部位原料来源丰富、价廉，制备方法简单，采用低极性溶剂充分萃取，使黄槿中的抗肿瘤活性物质富集，易于操作，成本低廉。

C.该有效部位在预防或***疾病药物或保健品中具有重要用途。

附图说明

图1：黄槿有效部位和黄槿提取物的UPLC检测结果图。

图2：各组样品对H22荷瘤小鼠肿瘤形态体积的影响结果图。

图3：各组样品对H22荷瘤小鼠瘤重的影响结果图。

图4：各组样品对H22荷瘤小鼠肿瘤增殖率的影响结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：

一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法，包括以下步骤：

(1)取黄槿药材树干，阴干，去除杂木；将黄槿药材切成小段，粉碎成0.5～2cm；

(2)使用有机溶剂(二氯甲烷)加热回流6～12h，回流提取3次；

(3)过滤得到黄槿总提取液，减压浓缩至流体膏状物密度为0.9g/ml，得总浸膏；

(4)取所得总浸膏，使用硅胶干法拌样，待有机溶剂挥发干后，磨细，使用硅胶(200-300目)柱层析，以石油醚为洗脱剂，洗脱3个柱体积得到石油醚部位，再使用二氯甲烷-甲醇(40:1)为洗脱剂，洗脱3～10个柱体积至红色变浅为止，收集洗脱液；

(5)使用大孔吸附树脂(D101)洗脱，分别以70％乙醇溶液和90％乙醇溶液为洗脱剂(每种洗脱剂洗脱3个柱体积)，去除70％乙醇溶液洗脱后的洗脱液，收集90％乙醇溶液洗脱后的洗脱液，减压浓缩，真空冷冻干燥，获得干粉状有效部位。

实施例2：

一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法，包括以下步骤：

(1)取黄槿药材树干，阴干，去除杂木；将黄槿药材切成小段，粉碎成0.5～2cm；

(2)使用有机溶剂(丙酮)冷浸提取24h，提取3次；

(3)过滤得到黄槿总提取液，减压浓缩至流体膏状物密度为1.2g/ml，得总浸膏；

(4)将所得总浸膏，使用硅胶干法拌样，待有机溶剂挥发干后，磨细，使用硅胶(200-300目)柱层析，以石油醚为洗脱剂，洗脱10个柱体积得到石油醚部位，再使用二氯甲烷-甲醇(40:1)为洗脱剂，洗脱3～10个柱体积至红色变浅为止，收集洗脱液；

(5)使用大孔吸附树脂洗脱(D101)，分别以70％乙醇溶液和80％乙醇溶液为洗脱剂(每种洗脱剂洗脱5个柱体积)，去除70％乙醇溶液洗脱后的洗脱液，收集80％乙醇溶液洗脱后的洗脱液，减压浓缩，真空冷冻干燥，获得干粉状有效部位。

实施例3

实施例3与实施例2的主要区别是：

步骤(5)中，进行大孔吸附树脂洗脱时，色谱柱中依序装填D101、D201和D411型大孔吸附树脂(质量比为4:1:2)。

实施例4

实施例4与实施例2的主要区别是：

步骤(5)中，进行大孔吸附树脂洗脱时，色谱柱中依序装填D101、D201和D411型大孔吸附树脂(质量比为5:1:1)。

对比例1

将黄槿替换为白木，制备方法与实施例1相同。

取实施例制备所得有效部位，以及对比例1制备所得提取物，进行UPLC检测，结果见图1和表1。

表1

UPLC检测结果显示，通过富集工艺制备后，有效部位中杂质明显减少，有效成分的含量显著提高，达70％以上。其中，有效部位中Hibiscone B含量为2.1～3.7％，HibisconeC含量为70.3～77.6％，Hibiscone A含量为4.2～5.8％。

试验例1：黄槿有效部位抗肿瘤活性药效学研究-体外细胞实验

取实施例制备所得有效部位，以及对比例1制备所得提取物，参考文献报道的MTT法进行抗肿瘤细胞毒活性试验，结果见表2。

表2黄槿有效部位与白木提取物抗肿瘤细胞毒活性

结果显示：本发明所得有效部位可抑制肿瘤细胞增殖，其中，对H22细胞表现出最强的抗增殖活性，且对H22细胞的抗增殖活性(IC₅₀＝7.4～8.1μg/ml)优于对MGC细胞的抗增殖活性(IC₅₀＝31.9～42.2μg/ml)，体现出一定的选择性。

试验例2：黄槿有效部位抗肿瘤活性药效学研究-体内动物实验

一、实验材料

实验动物：ICR小鼠，体重18～22g，雌雄各半；

细胞株：小鼠肝癌细胞H22；

去甲斑蝥素，华北制药股份有限公司，批号：FAX1607002，人每次口服5～15mg，每日3次；

1640培养基，胎牛血清，GIBCO。

二、实验方法

H22细胞经液氮中取出，离心弃去上层冻存液，加完全1640培养基重悬细胞，CO₂培养箱中37℃，CO₂浓度5％培养。传代3次后，离心收集细胞，使用生理盐水重悬细胞细胞计数仪测定细胞密度，加入适量生理盐水稀释细胞密度为100万个/mL，进行小鼠腹腔传代，每只小鼠腹腔注射0.2毫升每只。5～7天后，处死小鼠，取腹水离心，重复上述体内传代过程3次(第一次实验，受寒假影响，体内传代2次)。取小鼠腹水离心收集细胞，生理盐水重悬调节密度为1000万个/mL。每只小鼠腋下靠近背部皮下注射0.2mL。次日开始给药，连续给药10天。

三、给药剂量

小鼠分为模型组、阳性对照组和受试药(实施例1所得有效部位)高、中、低剂量组。模型组给予等体积赋形剂，第一次实验使用食用油溶解药物，第二次实验使用0.5％羧甲基纤维素钠。阳性对照药给药小鼠去甲斑蝥素，2片研磨碎，加CMC-Na混悬体积50毫升。每只小鼠给予0.2毫升每10克体重，相当于人每日口服30mg。受试药物给药剂量为0.1、0.07、0.035、0.0175g/kg。

四、实验结果

结果见图2-4，结果显示：黄槿提取物有效部位在35～100mg/kg剂量范围内能够明显抑制肿瘤增殖作用，且70～100mg/kg剂量范围内相对肿瘤增殖率≤40％，符合国家抗肿瘤药物活性指标。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。