微针贴片及其在伤口愈合中的应用
阅读说明：本技术 微针贴片及其在伤口愈合中的应用 (Microneedle patch and application thereof in wound healing ) 是由 王贤松 尹梦婷 于 2021-08-04 设计创作，主要内容包括：一种微针贴片,包括支撑层和微针,微针尖端是负载Mg-MOF的γ-PGA水凝胶,以实现在真皮中的控制和长期释放。本发明提供的微针贴片能具有促进细胞迁移和小管生成的能力,具有促进血管生成、抗氧化和抗炎的协同作用,高效的伤口愈合能力,有效促进糖尿病病患的创面愈合。(A microneedle patch comprising a support layer and microneedles, the microneedle tips being Mg-MOF loaded γ -PGA hydrogel to achieve controlled and long-term release in the dermis. The microneedle patch provided by the invention has the capability of promoting cell migration and tubule generation, has the synergistic effects of promoting angiogenesis, resisting oxidation and inflammation, has high-efficiency wound healing capability, and effectively promotes wound healing of diabetic patients.)
技术领域
本发明涉及一种由生物材料制造的医疗器械，尤其涉及一种具有微针的贴片，用于促进伤口，尤其是糖尿病患者伤口的愈合。
背景技术
慢性不愈合伤口是全球健康和经济的主要威胁之一。约15％至25％的糖尿病患者在其一生中会出现糖尿病足溃疡(DFU病)。全球DFU的年发病率在910万至2610 万之间。目前，我们对复杂伤口愈合过程的了解仍然有限，对慢性不愈合DFU病的有效治疗仍然难以捉摸。因此，迫切需要开发新的促进伤口愈合的有效策略。
伤口愈合过程一般分为三个阶段：炎症、增生和组织重塑。因此，希望开发一种多功能平台，不仅能从炎症中促进伤口愈合，还能加速细胞增殖和组织重塑。一些金属离子(如：银离子、锌离子和铜离子)能够抑制细菌感染，从而避免抗生素耐药性。此外，金属离子(如：Mg2+、Zn2+和Cu2+)作为基本生化反应的必需物质，也可以帮助细胞增殖和组织再生。与药物或生物治疗剂相比，金属离子因其更低的产品开发成本和更短的上市时间而备受青睐。然而，常规治疗通常采用直接和多次施用金属离子，这引起了对患者毒性的担忧，并可能导致不一致的结果。
近年来，金属有机骨架材料作为一种有吸引力的纳米平台被用于药物控制释放。MOFs是一类由金属离子或团簇与有机配体配位形成结晶多孔材料的化合物。由于其可调的组成和结构、多功能性和增强的生物相容性，多孔膜是金属离子储存和释放的有前途的候选材料。此前，铜基金属有机框架材料(Cu-MOFs)已被报道用于糖尿病伤口愈合，其实现了Cu2+的持续释放，降低了Cu2+的细胞毒性，并促进了细胞迁移、血管生成、胶原沉积。然而，治疗效果仍然很大程度上受限于现有金属有机框架材料无法进行组织渗透，这些载体仅接触伤口区域的表面。为了克服这一挑战，需要一种将载体将药物输送到真皮深层的有效策略。
近年来，可溶性聚合物微针贴片(MN)作为一种给药系统引起了广泛的研究兴趣。MN可用于多种物质的透皮给药，包括小分子药物、蛋白质和细胞因子。通常，治疗剂被包封在MN中，其中MN的生物相容性聚合物在真皮深层快速溶解和释放包封剂。MN贴片可以长时间持续释放治疗药物，克服局部药物传递的问题，最大限度地减少疼痛和组织损伤，减少伤口对外界环境的暴露。虽然MN在不同治疗剂的透皮给药方面示出优势，但其在基于MOF的纳米治疗剂在皮肤深部的控制释放方面的应用却鲜有探索。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种微针贴片，用于伤口，促进愈合。
本发明的另一个目的在于提供一种微针贴片，由可溶性聚合物制成，用于伤口，促进愈合。
本发明的另一个目的在于提供一种微针贴片，由可溶性聚合物制成，用于糖尿病足溃疡，促进愈合。
一种微针贴片，包括支撑层和微针，微针一端与支撑层连接。支撑层由氧化石墨烯/银纳米复合材料(GO-Ag)负载γ-多聚谷氨酸(γ-PGA)制成，在微针尖端是负载 Mg-MOF的γ-PGA水凝胶，以实现在真皮中的控制和长期释放。
Mg-MOF化合物由Mg2+和没食子酸组成，在酸性微环境中缓慢释放。释放的Mg2+能够促进血管生成以及调节炎症，并且其细胞毒性比先前研究中使用的Cu2+低。同时，释放的没食子酸可以清除过量产生的细胞内活性氧，从而减轻活性氧诱导的巨噬细胞炎症。
伤口为外来微生物的生长提供了有利的环境，导致伤口自然愈合过程的延迟。本发明将GO-Ag被装载到微针背部支撑层。创面抗菌成分抗感染加速愈合过程。体外实验证实了MN-MOF-GO-Ag增强的细胞增殖、迁移和抗炎活性。此外，观察到在体内用MN-MOF-GO-Ag处理的伤口愈合显著增强。
经验证，本发明制得微针贴片能具有促进细胞迁移和小管生成的能力，细胞产生的活性氧可以被MN-MOF-GO-Ag释放的Mg-MOF有效清除。
MN-MOF-GO-Ag具有血管生成促进、抗氧化和抗炎的协同作用，高效的伤口愈合能力，有效促进糖尿病病患的创面愈合。
附图说明
图1为MN-MOF-GO-Ag支持的体外细胞迁移和小管形成的结果图；
图2为MN-MOF-GO-Ag的体外抗氧化实验结果图；
图3为MN-MOF-GO-Ag的体外抗菌实验结果图；
图4为糖尿病小鼠体内伤口愈合评估结果图；
图5为糖尿病小鼠体内伤口愈合评估染色图。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
实施例1Mg-MOF的合成与表征
没食子酸(H4gal)和Mg2+盐在pH12的溶剂(如：水或缓冲液)中反应制成的多孔Mg-MOF，它将通过π-π堆积相互作用自组装成纳米微球。首先，将10g氯化镁和 38g H4gal加入到含有500毫升H2O的圆底烧瓶中，并在回流下搅拌。然后用10mol·L-1 KOH溶液将溶液pH调至8，混合溶液在马弗炉(中国郑州韩信仪器设备有限公司 Sxi-8-10)中于20-140℃加热24h。通过在离心机(12000rpm，15分钟，4℃)中分离获得浅灰色固体，并用H2O洗涤两次。为了将3毫克Mg-MOF加入到600微升的γ-PGA 水凝胶(0.35g 600μL-1)中。使用超声波清洗机(SK 1200BT，KUDOS，中国上海)将混合溶液在4℃超声处理30分钟。然后，将300微升EDC(55mg·mL-1)加入到600微升 Mg-MOF中进行交联，制备Mg-MOF水凝胶。
Mg-MOF的场发射扫描电子显微镜(FESEM)成像和扫描电子显微镜(SEM)成像均显示出大小约为10μm的均匀球形结构。使用明场扫描电子显微镜通过元素绘图确认了Mg-MOF纳米材料的组成，显示碳(碳)、镁(镁)和氧(氧)在镁-多壁碳纳米管纳米颗粒中的均匀分布。粉末X光衍射(XRD)表征进一步验证Mg-MOF的成功合成，这与文献中报道的结果一致(CHEM.COMMUN,51(2015)5848-5851)。此外，Mg-MOF 的吸收曲线在260纳米处显示出特征峰，在浓度高达120μg·mL-1的Mg-MOF，没有观察到明显的细胞毒性。
实施例2制取MN-MOF-GO-Ag微针贴片
采用溶剂热法合成了GO-Ag。将0.1克GO片状粉末加入到100毫升去离子水中，并在超声波清洗器中超声30分钟。然后，将10毫米的硝酸银溶液加入到5毫升的去离子水溶液中，混合物进行超声振动10分钟。然后，将混合物在离心机中离心以除去上清液，从而获得GO-Ag沉淀，并用H2O洗涤两次以除去残留的Ag+。
将3mL GO-Ag加入到600μL的γ-PGA水凝胶中，并用超声波清洗器将混合溶液在4℃超声40分钟。然后，将300微升EDC(5mg mL-1)加入到600微升GO-Ag水凝胶中进行交联，制得GO-Ag水凝胶。
微针贴片的制造和表征:微针模具是通过放电加工工艺制备的。有限公司，新加坡)。负载Mg-MOF的微针贴片通过两步铸造工艺制造。(尼康ECLIPSE E 100，尼康公司，日本)以观察其形态。
本实施例制取微针贴片的模具由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成，从MicropointTechnologies Pte购买。通过两步模板复制法，将Mg-MOF和GO-Ag分别装载到针尖和支撑层中来制造微针贴片。即微针尖端采用载Mg-MOF的γ-PGA水凝胶，背部支撑结构采用GO-Ag和γ-PGA水凝胶的混合物作为第二层。在真空下将Mg-MOF水凝胶完全填充到模具的锥形微腔针尖中。将GO-Ag水凝胶加入微针底部的凹槽中，离心 5分钟(5100rpm，30℃)，用棉签擦去表面残留的凝胶。将填充好的模具放入37℃的烘箱中干燥6小时。最后，将干燥的MN-MOF-GO-Ag脱模并在显微镜下分析
制得微针贴片为10×10阵列由200微米×200微米×600微米(宽×长×高)的微针组成。此外，扫描电镜图像显示微针尖端在支撑层上有序排列，其是尖锐的并且排列成金字塔形状。这种尖锐的金字塔结构确保MN能够快速、无创、准确地插入深层皮肤。接下来，通过使用荧光标记的FITC-BSA来评估Mg-MOF在微针内的分布，该蛋白质与Mg-MOF粉末混合，然后装载在微针的尖端内。用共聚焦显微镜捕获的荧光图像显示，荧光信号均匀地分布在整个微针针尖结构中，这意味着Mg-MOF被均匀地装载到微针尖端，成功合成了负载Mg-MOF的MN-MOF-GO-Ag微针贴片，这可能允许透皮给药。
实施例3MN-MOF-GO-Ag支持的体外细胞迁移和小管形成
高血糖损害细胞的迁移，导致皮肤成纤维细胞粘附不足，从而延迟伤口愈合时间。因此，促进血管生成是糖尿病伤口愈合的关键步骤。据报道，高浓度的镁离子能够刺激细胞迁移和增殖，从而促进血管生成。为评价人脐静脉内皮细胞的促血管生成作用，研究了人脐静脉内皮细胞的迁移。图1A显示，Mg-MOF和MN-MOF-GO-Ag处理组的细胞迁移比空白对照组显著得多。特别是，定量分析显示，MN-MOF-GO-Ag组的人脐静脉内皮细胞迁移率比空白对照组高3.5倍(图1B)。同时，进行小管形成实验以进一步评估Mg2+的促成管活性。结果显示，与对照组相比，暴露于Mg-MOF和 MN-MOF-GO-Ag的人脐静脉内皮细胞的管形成显著增加(图1C)。在血管分支点和平均管长度方面都观察到相当大的增强(图1D)。由此可见，MN-MOF-GO-Ag在体外具有促进细胞迁移和小管生成的能力，可以用于在体内促进血管生成和伤口愈合。
实施例4MN-MOF-GO-Ag的体外抗氧化和抗菌能力
用2,2-二苯基-1-苦基酰肼(DPPH)自由基清除法测定MN-MOF-GO-Ag的抗氧化作用。如图2A所示，随着Mg-MOF浓度的增加，自由基抑制率逐渐增加，在Mg-MOF 浓度为60μg·mL-1时达到最大，确定为75％抑制率。同时，含Mg-MOF的 MN-MOF-GO-Ag处理显示出与Mg-MOF溶液相当的抑制率。因此，Mg-MOF能够保护没食子酸，并且能够通过没食子酸的抗氧化和抗炎特性促进糖尿病伤口愈合。从 MN-MOF-GO-Ag中释放的Mg-MOF保留了其优异的抗氧化性能，并能去除皮肤伤口中过量的活性氧。
此外，通过测试在与不同浓度下Mg-MOF共孵育的人成纤维细胞的细胞活力，在体外探索了Mg-MOF的抗氧化特性(图2B)。发现与仅用H2O2孵育的细胞相比，添加 Mg-MOF能够显著提高细胞活力。接下来，使用2’,7’二氯二氢荧光素二乙酸酯 (DCFH-DA)作为ROS探针，并通过绿色荧光强度评估孵育期间的ROS水平。当人成纤维细胞在含有H2O2的细胞培养基中孵育时，产生强烈的绿色荧光(图2C)。值得注意的是，当用30μg·mL-1Mg-MOF处理细胞，然后用H2O2刺激时，荧光强度显著降低。此外，通过将Mg-MOF化合物浓度增加到60μg·mL-1，荧光进一步减弱。当细胞在含有从MN-MOF-GO-Ag释放的Mg-MOF的培养基中孵育时，活性氧浓度也显著降低(图2D和2E)。这些结果表明，细胞产生的活性氧可以被MN-MOF-GO-Ag释放的Mg-MOF有效清除。
由于其良好的抗菌效果，微针贴片的支撑层被选择为GO-Ag水凝胶。为了评估 GO-Ag成分的抗菌活性，将负载GO-Ag的微针贴片与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或铜绿假单胞菌在37℃下培养24小时。如图3所示，含有GO-Ag的微针贴片对这些不同类型的细菌具有明显的生长抑制作用。相比之下，不含GO-Ag的微针贴片没有任何抗菌效果。因此，GO-Ag的加入有助于减轻持续性炎症，促进MN-MOF-GO-Ag对伤口愈合过程的治疗效果。
实施例5糖尿病小鼠体内伤口愈合评估
通过在糖尿病小鼠(db/db)背部创建6mm圆形伤口来建立小鼠模型。手术后，将所有小鼠随机分为四组，采用不同的治疗方法。采用与制备MN-MOF-GO-Ag相同的方法，将GO-Ag或Mg-MOF装入微针贴片中。为了评估不同组的治疗效果，在治疗0、 3、5、7、10、12、14和17天后拍摄每组的照片进行详细分析(图4A)。对照组不治疗，作为阳性对照。结果表明，治疗17天后，MN-MOF-GO-Ag组的伤口面积明显小于其他三组。从数量上看，对照组的伤口面积率为71％，MN-GO-Ag组为70％，MN-MOF 组为35％，MN-MOF-GO-Ag组为12％(图4B)。这些结果表明MN-MOF-GO-Ag具有高效的伤口愈合能力，这是血管生成促进、抗氧化和抗炎的协同作用的结果。
实施例6治疗后组织再生和血管生成的研究
采用H&E染色用于研究伤口床的收缩、肉芽形成和上皮形成过程。结果表明，经MN-MOF-GO-Ag处理后，肉芽组织间隙宽度最小，上皮组织几乎完全形成。从数量上看，与对照和单一治疗相比，MN-MOF-GO-Ag治疗的肉芽组织宽度显著减少(图 5B)。此外，Masson三色染色显示胶原沉积和血管生成(图5A)。从Masson三色染色观察到，MN-MOF-GO-Ag组的胶原沉积量和取向排列均比MN-Mg-MOF组或 MN-GO-Ag组大，表明联合治疗可显著改善细胞外基质重建和组织重塑。此外，如CD31 的免疫组织化学染色所示(图5C)，在MN-MOF-GO-Ag组(图5D)，伤口床中的毛细血管密度显著增加，这是新血管生成更快的结果。总的来说，MN-MOF-GO-Ag显示了突出的治疗效果，这表现在伤口闭合、组织再生和血管生成方面比对照组和单一药物治疗得以改善。