阅读说明：本技术 一种北柴胡地上部分不同提取物的抗癫痫作用 (A kind of antiepileptic action of Bupleurum chinense DC difference extract ) 是由 杨炳友 刘艳 匡海学 于 2019-10-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医药学领域,特别是涉及一种北柴胡地上部分不同提取物的抗癫痫作用的医药用途。通过水蒸气蒸馏法和溶剂回流提取法,制备了北柴胡地上部分的挥发油和乙醇提取物。药理学实验显示,北柴胡地上部分不同提取物均具有明显的抗癫痫作用,其中,乙醇提取物抗癫痫作用与北柴胡根相当、挥发油抗癫痫作用优于北柴胡根。北柴胡地上部分挥发油与拉莫三嗪联合使用的抗癫痫效果显著优于单用上述成分的效果,并且显著优于柴胡复方制剂与拉莫三嗪联合使用的抗癫痫效果,为中西药复方制剂的安全和质量可控提供了可能性。(The present invention relates to medicines, more particularly to a kind of medical usage of the antiepileptic action of Bupleurum chinense DC difference extract.By steam distillation and solvent refluxing extraction method, it is prepared for the volatile oil and ethanol extract of Bupleurum chinense DC.Pharmacological experiment shows that Bupleurum chinense DC difference extract all has apparent antiepileptic action, wherein suitable, volatile oil antiepileptic action is better than Bupleurum Chinese root to ethanol extract antiepileptic action with Bupleurum Chinese root.The antiepileptic efficacy that Bupleurum chinense DC volatile oil and Lamotrigine are used in combination is significantly better than the effect that mentioned component is applied alone, and be significantly better than radix bupleuri compound preparation and antiepileptic efficacy that Lamotrigine is used in combination, for Chinese and Western medicine compound preparation safety and quality controllable provide possibility.)

一种北柴胡地上部分不同提取物的抗癫痫作用

技术领域

本发明涉及医药学领域，特别是涉及一种北柴胡地上部分不同提取物的抗癫痫作用的医药用途。

背景技术

癫痫(Epilepsy)是全世界非常常见的神经系统疾病之一，也是最难治疗的神经系统疾病之一，具有突发性和反复性的病理特点，癫痫患者大多需要终身服药治疗。癫痫是由多种原因引起的一种慢性脑功能障碍性疾病，以反复发生的大脑神经元过度放电所致的暂时性中枢神经系统功能失常为特点，以肌肉抽搐和意识丧失为主要表现。全球约有7000万癫痫患者，其中90％以上的患者位于低、中等收入国家。流行病学调查显示，我国癫痫的发病率为5‰～7‰，全国现有大约650万～910万癫痫患者。癫痫的发生不仅会引起健康问题，使患者整体健康状况低下、智能及身体机能受损、发生意外及受伤的风险较高，而且伴随癫痫产生的情绪、家庭、职业等一系列社会心理问题，对患者的整体生活质量造成巨大影响。此外，癫痫直接医疗花费以及因生活质量和生产工作能力丧失而导致的间接花费巨大，造成了较为沉重的财政负担。因此，深入了解癫痫的发病机制、探寻最佳的治疗药物及控制癫痫的手段对患者及社会均具有重大意义。

多种病因可导致癫痫发作，其发病机制复杂，迄今尚未完全阐明。癫痫的治疗手段包括对病因进行针对性治疗、药物治疗、外科手术治疗及物理疗法等，通常抗癫痫药物(AEDs)是治疗癫痫的首选手段，临床上常用的抗癫痫药物既包括传统抗癫痫药如***、苯妥英钠、卡马西平、丙戊酸钠、氯硝西泮、乙琥胺、扑痫酮等，也包括近20年国内外陆续研发上市的新型抗癫痫药，如奥卡西平、拉莫三嗪、左乙拉西坦等。但其具有眩晕头疼、共济失调、过敏反应等副作用，导致部分患者不能耐受。然而，大约1/3的患者呈药物难治性,难治性癫痫一般是指经过AEDs的合理应用规范治疗2年或以上(两种或两种以上不同的AEDs联合应用并且达到有效血药浓度)，治疗效果仍不佳，症状控制仍不理想，为了控制癫痫发作，手术就成为又一选择。颞叶癫痫是最多见的癫痫综合征之一，难治性癫痫患者中约50％以上都是此类型。但颞叶结构(包括内侧结构)复杂，邻近丘脑、脑干、大脑中动脉、脉络膜前动脉、动眼神经等重要解剖结构，手术操作不慎会造成严重的并发症，首都医科大学三博脑科医院功能神经外科在2008年3月-2016年3月诊治436例颞叶癫痫病人并行颞叶癫痫灶切除术，其中24例(5.5％)术后出现偏瘫、颅内感染、颅内血肿、颞肌萎缩等并发症。而中药治疗癫痫具有副作用小、多成分、多靶点且减少癫痫并发症发作的优势，吸引了国内外科研学者的关注，具有十分广阔的开发前景。

北柴胡根为伞形科植物柴胡(Bupleurum chinense DC.)的干燥根。柴胡是常用解表药，其作为我国传统常用中药，已有2000余年的应用。柴胡，始载于《神农本草经》，被列为上品，并被记录总结在历版《中国药典》和《中药大辞典》中。有和解表里，疏肝，升阳之功效，常用于感冒发热、寒热往来、疟疾、肝郁气滞、胸肋胀痛、脱肛、子宫脱垂、***、抗惊厥、抗炎、抗抑郁、抗癫痫、抗肿瘤等。现代药理学研究表明柴胡挥发油具有解热、抗炎、保肝等作用。柴胡皂苷为北柴胡的主要成分，且具有广泛的生物活性，如抗炎、抗肿瘤、保肝利胆、免疫调节以及中枢抑制作用等。北柴胡内的黄酮类成分具有利胆、抑菌、杀菌等作用。对于北柴胡治疗癫痫的研究现状而言，目前已有研究显示柴胡总皂苷、柴胡皂苷a、c、d、柴胡挥发油和复方(柴胡疏肝汤、柴胡疏肝汤联合归脾汤加味、柴胡疏肝汤加浙贝母加味、加味柴胡加龙骨牡蛎汤等、小柴胡汤)对治疗癫痫均有一定作用。目前，多有关于将柴胡复方制剂与常用抗癫痫西药联合使用的报道，联用后对癫痫的疗效明显提高，而不良反应发生率明显降低，中西药联合使用已成趋势。

北柴胡地上部分据《本草述钩元》、《本草撮要》、《得配本草》记载均具有行气之功效；《千金翼方》、《本草撮要》、《中国医学大辞典》记载取北柴胡茎叶汁滴耳治卒聋。目前，对北柴胡地上部分的药理作用研究较为浅显，仅有对解热保肝、抗炎、抗病毒、镇痛和增强毛细管功能相关方面的报道，更没有关于北柴胡地上部分提取物与抗癫痫西药联合使用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种北柴胡地上部分不同提取物的新的药效活性，具体地说，本发明提供了一种北柴胡地上部分不同提取物与抗癫痫西药联用在抗癫痫的药物方面的应用。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一方面，本发明提供一种北柴胡地上部分的不同提取物(包含挥发油组分、乙醇提取组分)在制备治疗癫痫药物中的用途。

优选的，所述北柴胡地上部分的挥发油由如下步骤制成：称取干燥的北柴胡地上部分并粉碎，通过水蒸气蒸馏法进行提取，经无水硫酸钠干燥后即得。

优选的，采用水蒸气蒸馏法的提取时间为12小时，所需水量为药材重量的5-10倍，无水硫酸钠的干燥时间为12小时。

优选的，所述北柴胡地上部分乙醇提取物由如下步骤制成：称取干燥的北柴胡地上部分并粉碎，收集经水蒸气蒸馏法提取挥发油后的药渣，加入乙醇溶液加热回流提取，合并滤液，减压浓缩得到北柴胡地上部分乙醇提取物。

优选的，选用70-95％乙醇溶液，料液比为1:2-4，加热回流提取3次，每次2小时。

优选的，所述药物是以北柴胡地上部分的挥发油或乙醇提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

优选的，所述制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液或混悬剂。

优选的，所述不同提取物均为活性成分。

优选的，所述不同提取物均包含抗癫痫活性物质。

本发明的第二个目的是提供充分利用北柴胡地上部分丰富的药用植物资源的可能。

优选的，北柴胡地上部分生物产量占总生物产量的87.5％(同时也是北柴胡根生物产量的7倍)。

优选的，北柴胡地上部分挥发油的含量约为北柴胡根的7.8倍。

本发明的第三个目的是提供北柴胡地上部分的不同提取物(包含挥发油组分、乙醇提取组分)与抗癫痫西药联合使用在制备治疗癫痫药物中的用途。

优选的，抗癫痫西药为拉莫三嗪。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：药理学实验显示，北柴胡地上部分不同提取物具有明显的抗癫痫作用，其中，乙醇提取物抗癫痫作用与北柴胡根相当、挥发油抗癫痫作用优于北柴胡根，北柴胡地上部分挥发油与拉莫三嗪联合使用的抗癫痫效果显著优于单用上述成分的效果，并且显著优于柴胡复方制剂与拉莫三嗪联合使用的抗癫痫效果，为中西药复方制剂的安全和质量可控提供了可能性。

具体实施方式

以下结合具体实施例,对本发明作进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。

实施例1：一种北柴胡地上部分挥发油和乙醇提取物的制备

称取干燥的北柴胡地上部分44.4kg，按照药典(2015版)水蒸气蒸馏法提取12h，无水硫酸钠干燥12h，合并，称油重48.67g，计算北柴胡地上挥发油得率为0.1096％。药渣加70-95％EtOH加热回流提取3次，每次2h，滤过合并，减压浓缩得到北柴胡地上部分乙醇提取物浸膏6.06kg(出膏率为13.65％)。

对比例1：柴胡加龙骨牡蛎汤提取物的制备

取柴胡12g，龙骨、生姜、党参、桂枝、茯苓、黄芩各4.5g，半夏6g，大黄6g，牡蛎4.5克，大枣6枚，加水浸泡半小时后，煎煮3次，每次30min，过滤，合并滤液，减压浓缩成浸膏，备用。

效果例1：北柴胡地上部分对Sombati癫痫细胞模型的影响

1.1实验材料

从新生SD大鼠双侧海马中分离得到的原代海马神经元细胞。给药组分组情况如表1所示。

表1北柴胡对Sombati癫痫细胞模型药效学评价分组情况

1.2实验方法

将从新生SD大鼠双侧海马中分离得到的原代海马神经元细胞以神经元培养液(Neurobasal-A、2％B27、0.5mM GlutaMAX)于5％CO₂的37℃恒温培养箱中进行常规培养，以5×10⁵/孔接种到6孔板中，培养至第8d鉴定纯度后，分为11组(每组设6个复孔)如表2。空白组用正常细胞外液孵育3h后正常培养，模型组细胞给予无镁细胞外液刺激3h后正常培养。其他给药组，用无镁细胞外液孵育3h后，以含有不同浓度药物的维持培养液孵育培养，采用CCK-8比色法检测各组对Sombati癫痫细胞存活率的影响。

1.3实验结果

表2各分组对Sombati癫痫细胞模型药效学评价结果

CCK-8检测结果表明：空白组原代海马神经元细胞突起增粗，呈现锥形、三角形等，相互交织成网络状，胞体丰满，光晕明显。与空白组相比，模型组退化萎缩明显，突起断裂，大部分神经元凋亡。北柴胡地上部分乙醇提取物和挥发油高、低给药组对损伤的海马神经元细胞均有保护作用，其中北柴胡地上部分乙醇提取物和挥发油的高剂量组与模型组比较，细胞存活率有显著性差异(P<0.05)。北柴胡地上部分挥发油、乙醇提取物以及柴胡复方与拉莫三嗪联合使用的效果明显优于单药使用的效果，其中北柴胡地上部分挥发油与拉莫三嗪联合使用的效果最佳。

1.4协同效果计算方法及验证

基于上述实验结果，本发明还探讨了柴胡的有效部位活性较好的部分与现有药物的联用药效，为了评价协同作用，采用金正均协同作用计算公式来进行相关评价，具体方法为：q＝P_A+B/(P_A+P_B-P_A×P_B)。

式中P_A、P_B和P_A+B分别为A药组、B药组和两药联用组治疗率。q＜1说明两药合用后产生拮抗作用；q＞1，说明两药合用后产生协同作用，q＝1说明两药合用后产生相加作用。

具体的，如表2中所示的数据，北柴胡地上部分挥发油组(VAH组)的有效率分别为30.4％，对照药物拉莫三嗪组(TLG)的有效率是37.3％，北柴胡地上部分挥发油+拉莫三嗪组(VA+TLG组)的有效率是84.6％，经计算，q＝1.51＞1，说明北柴胡地上部分挥发油与拉莫三嗪联用具有协同效果。

效果例2：北柴胡地上部分对戊四唑致痫小鼠模型的药理作用研究

2.1实验动物及药物

C57BL/6雄性SPF级小鼠，随机分组如表1，每组20只，灌胃前12h禁止饮食，正常饮水。所有灌胃药物均用5‰羧甲基纤维素钠溶液配制，空白组和模型组小鼠灌胃同体积的5‰羧甲基纤维素钠溶液。

表3北柴胡对戊四唑致痫小鼠模型药效学评价分组情况

2.2实验方法

所有小鼠均灌胃给药7d，每天1次，最后一次给药结束后60min除空白组外均腹腔注射戊四唑(60mg/kg)，立即观察记录小鼠痫性发作级别、潜伏期、惊厥持续时间、躯体强直性痉挛发生率和死亡率。

小鼠痫性发作分级采用Racine标准：0级：无惊厥；I级：口、面部肌肉阵挛；II级：在I级基础上出现节律点头；III级：在II级基础上出现前肢阵挛；IV级：在III级基础上出现后肢伸直；V级：在IV级基础上出现跌倒。

2.3实验结果

表4各分组对戊四唑致痫小鼠模型药效学评价结果

注：与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01

与空白组(CON)小鼠相比，模型组(MOD)小鼠出现前肢痉挛并伴随不同程度的直立、强直阵挛和跌倒等症状；与模型组相比，对照药组(TLG)、提取物与对照药联用组(EA+TLG、VA+TLG、CHM+TLG)能明显改善小鼠癫痫症状，无IV级以上症状出现，同时能够显著延长小鼠惊厥潜伏期、缩短惊厥持续时间(P<0.05，EA+TLG)，显著降低躯体强直性痉挛发生率和死亡率(P<0.01)，其中VA+TLG组明显优于EA+TLG和CHM+TLG组。北柴胡地上部分乙醇提取物和挥发油、北柴胡根乙醇提取物和挥发油(除北柴胡根乙醇提取物低剂量组外)能够改善小鼠强直痉挛症状，延长模型小鼠惊厥潜伏期，缩短惊厥持续时间，降低躯体强直性痉挛发生率和死亡率(表4)。

综合可以看出，北柴胡地上部分乙醇提取物和北柴胡地上部分挥发油均具有明显改善戊四唑致痫小鼠模型癫痫状态的药理作用，且其乙醇提取物抗癫痫作用与北柴胡根相当、挥发油抗癫痫作用优于北柴胡根。

2.4协同效果验证

参见以上第1.4节的计算方法，对北柴胡地上部分挥发油与拉莫三嗪联用的协同效果进行验证。

具体的，如表4中所示的数据，北柴胡地上部分挥发油组(VAH组)的有效率(＝1-死亡率)分别为45％，对照药物拉莫三嗪组(TLG)的有效率是50％，北柴胡地上部分挥发油+拉莫三嗪组(VA+TLG组)的有效率是95％，经计算，q＝1.31＞1，验证了北柴胡地上部分挥发油与拉莫三嗪联用具有协同效果。

北柴胡地上部分挥发油与拉莫三嗪联合使用的效果明显优于单药使用以及北柴胡地上部分乙醇提取物或柴胡复方与拉莫三嗪联合使用的效果。

效果例3：北柴胡地上部分对红藻氨酸(KA)诱导的癫痫大鼠的药理作用研究

3.1实验动物及药物

SD雄性SPF级大鼠，体重220±20g，随机分组如表3，每组20只，所有灌胃药物均用5‰羧甲基纤维素钠溶液配制，空白组和模型组小鼠灌胃同体积的5‰羧甲基纤维素钠溶液。

表5北柴胡对KA诱导的癫痫大鼠模型药效学评价分组情况

3.2实验方法

采用侧脑室注射KA的方法建立KA致痫动物模型。大鼠用10％水合氯醛(400mg/kg，腹腔注射)麻醉后，将头顶部皮肤经碘酒消毒，75％的酒精脱碘后，沿头部正中线及两耳根连线的交点处开始切开头皮，切口长约1-1.5cm，用棉球擦除颅骨上的腱膜及外膜，暴露出前囟及冠状缝以便定位，将大鼠头部固定在大鼠立体定向仪上，保持头部前后在同一水平面上。用立体定向仪以前囟处为标记进行侧脑室定位：前囟后0.8mm，旁开1.6mm，定位后，用高速颅骨钻在定位处钻孔，在钻孔处，采用定制的微量注射管下针3.8mm，在微量注射泵的推动下向右侧侧脑室内以1μl/min的速度匀速注射3μl浓度为0.5μg/μl的KA溶液，注射结束后留针5min，再缓慢旋出微量注射管。观察大鼠生命体征后，缝合头皮皮肤，腹腔注射青霉素后放入鼠笼中观察至麻醉作用消失。

按照Racine分级标准，造模后出现IV级以上发作定为造模成功，未达到IV-V级发作的归入造模不成功组而弃用；造模大鼠癫痫发作达V级并持续超过30min则予以***注射液2mg(10mg/kg)肌注终止发作。成模大鼠进行随机分组如表2。第5d后开始灌胃给予药物治疗，每天1次，共30d。实验期间采用视频记录大鼠行为学，IV级及以上的自发性发作纳入数据统计，记录并分析其出现时间、次数及严重程度。所有灌胃药物均用5‰羧甲基纤维素钠溶液配制，空白组、假手术组和模型组大鼠灌胃同体积的5‰羧甲基纤维素钠溶液。给药第30d将各组大鼠断头取脑并取血，全血静置10min后离心取上层血清，在冰面上分离双侧大脑海马及皮层，全部取材完毕后放置于-80℃冰箱中保存备用。

3.3实验结果

表6各分组对KA诱导的癫痫大鼠模型药效学评价结果

与空白组(CON)大鼠相比，模型组(MOD)大鼠出现IV-V级的惊厥性全身强直阵挛性发作、前肢痉挛直立、跌倒等症状；与模型组相比，对照药组(TLG)能明显改善大鼠癫痫症状，仅有1只大鼠出现IV级以上的严重癫痫持续状态(Status Epilepticus，SE)，同时能够显著延长大鼠惊厥潜伏期、缩短惊厥持续时间；与模型组比较，北柴胡地上部分乙醇提取物和挥发油、北柴胡根乙醇提取物和挥发油能够改善大鼠癫痫症状，降低SE发生率(P<0.05)(表6)，同时能够延长模型大鼠惊厥潜伏期和缩短惊厥持续时间。

3.4协同效果验证

参见以上第1.4节的计算方法，对北柴胡地上部分挥发油与拉莫三嗪联用的协同效果进行验证。

具体的，如表6中所示的数据，北柴胡地上部分挥发油组(VAH组)的有效率(＝1-SE发生率)为40％，对照药物拉莫三嗪组(TLG)的有效率是50％，北柴胡地上部分挥发油+拉莫三嗪组(VA+TLG组)的有效率是95％，经计算，q＝1.36＞1，验证了北柴胡地上部分挥发油与拉莫三嗪联用具有协同效果。

综合以上研究结果可以看出，北柴胡地上部分乙醇提取物和北柴胡地上部分挥发油均具有改善红藻氨酸诱导的癫痫大鼠模型癫痫状态的药理作用，且其乙醇提取物抗癫痫作用与北柴胡根相当、挥发油抗癫痫作用优于北柴胡根。北柴胡地上部分挥发油与拉莫三嗪联合使用的效果明显优于单药使用以及北柴胡地上部分乙醇提取物或柴胡复方与拉莫三嗪联合使用的效果。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。