阅读说明：本技术 油类物质中邻苯二甲酸酯类增塑剂的荧光法检测方法 (The Fluorometric assay method of phthalic ester plasticizer in oily substance ) 是由 殷龙龙 李群 许光映 高忠东 王振 嵇莎莎 张倩茹 尹蓉 胡晓军 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种油类物质中邻苯二甲酸酯类增塑剂的荧光法检测方法,包括(1)制备邻苯二甲酸酯标准曲线；(2)制备皂化水解液；(3)制备荧光衍生物；(4)检测与换算。本发明采用NaOH将油类物质完全皂化、将邻苯二甲酸酯类水解成邻苯二甲酸钠,再通过加入石油醚在离心的作用下将油脂和溶解有邻苯二甲酸钠的水溶液彻底分开,然后在过氧化氢的作用下将邻苯二甲酸钠中和为邻苯二甲酸,并将具有给电子效应的过氧根(-O-)结构结合到邻苯二甲酸的羧基上,从而使本来存在于油脂里的不能产生荧光的邻苯二甲酸酯被分离出来并且产生荧光,使得采用荧光检测手段成为可能。本操作简便、使用试剂较少、检测条件温和易控,成本低廉,工作曲线线性范围宽。(The invention discloses a kind of Fluorometric assay methods of phthalic ester plasticizer in oily substance, including (1) to prepare phthalic acid ester standard curve；(2) saponification liquid is prepared；(3) fluorescent derivative is prepared；(4) detection and conversion.The present invention is fully saponified by oily substance using NaOH, phthalate is hydrolyzed into sodium phthalate, grease and aqueous solution dissolved with sodium phthalate are thoroughly separated under the effect of centrifugation by the way that petroleum ether is added again, then under the action of hydrogen peroxide by sodium phthalate and be phthalic acid, and peroxide root (- O-) structure with electron effect is integrated on the carboxyl of phthalic acid, to which the phthalic acid ester that cannot generate fluorescence made to be originally present in grease is separated and generates fluorescence, make it possible using fluorescence detection means.This is easy to operate, less using reagent, testing conditions are mildly easily-controllable, and low in cost, the working curve range of linearity is wide.)

油类物质中邻苯二甲酸酯类增塑剂的荧光法检测方法

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种适用于油类物质中邻苯二甲酸酯类增塑剂的检测方法。

背景技术

邻苯二甲酸酯（Phthalate esters, PAEs），一般是由邻苯二甲酸与4～15个碳的醇形成的一组酯类化合物，在常温下，除少数是低熔点的固体外，一般为高沸点低挥发性的粘稠液体，无色透明，有特殊气味，难溶于水，易溶于***、甲醇和乙醇等多种有机溶剂，属脂溶性物质。因其在增强可塑性方面的优良表现被被广泛作为塑化剂应用于食品包装材料、医疗用具、化妆品等各种塑料制品的生产中。然而PAEs并非以共价键与塑料基质分子连接，二者仅仅是以氢键或范德华力相连。PAEs在塑料中呈游离态，在接触水、油脂等物质时容易发生迁移，从而对外环境，比如水、土壤和大气造成污染，还会对生物体造成影响。PAEs属于生物内干扰素，毒性虽然不大，但富集力强，长期摄入会影响生物体内激素的正常分泌，给免疫系统、生殖系统和消化系统带来危害，还可能诱发肝癌及造成染色体的数目或结构突变。因为PAEs属脂溶性物质，当用塑料制品来承装油类产品时，塑料中的邻苯二甲酸酯类物质便容易缓慢地释放到油中，最终被食用者摄入体内，逐渐对身体造成损害。现在，欧盟、美国、日本、中国都先后将邻苯二甲酸酯类物质列入优先控制污染物的黑名单，美国有DEHP、BBP、DBP、DOP、DEP、DMP 6种，我国有DEP、DMP、DOP 3 种。

国外对于PAEs 研究起步较早，国内则相对较晚。目前实验室及工业用于PAEs的检测方法主要有凝胶渗透色谱法、气相色谱法、气质联用法、气相色谱-串联质谱法、高效液相色谱法，液相色谱-串联质谱法等。然而这些仪器方法在操作上都比较繁琐，检测周期较长，专业度高，且需要投入较大的成本，适用于大中型企业或专门的检测机构，不利于小微型企业的发展，而如果使用荧光法则可以在很大程度上减少企业的固定成本。CN105866089 B公开了“一种荧光法检测邻苯二甲酸酯类增塑剂的方法” 其先用四氢呋喃溶解测试样品中的邻苯二甲酸酯；加入二氧六环和强碱溶液将邻苯二甲酸酯水解成邻苯二甲酸盐，净化水解后，取上层水溶液，依次加入盐酸溶液、PBS溶液、硝酸铜溶液和过氧化氢溶液，邻苯二甲酸盐转化成可发荧光的羟基邻苯二甲酸盐，反应后加入二氧化锰和强碱溶液，静置或离心，保留上清水溶液作为待测溶液，最后用荧光法对待测溶液进行测定。该发明可在不需要大型检测设备的条件下，用于塑料、玩具、油漆涂层、食品包装材料等的邻苯二甲酸酯含量检测。但是，该发明不适用于油脂中邻苯二甲酸酯含量检测，且检测需要的化学试剂偏多，操作步骤也较繁锁。

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种适用于油类物质中邻苯二甲酸酯类增塑剂的荧光法检测方法，旨在通过采用相对简单易行的操作来实现荧光法检测油类物质中的邻苯二甲酸酯类增塑剂。

本发明是通过如下技术方案实现的。

一种油类物质中邻苯二甲酸酯类增塑剂的荧光法检测方法，包括如下步骤：

（1）制备邻苯二甲酸酯标准曲线 分别称取邻苯二甲酸酯标准品1mg、2mg、3mg、4mg、5mg于5个经过编号的1L容量瓶中，以甘油三酯定容，配置成含量呈梯度分布的一系列邻苯二甲酸酯标准溶液。再从5个1L容量瓶的标准溶液中分别移取1mL至依次编号的20mL容器中，向所有容器中分别加入10mL10%的NaOH溶液，再将所有容器置于水浴中，90-100℃下恒温搅拌至液体蒸干，使待测样品充分皂化、其所含的邻苯二甲酸酯充分水解成邻苯二甲酸钠和醇，然后冷却至室温，再向容器中分别加入10mL去离子水，搅拌，使容器中生成的少量邻苯二甲酸钠充分溶于水中，静置1h，然后从所有容器中分别取3mL下清液置于离心管中，并向离心管中分别加入2mL石油醚，密封离心管进行离心至溶液明显分层，离心结束后从离心管中分别取下清液1mL，分别置于相同编号的比色管中，并向比色管中分别加入1mL30%的过氧化氢溶液，摇匀，将所有比色管一起置于恒温箱中，在35-90℃条件下保温1-2h，然后冷却至室温，用荧光分光光度计对所有比色管中的溶液进行发射光强度的测定，最后将邻苯二甲酸酯标准溶液对应的发射光强度值和标准溶液中的邻苯二甲酸酯的含量进行线性拟合，得到邻苯二甲酸酯含量与发射光强度对应关系的标准曲线和方程。

（2）制备皂化水解液 量取1mL的待测油类物质样品，移至20mL容器中，向容器中加入10%的NaOH溶液10mL，将容器置于水浴中，90-100℃下恒温搅拌至液体蒸干，冷却至室温后向容器中加入10mL去离子水，搅拌，使容器中生成的少量邻苯二甲酸钠充分溶于水中，静置1h。

（3）制备荧光衍生物 从（2）处理的溶液中取3mL下清液置于离心管中，并向离心管中加入2mL石油醚，密封离心管进行离心至溶液明显分层，离心结束后从离心管中取下清液1mL置于与（1）相同规格的比色管中，加入1mL30%的过氧化氢溶液，摇匀后置于恒温箱中，在35-90℃条件下保温1-2h，后冷却至室温。

（4）检测与换算 把（3）制备的荧光衍生溶液用荧光分光光度计进行发射光强度测定，将检测结果代入（1）得到的标准曲线和方程算出待测样品中邻苯二甲酸酯的含量。

本方法适用于油类物质中的邻苯二甲酸酯的含量检测。

荧光检测是一种先进的分析方法，因其所用设备较简单、分析灵敏度高、选择性强和使用简便，相比质谱法、光谱法、极谱法等具有更广泛的应用的。荧光检测法能直接和间接地分析众多有机化合物和无机元素，常常应用于在食品工业和生物医药工业等诸多领域。具有较强电子云密度的共轭体系或者刚性平面是物质产生荧光的必要条件。然而，在油类物质中的邻苯二甲酸酯类的分子结构上有两个具有吸电子效应的羧基，从而降低了苯环上的电子云密度，造成其直接用荧光检测无明显发射光的峰出现。

本发明的有益效果在于：（1）采用NaOH将油类物质完全皂化、将邻苯二甲酸酯类水解成邻苯二甲酸钠，再通过加入石油醚在离心的作用下将油脂和溶解有邻苯二甲酸钠的水溶液彻底分开，从而实现油类产品里的塑化剂检测。（2）然后在过氧化氢的作用下将邻苯二甲酸钠中和为邻苯二甲酸，并将具有给电子效应的过氧根（-O-）结构结合到邻苯二甲酸的羧基上，从而使本来存在于油脂里的不能产生荧光的邻苯二甲酸酯被分离出来并且产生荧光，使得采用荧光检测手段成为可能。（3）本操作简便且使用试剂较少，工作曲线线性范围宽，除荧光分光光度计外，本发明不需要大型检测设备投入的条件下即可完成检测邻苯二甲酸酯类增塑剂的工作，操作方便且成本低廉，检测条件温和易控。

附图说明

图1为实施例1的邻苯二甲酸酯含量与发射光强度对应关系的标准曲线。

图2为实施例2的邻苯二甲酸酯含量与发射光强度对应关系的标准曲线。

实施例1

采用本发明方法检测香油中邻苯二甲酸酯的含量的方法。

（1）制备邻苯二甲酸酯标准曲线 分别称取邻苯二甲酸酯标准品1mg、2mg、3mg、4mg、5mg于5个经过编号的1L容量瓶中，以甘油三酯定容，配置成含量呈梯度分布的一系列邻苯二甲酸酯标准溶液。再从5个1L容量瓶的标准溶液中分别移取1mL至依次编号的20mL容器中，向所有容器中分别加入10mL10%的NaOH溶液，再将所有容器置于水浴中，90℃下恒温搅拌至液体蒸干，使待测样品充分皂化、其所含的邻苯二甲酸酯充分水解成邻苯二甲酸钠和醇，然后冷却至室温，再向容器中分别加入10mL去离子水，搅拌，使容器中生成的少量邻苯二甲酸钠充分溶于水中，静置1h，然后从所有容器中分别取3mL下清液置于离心管中，并向离心管中分别加入2mL石油醚，密封离心管进行离心至溶液明显分层，离心结束后从离心管中分别取下清液1mL，分别置于相同编号的比色管中，并向比色管中分别加入1mL30%的过氧化氢溶液，摇匀，将所有比色管一起置于恒温箱中，在35℃条件下保温2h，然后冷却至室温，用荧光分光光度计对所有比色管中的溶液进行发射光强度的测定，最后将得到的发射光强度值和对应的标准溶液中的邻苯二甲酸酯的含量进行线性拟合，得到邻苯二甲酸酯含量与发射光强度对应关系的标准曲线（如图1）和方程：

Y=20.52X-8.068，R²=0.994。

Y代表发射光强度（单位：A.U.），X代表邻苯二甲酸酯的浓度（单位：mg/L）。

（2）制备皂化水解液 量取1mL某品牌香油，移至20mL容器中，向容器中加入10%的NaOH溶液10mL，将容器置于水浴中，90℃下恒温搅拌至液体蒸干，冷却至室温后向容器中加入10mL去离子水，搅拌，使容器中生成的少量邻苯二甲酸钠充分溶于水中，静置1h。

（3）制备荧光衍生物 从（2）处理的溶液中取3mL下清液置于离心管中，并向离心管中加入2mL石油醚，密封离心管进行离心至溶液明显分层，离心结束后从离心管中取下清液1mL置于与（1）相同规格的比色管中，加入1mL30%的过氧化氢溶液，摇匀后置于恒温箱中，在35℃条件下保温2h后冷却至室温。

（4）检测与换算 把（3）制备的荧光衍生溶液用荧光分光光度计进行发射光强度测定，结果为15.64A.U.。将检测结果代入代入方程的Y，算出待测样品即某品牌食用油中邻苯二甲酸酯的含量X约为1.1554mg/L。

实施例2

采用本发明方法检测食用油中邻苯二甲酸酯的含量的方法。

（1）制备邻苯二甲酸酯标准曲线 分别称取邻苯二甲酸酯标准品1、2、3、4、5mg于5个经过编号的1L容量瓶中，以甘油三酯定容，配置成含量呈梯度分布的一系列邻苯二甲酸酯标准溶液。再从5个1L容量瓶的标准溶液中分别移取1mL至依次编号的20mL容器中，向所有容器中分别加入10mL10%的NaOH溶液，再将所有容器置于水浴中，100℃下恒温搅拌至液体蒸干，使待测样品充分皂化、其所含的邻苯二甲酸酯充分水解成邻苯二甲酸钠和醇，然后冷却至室温，再向容器中分别加入10mL去离子水，搅拌，使容器中生成的少量邻苯二甲酸钠充分溶于水中，静置1h，然后从所有容器中分别取3mL下清液置于离心管中，并向离心管中分别加入2mL石油醚，密封离心管进行离心至溶液明显分层，离心结束后从离心管中分别取下清液1mL，分别置于相同编号的比色管中，并向比色管中分别加入1mL30%的过氧化氢溶液，摇匀，将所有比色管一起置于恒温箱中，在90℃条件下保温1h，然后冷却至室温，用荧光分光光度计对所有比色管中的溶液进行发射光强度的测定，最后将得到的发射光强度值和对应的标准溶液中的邻苯二甲酸酯的含量进行线性拟合，得到邻苯二甲酸酯含量与发射光强度对应关系的标准曲线（如图2）和方程：

Y=19.00X-10.35，R²=0.996。

Y代表发射光强度（单位：A.U.），X代表邻苯二甲酸酯的浓度（单位：mg/L）。

（2）制备皂化水解液 量取1mL某品牌食用油，移至20mL容器中，向容器中加入10%的NaOH溶液10mL，将容器置于水浴中，100℃下恒温搅拌至液体蒸干，冷却至室温后向容器中加入10mL去离子水，搅拌，使容器中生成的少量邻苯二甲酸钠充分溶于水中，静置1h。

（3）制备荧光衍生物 从（2）处理的溶液中取3mL下清液置于离心管中，并向离心管中加入2mL石油醚，密封离心管进行离心至溶液明显分层，离心结束后从离心管中取下清液1mL置于与（1）相同规格的比色管中，加入1mL30%的过氧化氢溶液，摇匀后置于恒温箱中，在90℃条件下保温1h后冷却至室温。

（4）检测与换算 把（3）制备的荧光衍生溶液用荧光分光光度计进行发射光强度测定，结果为7.35A.U.。将检测结果代入代入方程的Y，算出待测样品即某品牌食用油中邻苯二甲酸酯的含量X约为0.9316mg/L。