一种细胞炎症因子吸附剂及其制备方法
阅读说明：本技术 一种细胞炎症因子吸附剂及其制备方法 (Adsorbent for cell inflammatory factors and preparation method thereof ) 是由 刘群奇 白珂 于 2021-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种细胞炎症因子吸附剂及制备方法,其骨架为聚苯乙烯氯球,利用骨架上苄氯的活泼性,将甘氨酸偶联到载体上。利用聚苯乙烯氯球上的苄氯的活泼性,直接偶联氨基酸,偶联效率高,通过对偶联氨基酸进一步改性,可链接缬氨酸等氨基酸,接链效率高。(The invention discloses a cell inflammation factor adsorbent and a preparation method thereof, wherein a skeleton of the adsorbent is a polystyrene chloride sphere, and glycine is coupled to a carrier by utilizing the activity of benzyl chloride on the skeleton. The amino acid is directly coupled by utilizing the activity of benzyl chloride on the polystyrene chlorine sphere, the coupling efficiency is high, the coupled amino acid can be further modified to be linked with amino acids such as valine, and the linking efficiency is high.)
技术领域
本发明涉及高分子生物医用材料，具体为一种应用于血液灌流的细胞炎症因子吸附剂及其制备方法。
背景技术
随着经济发展，城市化步伐不断提速，城市集群和人口密集程度不断增加，交通便利程度不断提高，在便利了人们生活和出行的同时也增加了传染病传播的风险，加之经济活动导致环境污染日益严重，这些都给公共卫生安全和人们的健康带来了新的挑战。
新型冠肺炎病例的最新研究显示，多数老年人和患有基础疾病（例如高血压、慢性阻塞性肺疾病、糖尿病、心血管疾病）的人迅速发展为急性呼吸窘迫综合征，败血症性休克，甚至死亡。通过实验室观察发现，多数重症患者炎症因子白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF-α）等细胞炎症因子显著增加。
细胞炎症因子是一类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的低分子蛋白或多肽，可分为白细胞介素（IL）、干扰素（IFN）、肿瘤坏死因子（TNF-α）和生长因子等。细胞炎症因子刺激和调节免疫系统反应的强度和持续时间以帮助身体抵抗感染，然而，细胞炎症因子是一把双刃剑，当体内细胞炎症因子被过度激活而过剩时，会导致人体发生“细胞因子风暴”。这种通过感染、药物等多种诱因导致的全身系统性炎症反应会损害人体，造成人体自身免疫性疾病。细胞因子风暴与流感、败血症/败血性休克、急性呼吸窘迫综合征等密切相关，最终可导致多器官功能衰竭。
细胞炎症因子分子量大多在几个至几十个kDa之间，其中以白介素-6（IL-6）为代表，其分子量为26kDa。在炎症反应中，IL-6的升高早于其他细胞因子，而且持续时间长，因此可用来辅助急性感染的早期诊断。人体感染后IL-6水平迅速升高，可在2h达高峰，其升高水平与感染的严重程度相一致。因此，IL-6可作为最典型炎症标志物。
浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室在已发表的《2019 冠状病毒病（COVID-19）诊疗浙江经验》中指出，由新型冠状病毒引起的休克和低氧血症多为细胞因子风暴所致，细胞因子风暴相关的免疫学指标，尤其是IL-6等，可能有衡量重型COVID-19患者病情严重程度和预测死亡风险的潜在临床价值。
肿瘤坏死因子（TNF-α）分子量在17kDa~25kDa，能够参与机体的免疫调节，同时也是某些感染性疾病的致病因素，大量累积时对多种生物细胞具有毒性。
血液吸附、灌流技术等组成的血液净化系统能迅速清除炎症介质，阻断炎症的级链式反应，恢复炎症因子平衡，重建机体免疫内稳态。
由于细胞炎症因子分子量较大，广谱型吸附剂对其吸附效果不理想，选择性较差。通用的方法是对吸附剂骨架进行修饰和改性达到特异性吸附的效果。专利号为201510343163.4的专利提到通过对聚苯乙烯骨架进行环氧化改性后连接选择性吸附基团制备的吸附剂可用于对细胞炎症因子的清除。但是由于环氧化再进行偶联配基，偶联配基的效率不高。
发明内容
本发明的目的是提供一种结构新颖独特，使用方便，无需对吸附剂骨架改性的细胞炎症因子吸附剂；具体技术方案为：
一种细胞炎症因子吸附剂，其骨架为聚苯乙烯氯球，利用骨架上苄氯的活泼性，将甘氨酸偶联到载体上。
进一步的，载体的粒径为0.4~1.2mm，载体的孔径为2~100nm，比表面积不低于500㎡/g，氯含量不低于17%。
进一步的，将甘氨酸偶联到载体上，甘氨酸溶液的浓度为wt5%~25%。
进一步的，偶联甘氨酸的反应温度为30℃~60℃。
进一步的，偶联甘氨酸的反应时间为8~48h。
进一步的，偶联甘氨酸时用到基团保护试剂
进一步的，基团保护试剂是氯代甲酸脂及其衍生物。
进一步的，氯代甲酸脂可以是氯代甲酸苯甲酯或氯代甲酸三级丁酯。
进一步的，所述氯代甲酸脂可以是氯代甲酸苯甲酯或氯代甲酸三级丁酯，与甘氨酸的摩尔比为1:1~3:1。
进一步的，偶联甘氨酸后使用一种脱保护试剂。
进一步的，脱保护试剂为乙醚、乙酸乙酯和三氟乙酸的混合物。
进一步的，三氟乙酸溶液的质量分数为0.1~5%，优选2%。
进一步的，将载体进一步偶联缬氨酸。
进一步的，偶联缬氨酸的溶液浓度为wt1%~8%，优选wt8%。
进一步的，偶联缬氨酸时对缬氨酸上的羧酸基团进行活化，活化时的pH控制在4~6。
进一步的，对缬氨酸上的羧酸基团进行活化的活化试剂为N-羟基琥珀酰亚胺和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
进一步的，对缬氨酸上的羧基基团进行活化的活化试剂可以是现有技术公开的。
进一步的，该吸附剂血液相容性良好，可进行全血灌流吸附。
本发明的有益效果是：
利用聚苯乙烯氯球上的苄氯的活泼性，直接偶联甘基酸，偶联效率高；还可链接缬氨酸等氨基酸，接链效率高。
接链形成的酰胺键增加了生物相容性。
细胞炎症因子本质是蛋白或糖蛋白，利用吸附剂上键合的缬氨酸，可与炎症因子形成氢键和静电作用的协同作用，提高对炎症因子的选择性清除能力。
缬氨酸本质上是一种带羧基和胺基的蛋白质，带有电荷，利用吸附剂上键合的缬氨酸，可与炎症因子形成氢键和静电作用的协同作用，提高对炎症因子的选择性清除能力。
无需包膜处理，避免了膜层脱落进入人体的风险。
具体实施方式
下面利用实施例对本发明进行更全面的说明。本发明可以体现为多种不同形式，并不应理解为局限于这里叙述的示例性实施例。
实施例1：
1-1前处理
取wt20%的甘氨酸水溶液，用0.5%NaOH调节溶液pH至9，也可以用其他低浓度强碱来调节溶液至碱性；量取配制好的甘氨酸溶液50ml，然后加入26.4g氯代甲酸苯甲酯，混匀，40℃下搅拌器转速100rpm搅拌1h后备用。所述氯代甲酸脂可以是氯代甲酸苯甲酯或氯代甲酸三级丁酯，与甘氨酸的摩尔比应控制在1:1~3:1之间。
1-2偶联甘氨酸
取聚苯乙烯氯球10g（市售，参数为：氯含量20%，孔径2~60nm，比表面积不低于500㎡/g）加入50ml二氯乙烷溶胀2h，然后分别加入10ml亚硫酰氯和步骤1-1得到的溶液20ml，于40℃温度下搅拌反应48小时，搅拌器转速100rpm。然后加入10ml乙酸乙酯和2%的冷三氟乙酸溶液30ml，降低搅拌器转速至50rpm继续反应8h，然后用乙酸乙酯提取，然后用甲醇或乙醇等醇类进行醇洗，用纯化水洗微球，干燥后备用。
1-3 偶联缬氨酸
取步骤1-2得到的微球5g，加入wt8%缬氨酸溶液50ml，滴入0.5%醋酸将溶液pH调节为5.0，加入0.4gN-羟基琥珀酰亚胺，再加入0.3g1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，常温下震荡反应6h，然后先后用乙醇、纯化水清洗，80℃干燥后得到细胞炎症因子吸附剂。
实施例2：
2-1 前处理
取wt20%的甘氨酸水溶液，滴入 0.5%NaOH溶液pH至10，量取配制好的甘氨酸溶液30ml，然后加入12.8g氯代甲酸三级丁酯，混匀，常温下搅拌器转速100rpm搅拌1h后备用。
2-2偶联甘氨酸
取聚苯乙烯氯球10g（市售，参数为：氯含量18%，孔径5~50nm，比表面积不低于500㎡/g）加入50ml二氯乙烷溶胀2h，然后分别加入10ml亚硫酰氯和2-1得到的溶液20ml，于40℃下搅拌反应24小时，搅拌器转速100rpm。然后加入10ml乙醚和2%的冷三氟乙酸溶液30ml，降低搅拌器转速至50rpm继续反应8h，用乙酸乙酯提取8h，然后醇洗，水洗微球，干燥后备用。
2-3 偶联缬氨酸
取2-2得到的微球5g，加入wt5%缬氨酸溶液50ml，用0.5%醋酸溶液调节pH为4.0，加入0.3gN-羟基琥珀酰亚胺，再加入0.3g1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，常温下震荡反应8h，然后分别用乙醇、纯化水清洗，干燥后得到细胞炎症因子吸附剂。
实施例3：
3-1 前处理
取wt20%的甘氨酸水溶液，滴入 0.5%NaOH调节溶液呈碱性，量取配制好的甘氨酸溶液20ml，然后加入8.5g氯代甲酸三级丁酯，混匀，40℃搅拌器转速100rpm搅拌1h后备用。
3-2偶联甘氨酸
取聚苯乙烯氯球10g（市售，参数为：氯含量18%，孔径5~50nm，比表面积不低于500㎡/g）加入50ml二氯乙烷溶胀2h，然后分别加入10ml亚硫酰氯和2-1得到的溶液20ml，于40℃下搅拌反应24小时，转速100rpm，然后加入10ml乙酸乙酯和2%的冷三氟乙酸溶液30ml，降低转速至50rpm继续反应8h，然后用乙酸乙酯提取8h，然后醇洗，水洗微球，干燥后备用。
3-3 偶联缬氨酸
取3-2得到的微球5g，加入wt5%缬氨酸溶液50ml，用0.5%醋酸溶液调节pH为6，加入0.3gN-羟基琥珀酰亚胺，再加入0.3g1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，常温下震荡反应8h，然后分别用乙醇、纯化水清洗，干燥后得到细胞炎症因子吸附剂。
实施例4：
4-1 前处理
取重量百分比20%的甘氨酸水溶液，滴入 0.5%NaOH调节溶液呈碱性，量取配制好的甘氨酸溶液30ml，然后加入15.8g氯代甲酸苯甲酯，混匀，常温下搅拌器转速100rpm搅拌1h后备用。
4-2偶联甘氨酸
取聚苯乙烯氯球10g（市售，参数为：氯含量18%，孔径5~50nm，比表面积不低于500㎡/g）加入50ml二氯乙烷溶胀2h，然后分别加入10ml亚硫酰氯和2-1得到的溶液20ml，于40℃下搅拌反应24小时，转速100rpm，然后加入10ml乙醚和2%的冷三氟乙酸溶液30ml，降低转速至50rpm继续反应8h，然后用乙酸乙酯提取8h，然后醇洗，水洗微球，干燥后备用。
4-3 偶联缬氨酸
取4-2得到的微球，用0.5%醋酸溶液调节pH为4.0，加入wt5%缬氨酸溶液，加入0.4gN-羟基琥珀酰亚胺，再加入0.5g1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，常温下震荡反应10h，然后分别用乙醇、纯化水清洗，干燥后得到细胞炎症因子吸附剂。
对照例1：
取市售氯球（粒径0.3~1.1mm）20g，加入60ml二氯乙烷，6g三氯化铝，开启机械搅拌，常温膨胀5h，升高温度值100℃反应8h，得粗产物，减压蒸馏蒸出二氯乙烷，醇洗，水洗抽滤后干燥，筛分得0.35~1.2mm深色微球。
对照例2：
取市售氯球（粒径0.3~1.1mm）10g，加入40ml二氯乙烷，5g三氯化铝，开启机械搅拌，常温膨胀3h，升高温度值100℃反应12h，得粗产物，减压蒸馏蒸出二氯乙烷，醇洗，水洗抽滤后干燥，筛分得0.355~1.2mm深色微球。
实施例5：溶血试验
根据GB/T16886.4-2003 医疗器械生物学评价第4部分：与血液相互作用试验选择评价吸附剂的溶血率。
试验设试验组、阴性对照和阳性对照，试验管加入上述制备的吸附剂5g，阴性对照管加入10ml0.9%NaCl水溶液，阳性对照加入10ml蒸馏水。试验管、阴性对照管、阳性对照管中分别加入10ml 0.9%NaCl水溶液。全部试管置于（37±1）℃恒温水域中60rpm震荡浸提（24±2）h后取出，得到试验液，按照0.2ml稀释兔血/10ml试验液的比例，每支试管加入稀释兔血后混匀，置于（37±1）℃恒温水域中60min，然后倒出管内液体离心5min，吸取上清液，用紫外分光光度计在545nm处测定吸光度。三组均取3管的平均值。计算得到的吸附剂溶血率见下表。
表1 吸附剂溶血率
项目 吸光度平均值 溶血率（%） 阴性对照 0.0197 / 阳性对照 08914 / 实施例1 0.0275 1.0 实施例2 0.0280 0.9 实施例3 0.0270 0.8 实施例4 0.0280 0.9 对照例1 0.0640 5.1 对照例2 0.0750 6.3
与对照例相比，实施例的溶血率均≤1.0%，符合≤5%的要求。
实施例6：细胞炎症因子吸附实验
取无热原的试管，分别加入实施例和对照例制得的吸附剂0.5g，然后分别加入含细胞炎性因子白介素-6（IL-6）140.3pg/ml和肿瘤坏死因子（TNF-α）336.4pg/ml的血浆2ml，置于（37±1）℃、（100±10）rpm的恒温水域振荡器中震荡2h，然后检测IL-6和TNF-α浓度，计算吸附前后IL-6和TNF-α的下降率。
表2 吸附剂对细胞炎症因子的清除率
吸附剂 吸附前IL-6浓度（pg/ml） 吸附后IL-6浓度（pg/ml） IL-6下降率（%） 吸附前TNF-α浓度（pg/ml） 吸附后TNF-α浓度（pg/ml） TNF-α下降率（%） 实施例1 140.3 26.4 81.2 336.4 67.3 80.0 实施例2 140.3 27.2 80.6 336.4 69.0 79.5 实施例3 140.3 28.2 79.9 336.4 71.7 78.7 实施例4 140.3 23.1 83.5 336.4 70.3 79.1 对照例1 140.3 98.1 30.1 336.4 237.8 29.3 对照例2 140.3 90.2 35.7 336.4 239.2 28.9
可以看出，经过与炎症因子具有类似结构的氨基酸基团的修饰的吸附剂，其对两种炎症因子的吸附率均较高，几乎为未经修饰的广普类吸附剂的2.5倍，显示了吸附剂对这两种炎症因子良好的选择性吸附能力。
实施例7：吸附剂凝血试验
分别取由实施例和对照例制得的吸附剂各0.5g，用0.9%NaCl浸泡30ml，然后分别加入1.5ml人血（枸橼酸钠抗凝），置于（37±1）℃、（100±10）rpm水域中恒温震荡孵育1h，然后测定凝血酶原时间。同法制备空白样。
表3 吸附剂凝血试验
项目 凝血酶原时间（s） 阳性对照 阴性对照（s） 实施例1 13.5 NC 13.0 实施例2 13.3 NC 13.1 实施例3 14.0 NC 13.9 实施例4 13.9 NC 13.2
注：NC表示未发生凝血
吸附剂的凝血酶原时间均在人体凝血酶原凝血机能的正常范围内（10~14s）。
本发明提出了一种新的制备选择性吸附细胞炎症因子的方法，无需对吸附剂骨架改性，即利用聚苯乙烯氯球上的苄氯的活泼性，直接偶联氨基酸，偶联效率高。
通过对偶联氨基酸进一步改性，可连接缬氨酸等氨基酸，接链效率高。
反应形成的酰胺键增加了材料的生物相容性。
细胞炎症因子本质是蛋白或糖蛋白，利用吸附剂上键合的氨基酸基团，可与炎症因子形成氢键和静电作用的协同作用，提高对炎症因子的选择性清除能力。
缬氨酸为人体必需氨基酸，可维持机体生长发育，避免缺乏引起神经障碍、运动失调和贫血等。
无需表面物理修饰，避免引入多余化学试剂。
上述示例只是用于说明本发明，除此之外，还有多种不同的实施方式，而这些实施方式都是本领域技术人员在领悟本发明思想后能够想到的，故，在此不再一一列举。