阅读说明：本技术 一种快速高效检测痕量对苯二胺的方法 (A method of rapidly and efficiently detecting trace p-phenylenediamine ) 是由 张胜利 刘伯芳 张思略 胡代燕 周祚万 裴彥博 于 2019-08-28 设计创作，主要内容包括：一种快速高效检测痕量对苯二胺的方法,具体地,将棉纤维素溶解制备再生纤维素膜,采用高碘酸钠将再生纤维素膜上的羟基选择性氧化为醛基,再通过两步席夫碱反应,制备得到发射黄色荧光的各体系固相荧光检测膜,用于对苯二胺的定性分析和定量检测,本发明具有简单快速、灵敏度高、选择性好的优点。(A method of rapidly and efficiently detecting trace p-phenylenediamine, specifically, gossypin dissolution is prepared into regenerated cellulose film, use sodium metaperiodate by the hydroxyl selective oxidation on regenerated cellulose film for aldehyde radical, pass through two step schiff base reactions again, each system solid phase fluorescent detection film of transmitting yellow fluorescence is prepared, for the qualitative analysis and quantitative detection of p-phenylenediamine, the present invention has the advantages that simple and quick, high sensitivity, selectivity are good.)

一种快速高效检测痕量对苯二胺的方法

技术领域

本发明涉及对苯二胺的分析检测方法，具体涉及采用固相表面荧光光谱法检测痕量对苯二胺的方法。

背景技术

对苯二胺是一种重要的有机化工原料，广泛用于生产染料、颜料、染发剂、橡胶防老剂等。它可以通过吸入、食入或皮肤渗入人体，对肝脏、血液系统、神经系统等造成严重损伤，还具有潜在的致癌、致突变等作用，是一种重要的环境污染物。

目前，检测对苯二胺的方法主要有紫外-可见分光光度法、气相色谱法(GC)、高相液相色谱法、液相色谱-质谱联用法(GC-MS)、电泳法等。这些方法有的灵敏度较低，有的仪器昂贵，有的预处理复杂、操作繁琐。

中国专利文献有如下公开。

文献一：“一种高选择性检测水溶液中对苯二胺的方法”(申请号201510464161.0)利用聚集荧光增强机理，采用液相荧光光谱法对水溶液中的对苯二胺进行检测、

文献一存在的缺点：第一，现有技术对对苯二胺的检测仍采用传统的液相荧光分析法，检测限较高。从现有技术公布的荧光发射图谱来看，0.5mg/L的对苯二胺荧光发射强度仅800左右；而本发明同样浓度下荧光强度达到5700，灵敏度大幅提高，检测限达到7.5μg/L。第二，现有技术的检测原理是利用水杨醛与对苯二胺合成双水杨醛缩对苯二胺希夫碱，后者具有聚集荧光增强现象。在我们的专利中，对苯二胺的一个胺基与二醛纤维素膜的醛基发生席夫碱反应富集到膜表面，之后另一个胺基与水杨醛发生反应制得发生黄色荧光的透明纤维素膜。同时，纤维素膜对分子链的振动和旋转起到限制作用，使得非辐射通道受阻，更容易以辐射方式释放能量，所以荧光强度大大增加。

文献二：(课题组此前申请的专利)专利1“一种PEI改性纤维素膜吸附剂及其制备方法”(申请号201711273187.2)、专利2“一种聚乙烯亚胺基氯胺型抗菌纤维素膜的制备方法及应用”(申请号201810897797.8)和专利3“一种PEI改性纤维素膜吸附剂及其制备方法”(申请号201811530631.9)。

文献二中3个专利仅公开了相应纤维素膜和氧化纤维素膜的制备方法，而不涉及对苯二胺的检测方法。本专利以再生纤维素膜为固相基质材料，通过选择性氧化，制得二醛纤维膜。上述三种专利的制膜环节与本专利相同；氧化环节，专利1(采用双氧水作氧化剂)与本专利不同，专利2和专利3(采用高碘酸钠作氧化剂)与本专利相同。那本发明在氧化环节究竟应该选双氧水还是高碘酸钠作氧化剂呢？为了回答这个问题，本专利在氧化环节经过原理探讨加系列批实验才最终确定选择高碘酸钠作氧化剂。事实上，该环节氧化剂的确定对本领域的技术人员而言，不付出创造性劳动是无法获得的。除了制膜、氧化环节外，上面三个专利与本专利在后续接枝以及应用目的方面是完全不同的。前者是为了制备重金属吸附剂或抗菌纤维素膜，而本发明利用纤维素膜作为固相基质材料检测对苯二胺。

发明内容

本发明的目的是提供一种选择性好、灵敏度高的检测痕量对苯二胺的方法。

本发明是这样实现的：一种快速高效检测痕量对苯二胺的方法，包括以下步骤：

(1)将棉纤维素溶解，制备再生纤维素凝胶膜；

(2)利用高碘酸盐作为氧化剂对(1)得到的再生纤维素凝胶膜进行选择性氧化，制备二醛纤维素凝胶膜；

(3)将二醛纤维凝胶膜浸入不同标定浓度的对苯二胺溶液中反应，得到不同体系的富集对苯二胺的纤维素凝胶膜；

(4)将不同体系的富集对苯二胺的纤维素凝胶膜分别浸入水杨醛溶液中反应，烘干，得到发射黄色荧光的各体系固相荧光检测膜；

(5)在365nm紫外灯照射下，各体系固相荧光检测膜发射黄色荧光用于对苯二胺的定性分析；

(6)测试各体系在370nm激发波长的荧光光谱，以对苯二胺浓度为横坐标，以发射波长545nm下不同对苯二胺浓度对应体系所得固相荧光检测膜的荧光强度为纵坐标，构建线性曲线，定量检测待测对苯二胺的浓度。

所述步骤(2)中的高碘酸盐为高碘酸钠；

所述步骤(3)中，对苯二胺浓度为0-1000μg/L，反应温度为0-45℃，反应时间1-120min，溶液pH值4-9；

所述步骤(3)中，配制对苯二胺溶液的溶剂为乙醇-水或无水乙醇，其中乙醇：水≥1：1。

所述步骤(4)水杨醛溶液浓度为0.05％-1％，溶液pH值为4-9，反应温度为0-55℃，反应时间1-60min。

所述步骤(4)中，配制水杨醛溶液的溶剂为无水乙醇

所述步骤(3)中，对苯二胺溶液浓度为0,10，……，1000μg/L；反应温度25℃，反应时间为1h，溶液pH值为8；对苯二胺溶液pH值是用0.1mol/L的盐酸或氢氧化钠来进行调节的。

所述步骤(4)中，水杨醛浓度为0.5％，不调pH值，反应温度为25℃，反应时间为10min。

与现有技术相比，本发明具有以下特点和优点：

(1)选择再生纤维素膜为固相表面荧光分析的固相基质材料。固相表面荧光光谱法的关键是选择合适的固相基质材料，目前常用的固体基质材料有硅胶、氧化铝、尼龙膜、滤纸和聚糖类凝胶等。但这些材料有的荧光背景高，有的选择性差。相比较，再生纤维素膜具有光学透明度高、荧光背景干扰小、机械强度高、易进行化学改性等优点。

(2)以二醛纤维素膜为固相基质，通过两步席夫碱反应，建立了一种集固相富集与固相荧光检测为一体的检测对苯二胺的新方法。以二醛纤维素膜作为基质材料，不仅光学透明度高、荧光背景干扰小、机械强度高，而且对目标污染物对苯二胺具有固相富集作用。

本发明的新方法集固相富集与固相荧光检测为一体。

(3)所建新方法检测对苯二胺时存在0.01-0.1mg/L和0.1-1mg/L两个线性范围，方法的检测限为7.5μg/L。体系中苯胺浓度低于100mg/L、邻苯二胺浓度低于10mg/L或间苯二胺浓度低于1mg/L时均不干扰对苯二胺的测定。

(4)固相富集与固相荧光检测机理：第一步，高碘酸钠将纤维素分子链中C2和C3位的仲羟基选择性氧化为二醛基，得到二醛纤维素膜(DCM)。第二步，二醛纤维素膜的醛基与对苯二胺的一个胺基发生席夫碱反应，将对苯二胺富集到膜表面。第三步，富集的对苯二胺的另一个胺基与水杨醛发生反应，得发射黄色荧光的固相荧光检测膜。

(5)以纤维素膜为固相基质，其二维平面结构对反应产物分子链的振动和旋转能起到限制作用，使非辐射通道受阻，更容易以辐射方式释放能量，所以荧光强度大大增加。

目前检测对苯二胺的方法存在待测样品的预处理过程繁琐、操作复杂或检测仪器不易于微型化、不能及时快速检测等缺点。本发明具有简单快速、样品消耗量少、灵敏度高、选择性好等特点，对环境中低浓度尤其是痕量对苯二胺的检测具有潜在优势。

附图说明

图1为不同对苯二胺浓度条件下所制固相荧光检测膜(水杨醛浓度为0.5％，反应温度25℃，反应时间10min；对苯二胺浓度为0,10，……，1000μg/L，对苯二胺溶液溶剂为无水乙醇，溶液pH值为8，反应温度25℃，反应时间1h)的荧光光谱图。

图2为荧光强度与对苯二胺浓度的关系(本发明检测对苯二胺时存在0.01-0.1mg/L和0.1-1mg/L两个线性范围，方法的检测限为7.5ug/L)。

图3二醛纤维素膜(DCM)、二醛纤维素膜浸水杨醛(DCM+水杨醛)、固相荧光检测膜(DCM+对苯二胺+水杨醛)的荧光光谱图。

图4二醛纤维素膜先与1mg/L的苯胺、邻苯二胺、间苯二胺和对苯二胺分别作用，再与水杨醛反应所得固相膜的荧光光谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细阐述，但这些实施例不对本发明构成任何限制，本发明可以按发明内容所述的任一方式实施。

下文中，未注明的浓度均为质量浓度。

实施例1对苯二胺浓度对固相荧光检测膜荧光强度的影响

一种对苯二胺的检测方法，基特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将棉纤维素溶解制备质量浓度为5％的纤维素溶液；

步骤2：将步骤1制得的纤维素溶液脱泡后，在基板流延成膜，凝固后洗涤得到再生纤维素凝胶膜；

步骤3：将步骤2得到的再生纤维素凝胶膜放入1g/L高碘酸钠水溶液于室温下氧化处理6h，得到二醛纤维素凝胶膜；

步骤4：将(3)中得到的二醛纤维膜置于不同浓度的对苯二胺溶液(0、10、20、40、50、60、80、100、200、400、500、600、800、1000μg/L)中反应，得到富集对苯二胺的纤维素膜；

步骤5：将富集对苯二胺的纤维素膜浸入0.5％的水杨醛溶液中反应1h，50℃烘干，然后测试各体系在370nm激发波长(λex)下的荧光光谱，如图1所示。由图1可以看到，所制固相荧光膜的最大发射波长(λem)约为545nm。以荧光强度为纵坐标，对苯二胺标定浓度为横坐标作图，结果如图2。由图2可见，随对苯二胺浓度增加，固相荧光检测膜的荧光强度增加。进一步模拟结果表明，所建方法检测对苯二胺时存在0.01-0.1mg/L和0.1-1mg/L两个线性范围，方法的检测限为7.5ug/L。

相比较，氧化纤维素膜DCM、只富集对苯二胺的氧化膜、只浸水杨醛的氧化膜在540nm左右无发射峰(见图3)，在365nm紫外灯照射下也观察不到黄色荧光。

实施例2水杨醛浓度对固相荧光检测膜荧光强度的影响

固定对苯二胺溶液浓度为250μg/L，研究水杨醛浓度对固相荧光检测膜荧光强度的影响。具体操作：分别向6组250μg/L的对苯二胺溶液中放入大小相同的二醛纤维素膜，于25℃水浴反应1h后，取出洗净。再将膜置于浓度为0％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％的水杨醛溶液中反应10min，水洗，并于50℃烘箱中干燥，然后测试各体系在370nm激发波长下的荧光光谱。结果表明，随着水杨醛浓度升高，固相荧光检测膜的荧光强度先增加后趋缓。

实施例3氧化膜醛基浓度对固相荧光检测膜荧光强度的影响

通过改变高碘酸钠溶液浓度、氧化时间获得醛基含量(0、50、100、200、300、400μmol/g)不同的二醛纤维素膜。之后，将得到的二醛纤维素膜分别置于6组浓度均为250μg/L的对苯二胺溶液中，于25℃水浴反应1h后，取出洗净。再将富集对苯二胺的膜置于浓度为0.5％的水杨醛溶液中反应10min，水洗，并于50℃烘箱中干燥，然后测试各体系在370nm激发波长的荧光光谱。结果表明，二醛纤维素的醛基量越高，固相荧光检测膜的荧光强度越大。

实施例4对苯二胺溶液pH对固相荧光检测膜荧光强度的影响

固定对苯二胺溶液浓度为250μg/L，调节溶液的pH分别为3、4、5、7、9、11和自然pH(≈8),研究对苯二胺溶液pH对固相荧光检测膜荧光强度的影响。具体操作步骤：在7组pH值不同的对苯二胺溶液中放入大小相同的二醛纤维素膜，于25℃水浴反应1h后，取出洗净。再将富集对苯二胺的膜置于浓度为0.5％的水杨醛溶液中反应10min，水洗，并于50℃烘箱中干燥，然后测试各体系在370nm激发波长的荧光光谱。结果表明，在酸性条件下，荧光强度有明显衰减，当pH＝3时，膜无荧光；当对苯二胺溶液的pH为8(自然)时，荧光强度最优。

实施例5反应时间对固相荧光检测膜荧光强度的影响

固定对苯二胺溶液浓度为250μg/L，研究对苯二胺富集时间对固相荧光检测膜荧光强度的影响。具体操作：分别向系列溶液中放入大小相同的二醛纤维素膜，于25℃水浴反应0s、30s、1min、5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h后，取出洗净。再将富集对苯二胺的膜置于浓度为0.5％的水杨醛溶液中反应10min，水洗，并于50℃烘箱中干燥，然后测试各体系在370nm激发波长的荧光光谱。结果表明，随着反应时间的推移，固相荧光检测膜的荧光强度增加；在30s时，膜已有荧光响应，表明所建检测方法能实现对苯二胺的快速检测。

实施例6反应温度对固相荧光检测膜荧光强度的影响

设置七组浓度均为250μg/L的对苯二胺溶液，研究对苯二胺富集温度对固相荧光检测膜荧光强度的影响。具体操作：向系列溶液中放入大小相同的二醛纤维素膜，于不同温度(0℃、15℃、25℃、30℃、35℃、45℃、55℃)水浴反应1h后，取出洗净。再将富集对苯二胺的膜置于浓度为0.5％的水杨醛溶液中反应10min，水洗，并于50℃烘箱在干燥，然后测试各体系在370nm激发波长的荧光光谱。结果表明，固相荧光检测膜的荧光强度在25℃时达到最大值，降低或升高温度荧光强度都出现减小。

实施例7选择性实验

固定苯胺、间苯二胺、邻苯二胺、对苯二胺4种溶液的浓度分别为1mg/L。向4种溶液中分别放入大小相同的二醛纤维素膜，于25℃水浴反应1h后，取出洗净。再将富集不同胺后的膜置于浓度为0.5％的水杨醛溶液中反应10min，水洗，并于50℃烘箱中干燥，然后测试各体系在370nm激发波长的荧光光谱。结果表明：将对苯二胺替换为苯胺、邻苯二胺和间苯二胺后，膜均无荧光(见图4)。因此，所建方法能用于对苯二胺的选择性检测。

实施例8自来水加标回收实验

采用自来水进行加标回收试验，对苯二胺的加标浓度为300μg/L。具体操作：采集实验室的自来水两组，一组加入对苯二胺标液，使其加标浓度为300μg/L。之后，在加标与未加标的水样中分别放入大小相同的二醛纤维素膜，于25℃水浴反应1h后，取出洗净。再将膜置于浓度为0.5％的水杨醛溶液中反应10min，水洗，并于50℃烘箱中干燥，然后测试两个体系所制膜在370nm激发波长的荧光光谱。根据标准曲线确定加标回收实验结果，计算加标回收率与相对标准偏差。结果表明：自来水中对苯二胺的测定结果为0；自来水中对苯二胺的加标回收率为92.6％-109.4％，相对标准偏差为8.3％。

实施例9染发膏加标回收实验

采用染发膏进行加标回收试验，对苯二胺的加标浓度为300μg/L。具体操作：取0.1克染发膏加入20mL乙醇-水体系(乙醇：水＝4：1)，搅拌使其分散溶解。之后，基于包装盒上标注的对苯二胺含量，估算上清液的稀释倍数。然后，在稀释液中分别放入大小相同的二醛纤维素膜，于25℃水浴反应1h后，取出洗净。再将膜置于浓度为0.5％的水杨醛溶液中反应10min，水洗，并于50℃烘箱中干燥，然后测试所制膜在370nm激发波长的荧光光谱。进行染发膏中对苯二胺的加标试验时，在染发膏溶解一步加入对苯二胺标液，使其加标浓度为300μg/L，其它操作同上。最后，根据标准曲线确定加标回收实验结果，计算加标回收率与相对标准偏差。

实验结果表明：染发膏中对苯二胺的含量约为2.4％。染发膏中对苯二胺的加标浓度为300μg/时，其加标回收率为95.3％-114.7％，相对标准偏差为9.9％。