用于体外抗原呈递、评估疫苗功效及生物制剂和药物的免疫毒性的组合物、试剂盒和方法
阅读说明：本技术 用于体外抗原呈递、评估疫苗功效及生物制剂和药物的免疫毒性的组合物、试剂盒和方法 (Compositions, kits and methods for in vitro antigen presentation, evaluation of vaccine efficacy and immunotoxicity of biologics and drugs ) 是由 P·M·达夫塔里安 P·塞拉菲尼 V·P·莱蒙 A·凯弗尔 B·B·布隆贝格 R·乔杜里 于 2010-05-19 设计创作，主要内容包括：本发明描述了用于将抗原(肽、蛋白质)或编码抗原的核酸递送到专门的APC(PAPC)的组合物、测定、试剂盒、方法和平台,其用于评估疫苗(例如,对特定抗原的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答)或其它疗法或干预(基于细胞的疗法、辅助疗法等)的功效。所述组合物、试剂盒、测定和方法涉及与带电荷的(例如,带正电荷的)高度支化聚合的树状聚合物(例如,PAMAM和其它树状聚合物)的组合使用MHC靶向性、通用DR结合肽(例如,PADRE、HA)作为媒介物以将核酸、肽、生物制剂、药物、或多肽靶向递送到APC。(The present invention describes compositions, assays, kits, methods and platforms for delivering antigens (peptides, proteins) or nucleic acids encoding antigens to professional apcs (papcs) for assessing the efficacy of vaccines (e.g., Cytotoxic T Lymphocyte (CTL) responses to particular antigens) or other therapies or interventions (cell-based therapies, adjuvant therapies, etc.). The compositions, kits, assays, and methods involve the use of MHC-targeted, universal DR-binding peptides (e.g., PADRE, HA) as vehicles to target nucleic acids, peptides, biologics, drugs, or polypeptides to APCs in combination with charged (e.g., positively charged) hyperbranched polymeric dendrimers (e.g., PAMAM and other dendrimers).)
具体实施方式
进一步示例。实施例仅提供示例，而不 应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实施例1：用于生成呈递抗原的自体APC的基于辅助/靶向性毫微粒 的平台
通常通过两种反应物：第五代以氨基为末端的PAMAM树状聚合物 和靶向性/免疫增强肽，或通用DR结合肽(例如，PADRE)的缀合来制 备本文中所描述的基于树状聚合物的毫微粒。下文所描述的数据显示了 此平台将在小鼠和人APC两者中的转染效率提高了2至3倍。此外，使 用与PADRE-树状聚合物缀合的GFP编码质粒的体内实验显示了GFP是 在引流***中生成的。
材料和方法
在具有以下修饰的情况下如上文所描述，生成PADRE衍生化的 PAMAM树状聚合物。通过以适当的N/P比率于室温温育10分钟来生成 PADRE-树状聚合物/DNA或siRNA复合物。将此类复合物添加到原代 PBMC或脾细胞以进行体外研究或者出于疫苗接种目而进行皮下注射。 图1显示了第五代PAMAM树状聚合物的PADRE装饰(与第五代 PAMAM树状聚合物缀合)。
为了保持高度带正电荷的表面以结合多个核酸，一个树状聚合物分 子通常具有两个与其表面缀合的PADRE肽，从而它仍将保持其正净电 荷。对树状聚合物添加PADRE导致APC的特异性靶向及强的CD4辅助。
结果
表征制备的PADRE-树状聚合物。通过肽的-COOH端与树状聚合物 胺基间的简单酰胺偶联来生成肽-树状聚合物缀合物。在反应中使用2:1 肽/树状聚合物考验比率，寻求每个树状聚合物仅几个肽的附接，以使大 多数胺基保持游离，从而在树状聚合物上形成大的正电荷。将产物通过 对纯水透析至少24小时来纯化，然后在真空下干燥。通过1H NMR、 UV-Vis和MALDI-TOF质谱术来表征所收集的产物，即一种澄清的油。 NMR显示了与树状聚合物质子对应的大峰和肽质子峰的小集合。 PADRE-树状聚合物缀合物的MALDI-TOF质谱显示了比单独对树状聚合 物观察到的峰高约3,000个单位的m/z比率的峰。超出的质量对应于约2个肽表位。
数据建立了每个树状聚合物上存在平均两个PADRE。显示了多种核 酸对自体APC的体外递送。以1:5和1:10的电荷比率最好地实现人原代 外周单核细胞的体外多核苷酸递送/转染。图2显示了经由PADRE-树状 聚合物对纯化的人B细胞的dsRNA递送(约％86)，其中将与PADRE- 树状聚合物复合的(缀合的)的加有Alexa Fluor标签的dsRNA与B细 胞一起温育4小时。用CD19/FITC染色细胞，并且红色通道(PE)代表具 有dsRNA/Alexa Fluor.man的细胞。
参考图3，显示了PADRE-树状聚合物的体内DNA递送。注射单独 的或与PADRE-树状聚合物复合的编码GFP或TRP-2的质粒或树状聚合 物(即，不与PADRE复合的树状聚合物)。该图显示了注射后24小时和 16小时的皮肤(左)和角膜(右)中的GFP表达。证明了在注射PADRE- 树状聚合物复合物后24小时和16小时，在皮肤和角膜两者中的GFP的 有效表达。证明了体内***靶向。皮下注射PADRE-树状聚合物/GFP- 质粒复合物(5μg总质粒)后8天，将相邻的***取出，并与仅注射 GFP-DNA的小鼠的***比较。在免疫后第8天对网状***拍摄荧光 显微镜图像。看到与注射部位相邻的***中的抗原表达，但是没有看 到对照***中的抗原表达。
证明了体内***靶向。皮下注射PADRE-树状聚合物/GFP-质粒复 合物(5μg总质粒)后8天，将相邻的***取出，并与仅注射GFP-DNA 的小鼠的***比较。在免疫后第8天对网状***拍摄荧光显微镜图 像。看到与注射部位相邻的***中的抗原表达，但是没有看到对照淋 巴结中的抗原表达。
这些数据清楚地证明，本文中所描述的靶向性辅助毫微粒平台导致 基因递送、编码的抗原的稳健表达和抗原呈递。因此，本文中所描述的 PADRE-树状聚合物毫微粒是一种用于递送dsRNA的新的有力的辅助/靶 向性递送工具和平台。
实施例2：体外靶向性递送和转染效率
参考图4，PBMC的体外靶向递送导致77％的B细胞转染效率。获 得来自健康供体的人PBMC。以每ml具有10％胎牛血清的RPMI培养基 6百万个细胞来培养PBMC。将5μg编码GFP的质粒在100ul生理缓冲 液PBS中稀释，并在摇动的情况下将50ul PBS中的5μg PADRE-树状聚 合物添加到DNA。在于室温温育10分钟后，然后，将GFP质粒和PADRE- 树状聚合物的混合物/复合物添加到PBMC，在37℃/5％CO2培养箱中 温育后24小时，用CD 19PE染色PBMC，并通过流式细胞术分析细胞。 在占总PBMC的43％中观察到GFP的表达，而在对B细胞门控时，77％ B细胞表达GFP。对照组，即与相同比率的树状聚合物和GFP质粒一起 温育的PBMC显示在总PBMC或B细胞中的约11％和7％GFP表达。在 与仅培养基情况下的PBMC相比时，没有观察到主要的存活力变化。这 是数项中的代表性实验。这些实验证明i)GFP质粒对PBMC且特别是对 MHC II类表达细胞(B细胞)的递送，和ii)PBMC且特别是B细胞的 GFP表达。
实施例3：在体内对小鼠DC及在体外对人B细胞的肽/蛋白质递送
将PDD/清蛋白-FITC递送到纯化的人B细胞中(图5)。参考图6， 此图显示了在体内在小鼠DC中的PADRE-树状聚合物靶向和功效及注射 和***分析的时间线。对此实验的分析显示为i)(图5)将与PADRE- 树状聚合物混合的清蛋白-FITC，即一种蛋白质在小于2小时内在人B细 胞中递送，ii)(图6)在皮下注射后第5天内，将与树状聚合物缀合的 PADRE，即一种表位在体内递送到***的B细胞和DC中(PADRE- 树状聚合物与GFP-质粒复合以显现复合物对***/B细胞/DC的递送)， iii)(图7)在皮下注射后第5天内，将与树状聚合物缀合的流感HA辅助 表位，即一种表位在体内递送到***的DC中(PADRE-树状聚合物与GFP-质粒复合以显现复合物对***DC的递送)。这些数据代表了数项 实验，并且在一些中，在皮下注射各与GFP质粒复合的PADRE-树状聚 合物或HA-树状聚合物后第3天取出***。这些结果建立经由FITC的 FITC显现对APC(包括B细胞和DC)递送与FITC缀合的蛋白质以及 递送两种肽，即与树状聚合物缀合的PADRE和HA辅助表位(其中GFP 质粒与肽-树状聚合物复合以便于显现并分析***细胞中的复合物(与 具有GFP编码质粒的树状聚合物复合物连接的肽))的例子。
通过在注射毫微粒(PADRE-树状聚合物/GFP编码质粒)对对照后5 天的关于靶向并扩充相邻***中的DC的体内流式细胞术数据(78％对 约7％GFP表达)显示DC的特异性体外和体内转染。PADRE衍生化的 树状聚合物(PDD)由于其PADRE的辅助调理效应而增强递送，所述 PADRE以高亲和力结合APC上表达的MHC II类。类似地，在皮下注射 时，在相邻的***中体内递送HA-树状聚合物(DRHA)/GFP-质粒(图 7)。注意，在小鼠中，PADRE结合IAb的MHC II类(C57BL小鼠)(图 6)，而选定的HA表位结合IAd的MHC II类(Balb/c小鼠)(图7)。已 经显示了用两种不同表位在两种不同小鼠品系中的体内递送具有相似结 果的可行性。通过PADRE-树状聚合物/GFP-质粒对人PBMC(图4)、纯 化的人B细胞(图4)，及在C57BL小鼠的脾细胞中导致GFP表达的APC 靶向性递送，及PADRE-树状聚合物/dsRNA对人B细胞(图8)和猴PBMC (图9)的递送是通过本文中所描述的组合物将肽递送到PAPC的另外的 体内证据。因为两种不同靶向肽(其独特的特征是结合MHC II类)的使 用如在本文中所描述的实验中所显示的那样起作用，所以本文中所描述 的方法、试剂盒、测定和组合物涵盖了所有MHC II类结合肽。参考图7， 还制备了与流感HA辅助表位(HDD)缀合的树状聚合物。
实施例4：PADRE-树状聚合物将dsRNA递送到人B细胞和非人灵 长类PBMC中及PADRE-树状聚合物将质粒递送到非人灵长类PBMC 中
参考图8，与dsRNA(核酸)复合的PADRE-树状聚合物在体外展现 出靶向性递送。将0.1μg dsRNA在100ul PBS中稀释，并在摇动情况下将 20ul中的0.7μg PADRE-树状聚合物添加到加有Alexa Fluor标签的 dsRNA。在于室温温育10分钟后，将复合物添加到24孔板的孔中的一 百万个纯化的B细胞(在RPMI加10％胎牛血清中)。于37℃/5％CO2培养箱温育后约1小时，将细胞清洗，并放回孔中(在1ml新鲜的RPMI 加10％胎牛血清)，并在荧光显微镜下在红色通道中分析。在明视野和红 色通道下的细胞的重叠图像证明加有Alexa Fluor标签的dsRNA被人B 细胞摄取(图8)。在将细胞用CD19(B细胞标志物)染色时，将它们于 37℃/5％CO2培养箱温育过夜，并通过流式细胞术分析(图2)。如图2 中所显示，相对于对照的约6％，对于树状聚合物/dsRNA-Alexa Fluor， 大于80％的B细胞在Alexa Fluor(对dsRNA加标签)方面呈阳性。这些 结果清楚地证明PADRE-树状聚合物将核酸稳健地递送到PAPC。
测试PBMC，即来自狒狒(狒狒(papio hamadryas))的一份样本和来自 猕猴(食蟹猴(macaca fascicularis))的两份不同样本。图9中所显示的荧光 显微镜图像是代表性的，在添加各自与dsRNA/Alexa Fluor复合的 PADRE-树状聚合物或树状聚合物后2小时拍摄。类似地，将与GFP-质 粒复合的PADRE-树状聚合物或树状聚合物添加到PBMC，并温育后24 小时分析(图10)。结果显示了，在小于2小时内，PADRE-树状聚合物 将核酸递送到猴的PBMC中，而树状聚合物仅显示适度的递送。这些结 果有力地表明，PADRE-树状聚合物对非人灵长类起作用。
实施例5：评估细胞介导的对疫苗接种的免疫应答
本文中所描述的测定、试剂盒、组合物和方法提供了数个优点。这 些优点包括：天然的/天然处理的表位的全谱可用于对来自同一个体的细 胞进行免疫评估；PBMC的EBV感染、病毒载体感染刺激的细胞、使用 CD40表达细胞、细胞的肽加载是劳动密集的/昂贵的，而且对于所有地 方的非专业化实验室是不可行的；与目前不是有效的并且诱导较差的免疫应答的DNA递送方法不同，本文中所描述的方法导致暗示高表达的强 抗体应答；而且本文中所描述的方法是快速的。另外，基因对PBMC的 病毒递送导致对病毒载体的强免疫应答，并且处理病毒载体与安全性顾 虑有关。
在评估疫苗功效的方法中，用PADRE加标签的树状聚合物在10分 钟内与抗原、编码疫苗抗原的DNA或RNA生成复合物(此类复合物通 过电泳来证明)。将此复合物与预先接种疫苗的PBMC共培养(过夜)， 并用于转染APC。用丝裂霉素-C处理此类细胞，并用作表达在疫苗接种 中使用的抗原的靶细胞(自体APC)。树状聚合物表面上的PADRE靶向 APC上的MHCII类。
证明了对人PBMC中的原代CD3T细胞的转染。将10ug GFP-质粒 与如本文中所描述的毫微粒复合10分钟。将毫微粒和DNA的复合物与 PBMC共培养过夜。在转染后第3天和第7天实施FACS分析。还证明 了对原代纯化的CD19B细胞的转染，建立了经由与毫微粒/GFP-质粒共 培养来转染APC的可行性。将10ug GFP-质粒与毫微粒复合10分钟。将 毫微粒和DNA的复合物与纯化的人B细胞共培养过夜，并在转染后第2 天实施FACS分析。
参考图15-17，这些图中所显示的实验结果表明本文中所描述的树状 聚合物用于递送核酸和肽/多肽及用于评估在哺乳动物中的疫苗功效的有 用性。在图15中，PDD/清蛋白-FITC在人B细胞中的高水平递送(73％) 清楚地显示，平台可以与蛋白质/多肽或其类似的抗原一起使用。在图16 中，PDD/GFP质粒在人B细胞中的高水平递送(77％)清楚地显示，平台 有效地将质粒递送到B细胞中，并且导致编码的蛋白质/抗原的表达。图 17显示了在小鼠中测量疫苗接种功效；注意接种疫苗的小鼠中的IFN-γ 水平的显著差异。
图14是以下结果的照片，其显示了A)树状聚合物、PADRE和树状 聚合物-PADRE的紫外光谱。通过标准的方法来实施肽-树状聚合物的紫 外光谱。对G5树状聚合物-PEDRE看到的苯丙氨酸峰显示了肽-PADRE 被添加到树状聚合物。B)对树状聚合物/DNA复合物的琼脂糖凝胶电泳和 电泳迁移率分析。通过检查琼脂糖凝胶电泳期间的质粒DNA的迁移延迟来实施对PDD与DNA的复合物形成和结合的分析。对肽衍生化的树状 聚合物(PDD)/质粒复合物测试其在凝胶电泳中的DNA保留。对PDD/质 粒和对照：单独的DNA、单独的树状聚合物及多个比率1:1、1:2、1:5、 1:10、1:20(P:N)的[PDD/质粒]样本实施凝胶电泳。PDD能够以大于(1:2) 的比率保留DNA质粒。图15是显示蛋白质/抗原的细胞特异性递送的一 系列流式细胞术点图式的图。将PDD/清蛋白-FITC递送到纯化的人B细 胞中。将PBMC与单独的清蛋白-FITC、[树状聚合物/清蛋白-FITC]或[树 状聚合物-PADRE(PDD)/清蛋白-FITC]之任一种共培养。在37℃/CO2培 养箱中温育后24小时，在流式细胞术中分析每种处理情况下的细胞，并 使用抗CD 19-APC来门控人B细胞。使用比率为1:10(w:w)的清蛋白 -FITC和PDD或树状聚合物。PDD/清蛋白-FITC在人B细胞中的高水平 递送(73％)清楚地显示了平台可以与蛋白质/多肽或其类似抗原一起使用。 图16是一系列流式细胞术直方图，其显示了用PDD(PADRE-树状聚合 物(PDD)/GFP-质粒)体外转染人B细胞(CD19)(上方小图)和小鼠脾细 胞群(下方小图)。上方小图：将纯化的人B细胞与单独的GFP质粒、[树 状聚合物/GFP质粒]或指定P:N比率的[树状聚合物-PADRE(PDD)/GFP 质粒]共培养。在37℃/CO2培养箱中温育后24小时，在流式细胞术中来 对每种处理情况下的细胞分析GFP蛋白表达。PDD/GFP质粒在人B细胞 中的高水平递送(77％)清楚地显示了平台有效地将质粒递送到B细胞中， 而且导致编码的蛋白质/抗原的表达。下方小图显示了在C57BL未免疫小 鼠的脾细胞情况下实施相似实验时的流式细胞术点图式的图，而且类似 地显示了CD-19阳性细胞(B细胞)的GFP转染。图17是显示表达抗 原的APC的生成的图。用TiterMax(Sigma)中的OVA蛋白将5只组中的6-8周龄雌性C57BL小鼠免疫两次。最后一次免疫后10天，将经免疫小 鼠的脾细胞收集，并以每孔一百万个细胞在含具有10％FBS的RPMI中 的24孔板的4孔中分配，将孔标记为“单独的培养基”、“单独的PADRE- 树状聚合物(PDD)”、“PADRE-树状聚合物(PDD)/对照质粒”和“PADRE- 树状聚合物(PDD)/OVA质粒”。将5微克与PADRE-树状聚合物复合的质 粒(以1:10的比率)添加到合适的孔(靶细胞)。次日早晨，将每种经处 理的/经转染的细胞添加到不同孔中的同一小鼠的未免疫脾细胞。刺激后 24小时，使用ELISA(Thermo)在上清液中检测INF-γ的水平。IFN水平 在含有用[PDD/QVA-质粒]处理的脾细胞的孔中显著(P值<0.006)高于所 有对照，这显示了试剂盒可以用于评估疫苗接种后的T细胞应答。通过 使用50,000个B16-OVA的考验实验以及通过OVA肽刺激(未显示)证 实T细胞应答的诱导。
实施例6：制备通用DR结合肽-树状聚合物以用于评估疫苗功效及 评估药物或生物制剂的免疫原性
通用DR结合肽(包括表1中所提及的那些通用DR结合肽)可以购 自任何商业来源或者可合成，并且一般以95％的最小纯度购自商业供应 商。使用标准方法来将肽附接于以氨基为末端的树状聚合物。例如，使 用两种合成路径来调查PADRE肽对以氨基为末端的树状聚合物的附接。 肽表位的氨基端受到乙酰化保护。一种路径使用末端半胱氨酸残基的羧酸以经由标准的酰胺化化学实现附接。第二种路径利用肽半胱氨酸的硫 醇(若肽没有此氨基酸，则将其添加)以将其与通过用溴己酰氯的先前 处理对树状聚合物表面添加的溴化物基团起反应。这两种路径都允许用 肽表位功能化树状聚合物，但是第二种路径提供了树状聚合物与表位间 的5-亚甲基间隔物。每个树状聚合物已经附接不同数目的表位。每个树状聚合物的平均2至6个表位增强DNA递送剂的靶向特性。然而，它留 下大量未起反应的胺基，从而经由在生理学pH值下的质子化，树状聚合 物将获得大的正电荷。通过紫外-可见和荧光光谱学、元素分析和 MALDI-TOF质谱术来完成肽衍生化的树状聚合物的表征。将肽-树状聚 合物与DNA的比率优化以促进肽-树状聚合物表面上的表位的呈递以及 允许DNA复合物形成。使用人PBMC进行有效基因递送和由DNA编码 的抗原的呈递的最佳比率测定为5:1、10:1、20:1的变化的平台与质粒比 率。
实施例7：用于免疫评估的简单且快速的方法
通过将PBMC的第一部分或样本添加到含有与肽衍生化的树状聚合 物(例如，G5树状聚合物)复合的靶基因(即，编码目标抗原的基因) 的质粒混合物来实施转染。将所得的经转染的APC和PBMC在DMSO 中冷冻，并在与来自同一个体的PBMC的第二样本或部分共培养时作为 自体APC使用。会将每个个体的PBMC的一部分与由毫微粒加质粒构成 的复合物温育过夜，所述质粒含有编码目标抗原的基因。次日，将经PDD/ 抗原处理的表达个体MHC背景中的抗原的PBMC(靶细胞：在用PDD/ 质粒或抗原处理时的PBMC变为表达抗原的APC)与来自个体的PBMC (效应细胞)的第二样本共培养。
毫微粒复合物上的通用DR结合肽充当APC上存在的MHC II类分 子的配体。本文中描述了一种使用具有结合MHC II类能力的通用DR结 合肽作为APC的归巢标志物的新方法。通常用丝裂霉素C处理充当靶细 胞的经转染的APC。在用疫苗抗原转染APC后的此丝裂霉素C处理导致 消除其增殖，而且降低细胞因子表达，由此导致对靶标APC的干扰的消 除以及CTL测定中可能的PADRE诱导的背景的降低。
实施例8：呈递由与树状聚合物缀合的RNA编码的抗原的APC的 生成
图11和图12显示了来自涉及经流感血凝素(HA)SFERFEIFPKEC (SEQ ID NO:28)T辅助表位装饰的树状聚合物(DRHA)、同基因小鼠脾细 胞(靶细胞)、同基因小鼠的MHC 1类-HA反应性CD8+T细胞(效应细 胞)的实验的结果。在该实验中，将源自血凝素表达肿瘤的mRNA(包 括血凝素RNA)的混合物与DRHA混合，然后添加到识别MHC I类限 制性血凝素肽的T细胞。测量IFN-γ。图12和图13显示了仅DRHA能 够诱导可察觉水平的IFN-γ。因为血凝素特异性CD8+T细胞仅在将该蛋 白质翻译、处理并与MHC I类复合时才能识别血凝素，但是它们不能识 别树状聚合物上缀合的或MHC II类上暴露的MHC II类限制性HA肽， 这些结果清楚地显示了，缀合有MHC II类限制性肽的树状聚合物在 mRNA的情况下可以有效地转染APC。将包含目标抗原的这些mRNA翻 译成蛋白质、处理并在MHC分子上暴露。此实验有力地表明，可以通过 使用通过用还含有目标mRNA的RNA混合物加载的肽树状聚合物转染 的APC来检出对任何肿瘤相关抗原的免疫应答。这在需要评估来自肿瘤 表达的未知肿瘤相关抗原的免疫应答时是特别重要的。
实施例9：其它通用DR结合肽-树状聚合物的制备
用两种MHC II类结合肽装饰树状聚合物，每种所述MHC II类结合 肽覆盖大量MHC等位基因。或者，为了具有不太复杂的合成选项，生成 各具有这些肽之一的两组树状聚合物，并且在使用点将它们以1:1混合。
第一平台由用肽FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO:30)装 饰的树状聚合物和树状聚合物与肽FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO:30)的缀合物组成。平均2个肽在每个树状聚合物上。此肽衍生化 的树状聚合物称为“FNN-DR”。报道了此通用MHC结合肽结合非人灵 长类、Balb/c、C57B1以及人的以下等位基因：DRB1*1101、DRB1*1104、 HLA-DPB1*0402、HLA-DRBl*1101和HLA-DPB1*0401。
第二平台由用肽SSVFNVVNSSIGLIM(SEQ ID NO:29)装饰的树状 聚合物和树状聚合物与肽SSVFNVVNSSIGLIM(SEQ ID NO:29)的缀合 物组成。平均2个肽在每个树状聚合物上。此肽衍生化的树状聚合物称 为“SSV-DR”。此通用DR结合肽结合以下等位基因：DRB1*0401(15％)、 DRB1*0405、DRB1*1101、DRB1*1302、DRB1*0701、DRB1*0802、 DRB1*0901、DRB1*1501、DRB1*0101(24％)和DRB5*0101。
实施例10：用于靶向APC的超基序-树状聚合物平台
超基序靶向MHC II类，并且与通用的T辅助表位不同，II类相关恒 定链肽(CLIP)没有T辅助活性，因此使它们成为一种用于MHC II类的通 用靶向，特别是用于免疫监测应用及不期望免疫增强的递送的良好候选 物。还可以使用与CLIP缀合的树状聚合物来递送例如FoxP3siRNA或质 粒以抑制或诱导T调节细胞(TReg细胞)增殖或活性，因为Treg细胞表达MHC II类。可以使用此平台来靶向APC以i)将抗微生物或抗寄生物药物 特异性递送到巨噬细胞，ii)将细胞特异性siRNA或DNA递送到Treg细 胞中，及iii)生成T细胞免疫监测试剂盒(需要较少的活化或不需要活化)。 例如，可以使用平台来将药物(例如，抗利什曼原虫药物)靶向以预防 或治疗存活于巨噬细胞和/或树状细胞中的寄生物(例如，利什曼原虫) 或病原性微生物的感染。通过使用所述平台，可以降低此类药物的剂量 和毒性。
实施例11：测量T和B细胞应答以评估对疫苗或其它干预的总免疫 应答
抗原对PBMC的合适的体外呈递也可以揭示关于B细胞应答的重要 信息，所述B细胞应答可用于预测或评估对疫苗的总体免疫应答，特别 是在诸如非常期望快速的B细胞应答的流感等情况中。可以经由测量疫 苗抗原诱导的B细胞IgG或酶AID(活化诱导的细胞因子脱氨酶)的诱 导来测量此类应答，其使用与同一个体的PBMC共培养的本文中所描述 的PDD/PBMC用上文对T细胞应答所描述的相同方案，只是测量的细胞 因子或其它标志物/分析物为B细胞特异的来进行。
其它实施方案
可以在部分或所有组合物、试剂盒、测定和方法步骤中进行任何改 善。通过引用方式将本文中所引用的所有参考文献(包括出版物、专利 申请和专利)并入本文。本文中所提供的任何及所有例子或示例性语言 (例如“诸如”)的使用意图阐明本发明，而并不对本发明的范围造成限 制，除非另外要求保护。例如，可以使用本文中所描述的测定、方法、 试剂和试剂盒来测量未接种疫苗的受试者中对病原体或肿瘤的免疫应 答。本文中关于本发明或优选实施方案的性质或益处的任何叙述并不意 图为限制性的，并且所附权利要求书不应视为由此类叙述限制。更一般 地，说明书中的文字不应解释为将任何不要求保护的要素指示为对于本 发明的实践是必要的。如适用法律允许，本发明包括其所附权利要求书中所叙述的主题的所有修改和等同方案。此外，除非本文中另有指明或 者上下文另有明确禁忌，本发明涵盖了其所有可能的变化的上文所描述 的要素的任意组合。
序列表
<110> 迈阿密大学 (University of Miami)
<120> 用于体外抗原呈递、评估疫苗功效及生物制剂和药物的免疫毒性的
组合物、试剂盒和方法
<130> 7230-66WO
<150> US 61/179,614
<151> 2009-05-19
<160> 46
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 乙酰化 D-丙氨酸
<222> (1)..(1)
<220>
<221> Ala
<222> (3)..(3)
<223> 环己基丙氨酸
<220>
<221> D-丙氨酸
<222> (14)..(14)
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<221> 氨基己酸
<222> (15)..(15)
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<400> 1
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1 5 10 15
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
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<221> D-Ala
<222> (1)..(1)
<220>
<221> 丙氨酸
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<210> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> D-Ala
<222> (1)..(1)
<220>
<221> D-Ala
<222> (13)..(13)
<400> 3
Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> D-Ala
<222> (1)..(1)
<220>
<221> D-Ala
<222> (13)..(13)
<400> 4
Ala Lys Tyr Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> D-Ala
<222> (1)..(1)
<220>
<221> D-Ala
<222> (13)..(13)
<400> 5
Ala Lys Phe Val Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> D-Ala
<222> (1)..(1)
<220>
<221> Ala
<222> (3)..(3)
<223> 环己基丙氨酸
<220>
<221> D-Ala
<222> (13)..(13)
<400> 6
Ala Lys Xaa Val Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> D-Ala
<222> (1)..(1)
<220>
<221> D-Ala
<222> (13)..(13)
<400> 7
Ala Lys Tyr Val Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> D-Ala
<222> (1)..(1)
<220>
<221> D-Ala
<222> (13)..(13)
<400> 8
Ala Lys Phe Val Ala Ala His Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 9
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> D-Ala
<222> (1)..(1)
<220>
<221> 环己基丙氨酸
<222> (3)..(3)
<220>
<221> D-Ala
<222> (13)..(13)
<400> 9
Ala Lys Xaa Val Ala Ala His Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> D-Ala
<222> (1)..(1)
<220>
<221> D-Ala
<222> (13)..(13)
<400> 10
Ala Lys Tyr Val Ala Ala His Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> D-Ala
<222> (1)..(1)
<220>
<221> D-Ala
<222> (13)..(13)
<400> 11
Ala Lys Phe Val Ala Ala Asn Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> D-Ala
<222> (1)..(1)
<220>
<221> 环己基丙氨酸
<222> (3)..(3)
<220>
<221> D-Ala
<222> (13)..(13)
<400> 12
Ala Lys Xaa Val Ala Ala Asn Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> D-Ala
<222> (1)..(1)
<220>
<221> D-Ala
<222> (13)..(13)
<400> 13
Ala Lys Tyr Val Ala Ala Asn Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Ala Lys Tyr Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Ala Lys Phe Val Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 环己基丙氨酸
<222> (3)..(3)
<400> 17
Ala Lys Xaa Val Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Ala Lys Tyr Val Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Ala Lys Phe Val Ala Ala His Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 20
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 环己基丙氨酸
<222> (3)..(3)
<400> 20
Ala Lys Xaa Val Ala Ala His Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 21
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Ala Lys Tyr Val Ala Ala His Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Ala Lys Phe Val Ala Ala Asn Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 环己基丙氨酸
<222> (3)..(3)
<400> 23
Ala Lys Xaa Val Ala Ala Asn Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Ala Lys Tyr Val Ala Ala Asn Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 前病毒 PR8病毒
<400> 25
Ser Phe Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu
1 5 10
<210> 26
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 环己基丙氨酸
<222> (3)..(3)
<400> 26
Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 流感病毒
<400> 28
Ser Phe Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Cys
1 5 10
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> 恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400> 29
Ser Ser Val Phe Asn Val Val Asn Ser Ser Ile Gly Leu Ile Met
1 5 10 15
<210> 30
<211> 21
<212> PRT
<213> 破伤风
<400> 30
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
1 5 10 15
Ala Ser His Leu Glu
20
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu
1 5 10 15
<210> 32
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Lys Leu Leu Ser Leu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly
1 5 10 15
Val Glu
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val
1 5 10 15
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Ala
1 5 10 15
<210> 35
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Glu Asn Asp Ile Glu Lys Lys Ile Cys Lys Met Glu Lys Cys Ser Ser
1 5 10 15
Val Phe Asn Val
20
<210> 36
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala
1 5 10
<210> 37
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Gly Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn Arg Asp Ile Leu
1 5 10
<210> 38
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Ile Asp Val Val Asp Ser Tyr Ile Ile Lys Pro Ile Pro Ala Leu Pro
1 5 10 15
Val Thr Pro Asp
20
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 40
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Pro Arg Tyr Ile Ser Leu Ile Pro Val Asn Val Val Ala Asp
1 5 10
<210> 41
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Val Ala Thr Arg Ala Gly Leu Val Met Glu Ala Gly Gly Ser Lys Val
1 5 10 15
Thr
<210> 42
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人 (HOMO SAPIENS)
<400> 42
Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro Leu Leu Met Gln
1 5 10
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> L-环己基胺
<222> (3)..(3)
<220>
<221> 氨基己酸
<222> (14)..(14)
<223> 氨基己酸
<400> 43
Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Xaa Cys
1 5 10 15
<210> 44
<211> 18
<212> PRT
<213> 破伤风
<400> 44
Val Asp Asp Ala Leu Ile Asn Ser Thr Lys Ile Tyr Ser Tyr Phe Pro
1 5 10 15
Ser Val
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> 边缘无浆体 (Anaplasma marginale)
<400> 45
Ser Ser Ala Gly Gly Gln Gln Gln Glu Ser Ser
1 5 10
<210> 46
<211> 18
<212> PRT
<213> 流感病毒
<400> 46
Ser Lys Ala Phe Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5 10 15
Ser Leu