阅读说明：本技术 一种酶解兔血发酵液制备抗氧化低聚肽的方法 () 是由 肖岚 董平 辛松林 安攀宇 李燮昕 吕龙 于 2019-09-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种酶解兔血发酵液制备抗氧化低聚肽的方法,其包括步骤：首先,分别制备枯草芽孢杆菌种子培养液、凝结芽孢杆菌种子培养液和植物乳杆菌种子培养液；按体积比3:1:1的比例,将枯草芽孢杆菌种子培养液、凝结芽孢杆菌种子培养液和植物乳杆菌种子培养液混合,得到混合种子液；然后,以灭菌后的兔血作为培养底物,将混合种子液接种至培养底物中,接种量为2.5～6.5％,在30～40℃、120-150r/min转速下,培养2-4天,取所得培养液的上清液；之后利用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶复合酶液进行酶解,再进行离心、抽滤和超滤,即得。本发明可以获得具有优异抗氧化性的抗氧化低聚肽,同时,本发明所得的多肽含量高。()

一种酶解兔血发酵液制备抗氧化低聚肽的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酶解兔血发酵液制备抗氧化低聚肽的方法。

背景技术

我国是世界上第一养兔大国，是世界兔肉生产和加工大国。兔业是一个具有发展特色的优势产业，在我国畜牧业全面发展中占重要的一部分。据研究发现，兔肉中蛋白质和赖氨酸含量分别高达21.21％、10.6％，可消化率高达85％，脂肪含量仅3.89％，胆固醇含量较猪、牛、羊、鸡肉的胆固醇含量分别低于63％、41％、8％和15％。兔肉富含人体所需各种矿物质，其中钙含量高达12.8mg/100g，也由于其自身生长特点，受环境、农兽药等有毒有害物质污染的程度低，营养价值极高。长期摄入能够提高人体的免疫力，促进青少年生长发育，减少心血管病、脑血管病的发病率，提高人体新陈代谢等功能。

按照经济发展兔业的主要用途为三个方面：肉用、毛用和皮用，其中并没有对兔血进行回收利用。在屠宰过程中血液被大量丢弃，不仅是对蛋白质资源的一种浪费，还造成了环境的污染。目前对兔血的研究报告还相对较少，研究的方向也主要集中在生物医学方面，杨文润等探讨了兔血替代人血在医疗器械血液相容性评价中的可行性(杨文润,田胜慧,柯军.家兔血液应用于医疗器械血液相容性评价的可行性研究[J].中国医疗器械信息,2016,22(13):41-45)；曾丽研究了兔血中超氧化物歧化酶的提取与应用(曾丽.兔血超氧化物歧化酶的提取及其在酸奶中的应用[D].四川农业大学,2014)；单纯研究从兔血中分离出治疗失眠的药物(单纯.从兔血中分离出治疗失眠的药物[J].医学情报通讯,1985(01):8)。然而关于利用兔血发酵液制备抗氧化低聚肽的研究，迄今为止还未见报道。

生物活性肽是由两个或两个以上的氨基酸按照不同组成和排列方式脱水构成的，含有羧基和氨基的，具有特殊生理调节功能的两性化合物。抗氧化低聚肽是多种生物活性肽中的一种，不仅比其他游离氨基酸吸收多、消化快，还具有清除自由基、维持自由基平衡、抑制或减缓氧化反应、提高生物体免疫力、抗衰老等功能。由于其有极强的抗氧化活性、多样性和较高的安全性，近年来已备受人们关注，在保健品和医药、化妆品和食品添加剂等领域都有广阔的应用前景。根据其制备的产物不同可将抗氧化肽分为化学合成类抗氧化肽和天然类抗氧化肽两类。化学合成类抗氧化肽存在明显的优缺点，优点是能抑制油脂氧化作用、价格相对较低，缺点是使用量受到严格控制且存在明显的毒副作用。然而，介于蛋白质和氨基酸间的天然抗氧化肽类，具有极强的生物活性和多样性，安全性高，抗氧化性也更为显著。于是各种天然抗氧化肽的研究近年来备受人们关注，在保健品和医药、化妆品和食品添加剂等领域都有广阔的应用前景。

制备抗氧化低聚肽的方法有很多。目前国内外主要是采用三种方法，一是微生物发酵法，二是控制水解参数的酶解法，三是最合理也是最常用的菌酶联合的制备方法。

微生物发酵法是指在适宜的生长代谢条件下，某些微生物会产生大量的蛋白酶。这些菌体产生的蛋白酶可以水解发酵底物从而产生生物活性肽，而生物活性肽则可促进微生物的代谢及产酶能力。两者相互促进，从而大大提高了多肽的产生速率。目前，枯草芽孢杆菌、黑曲霉、乳酸菌、酵母菌等微生物在微生物发酵法中应用广泛，其中霉菌和枯草芽孢杆菌分别较多的参与固态发酵和液态发酵。祁红兵等研究发现利用微生物发酵法进行液体发酵米糠，发酵上清液所得的体外自由基清除能力指标均有显著的提高(祁红兵,陈钧,何佳,等.纳豆芽孢杆菌发酵米糠上清液的抗氧化功能研究[J].食品科学,2008(03):293-297)。李峰用纳豆芽孢菌发酵蚕蛹蛋白，发现低分子蚕蛹蛋白肽得率高达到53.75％(李峰,李丽,宗绪岩.纳豆菌发酵蚕蛹蛋白制备低分子蛋白肽的工艺优化[J].食品工业,2014(04):14-17)。

酶解法应用于制备抗氧化肽比较普遍，利用蛋白酶分解蛋白质，获得肽段，产生生物活性肽。酶解法存在明显的优劣势，其优势主要体现在多肽的营养价值能保存较好、反应的条件较温和、不会产生任何的毒副产物、且可获得最大化的目标肽段。其劣势主要表现于酶解法会产生苦味肽使其产品的风味变差、商品酶不仅品种少且价格昂贵、酶解规模小。雷鸣利用木瓜蛋白酶酶解大豆制备抗氧化活性肽，发现产物有强烈的抗氧化活性(雷鸣.大豆多肽抗氧化研究[D].兰州,兰州理工大学,2007)。严群芳等人在一定条件下研究大豆酶解物抗氧化能力时，发现木瓜蛋白酶的水解产物具有较高的抗氧化活性(严群芳,张莉莉,王恬.大豆蛋白酶解物抗油脂氧化性研究[J].粮油加工,2006(03):45-46)。

菌酶联合法是指将微生物发酵法与酶解法联合起来，结合两者的优势使蛋白质降解得更彻底，得到更小的肽段。同时蛋白质在降解的过程中，菌酶修饰了小肽末端，避免了苦味肽的产生，提高了多肽产物的口感及风味，同时提高了多肽的营养价值和质量。孙宏采用菌酶联合的方法协同处理棉籽粕，采用枯草芽孢杆菌发酵用木瓜蛋白酶酶解，使棉籽蛋白的体外消化率和DPPH清除能力均有显著增强(孙宏.菌酶协同处理棉籽粕的营养特性、棉籽肽的制备及其抗氧化活性研究[D].杭州,浙江大学,2013)。

为了从兔血中通过发酵和酶解获得高效的抗氧化肽，首先要解决兔血发酵制备具有相对高的抗氧化性的粗肽液，再选择合适的酶解方式，提高相应的抗氧化性和多肽含量的指标。然而，目前，现有技术中尚未有相关的报道。

发明内容

针对现有技术的缺点和需求，本发明的目的在于提供一种可以获得高抗氧化性抗氧化低聚肽及高多肽含量的、以兔血为原料的制备方法。

为了实现上述目的，本申请采用如下技术方案：

一种酶解兔血发酵液制备抗氧化低聚肽的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)、分别制备枯草芽孢杆菌种子培养液、凝结芽孢杆菌种子培养液和植物乳杆菌种子培养液；按体积比3:1:1的比例，将枯草芽孢杆菌种子培养液、凝结芽孢杆菌种子培养液和植物乳杆菌种子培养液混合，得到混合种子液；

(2)、以灭菌后的兔血作为培养底物，将混合种子液接种至培养底物中，接种量为2.5～6.5％；

(3)、对步骤(2)所得物，在30～40℃、120-150r/min转速下，培养2-4天，取所得培养液的上清液；

(4)、利用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶混合酶液对步骤(3)所得上清液进行酶解，酶解时，酶底比为100～500U/g、酶解时间2～4h、pH值8.0～8.5、酶解温度50～60℃；其中，碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的活力单位之比为1.5～4:1；

(5)、对步骤(4)所得的酶解液进行离心、抽滤和超滤，即得抗氧化肽。

作为本发明一个可选的实施方案，所述枯草芽孢杆菌种子培养液是将活化好的枯草芽孢杆菌斜面菌种单菌落接种入灭菌后的种子液体培养基中，于35℃，转速135r/min的恒温振荡培养箱中培养12h，所述种子培养液体培养基的配方为：葡萄糖10g/L、牛肉膏10g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L，pH＝7.0。

作为本发明一个可选的实施方案，所述凝结芽孢杆菌种子培养液是将活化好的凝结芽孢杆菌斜面菌种单菌落接种入灭菌后的种子液体培养基中，于35℃，转速135r/min的恒温振荡培养箱中培养12h，所述种子培养液体培养基的配方为：葡萄糖6g/L、牛肉膏10g/L、蛋白胨10g/L、磷酸一氢钾2g/L、七水硫酸锰1g/L，pH＝7.0。

作为本发明一个可选的实施方案，所述植物乳杆菌种子培养液是将活化好的植物乳杆菌斜面菌种单菌落接种入灭菌后的种子液体培养基中，于35℃，转速135r/min的恒温振荡培养箱中培养12h，所述种子培养液体培养基的配方为：葡萄糖20g/L、牛肉膏10g/L、蛋白胨10g/L、磷酸一氢钾2g/L、七水硫酸锰0.25g/L、柠檬酸三钠3g/L，pH＝7.0。

作为本发明一个优选的实施方案，所述兔血的浓度为10g/mL。作为本发明一个优选的实施方案，步骤(4)中，酶解时，酶底比为200U/g、酶解时间2.5h、pH值8.5、酶解温度60℃；其中，碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的活力单位之比为2:1

作为本发明一个优选的实施方案，步骤(3)中，对步骤(2)所得物，在37℃、135r/min转速下，培养3.5天。

作为本发明一个可选的实施方案，步骤(5)中，进行离心时，用高速冷冻离心机进行离心，离心参数为：温度为4℃、转速为6000r/min、时间20min。

作为本发明一个可选的实施方案，步骤(5)中，进行抽滤时，利用0.45μm滤膜过滤；进行超滤时，利用5KD滤膜于离心机进行，离心参数为：温度4℃，转速4000r/min，时间10min。

在本发明之前，有《枯草芽孢杆菌发酵牦牛血制备抗氧化肽工艺优化》、《牦牛血抗氧化肽制备方法对比及分离纯化研究》曾利用枯草芽孢杆菌从牦牛血中提取抗氧化肽，并取得了良好的结果。本发明在上述报道技术的基础上，对兔血进行了相应的实验，也获得了一定的效果，但总体而言，所得抗氧化肽对于ABTS+的清除率仍未能尽如人意，多肽含量较低。

在利用枯草芽孢杆菌作为发酵菌的基础上，本发明发明人将凝结芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌进行混菌发酵，但是对于所得抗氧化肽的ABTS+清除率和多肽含量并没有明显提升。经过大量的摸索，发明人发现将枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和植物乳杆菌三者混合进行混菌发酵，可以大幅度的提升发酵所得抗氧化肽对于ABTS+的清除率和多肽含量。除此之外，发明人还发现，本发明的混菌发酵所得抗氧化肽还可以大幅度的提升对于·OH和·O₂-自由基的清除。因此，本发明对于本领域的贡献在于提供了一种可以利用兔血制备具有高抗氧化性的抗氧化肽的方法。在获得上述实验结果的基础上，本发明的发明人利用枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌进行混菌发酵，发现所得抗氧化肽的对于ABTS的清除率相对于利用枯草芽孢杆菌进行单菌发酵所得的抗氧化肽并没有提升。因此，可以确定，枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌活菌和植物乳杆菌在进行发酵时，对于所得抗氧化肽的抗氧化性和多肽含量起到了协调增效的作用。

在上述实验结果的基础上，本发明的发明人考察了酶解方式的选择。《酶解牦牛血发酵液制备抗氧化肽工艺优化》考察了几种酶联合发酵对所得抗氧化肽的影响。然而，本发明的发明人发现，对于本发明，仅用单酶联合发酵，无论是对于抗氧化性还是多肽含量的提升均没有明显影响。通过大量的摸索之后，发明人发现，当采用碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的复合酶联合发酵制备抗氧化肽之后，相比于仅用发酵工艺制备所得的抗氧化肽的抗氧化性和多肽含量均有明显的提升。

本发明的有益效果：

1、本发明所得的抗氧化低聚肽对于ABTS自由基的清除率可达到96.20％，具有优异的ABTS自由基清除效果。

2、本发明制备方法制备得到的多肽含量高，多肽含量可达到4.77mg/ml。

3、本发明所得抗氧化低聚肽对于·OH自由基的清除率可达到93.22％、对于·O₂-自由基的清除率可达到94.10％。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

1.1实验材料

枯草芽孢杆菌：SICC.197.四川省微生物资源平台菌种保藏中心

凝结芽孢杆菌：CGMCC No.6729中国普通微生物菌种保藏管理中心

植物乳杆菌：CGMCC No.5105中国普通微生物菌种保藏管理中心

碱性蛋白酶(酶活力85.61U/mg)：上海Kayon公司

木瓜蛋白酶(酶活力800U/mg)：上海Kayon公司

1.2实验试剂

lowry法蛋白浓度试剂盒：北京索莱宝科技有限公司

国产化学分析纯：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、氯化钠、葡萄糖、琼脂、ABTS、K2S2O8、三氯乙酸(TCA)、磷酸一氢钾、七水硫酸锰、磷酸二氢钠、柠檬酸三钠。

1.3实验仪器

HHS-8S型电子恒温不锈钢水浴锅：上海光地仪器设备有限公司；

H2050R台式高速冷冻离心机：长沙湘仪离心机有限公司；

QYC-2102C型恒温振荡培养箱：上海福玛实验设备有限公司；

XW-80A型漩涡混合器：上海驰塘电子有限公司；

FALL04N型电子天平：常州市衡正电子仪器有限公司；

UV Power型紫外可见分光光度计：北京莱伯泰科仪器有限公司；

STARTER3100型PH计：上海奥豪斯有限公司；

XHF-D型高速分散器(内切式匀浆机)：宁波新芝生物科技股份有限公司；

GM-0.33型隔膜真空泵：天津市津腾实验设备有限公司；

WP-UP-UV-20型超纯水机：四川沃特尔科技发展有限公司；

JJ-CJ-2FD型洁净工作台：苏州市金净净化设备科技发展有限公司；

GZ-150-S型生化培养箱：韶关市广智科技设备有限公司；

移液枪：德国Brand公司；

超滤管(5kDa、1kDa)：德国Sartorius公司、美国Pall公司。

1.4混合种子液的制备

将活化后的枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和植物乳杆菌，分别挑取适量接入装有50mL各自液体培养基的锥形瓶中，放在温度为35℃，转速135r/min的恒温振荡培养箱中培养12h，分别得到各自的种子培养液(1×10⁹cfu/mL)。试验用用培养基配制参数如下表1：

表1种子培养基的配制

其中，种子培养基1为枯草芽孢杆菌种子培养液体培养基，所述种子培养基2为凝结芽孢杆菌种子培养液体培养基，所述种子培养基3为植物乳杆菌种子培养液体培养基；调至合适pH后，高压蒸汽灭菌锅灭菌20分钟，冷却备用。

1.5抗氧化低聚肽的发酵酶解制备

发酵液制备：按体积比3:1:1的比例，将枯草芽孢杆菌种子培养液、凝结芽孢杆菌种子培养液和植物乳杆菌种子培养液混合，得到混合种子液；以灭菌后的兔血作为培养底物，将混合种子液接种至培养底物中，接种量为4.5％；在37℃、135r/min转速下，培养3.5天，取培养液的上清液。

酶解：利用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶混合酶液对经发酵后的培养液上清液进行酶解，酶解时，酶底比为200U/g、酶解时间2.5h、pH值8.5、酶解温度60℃；其中，碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的活力单位之比为2:1。

离心：将培养后的发酵液称取相同重量于离心管中，对称放置在高速冷冻离心机，设置离心参数为：温度为4℃、转速为6000r/min、时间20min。结束后用移液枪吸取上清液，低温下保存。

抽滤：将离心后的兔血粗提液在抽滤装置中经0.45μm滤膜过滤，去除菌体和残渣得到过滤液体，低温保存。

超滤：选用5KD的滤膜，称取等量过滤液，对称放置于离心机内，设置参数为：温度4℃，转速4000r/min，时间10min，用移液枪吸取离心管内液体，得到纯度较高的兔血抗氧化低聚肽。

1.6抗氧化活性的测定

1.6.1抗氧化低聚肽的ABTS+清除率测定

取适量ABTS粉末溶于一定量蒸馏水中，配置成浓度为7mmol/L的ABTS溶液，加入等体积2.45mmol/L的K2S2O8溶液混合均匀，混合液在室温避光条件下静止12-16h，以磷酸盐缓冲液(0.2mol/l,pH7.4)稀释，使其在734nm时吸光度达到0.70±0.02形成墨绿色ABTS+测定液。

取4.0mL的ABTS+测定液，加入兔血抗氧化活性肽样品溶液100μL，准确振荡30s，测定反应体系在734nm处的吸光值。空白管用磷酸盐缓冲液代替样品，对照管用磷酸盐缓冲液代替ABTS+测定液。ABTS+清除率计算公式如下：

ABTS自由基清除率(％)＝[A0-(A1-A2)]/A0×100％

式中：A0—空白管的吸光度；A1—测定样品的吸光度；A2—对照管的吸光度。

1.6.2抗氧化低聚肽的·OH清除率测定

参考张凤英的学位论文《猪血红蛋白的酶解及其产物抗氧化活性研究》中的方法进行测定，具体为：各试管中加入1mL待测样品溶液，分别加入1mL 9mmol/L水杨酸—乙醇溶液与1mL 9mmol/L FeSO₄混合均匀，最后加入1mL8.8 mmol/L H₂O₂混匀，静置于37℃水浴锅保温30min，采用紫外-可见分光光度计测OD510nm。空白组以超纯水代替样品溶液，对照组以超纯水代替除样品以外3种溶液。样品对羟基自由基的清除率的计算方式如下：

ABTS自由基清除率(％)＝[1-(A1-A2)]/A0×100％

式中：A0—空白管的吸光度；A1—测定样品的吸光度；A2—对照管的吸光度。

1.6.3抗氧化低聚肽的·O₂-清除率测定

取200μL大豆卵磷脂溶液(20mg卵磷脂，溶于5mL 0.05mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液)，和1mL不同浓度的样品溶液混合均匀，加入50μL 50mmol/L FeSO4，并以0.1mmol/L pH7.4磷酸缓冲液补足至体系总体积为3mL，37℃水浴40min，分别加入0.8mL 15g/L TCA和1mL0.8g/L TBA，沸水浴15min后冷却，6 000r/min离心10min，取上清液用紫外-可见分光光度计在532nm波长下测定其吸光度。空白组用磷酸缓冲液代替样品溶液。脂质过氧化清除率的的计算方式如下：

脂质过氧化清除率(％)＝(1－A1/A0)×100％

式中，A0为空白组的吸光度；A1为实验组的吸光度。

1.7多肽含量的测定

取4mL多肽样品加入同等体积15％(w/v)的三氯乙酸(TCA)均匀混合，静止使大分子蛋白沉淀，设置参数为6000r/min在高速离心机中离心15min，再用Lowry法测定上清液蛋白含量,计为上清液多肽含量。

即取适量Folin酚甲试剂A和B按50：1混合(混合后有效期24小时，过期失效)，根据所需量，将BSA标准品用PBS稀释10倍至浓度0.5mg/ml，取5ml离心管，标号，加入200ul适当稀释的多肽，加入2ml Folin酚甲试剂，混匀后室温放置10分钟。再加入200ul Folin酚乙试剂，混匀，37℃恒温放置30分钟，用紫外-可见分光光度计测定，设定波长为650nm，以所得吸光度计算上清液蛋白浓度，计为上清液中多肽含量。

1.8实验结果

本发明所得抗氧化低聚肽对于ABTS+、·O₂-和·OH的清除率结果和本发明制备方法所得的多肽含量结果如表2所示：

表2

ABTS+清除率(％)	·O<sub>2</sub>-清除率(％)	·OH清除率(％)	多肽含量(mg/ml)
				96.20	93.22	94.10	4.77

对比实施例1

除了缺少酶解步骤之外，其余与实施例1一致，所得抗氧化肽的ABTS+清除率为94.00％、·O2-清除率为89.31％、·OH清除率为91.27％、多肽含量为3.42mg/ml。

对比实施例2

除了种子培养液中的菌仅含枯草芽孢杆菌之外，其余与对比实施例1一致。所得抗氧化肽的ABTS+清除率为84.64％、·O2-清除率为77.35％、·OH清除率为79.66％、多肽含量为2.84mg/ml。

对比实施例3

除了混合种子液是枯草芽孢杆菌种子培养液和凝结芽孢杆菌种子培养液按照3:1的比例混合而得之外，其余与对比实施例1一致。所得抗氧化肽的ABTS+清除率为86.13％、·O2-清除率为78.22％、·OH清除率为80.17％、多肽含量为2.80mg/ml。

对比实施例4

除了将复合酶改为仅用碱性蛋白酶之外，其余与实施例1一致。所得抗氧化低聚肽的ABTS+清除率为94.35％、·O2-清除率为90.65％、·OH清除率为92.36％、多肽含量为3.51mg/ml。