阅读说明：本技术 一种具有中空贯通结构的磷酸钙骨水泥、制备方法及其应用 (calcium phosphate bone cement with hollow through structure, preparation method and application thereof ) 是由 车七石 单玲星 刘少辉 张俊辉 赵澎 于 2019-10-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有中空贯通结构的磷酸钙骨水泥、制备方法及其应用,属于磷酸钙骨水泥技术领域,所述的中空贯通结构的磷酸钙骨水泥包括固相和固化液,所述固相包括磷酸钙粉末、纤维混合物,所述纤维混合物为可吸收纤维与纤维蛋白纤维,所述可吸收纤维的直径为100-500μm,长度为：0.5mm-1.5mm,优选地,所述可吸收纤维的直径为200-400μm。制得的磷酸钙骨水泥可以形成三维联通的大孔,促进细胞的黏附,增殖并可提高骨水泥的力学强度。(The invention discloses calcium phosphate cement with a hollow through structure, a preparation method and application thereof, belonging to the technical field of calcium phosphate cement, wherein the calcium phosphate cement with the hollow through structure comprises a solid phase and a curing liquid, the solid phase comprises calcium phosphate powder and a fiber mixture, the fiber mixture is an absorbable fiber and a fibrin fiber, the diameter of the absorbable fiber is 100-500 mu m, and the length of the absorbable fiber is as follows: 0.5mm to 1.5mm, preferably, the absorbable fiber has a diameter of 200 and 400 μm. The prepared calcium phosphate bone cement can form three-dimensional communicated macropores, promote cell adhesion and proliferation and improve the mechanical strength of the bone cement.)

一种具有中空贯通结构的磷酸钙骨水泥、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及磷酸钙骨水泥技术领域，具体涉及一种具有中空贯通结构磷酸钙骨水泥、制备方法及其应用。

背景技术

磷酸钙骨水泥（Calcium Phosphate Cement，CPC）于上世纪90年代由Borwn和Chow研制成功，是一种具有自固化性的非陶瓷型羟基磷灰石类人工骨材料。它由固相粉末和固化液按照一定的比例混合后形成易塑形的浆体，在短时间内自固化，最终的水化产物为与人体骨组织的无机成分和晶体结构相似的磷灰石。CPC具有良好的骨传导性和生物相容性。

聚乳酸羟基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）是由丙交酯（LA）和乙交酯（GA）共聚得到的酯类高聚物，具有良好的生物相容性、完全的生物降解性，长期以来，在人体中用作控释体系具有安全性，但是材料本身具有一定的缺陷，例如机械强度低、可塑性差、骨结合力弱。

在骨水泥中加入PLGA可以使两者的性能互补，以形成理想的骨水泥材料。

由于CPC固化体中的孔隙多为亚微米级和纳米级孔，缺乏100μm以上的连通大孔，新生骨组织只是在CPC表面爬行替代，不利于新生骨组织长入材料内部，也不利于血管的早期形成，而且会使材料降解较慢，降解时间通常在一年以上，有些甚至超过两年，造成骨缺损修复过程较长。从而影响了骨修复的效果，使其临床应用受到限制。

但是磷酸钙骨水泥作为骨组织工程应用的支架虽然能形成微孔结构， 但孔径及孔的连通程度都达不到临床要求， 而且材料强度不足。

专利 CN107881650A 一种同轴双层静电纺丝制备具有芯/壳包埋结构的纳米纤维膜的方法及其应用公开了利用同轴双层静电纺丝技术制备纳米纤维，然而由于高分子材料被纤维蛋白包裹，纤维蛋白的降解需要纤溶酶的参与，降解过程是首先纳米纤维中的壳层降解，芯层暴露，因此内部的高分子材料降解迟于纤维蛋白，将此材料应用在骨水泥中需要纤维蛋白降解了芯层的高分子材料才能降解，不利于细胞的生长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有中空贯通结构的磷酸钙骨水泥，通过本发明公开的技术方案得到的骨水泥适合骨组织长入，促使骨细胞粘附和组织的长入。

中空贯通结构可以为细胞提供赖以生存的三维空间，有利于细胞黏附生长，细胞外基质沉淀， 营养和氧气进入，代谢产物排出，同时还有利于血管和神经长入，有利于骨的修复。

骨组织长入的最小孔径是100μm，200～500μm的孔径分布比较适合骨组织长入，能够为骨细胞的粘附和组织的长入提供适宜的空间和力学环境，本发明采用直径为200～500μm的可吸收纤维在体内可降解从而形成贯通的孔道，具有良好的生物相容性和生物降解性，可促进血管的生长、形成和修复。

具体的，本发明采取以下的技术方案：

一种具有中空贯通结构的磷酸钙骨水泥，其特征在于，包括固相和固化液，所述固相包括a-磷酸三钙、纤维混合物，所述纤维混合物为可吸收纤维与纤维蛋白纤维，所述可吸收纤维的直径为100-500μm，长度为：0.5mm-1.5mm。

优选地，所述可吸收纤维的直径为200-400μm。

优选地，所述固相中可吸收纤维的质量分数为5%-25%，磷酸钙粉末的质量分数为75-95%。优选地，可吸收纤维的质量分数为10-20%，磷酸钙粉末的质量分数为80-90%；所述固相与所述固化液的按重量比1:（0.3-0.8）比例调成糊状，优选地，所述固相与所述固化液的按重量比1:0.4比例调成糊状。

优选地，所述固化液为生理盐水、磷酸盐溶液、柠檬酸溶液或柠檬酸钠溶液，优选地，所述磷酸盐溶液为磷酸氢二钠。

优选地，所述可吸收纤维为PLGA纤维。

PLGA为聚乳酸-羟基乙酸，PLGA共聚物中PGA与PLA的重量比为（65-90）:（35-10），优选地，PLGA共聚物中PGA与PLA的重量比为75:25。

优选地，所述纤维混合物包含质量百分比分别为：70-95%的可吸收纤维，5-30%的纤维蛋白，优选地，所述所述纤维混合物包含质量百分比分别为：75-85%的可吸收纤维，15-25%的纤维蛋白，优选地，所述所述纤维混合物包含质量百分比分别为：80%的可吸收纤维，20%的纤维蛋白。

优选地，所述纤维蛋白纤维的制备方法如下：

将浓度为15-30%的纤维蛋白原溶液进行高压静电纺丝，设置电压10-18kV，纺丝速率0.8-1.2ml/h，用金属载体接收电纺纤维，将纤维切割成长度0.5-1.5mm的纤维蛋白纤维。

优选地，称取450 mg人源纤维蛋白原，溶于2.25 ml六氟异丙醇溶液中，搅拌，加入0.25ml 生理盐水后再搅拌，制得18%纤维蛋白原溶液；

将纤维蛋白原溶液进行高压静电纺丝，设置电压15kV，纺丝速率1.0 ml/h，用金属载体接收电纺纤维，2.5小时后得到静电纺丝纤维蛋白，将纤维切割成长度0.5-1.5mm的纤维蛋白纤维。

本发明的又一目的是提供磷酸钙骨水泥的制备方法，其特征在于：

1）将可吸收纤维与纤维蛋白纤维混合，得到纤维混合物。

2）将磷酸钙粉末与纤维混合物混合。

3）加入固相与所述固化液的按重量比1:（0.3-0.8）比例调成糊状，得到磷酸钙骨水泥。

优选地，将85%质量分数的a-磷酸钙粉末与15%质量分数纤维混合物混合。

优选地，步骤3）所述固化液为质量分数4%的Na₂HPO₄溶液。

本发明的再一目的是提供上述磷酸钙骨水泥在骨修复材料中的应用。

PLGA纤维的降解速度要快于纤维蛋白纤维，采用将纤维蛋白纤维与可降解纤维PLGA混合，PLGA降解形成贯通的大孔，纤维蛋白纤维具有粘附细胞的作用，当成骨细胞或其他生长因子通过大孔时，被纤维蛋白纤维粘附，促进骨组织的长入。

通过以上技术方案，本发明所取得的有益效果包括：

1）本发明制备的磷酸钙骨水泥随着PLGA降解，后期可形成200-500μm直径的三维连通的大孔结构，复合骨形成的理想大小孔径结构，可形成良好的孔隙连通，有利于内部对干细胞及信号分子的募集与吸附，促进骨修复早期的骨组织与血管的长入。

2）纤维蛋白纤维可促进细胞在通道上的粘附，有利于营养物质与新陈代谢产物的运输和气体交换，促进细胞的黏附、增殖和分化，有助于骨组织和血管的形成与长入，改善骨修复效果。

3）本发明加入的PLGA纤维可以提高骨水泥的力学强度。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

纤维蛋白纤维的制备：

称取450 mg人源纤维蛋白原，溶于2.25 ml六氟异丙醇溶液中，磁力搅拌30分钟，加入0.25ml 生理盐水后再搅拌10分钟，制得18%纤维蛋白原溶液；

将纤维蛋白原溶液进行高压静电纺丝，设置电压15kV，纺丝速率1.0 ml/h，用金属载体接收电纺纤维，2.5小时后得到静电纺丝纤维蛋白，将纤维切割成长度0.5mm的纤维蛋白纤维。

实施例2

作为本发明所述的磷酸钙骨水泥的一种实施例，本实施例所述的磷酸钙骨水泥包括固相粉末和固化液；

将70重量份可吸收纤维PLGA与30重量份纤维蛋白纤维均匀混合形成混合纤维，所述可吸收纤维PLGA长度0.5mm，直径100微米，所述纤维蛋白纤维长度0.5mm。将95%质量分数的a-磷酸钙粉末与5%质量分数混合纤维混合，按照每克固相中加入0.3g液相固化液的量制备将骨水泥调成糊状；其中固化液为质量分数4%的Na₂HPO₄溶液。

实施例3

作为本发明所述的磷酸钙骨水泥的一种实施例，本实施例所述的磷酸钙骨水泥包括固相粉末和固化液；

将80重量份可吸收纤维PLGA与20重量份纤维蛋白纤维均匀混合形成混合纤维，所述可吸收纤维PLGA长度1mm，直径250微米，所述纤维蛋白纤维长度0.5mm。将85%质量分数的a-磷酸钙粉末与15%质量分数混合纤维混合，按照每克固相中加入0.5g液相固化液的量制备将骨水泥调成糊状；其中固化液为质量分数4%的Na₂HPO₄溶液。

实施例4

作为本发明所述的磷酸钙骨水泥的一种实施例，本实施例所述的磷酸钙骨水泥包括固相粉末和固化液；

将95重量份可吸收纤维PLGA与5重量份纤维蛋白纤维均匀混合形成混合纤维，所述可吸收纤维PLGA长度1.5mm，直径500微米，所述纤维蛋白纤维长度0.5mm。将75%质量分数的a-磷酸钙粉末与25%质量分数混合纤维混合，按照每克固相中加入0.8g液相固化液的量制备将骨水泥调成糊状；其中固化液为质量分数4%的Na₂HPO₄溶液。

对比例1

将85%质量分数的a-磷酸钙粉末与15%质量分数PLGA纤维混合，所述可吸收纤维PLGA长度1mm，直径250μm，按照每克固相中加入0.5g液相固化液的量制备将骨水泥调成糊状；其中固化液为质量分数4%的Na₂HPO₄溶液。

本实施例与实施例3的区别是：不含纤维蛋白。

对比例2

将85%质量分数的a-磷酸钙粉末与15%质量分数纤维蛋白纤维混合，所述纤维蛋白纤维长度0.5mm，按照每克固相中加入0.5g液相固化液的量制备将骨水泥调成糊状；其中固化液为质量分数4%的Na₂HPO₄溶液。

本实施例与实施例3的区别是：不含可吸收纤维PLGA。

对比例3

将80重量份可吸收纤维PLGA与20重量份胶原蛋白纤维均匀混合形成混合纤维，所述可吸收纤维PLGA长度1mm，直径250微米，所述胶原蛋白蛋白纤维长度0.5mm。将85%质量分数的a-磷酸钙粉末与15%质量分数混合纤维混合，按照每克固相中加入0.5g液相固化液的量制备将骨水泥调成糊状；其中固化液为质量分数4%的Na₂HPO₄溶液。

本实施例与实施例3的区别是：将纤维蛋白纤维用胶原蛋白纤维替换。

对比例4

将70重量份可吸收纤维PLGA与40重量份纤维蛋白纤维均匀混合形成混合纤维，所述可吸收纤维PLGA长度1mm，直径250微米，所述纤维蛋白纤维长度0.5mm。将85%质量分数的a-磷酸钙粉末与15%质量分数混合纤维混合，按照每克固相中加入0.5g液相固化液的量制备将骨水泥调成糊状；其中固化液为质量分数4%的Na₂HPO₄溶液。

本实施例与实施例3的区别是：本实施例的纤维蛋白纤维加入量为30重量份。

对比例5

将95重量份可吸收纤维PLGA与3重量份纤维蛋白纤维均匀混合形成混合纤维，所述可吸收纤维PLGA长度1mm，直径250微米，所述纤维蛋白纤维长度0.5mm。将85%质量分数的a-磷酸钙粉末与15%质量分数混合纤维混合，按照每克固相中加入0.5g液相固化液的量制备将骨水泥调成糊状；其中固化液为质量分数4%的Na₂HPO₄溶液。

本实施例与实施例3的区别是：本实施例的纤维蛋白纤维加入量为5重量份。

对比例6

按照每克固相中加入0.5g液相固化液的量制备将骨水泥调成糊状；固相为a-磷酸钙，固化液为质量分数4%的Na₂HPO₄溶液。

对比例7

将80重量份可吸收纤维PLGA与20重量份纤维蛋白纤维均匀混合形成混合纤维，所述可吸收纤维PLGA长度1mm，直径250微米，所述胶原蛋白蛋白纤维长度0.5mm。将65%质量分数的a-磷酸钙粉末与35%质量分数混合纤维混合，按照每克固相中加入0.5g液相固化液的量制备将骨水泥调成糊状；其中固化液为质量分数4%的Na₂HPO₄溶液。

本实施例与实施例7的区别是：a-磷酸钙粉末与混合纤维的比例不同。

对比例8

采用专利CN107881650A的方法制备直径250微米，长度为1mm，壳层为PLGA，芯层为纤维蛋白的同轴纳米纤维膜。

对实施例2~4和对比例1~6的快速降解的可注射型骨水泥进行以下性能检测。

1、可注射性

将固相粉末和固化液按比例调和后，将骨水泥浆料灌入10mL的一次性注射器，垂直置于力学试验机平板上，以速率15mm/min推进将骨水泥浆体推出，直至最大推进力为100N时停止。可注射性为挤出注射后磷酸钙骨水泥质量占注射前骨水泥总质量的百分比，结果如表1所示。

2、抗压强度

将固相粉末和固化液按比例混合，用药匙调和 30s 以形成均匀一致的骨水泥浆料，填入直径为6mm、高为12mm的不锈钢圆柱体模具中并施加0.7MPa的压力压实，将制成的圆柱体试样塞进直径6.5mm、高13mm的玻璃管中，然后置入温度为37℃、相对湿度为100％的环境中固化3d后，通过万能材料试验机测试试样的抗压强度，加载速率为1 mm/min，结果如表1所示。

3、凝结时间

按标准ASTM C191-13，采用吉尔摩仪测定所述快速降解的可注射型骨水泥的凝结时间，结果如表1所示。

4、孔隙率 将固相和固化液按比例混合，用药匙调和 30s 以形成均匀一致的骨水泥浆料，填入直径为6mm、高为12mm的不锈钢圆柱体模具中并施加0.7MPa的压力压实，将制成的圆柱体试样塞进直径6.5mm、高13mm的玻璃管中，然后置入温度为37℃、相对湿度为100％的环境中固化3d后，干燥，以无水乙醇作为液相介质，通过比重天平，根据阿基米德排水法测定样品的孔隙率，同时对制备的骨水泥采用SBF模拟体液浸泡降解，5d换一次液体，10d后取出骨水泥烘干后扫描电镜测量孔径范围。

结果如表1所示。

表1

组别	可注射性（%）	抗压强度（MPa）	孔隙率（%）	10天后孔径平均值（μm）
					实施例2	98	20.9	42	73
实施例3	97	24.5	43	143
					实施例4	98	28.8	46	326
对比例1	83	20.8	47	147
					对比例2	79	21.2	45	42
对比例3	75	21.4	48	142
					对比例4	92	22.7	46	147
对比例5	91	20.6	45	134
					对比例6	88	10	51	35
对比例7	62	19.3	46	153
					对比例8	91	20.4	42	42

实验结果表明，骨水泥的可注射性与混合纤维的加入量相关，当混合纤维加入过多会影响可注射性，本申请中纤维蛋白与PLGA纤维混合，可以提高纤维的注射性，实施例2-4的可注射性为97-98%，对比例1未加入纤维蛋白纤维，可注射性为83%，对比例2未添加PLGA纤维，可注射性为79%，而对比文件3将纤维蛋白纤维替换为胶原蛋白纤维，可注射性降为75%，同时磷酸三钙与纤维混合物的比例也会影响可注射性，对比例7由于混合纤维加入增多，注射性急剧降低；随着可吸收纤维直径的增加，抗压强度逐渐增加；通过试验结果可知，骨水泥可吸收纤维在SBF模拟体液中逐渐降解，形成大孔径，而对比文件8由于外层包裹有纤维蛋白不能降解导致不能形成大孔。

5、动物实验

将实施例2-4、对比例1-8所制的骨水泥分别植入到55只兔股骨髁部，均未见化脓或异常渗出，生物相容性好。

实施例2的骨水泥植入2周后骨样组织附着增多，2个月后新骨向材料内部生长；4个月后新骨替代非常明显；15个月后基本完全降解且被新生骨替代。

实施例3的骨水泥植入2周后骨样组织附着增多，1个月后新骨向材料内部生长；3个月后新骨替代非常明显；12个月后基本完全降解且被新生骨替代。

实施例4的骨水泥植入2周后骨样组织附着增多，2个月后新骨向材料内部生长；4个月后新骨替代非常明显；15个月后基本完全降解且被新生骨替代。

对比例1的骨水泥植入4个月后新骨向材料内部生长；12个月后开始出现新生骨替代。

对比例2的骨水泥植入6个月后新骨向材料内部生长；12个月后开始出现新生骨替代。

对比例3的骨水泥植入2个月后新骨向材料内部生长；6个月后开始出现新生骨替代。

对比例4的骨水泥植入2个月后新骨向材料内部生长；6个月后开始出现新生骨替代。

对比例5的骨水泥植入6个月后新骨向材料内部生长；15个月后开始出现新生骨替代。

对比例6的骨水泥植入8个月后新骨向材料内部生长；18个月后开始出现新生骨替代。

对比例7的骨水泥植入2周后骨样组织附着增多，1个月后新骨向材料内部生长；3个月后新骨替代非常明显；12个月后基本完全降解且被新生骨替代。

对比例8的骨水泥植入8个月后新骨向材料内部生长；18个月后开始出现新生骨替代。

动物实验结果表明，纤维蛋白的加入能够促进新骨的生长，可吸收纤维的直径会影响新骨的生成。

综上所述，本发明通过在骨水泥的固相中加入直径100-500μm可吸收纤维PLGA与纤维蛋白纤维混合物，可增强磷酸钙骨水泥的力学性能，并且可诱导骨细胞的生长。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。