双重细胞膜包裹负载siEFNA1蛋黄脂质纳米药物及制备方法和应用
阅读说明：本技术 双重细胞膜包裹负载siEFNA1蛋黄脂质纳米药物及制备方法和应用 (Double-cell-membrane-wrapped siEFNA 1-loaded yolk lipid nano-drug, and preparation method and application thereof ) 是由 王其龙 张莉 隽雅丽 于 2021-07-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种双重细胞膜包裹负载siEFNA1蛋黄脂质纳米药物及制备方法和应用,该纳米药物以蛋黄脂质纳米载体EYLNs为核心,负载siEFNA1,同时包裹食管鳞癌细胞膜及中性粒细胞膜。siEFNA1的负载可抑制食管鳞癌细胞的转移能力,中性粒细胞膜的包裹可增加纳米药物的肿瘤靶向富集,而食管鳞癌细胞膜的包裹可有效增加抗食管鳞癌免疫应答,具有更为有效的抗食管鳞癌作用。(The invention discloses a double cell membrane wrapped and loaded siEFNA1 yolk lipid nano-drug, a preparation method and application thereof, wherein the nano-drug takes yolk lipid nano-carrier EYLNs as a core, loads siEFNA1, and wraps esophageal squamous cell carcinoma cell membranes and neutral granular cell membranes at the same time. The load of the siEFNA1 can inhibit the transfer capacity of esophageal squamous cell carcinoma cells, the encapsulation of neutral granulocyte cell membranes can increase the tumor targeted enrichment of nano-drugs, and the encapsulation of esophageal squamous cell carcinoma cell membranes can effectively increase the anti-esophageal squamous cell carcinoma immune response and have more effective anti-esophageal squamous cell carcinoma effect.)
技术领域
本发明属肿瘤靶向治疗领域，涉及用于肿瘤靶向治疗的纳米药物，具体涉及食管鳞癌细胞膜、中性粒细胞膜包裹的、同时负载siEFNA1的蛋黄脂质纳米药物 NEM/EYLNs-siEFNA1及其制备方法和应用。
背景技术
随着纳米科技的发展，纳米药物的开发成为肿瘤靶向治疗研究的热点。纳米 药物须兼备实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)介导的被动靶向效应及各 种修饰介导的主动靶向效应以发挥其高效的抗肿瘤作用。同时，各种细胞膜介导 的仿生纳米可以有效逃避机体的免疫清除，有效延长纳米药物在机体的循环时间， 进一步增强了纳米药物在肿瘤部位的蓄积。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种食管鳞癌细胞膜、中性粒细胞膜包裹的、同时负载siEFNA1的蛋黄脂质纳米药物NEM/EYLNs-siEFNA1；本发明的第二个目的在于提供NEM/EYLNs-siEFNA1的制备方法；本发明的第三个目的在于提供纳米药物NEM/EYLNs-siEFNA1在食管鳞癌治疗方面的应用。
本发明的技术解决方案是：一种食管鳞癌细胞膜、中性粒细胞膜包裹的、同时负载siEFNA1的蛋黄脂质纳米药物NEM/EYLNs-siEFNA1，该纳米药物以蛋黄脂质纳米EYLNs为核心，负载具有显著食管鳞癌细胞转移抑制作用的siEFNA1，并进行食管鳞癌细胞膜、中性粒细胞膜包裹。
更进一步的是，以该纳米药物为核心，制备负载其它治疗性制剂的其它纳米药物体系。
其中，该纳米药物的制备方法包括以下步骤：
(1)蛋黄脂质载体EYLNs的制备：向分装并干燥的脂质安剖瓶中加入200-400μL的ddH2O，FS60水浴超声15-20min至透亮，然后将其经50nm孔径的滤膜反复滤过后置于4℃备用；
(2)携带siEFNA1的纳米载体EYLNs-siEFNA1的制备：将预制备的EYLNs载体3mg与33μg聚醚酰亚胺PEI于室温震荡孵育1h， 15000rpm离心20min后加入500μL的ddH2O，每3min水浴超声1次，共超声处理3次；然后加入5nmol的siEFNA1，并于室温震荡孵育30min，15000rpm离心5min去除游离siEFNA1；
(3)中性粒细胞膜及食管鳞癌细胞膜的提取：所述的中性粒细胞膜的提取是，分离人外周血中性粒细胞；将细胞重悬于均质化缓冲液中，然后于冰上通过手动均质器反复均质处理100次左右；最后经蔗糖密度梯度离心分离纯化细胞膜；所述的食管鳞癌细胞KYSE-150膜的提取方法同中性粒细胞膜的提取；
(4)中性粒细胞膜、食管鳞癌细胞膜包裹EYLNs-siEFNA1：将离心收集的中性粒细胞膜与肿瘤细胞膜分别按照不同比例混合后以ddH2O重悬，再相混匀，冰浴超声10min至清亮，得到中性粒细胞膜/肿瘤细胞膜融合膜纳米颗粒；将融合细胞膜纳米颗粒与EYLNs-siEFNA1冰上孵育10min后冰浴超声3次，每次3min，得NKM/EYLNs-siEFNA1纳米药物。
所述步骤(3)中，L缓冲液中组分如下：10mmol/L的MgCL2，1mmol/L 的KCL，10μg/mL的RNase，10μg/mL的DNase及1×蛋白酶抑制剂cocktail。
所述步骤(3)中，蔗糖的质量百分比密度梯度是：30％，40％及55％。
所述步骤(4)中，离心收集的中性粒细胞膜与肿瘤细胞膜的混合质量比是： 1:2，1:1，2:1。
其中，该纳米药物应用于食管鳞癌治疗中。
本发明的优点是：以天然蛋黄脂质纳米载体EYLNs为核心，构建了一种食管鳞癌细胞膜、中性粒细胞膜包裹的、同时负载siEFNA1的纳米药物 NEM/EYLNs-siEFNA1，以期通过EYLNs载体被动靶向作用介导的siEFNA1靶向递送、中性粒细胞膜介导的主动靶向以及食管鳞癌膜介导的抗食管鳞癌免疫应答的增强实现更为有效的食管鳞癌治疗效果。
附图说明
图1为中性粒细胞膜、食管鳞癌细胞膜提取、鉴定以及融合膜包裹的EYLNs 载体鉴定；其中：A，SDS-PAGE电泳鉴定中性粒细胞膜蛋白；B，SDS-PAGE电泳鉴定食管鳞癌细胞膜蛋白；C，SDS-PAGE电泳鉴定食管鳞癌细胞膜、中性粒细胞融合膜。
图2为激光共聚焦鉴定不同比例食管鳞癌细胞膜、中性粒细胞膜包裹的 EYLNs-siEFNA1载体。
图3为不同比例食管鳞癌细胞膜、中性粒细胞膜包裹的纳米药物组织分布分析；其中，A，荧光DiR标记的三种比例膜包被的纳米药物荧光强度检测；B，三个纳米药物在食管鳞癌皮下荷瘤小鼠组织中的分布检测及定量；C，三个纳米药物在食管鳞癌肺转移模型小鼠组织中的分布检测及定量。
图4为1:1比例膜包裹的纳米药物形态及粒径分布分析；其中，A，1:1比例膜包裹的纳米药物的电镜形态；B，1:1比例膜包裹的纳米药物粒径分布。
图5为纳米药物注射小鼠后免疫应答及对食管鳞癌肺转移能力的影响；其中， A，纳米药物注射后小鼠肿瘤细胞膜特异性IgG水平；B，纳米药物注射后小鼠肿瘤细胞膜特异性IgG1水平；C，纳米药物注射后小鼠肿瘤细胞膜特异性IgG2a 水平。
图6为纳米药物注射后对食管鳞癌细胞肺转移能力的抑制作用分析。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的技术解决方案，但不能理解为是对技术方案的限制，在此基础上的适应性改进皆属于本发明的保护范围。
1、NEM/EYLNs-siEFNA1的构建：
(1)蛋黄脂质载体EYLNs的制备：向分装并干燥的脂质安剖瓶中加入200-400 μL的ddH2O，水浴超声(FS60)15-20min至透亮，然后将其经50nm孔径的滤膜反复滤过后置于4℃备用；
(2)携带siEFNA1的纳米载体EYLNs-siEFNA1的制备：将预制备的EYLNs载体(3mg)与聚醚酰亚胺PEI(33μg)于室温震荡孵育1h，15000rpm离心20min后加入500μL ddH2O，每3min水浴超声1次，共超声处理3次；然后加入5nmol的siEFNA1并于室温震荡孵育30min，15000 rpm离心5min去除游离siEFNA1；
(3)中性粒细胞及食管鳞癌细胞膜提取：分离人外周血中性粒细胞，将细胞重悬于均质化缓冲液(10mmol/L的MgCL2，1mmol/L的KCL，10μg/mL的 RNase，10μg/mL的DNase及1×蛋白酶抑制剂cocktail)中，然后于冰上通过手动均质器反复均质处理100次左右，最后经蔗糖质量密度梯度(30％，40％及55％)离心分离纯化细胞膜；食管鳞癌细胞KYSE-150膜提取方法同上；
(4)中性粒细胞、食管鳞癌细胞膜包裹EYLNs-siEFNA1：将离心收集的中性粒细胞膜与肿瘤细胞膜(分别按照1:2,1:1,2:1比例)以ddH2O重悬后相混匀，冰浴超声10min至清亮，得到中性粒细胞膜/肿瘤细胞膜融合膜纳米颗粒；将融合细胞膜纳米颗粒与EYLNs-siEFNA1冰上孵育10min后冰浴超声3次，每次3min。
2、融合膜包裹的EYLNs载体鉴定
(1)食管鳞癌细胞膜、中性粒细胞膜SDS-PAGE电泳鉴定：分离人外周血中性粒细胞，将细胞重悬于均质化缓冲液(10mmol/L的MgCL2，1mmol/L的KCL， 10μg/mL的RNase，10μg/mL的DNase及1×蛋白酶抑制剂cocktail)中，然后于冰上通过手动均质器反复均质处理100次左右，最后经蔗糖密度梯度 (30％，40％及55％)离心分离纯化细胞膜；食管鳞癌细胞KYSE-150的膜提取方法同上；将分离的细胞膜及对应的细胞裂解液分别进行SDS-PAGE电泳鉴定。
如图1所示，食管鳞癌细胞膜、中性粒细胞膜以及融合膜SDS-PAGE鉴定；其中，A，食管鳞癌细胞膜及食管鳞癌细胞裂解液SDS-PAGE对比分析；B，中性粒细胞膜及中性粒细胞裂解液SDS-PAGE对比分析；C，融合膜SDS-PAGE电泳分析。
(2)激光共聚焦分析食管鳞癌细胞膜、中性粒细胞膜在载体表面的融合：将 PKH67标记的中性粒细胞膜与PHK26标记的食管鳞癌细胞膜(分别按照 1:2,1:1,2:1比例)以ddH2O重悬后相混匀，冰浴超声10min至清亮，得到中性粒细胞膜/肿瘤细胞膜融合膜载体，将其与EYLNs-siEFNA1冰上孵育10min后冰浴超声3次，每次3min；将载体分别与食管鳞癌细胞KYSE-150孵育12h， PBS清洗3次后，2％PFA室温固定10min，0.2％Triton X-100作用5min， DAPI染色后激光共聚焦显微镜观察两种细胞膜的融合情况。
如图2所示，红色荧光PKH26标记的中性粒细胞膜与绿色荧光PKH67标记的食管鳞癌细胞膜很好的融合在一起。
3、纳米药物在荷瘤小鼠组织分布分析
(1)小鼠皮下荷瘤模型的建立：0.25％胰酶消化处于对数生长期的 KYSE-150细胞，使用无血清培养基离心洗涤细胞两次，计数活细胞，通过PBS调整细胞浓度至1×107/100μL，将细胞重悬置于冰上备用。将Balb/c裸鼠麻醉后，消毒左下腹皮肤消毒，然后取50μL(5×106)细胞悬液皮下接种至小鼠的左下腹部；
(2)小鼠食管鳞癌肺转移模型的建立：将表达Luciferase报告基因的食管鳞癌细胞(5×106/100μL)尾静脉注射Balb/c裸鼠，于注射后7天通过小动物活体成像系统观察小鼠肺部转移瘤形成情况；
(3)纳米药物组织分布分析：将DiR标记的NEM/EYLNs-PTX-siEFNA14载体分别静脉注射食管癌皮下荷瘤或肺转移模型小鼠，注射24h后将小鼠行CO2 安乐死，取小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、大脑、胃肠、肿瘤等组织器官，然后通过小动物活体扫描，比较并分析各脏器中DiR信号的强度。
如图3所示，纳米药物在荷瘤小鼠组织分布分析；其中，A，三种比例不同细胞膜包裹的纳米药物荧光检测及定量；B，三种比例不同细胞膜包裹的纳米药物在食管鳞癌皮下荷瘤小鼠组织分布分析；C，三种比例不同细胞膜包裹的纳米药物在食管鳞癌肺转移小鼠组织分布分析。
4、1:1细胞膜包裹纳米药物形态及粒径分析
将食管鳞癌细胞膜与中性粒细胞膜按照1：1比例混合包裹EYLNs-siEFNA1 载体，将制备好的载体(10)滴于铜网上，室温静置20min，2％醋酸双氧铀负染2min，吸去残液；2％醋酸双氧铀负染5min，吸去残液后晾干，然后通过透射电镜(FEI TECNAI G2，电压：120kv)进行观察。
另外，取新鲜制备的NEM/EYLNs-siEFNA1纳米药物溶于约500μL的ddH2O 中，然后将其置于检测样品池中，通过Nicomp380Z3000粒度分析仪分析载体的粒径分布情况。
如图4所示，1:1细胞膜包裹的纳米药物形态及粒径分布检测；其中，A，电镜观察纳米药物的形态；B，粒径分布显示粒径约150nm。
5、纳米药物对机体抗食管鳞癌免疫应答刺激作用
将1:1细胞膜包裹的纳米药物尾静脉注射小鼠，每5天注射一次，共注射5 次，然后每5天通过ELISA方法检测食管鳞癌细胞膜特异性IgG、IgG1以及IgG2a 水平。
如图5所示，纳米药物注射后小鼠外周血清中食管鳞癌细胞膜特异性抗体水平检测；其中，A，纳米药物注射后食管鳞癌细胞膜特异性IgG水平；B，纳米药物注射后食管鳞癌细胞膜特异性IgG1水平；C，纳米药物注射后食管鳞癌细胞膜特异性IgG2a水平。
6、纳米药物注射后小鼠食管鳞癌肺转移能力分析
将1:1细胞膜包裹的纳米药物尾静脉注射小鼠，每5天注射一次，共注射5 次，然后尾静脉注射表达luciferase的食管鳞癌细胞KYSE-150(5ⅹ106)，小动物活体成像观察食管鳞癌肺转移情况。
如图6所示，纳米药物注射可显著抑制食管鳞癌细胞肺转移。
结果显示：我们制备获得了粒径约150nm、负载食管鳞癌抑制性siEFNA1，同时包裹食管鳞癌细胞膜以及中性粒细胞膜的纳米药物NEM/EYLNs-siEFNA1，该载体具有较好临床转化应用前景。