阅读说明：本技术 一种云牛膝茎和/或叶和/或根的提取物、提取方法和应用 (Extract of stem and/or leaf and/or root of achyranthes bidentata, extraction method and application ) 是由 徐寒梅 戚微岩 董瑶 于 2018-05-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种云牛膝茎和/或叶和/或根的提取物、提取方法和应用,属于医药保健品领域。所述提取物为云牛膝多糖,所述云牛膝多糖的单糖基本结构单元包括果糖和葡萄糖。该云牛膝多糖由所述的云牛膝茎和/或叶和/或根的提取物纯化所得,所述云牛膝多糖分子量范围为1～3kD。所述的云牛膝茎和/或叶和/或根的提取物的提取方法,提取剂为碱水或乙醇。本发明的方法克服了目前云牛膝的研究存在空白、药用价值开发不足的问题,本发明的云牛膝多糖与已公布的云牛膝多糖相比,具有更高的免疫活性、降血糖活性和保肝活性,利于推广,可用于提高免疫活性型、降血糖型及保肝型的保健食品及药品的开发。(The invention discloses an extract of stem and/or leaf and/or root of achyranthes bidentata, an extraction method and application, belonging to the field of medical and health-care products. The extract is achyranthes bidentata polysaccharide, and monosaccharide basic structural units of the achyranthes bidentata polysaccharide comprise fructose and glucose. The achyranthes bidentata polysaccharide is obtained by purifying the extract of stems, leaves and/or roots of achyranthes bidentata, and the molecular weight of the achyranthes bidentata polysaccharide is 1-3 kD. The extraction method of the extract of the stem, leaf and/or root of the achyranthes yunnanensis comprises the step of extracting the extract by using alkaline water or ethanol. Compared with the published achyranthes bidentata polysaccharide, the achyranthes bidentata polysaccharide has higher immunocompetence, hypoglycemic activity and hepatoprotective activity, is beneficial to popularization, and can be used for developing health-care foods and medicines with the immunocompetence type, the hypoglycemic type and the hepatoprotective type.)

一种云牛膝茎和/或叶和/或根的提取物、提取方法和应用

技术领域

本发明属于医药保健品领域，具体涉及一种云牛膝茎和/或叶和/或根的提取物、提取方法和应用。

背景技术

保健品，是保健品食品的通俗说法。国家食品药品监督管理总局(CFDA)中对于保健食品的定义是：保健食品，是指声称具有特定保健功能或者以补充维生素、矿物质为目的的食品。即适宜于特定人群食用，具有调节机体功能，不以治疗疾病为目的，并且对人体不产生任何急性、亚急性或者慢性危害的食品。

截止目前，我国允许注册申请的特定保健食品功能共有27个，分别为：1、增强免疫力；2、辅助降血脂；3、辅助降血糖；4、抗氧化；5、辅助改善记忆；6、缓解视疲劳；7、促进排铅；8、清咽；9、辅助降血压；10、改善睡眠；11、促进泌乳；12、缓解体力疲劳；13、提高缺氧耐受力；14、对辐射危害有辅助保护功能；15、减肥；16、改善生长发育；17、增加骨密度；18、改善营养性贫血；19、对化学性肝损伤的辅助保护作用；20、祛痤疮；21、祛黄褐斑；22、改善皮肤水份；23、改善皮肤油份；24、调节肠道菌群；25、促进消化；26、通便；27、对胃粘膜损伤有辅助保护功能。

保健品顾名思义应该是保证健康的产品，保：是保证，保护之意；健：是健康，健美，健全之意；品：指产品，指食品，用品或器械。随着生活水平的提高，人们的保健意识也加强，所以，保健品市场广大。

免疫力是人体自身的防御机制，是人体识别和消灭外来侵入的任何异物(病毒、细菌等)；处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞以及识别和处理体内突变细胞和病毒感染细胞的能力。虽然人体对不同的病原体会产生相应的抗体，以抵御再次感染，但抗体具有专一性和时限性，比如链球菌抗体只能在较短时期内保护机体不受链球菌的再次侵犯，也并不能抵御其他病毒的感染。免疫力低下的人根本无法抵御感冒病毒的侵袭，这才是频繁感冒的真正原因。

高血糖是指人的血糖高于正常水平，如果这种状况持久存在，对人体的各部分均有害。引起高血糖的原因很多，可能是遗传因素，亦或是由其他疾病引起的。但是，随着现代生活水平的不断提高，大多数因素往往在于不良生活习惯和环境，现在的年轻人大都很喜欢高热量快餐，不喜蔬菜和水果，长久的饮食习惯可能导致血糖偏高。

肝损伤可分为免疫性肝损伤和化学性肝损伤，随着经济的发展和人们生活水平的提高，化学性肝损伤发病率越来越高，严重影响人们的生命健康，因此引起高度重视。随着社会的发展，工业污染日益加剧。受污染的空气、水、食物以及日常生活中所用到的药品、酒精等均可使人体产生大量自由基，损伤肝细胞，导致化学性肝损伤。同时人们生活水平的提高，社交圈的扩大，全球酒销量猛增，酒精性肝病的发生显著增加，已成为不容忽视的隐型杀手。我国脂肪肝、酒精肝的患病人数不断增加，且患病人群的年龄趋于低龄化。所以对化学性肝损伤有辅助保护作用的产品的研制与开发已成为当今社会的一个重要课题。

因此，不管事出于提高免疫力、降血糖还是保肝，采用保健食品都是不错的办法，如果能使用一种保健食品而同时解决上述问题，则更是锦上添花。

牛膝，别名：牛磕膝，拉丁文名：Achyranthes bidentata Blume.苋科。牛膝根据产地不同可分为怀牛膝和川牛膝。怀牛膝主要分布在河南，因主产古怀庆府而得名为怀牛膝，是四大怀药之一，山东、山西、河北、辽宁等地也有分布。川牛膝大量栽培于四川，福建、云南、贵州也有引种，以四川所产为道地药材。

科学家们从怀牛膝和川牛膝中提取到2种结构不同、相对分子质量较小的多糖，分别命名为怀牛膝多糖(Aehyranthes bidentata polysaeeharides，AbPS)和川牛膝多糖(RCP)。由于对AbPs的研究较为深入，所以一般意义上的牛膝多糖是指AbPS。对牛膝多糖的研究由来已久，例如中国专利申请号为CN88105524，公告日为1989年12月06日的专利申请公开了从中药牛膝中提取牛膝多糖的方法。该发明以中药牛膝为原料，对其浸泡液用与水互溶的丙酮进行二级分级沉淀后，再透析及冷冻干燥，得到的粗牛膝多糖再进行一次醇类沉淀后，即得牛膝多糖精制品。中国专利申请号为CN02110987.7，公告日为2003年2月19日的专利申请公开了牛膝多糖衍生物、制备方法和用途。其牛膝多糖衍生物包括牛膝多糖磷酸酯(盐)及羟烷基牛膝多糖，其是用磷酸化试剂或羟烷基化试剂，在相应条件下与牛膝多糖生成不同取代度的牛膝多糖衍生物，这一系列不同取代度的牛膝多糖衍生物经生物活性试验表明，具有抗肿瘤及增强免疫功能的作用。

云牛膝(Achyranthes aspera L.var.rubrafusca(Wight)Hook.f.[A.rubro-fusca Wi-ght])别名昆明土牛膝、拐牛膝、鸡豚草，为土牛膝的变种，为苋科植物红褐粗毛牛膝的根及根茎。据《滇南本草》记载，云牛膝可治疔疮、痈疽，敷患处；亦能打胎；同猪肉煨食之，能明日。云牛膝为土牛膝的变种，此为云南特有植物。经检索，现有技术中同样存在关于云牛膝多糖的申请案，如中国专利申请号为CN201610283822.4，公开日为2016年08月17的申请案公开一种云牛膝茎和/或叶和/或根的提取物及其提取方法和应用，该申请案对云牛膝茎和/或叶和/或根的提取物的提取方法进行了报道，证实了其提取的多糖结构在提高免疫力、保肝、降血糖等药理作用，然而目前云牛膝的研究存在空白、药用价值开发不足的问题。

发明内容

1.要解决的问题

针对于目前云牛膝的研究存在空白、药用价值开发不足，从而造成其的不合理利用及大量浪费的问题，本发明旨在提供一种云牛膝茎和/或叶和/或根的提取物、提取方法和应用。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

本发明提供了一种云牛膝茎和/或叶和/或根的提取物，所述提取物为云牛膝多糖；所述云牛膝多糖的单糖基本结构单元包括果糖和葡萄糖。

作为本发明更进一步的改进，本发明提供了一种云牛膝多糖，所述云牛膝多糖由所述的云牛膝茎和/或叶和/或根的提取物纯化所得，所述的云牛膝多糖的单糖基本结构单元为：

其中，n₁＝0～6，n₂＝0～3，n₃＝0～3。

作为本发明更进一步的改进，所述的云牛膝多糖的分子量范围为1～3kD。

作为本发明更进一步的改进，所述的云牛膝茎和/或叶和/或根的提取物的提取方法，所述提取物的提取剂为碱水(碱性水溶液)或乙醇。

作为本发明更进一步的改进，所述的云牛膝茎和/或叶和/或根的提取物的提取方法，包括以下步骤：

1)取云牛膝茎和/或叶和/或根，首先水浴加热，再用碱水或乙醇提取云牛膝多糖；

2)将步骤1)提取的云牛膝多糖加入无水乙醇静置过夜，去除乙醇，沉淀用水溶解；

3)将步骤2)处理后的云牛膝多糖冻干，得云牛膝多糖提取物。

作为本发明更进一步的改进，所述步骤1)中所述碱水的pH值为8～9。。

作为本发明更进一步的改进，所述步骤1)中水浴加热温度为70～90℃，提取次数为2次。

作为本发明更进一步的改进，本发明提供了一种保健食品，所述保健食品包含所述的云牛膝茎和/或叶和/或根的提取物或所述的云牛膝多糖。

作为本发明更进一步的改进，本发明提供了一种保健药物，所述保健药物包含所述的云牛膝茎和/或叶和/或根的提取物或所述的云牛膝多糖。

作为本发明更进一步的改进，所述保健食品包括提高免疫力型保健食品、降血糖型保健食品或保肝型保健食品中的任意一种。

作为本发明更进一步的改进，所述保健药物包括提高免疫力型保健药物、降血糖型保健药物或保肝型保健药物中的任意一种。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明的一种云牛膝茎和/或叶和/或根的提取物，克服了目前云牛膝的研究存在空白、药用价值开发不足的问题，提取的多糖结构单元包括果糖和葡萄糖，而专利申请号CN201610283822.4公开的云牛膝多糖单元结构为葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸，与已公布的云牛膝多糖相比：一方面本发明云牛膝多糖结构更为简单；其次，本发明的云牛膝多糖在与已公布的云牛膝多糖的对比免疫活性实验、降血糖活性实验和保肝活性试验中显示，本发明的云牛膝多糖具有更高的免疫活性、降血糖活性和保肝活性，尤其在云牛膝多糖对高血糖模型动物空腹血糖的影响试验中，本发明的云牛膝多糖造成的血糖下降百分率是上述对比云牛膝多糖的2倍，因此将其制备成增强免疫力型、保肝型、降血糖型保健食品以及抗肿瘤药物均具有更优异的治疗效果，利于推广。

(2)本发明的一种云牛膝茎和/或叶和/或根的提取物，提取物中的云牛膝多糖的结构单元包括果糖和葡萄糖，该结构的云牛膝多糖符合国家对保健食品及中药采用规定，如制备成保健品或药物可以达到更优异的提高免疫力、保肝、降血糖等效果，同时还具有抗肿瘤等功能，适合大部分人群食用，同时不产生任何副作用及不良反应，利于推广。

(3)本发明的一种云牛膝茎和/或叶和/或根的提取物，依据《增强免疫力功能评价方法(征求意见稿)保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定》、《辅助降血糖功能评价方法试验项目、试验原则及结果判定》、《对化学性肝损伤有辅助保护功能评价方法(修订稿)保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定》进行设计，符合CFDA保健食品评价申报要求；且主要开发云牛膝茎、叶、根部位，成本低，变废为宝，具有显著的社会价值和市场价值，具有良好的开发应用前景。

(4)本发明的一种云牛膝茎和/或叶和/或根的提取物的提取方法，首先将云牛膝茎和/或叶和/或根采用水浴加热，再用碱水或乙醇提取云牛膝多糖，最终得到纯化后基本结构单元为葡萄糖和果糖的云牛膝多糖，该类型的多糖与已公布的云牛膝多糖相比具有更优异的免疫活性、降血糖活性和保肝活性，该结构单元的云牛膝多糖已经多次提取试验证实，且纯化后的结构单元经过碳谱、氢谱、质谱等多种类型的结构确证；本发明的提取方法操作简单、提取结果稳定可靠，利于推广。

附图说明

图1为云牛膝多糖碳谱；

图2为云牛膝多糖氢谱；

图3为云牛膝多糖在正离子模式下的质谱图；

图4为云牛膝多糖在负离子模式下的质谱图；

图5为测试小鼠耳肿胀图；

图6为测试小鼠脾脏指数图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1

本实施例为云牛膝多糖的提取、纯化及云牛膝多糖的结构确证。

一、实验方法

称取干燥的云牛膝茎和/或叶和/或根的细段，加蒸馏水置于烧杯中，于70～90℃水浴中，加热半小时后，采用碱水提取，调节碱水pH值至8-9；水浴加热提取2h，共提取2次，每10min搅拌一次，取上清液，抽滤后浓缩至原体积的1/10～1/20。

用4倍体积的无水乙醇沉淀，4℃冰箱放置过夜，取沉淀并溶解，冷冻真空干燥，得到云牛膝多糖提取物，即云牛膝多糖粗品。

经提取的云牛膝多糖粗品，用大孔树脂D101、葡聚糖凝胶Sephadex G-50、葡聚糖凝胶LH-20分别进行纯化。

纯化过程如下：称取云牛膝多糖粗品100mg左右，溶于200μL去离子水，充分溶解后上样。去离子水做流动相进行洗脱，流出液用DSB-100A自动部份收集器收集。蒽酮-硫酸法跟踪检测。收集多糖含量大于95％的样品，得到云牛膝多糖纯品。

二、实验过程

1)试剂配制

80％硫酸蒽酮溶液：向装有20mL蒸馏水的烧杯沿壁缓慢加入80mL浓硫酸，并不断搅拌；待浓硫酸温度降至常温，向其中加入0.2g的硫酸蒽酮固体，并不断搅拌，至完全溶解。避光保存，现配现用。

2)标准曲线的建立

精确称取105℃干燥至恒重的葡萄糖100mg，定容至500mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，混匀。在8支试管中分别加入0.2mg/mL葡萄糖标准溶液0.0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，补蒸馏水至1.0mL，然后加入3mL 80％硫酸蒽酮溶液，充分混匀。置于100℃沸水浴中煮沸15min，然后用流水迅速冷却。在620nm处读OD值。以葡萄糖浓度(mg/mL)为横坐标，以OD值为纵坐标制作标准曲线，得到其线性回归方程：y＝9.5415x+0.003，R²＝0.9994；线性范围为0～0.2mg/mL。

3)多糖含量的测定

所收集的样品冻干，配成0.01mg/mL溶液，加入3mL 80％硫酸蒽酮溶液，按照上述步骤测定OD值，并代入回归方程中计算样品中的云牛膝总多糖含量。

4)收集多糖含量大于95％的样品，冻干，得到云牛膝多糖纯品。

5)用200μL氘水溶解云牛膝多糖纯品，经核磁检测多糖结构和单糖组成，质谱测定多糖分子量。

三、实验结果

1)云牛膝多糖含量的测定结果

云牛膝多糖含量的测定结果如表1所示。

表1云牛膝多糖含量

2)云牛膝多糖的单糖组成测定

对云牛膝多糖纯品的结构确证结果如图1、图2所示，其中，图1为云牛膝多糖碳谱；图2为云牛膝多糖氢谱。由图1和图2可知，本专利的云牛膝多糖的单糖结构单元包括果糖和葡萄糖，云牛膝多糖结构单元为：

其中，n₁＝0～6，n₂＝0～3，n₃＝0～3。

3)云牛膝多糖分子量结果

云牛膝多糖分子量结果如图3、图4所示。其中，图3为云牛膝多糖在正离子模式下的质谱图；图4为云牛膝多糖在负离子模式下的质谱图。由图3、图4可知，云牛膝多糖的分子量在1～3kD之间。

实施例2

本实施例为采用乙醇为提取试剂的云牛膝多糖的提取、纯化、及云牛膝多糖的结构确证。

一、实验方法

称取干燥的云牛膝茎和/或叶和/或根的细段，加乙醇置于烧杯中，于70～90℃水浴中，加热提取2h，共提取2次，每10min搅拌一次，取上清液，抽滤后浓缩至原体积的1/10～1/20。用水溶解，冷冻真空干燥，得到云牛膝多糖提取物，即云牛膝多糖粗品。

经提取的云牛膝多糖粗品，用大孔树脂D101、葡聚糖凝胶Sephadex G-50、葡聚糖凝胶LH-20分别进行纯化。纯化方法同实施例1。对云牛膝多糖纯品的结构确证可知，乙醇提取和碱水提取的结构单元相同，单糖结构单元包括果糖和葡萄糖，云牛膝多糖结构单元为：

其中，n₁＝0～6，n₂＝0～3，n₃＝0～3。

实施例3

本实施例为对实施例1中提取的云牛膝多糖粗品的进行的免疫功能测定。

该实验采用迟发型***反应实验-二硝基氟苯诱导小鼠DTH(耳肿胀法)进行测试。

依据《增强免疫力功能评价方法(征求意见稿)保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定》进行设计，选择细胞免疫功能测定中的迟发型***反应实验-二硝基氟苯诱导小鼠DTH(耳肿胀法)来判断是否具有细胞免疫。用氢化可的松建立小鼠免疫抑制模型，以香菇多糖、灵芝孢子粉作为阳性药；通过对比小鼠耳肿胀差异来判断云牛膝多糖(AAP)是否具有细胞免疫。受试样品组的重量差值显著高于与对照组的重量差值，可判定该项实验结果阳性。

一、试验材料

1)实验动物：清洁级ICR种小鼠，6～8周龄，18～22g；性别：雄性；每组10只。

2)试验药物：市售香菇多糖、市售灵芝孢子粉、实施例1中提取的云牛膝多糖粗品。

二、实验方法

1)分组：小鼠随机分组，每组10只，共七组，分组为：空白对照组、氢化可的松模型组、香菇多糖(121mg/kg)+模型组、灵芝孢子粉组(182mg/kg)+模型组(香菇多糖和灵芝孢子粉是以人的服用剂量换算为小鼠给药剂量)、AAP高剂量(100mg/kg)+模型组、AAP中剂量组(75mg/kg)+模型组、AAP低剂量(50mg/kg)+模型组；其中，香菇多糖(121mg/kg)+模型组为香菇多糖组，灵芝孢子粉组(182mg/kg)+模型组为灵芝孢子粉组，AAP高剂量(100mg/kg)+模型组为AAP高剂量组，AAP中剂量组(75mg/kg)+模型组为AAP中剂量组，AAP低剂量(50mg/kg)+模型组为AAP低剂量组。其中共包含除空白对照组、氢化可的松模型组外的5个实验组。

2)小鼠每天上午称重一次，5个实验组连续灌胃给予上述受试物30天，空白对照组给予蒸馏水；氢化可的松模型组首先给予蒸馏水，在第3周后模型组和给药组同时开始给予免疫抑制剂。氢化可的松可选择40mg/kg，肌内注射(mc)，隔天一次，共5次，末次注射给药后次日测定各项指标。

3)每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约3cm×3cm、用DNFB溶液50μL均匀涂抹致敏。

4)DTH的产生与测定。

5)5天后，用DNFB溶液10μL均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击。攻击后24h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片，称重。

6)数据处理与结果判定：用左右耳重量之差表示DTH的程度。受试样品组的重量差值显著高于与对照组的重量差值，可判定该项实验结果阳性。

三、实验结果

耳肿胀结果：耳肿胀测量中，用左右耳重量之差表示DTH的程度。空白对照组、氢化可的松模型组、香菇多糖组、灵芝孢子粉组、AAP低剂量组、AAP中剂量组、AAP高剂量组的耳肿胀程度分别为17.81±4.21mg、6.75±2.56mg、16.01±4.96mg、18.57±4.76mg、27.01±4.61mg、20.19±7.11mg、18.64±7.47mg。

脾指数结果：脾指数测量中，空白对照组、氢化可的松模型组、香菇多糖组、灵芝孢子粉组、AAP低剂量组、AAP中剂量组、AAP高剂量组的脾指数分别为0.004886±0.000594、0.003116±0.000566、0.003985±0.000661、0.005149±0.001084、0.007785±0.000917、0.005078±0.001008、0.005379±0.000790。

AAP对免疫抑制小鼠体重、脾指数、及耳肿胀程度的影响具体测试结果如表2所示。

表2 AAP对免疫抑制小鼠体重、脾指数、及耳肿胀程度的影响

与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

耳肿胀程度分析：

由表2可得，小鼠耳肿胀程度，与模型组相比：香菇多糖组有显著性差异(*p<0.05)，灵芝孢子粉组、AAP低剂量组、AAP中剂量组、AAP高剂量组具有极显著性差异(**p<0.01)；与香菇多糖组比，AAP低剂量组、AAP中剂量组具有极显著性差异(**p<0.01)；与灵芝孢子粉组比，AAP低剂量组有极显著性差异(**p<0.01)。

图5测试小鼠耳肿胀图；图中，G1为空白对照组；G2为氢化可的松模型组；G3为阳性组(香菇多糖组)；G4为阳性组(灵芝孢子粉组)；G5为AAP低剂量组(50mg/kg)；G6为AAP中剂量组(75mg/kg)；G7为AAP高剂量组(100mg/kg)；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001vs模型组。

脾指数分析：

由表2可得，脾指数，与氢化可的松模型组相比，灵芝孢子粉组、AAP低剂量组、AAP中剂量组、AAP高剂量组具有极显著性差异(**p<0.01)；与香菇多糖组比，AAP低剂量组具有极显著性差异(**p<0.01)；与灵芝孢子粉组比，AAP低剂量组有显著性差异(*p<0.05)。

图6为测试小鼠脾脏指数图；图中，G1为空白对照组；G2为氢化可的松模型组；G3为阳性组(香菇多糖组)；G4为阳性组(灵芝孢子粉组)；G5为AAP低剂量组(50mg/kg)；G6为AAP中剂量组(75mg/kg)；G7为AAP高剂量组(100mg/kg)；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001vs模型组。

实施例4

本实施例为实施例1中提取的云牛膝多糖粗品采用小鼠碳廓清实验进行的免疫功能测试。

依据《增强免疫力功能评价方法(征求意见稿)保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定》进行设计，选择单核-巨噬细胞功能测定中的小鼠碳廓清实验来判断是否具有单核-巨噬细胞免疫功能。用氢化可的松建立小鼠免疫抑制模型，以香菇多糖、灵芝孢子粉作为阳性药；通过对比小鼠吞噬指数来判断AAP是否具有单核-巨噬细胞免疫。受试样品组的重量差值显著高于与对照组的重量差值，可判定该项实验结果阳性。

一、试验材料

1)实验动物：清洁级ICR种小鼠，6～8周龄，18～22g；性别：雄性；每组10只

2)试验药物：市售香菇多糖，市售灵芝孢子粉，所制的云牛膝多糖

二、实验方法

1)分组：小鼠随机分组，每组10只，共七组，分组为：空白对照组、氢化可的松模型组、香菇多糖(121mg/kg)+模型组、灵芝孢子粉组(182mg/kg)+模型组、AAP高剂量(100mg/kg)+模型组、AAP中剂量组(75mg/kg)+模型组、AAP低剂量(50mg/kg)+模型组；其中，香菇多糖(121mg/kg)+模型组为香菇多糖组，灵芝孢子粉组(182mg/kg)+模型组为灵芝孢子粉组，AAP高剂量(100mg/kg)+模型组为AAP高剂量组，AAP中剂量组(75mg/kg)+模型组为AAP中剂量组，AAP低剂量(50mg/kg)+模型组为AAP低剂量组。其中共包含除空白对照组、氢化可的松模型组外的5个实验组。

2)小鼠每天上午称重一次，5个实验组连续灌胃给予上述受试物30天，空白对照组给予蒸馏水；氢化可的松模型组首先给予蒸馏水，在第3周后模型组和给药组同时开始给予免疫抑制剂。氢化可的松可选择40mg/kg，肌内注射(mc)，隔天一次，共5次，末次注射给药后次日测定各项指标。

3)溶液配制：注射用墨汁将印度墨汁原液用生理盐水稀释3～4倍；Na₂CO₃溶液：取0.1gNa₂CO₃，加蒸馏水至100mL。

4)注射墨汁：30天后，称体重，从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁，按每10g体重0.1mL计算。待墨汁注入，立即计时。

5)数据测定

注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，并立即将其加到2mL 0.1％Na₂CO₃溶液中。用分光光度计或全自动酶标仪在600nm波长处测光密度值(OD)，以Na₂CO₃溶液作空白对照。

将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。

以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数a：

6)数据处理与结果判定

三、实验结果

吞噬指数：小鼠碳廓清实验中，通过对比小鼠吞噬指数来判断AAP是否具有单核-巨噬细胞免疫功能。空白对照组、氢化可的松模型组、香菇多糖组、灵芝孢子粉组、AAP低剂量组、AAP中剂量组、AAP高剂量组的吞噬指数为5.45±1.10、4.31±1.24、5.19±0.92、5.13±0.84、6.26±0.56、6.82±1.19、7.23±1.12。与氢化可的松模型组相比，AAP低剂量组、AAP中剂量组、AAP高剂量组有极显著性差异(^**p<0.01)；与香菇多糖组比，AAP高剂量组具有显著性差异(^*p<0.05)；与灵芝孢子粉组比，AAP高剂量组有极显著性差异(^**p<0.01)。

脾脏指数：脾指数测量中，空白对照组、氢化可的松模型组、香菇多糖组、灵芝孢子粉组、AAP低剂量组、AAP中剂量组、AAP高剂量组的脾指数分别为0.003030±0.000715、0.002256±0.000472、0.002115±0.000190、0.002695±0.000603、0.004037±0.000974、0.003935±0.000877、0.003850±0.000821。其中脾指数，与模型组相比，AAP低剂量组、AAP中剂量组、AAP高剂量组具有极显著性差异(^**p<0.01)；与香菇多糖组比，AAP低剂量组、AAP中剂量组、AAP高剂量组具有极显著性差异(^***p<0.001)；与灵芝孢子粉组比，AAP低剂量组、AAP中剂量组有显著性差异(^*p<0.05)。

AAP对免疫抑制小鼠体重、脾指数、及吞噬指数的影响如表3所示。

表3 AAP对免疫抑制小鼠体重、脾指数、及吞噬指数的影响

与氢化可的松模型组比较，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001。

实施例5

本实施例为对实施例1中提取的云牛膝多糖粗品进行的免疫功能低下模型血常规测试。

在免疫功能低下模型成立条件下，血液白细胞总数、细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能及NK细胞活性五个方面测定中，任两个方面试验结果为阳性，判定该受试样品对免疫功能低下者具有增强免疫力作用。

一、试验材料

实验动物：清洁级ICR种小鼠，6～8周龄，18～22g；性别：雄性；每组10只

试验药物：市售香菇多糖，市售灵芝孢子粉，所制的云牛膝多糖

二、实验方法

1)分组：小鼠随机分组，每组10只，共七组，分组为：空白对照组、氢化可的松模型组、香菇多糖(121mg/kg)+模型组、灵芝孢子粉组(182mg/kg)+模型组、AAP高剂量(100mg/kg)+模型组、AAP中剂量组(75mg/kg)+模型组、AAP低剂量(50mg/kg)+模型组；其中，香菇多糖(121mg/kg)+模型组为香菇多糖组，灵芝孢子粉组(182mg/kg)+模型组为灵芝孢子粉组，AAP高剂量(100mg/kg)+模型组为AAP高剂量组，AAP中剂量组(75mg/kg)+模型组为AAP中剂量组，AAP低剂量(50mg/kg)+模型组为AAP低剂量组。其中共包含除空白对照组、氢化可的松模型组外的5个实验组。

2)小鼠每天上午称重一次，5个实验组连续灌胃给予上述受试物30天，空白对照组给予蒸馏水；氢化可的松模型组首先给予蒸馏水，在第3周后模型组和给药组同时开始给予免疫抑制剂。氢化可的松可选择40mg/kg，肌内注射(mc)，隔天一次，共5次，末次注射给药后次日测定各项血常规指标。

三、实验结果

在小鼠血常规检测中，AAP对免疫抑制小鼠血常规的影响如表4所示。

表4 AAP对免疫抑制小鼠血常规的影响

与模型组比较，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001。

其中对于白细胞数，与模型组相比，灵芝孢子粉组、AAP低剂量组、AAP中剂量组、AAP高剂量组白细胞数极显著高于模型组(^**p<0.01)。与香菇多糖阳性药比，AAP中剂量组有显著性差异(^**p<0.01)。

淋巴细胞数，与模型组相比，香菇多糖组显著高于模型组(^*p<0.05)，灵芝孢子粉组、AAP低剂量组、AAP中剂量组、AAP高剂量组淋巴细胞数极显著高于模型组(^**p<0.01)。

红细胞、血小板，各组间均无显著性差异。

实施例6

本实施例为对实施例1中提取的云牛膝多糖粗品进行的降血糖作用试验。

按《辅助降血糖功能评价方法试验项目、试验原则及结果判定》进行设计，选择正常动物降糖实验和高血糖模型降糖实验中的胰岛损伤高血糖模型实验。

以体重、空腹血糖、糖耐量三个指标对云牛膝多糖的降血糖作用进行研究评价。

一、实验材料

1)研究对象：实施例1中提取的云牛膝多糖粗品；

2)研究动物：SPF级昆明种雄性小鼠，体重在24～28g。

二、实验方法

1)实验动物分组

取体重在24～28g试验雄性小鼠90只，将小鼠分为两大组，其中70只小鼠用于制造高血糖模型，测定云牛膝多糖对高血糖模型动物血糖含量的影响，另外20只小鼠用于样品对照组即正常动物组，正常动物组分为对照组和高剂量组(100mg/kg)，每组10只；模型动物组分为低剂量组(50mg/kg)、中剂量组(75mg/kg)、高剂量组(100mg/kg)和空白组，每组10只。

2)正常动物降糖实验

选20只健康小鼠，禁食4h后测定小鼠血糖值，按血糖值随机分成两组，1个对照组和1个受试样品组(高剂量组)。空白对照组小鼠给予空白溶剂，受试样品组小鼠给予高剂量浓度云牛膝多糖，连续喂养30天，禁食4h后测定小鼠空腹血糖值，比较两组小鼠血糖值及血糖下降百分率。

血糖下降百分率(％)＝(试验前血糖值-试验后血糖值)/试验前血糖值*100％

3)高血糖模型动物降糖实验

四氧嘧啶是一种β细胞毒剂，可选择性地损伤小鼠的膜岛β细胞，造成胰岛素分泌低下，引起实验性糖尿病。据此随机取体重24g左右的小鼠，禁食4h，测小鼠空腹血糖值，作为该批次小鼠基础血糖值。随后将小鼠禁食24h(自由饮水)，尾部静脉注射四氧嘧啶(用前新鲜配制)造模，注射用量为50mg·kg^-1bw。6天后小鼠禁食4h，测血糖，血糖值在10-25mmol·L^-1的小鼠为高血糖模型小鼠。选高血糖造模成功的小鼠，按禁食4h的血糖水平分组，随机选1个模型对照组和3个剂量姐，每组10只，组间差不大于1.1mmol/L。剂量组给予不同浓度云牛膝多糖，模型对照组给予空白溶剂，连续喂养30天后，禁食4h，测空腹血糖值，比较各组动物血糖值及血糖下降百分率。

血糖下降百分率＝(实验前血糖值-实验后血糖值)/实验前血糖值*100

4)糖耐量实验

取高血糖造模成功小鼠，禁食4h后，低、中、高剂量组小鼠分别给予不同浓度云牛膝多糖，模型对照组给予相同体积空白溶剂，15min后各组小鼠经口给予葡萄糖，2.0g·kg^{- 1}bw，测定给予葡萄糖后.各组0、0.5、2h的血糖值，观察模型对照组小鼠与受试样品组给予葡萄糖后，不同时间点血糖曲线下面积的变化。

血糖曲线下面积＝0.25*(0h血糖值+4*0.5h血糖值+3*2h血糖值)

三、实验结果

1)云牛膝多糖对小鼠体重的影响

云牛膝多糖对正常小鼠体重的影响如表5-1所示，云牛膝多糖对高血糖模型小鼠体重的影响如表5-2所示。

表5-1云牛膝多糖对正常小鼠体重的影响

表5-2云牛膝多糖对高血糖模型小鼠体重的影响

由表5-1和表5-2可知，高剂量组对正常小鼠初期、中期、末期的体重情况影响无显著性差异(P＞0.05)；各剂量组云牛膝多糖对高血糖模型小鼠初期、中期、末期的体重影响无显著性差异(P＞0.05)。

2)云牛膝多糖对正常小鼠空腹血糖的影响

云牛膝多糖对正常小鼠空腹血糖的影响如表5-3所示。

表5-3云牛膝多糖对正常小鼠空腹血糖的影响

由表5-3可知，正常小鼠经口给予高剂量云牛膝多糖，连续灌胃30d，测定小鼠空腹血糖值、血糖下降百分率等，结果P＞0.05，表明无显著影响。

3)云牛膝多糖对高血糖模型动物空腹血糖的影响

云牛膝多糖对高血糖模型动物空腹血糖的影响如表5-4所示。

表5-4云牛膝多糖对高血糖模型动物空腹血糖的影响

与模型对照组相比，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001。

由表5-4可知，小鼠经灌胃给药高、中、低不同剂量的云牛膝多糖，连续灌胃30d，测定各组小鼠的空腹血糖值，与对照组相比，髙、中、低三个剂量组小鼠的血糖下降百分率均有显著性差异，随着灌胃药液浓度的递增有递増趋势，高剂量组与对照组相化趋势最明显。

4)云牛膝多糖对高血糖模型动物糖耐量的影响

云牛膝多糖对高血糖模型动物糖耐量的影响如表5-5所示。

表5-5云牛膝多糖对高血糖模型动物糖耐量的影响

与模型对照组相比，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001。

由表5-5可知，小鼠经口给药予高、中、低不同剂量的云牛膝多糖，连续灌胃30d后，各剂量组小鼠的血糖曲线下面积与对照组作比较，均有显著性差异。

由上述结果可知，各剂量组云牛膝多糖受试液对高血糖模型小鼠各时点的体重影响无显著性差异(P＞0.05)。正常小鼠经口给予高剂量云牛膝多糖，连续灌胃30d，测定小鼠空腹血糖值、血糖下降百分率等，结果P＞0.05，表明无显著影响。经灌胃给药低、中、高不同剂量的云牛膝多糖，连续30d，测定各组小鼠空腹血糖值、血糖曲线下面积，与对照组相比，均有显著性差异(P<0.05)，随着灌胃药液浓度的递增有递増趋势。根据《辅助降血糖功能评价方法试验项目、试验原则及结果判定》的判定标准，空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性，且对正常动物空腹血糖无影响，即可判定该受试样品辅助降血糖功能动物实验结果阳性。因此可判定云牛膝多糖具有辅助降血糖的保健功能。

实施例7

本实施例为对实施例1中提取的云牛膝多糖粗品进行的证明云牛膝多糖化学性肝损伤有辅助保护功能的试验。

按《对化学性肝损伤有辅助保护功能评价方法(修订稿)保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定》进行设计，选择亚急性酒精性肝损伤模型实验。以LDL-C、TBIL和TC三项指标对云牛膝多糖制剂的保肝作用进行研究评价。

一、实验材料

研究对象：实施例1中提取的云牛膝多糖粗品；

研究动物：SPF级SD大鼠，雄性，50只，体重在180～220g。每组10只。

二、实验方法

1)实验动物分组：高(100mg/kg)、中(75mg/kg)、低(50mg/kg)三个剂量，另设模型对照组和正常对照组。

2)经口灌胃给予受试样品，连续给予30天。

3)造模方法：每日经口灌胃给予受试样品，正常对照组和模型对照组给予纯净水。将动物每周称重两次，以调整受试样品剂量。模型对照组和样品组于实验结束前14天每天经口灌胃给予30％的乙醇。样品灌胃后间隔4小时以上再给予乙醇。实验结束前禁食4h，经腹腔注射60mg/kg BW的戊巴比妥钠溶液麻醉后，腹主动脉采血，并取肝组织，进行各项指标的检测。

4)血清生化指标检测：体重、血清中胆固醇(TC)、血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、血清中胆红素(TBIL)测定。

5)数据处理与结果判定

模型对照组与阴性对照组比较，血清TC、LDL和TBIL含量升高有统计学意义(P<0.05)，表示模型成立。在模型成立的前提下，受试样品组血清TC、LDL和TBIL含量与模型对照组比较降低，差异有显著性(P<0.05)，判定该指标结果阳性。

三、实验结果

云牛膝多糖对血清TC、LDL和TBIL的影响如表6-1所示。

表6-1云牛膝多糖对血清TC、LDL和TBIL的影响

与模型对照组比较差异具有统计学意义，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001。

如表6-1所示，实验末，模型对照组大鼠的血清LDL-C、TBIL和TC含量与正常对照组相比均显著升高，经统计分析，差异具有统计学意义(P<0.05)，证明构建的亚急性酒精性肝损伤模型成立。3个剂量组的血清LDL-C、TBIL和TC含量与模型对照组相比均显著降低，且差异有统计学意义(P<0.05)。

因此，本发明的云牛膝多糖的低、中、高剂量组均能够显著降低大鼠LDL-C、TBIL和TC三项指标，说明本发明的云牛膝多糖对亚急性酒精性肝损伤具有辅助保护功能。

实施例8

本实施例为实施例1中提取的云牛膝多糖粗品进行的对多种肿瘤细胞的增殖抑制试验。

一、实验方法

采用MTT法检测云牛膝多糖抑制多种肿瘤细胞生长的活性。肿瘤细胞在37℃、5％CO₂的培养箱中培养至90％以上的汇合度时用胰蛋白酶消化收集，用培养液重悬细胞并在显微镜下计数，将细胞浓度调整为2×10⁴个/mL，将细胞悬液接种到96孔板中，100μL/孔，并于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜。

云牛膝多糖用培养液稀释到高(100μg/mL)、中(75μg/mL)、低(50μg/mL)三个浓度。多西他赛用培养液稀释到终浓度(2.5μg/mL)。待细胞完全贴壁后，将各个稀释液分别加入96孔板中(100μL/孔)。以加入云牛膝多糖稀释液作为给药组，以加入多西他赛作为阳性对照组，以不加任何药物的培养液作为阴性对照组。在37℃，5％CO₂培养箱孵育48h。向96孔板中加入5mg/mL的MTT，每孔20μL，继续培养4h。吸掉培养基，每孔加入150μL DMSO溶解，摇床10min轻轻混匀。用酶标仪在测定波长为570nm，参比波长为630nm处测定吸光值，并计算生长抑制率(proliferation inhibition，PI)，公式如下：

PI(％)＝1-给药组/阴性组

试验独立重复3次，试验得到的结果以mean±SD表示。

二、实验结果

云牛膝多糖对多种肿瘤细胞的增殖抑制试验如表7所示。

表7云牛膝多糖对多种肿瘤细胞的增殖抑制试验

由结果可知，与阴性对照相比，云牛膝多糖对多种肿瘤细胞的增殖均有一定程度的抑制作用，其中云牛膝多糖高剂量组(100μg/mL)对大部分肿瘤细胞的增殖抑制作用效果超过了阳性药，为本发明的云牛膝多糖开发为有效的抗肿瘤药物提供了良好的前景。

实施例9

本实施例为实施例1提取的云牛膝多糖粗品与专利申请号为CN201610283822.4中的云牛膝多糖粗品之间的免疫活性对比。

1)试验药物：实施例1提取的云牛膝多糖粗品；

2)对比药物：专利申请号为CN201610283822.4中的云牛膝多糖粗品。

3)实验方法：同实施例4，给药相同剂量的情况下，比较两种结构的云牛膝多糖的免疫功能。

云牛膝粗多糖对免疫抑制小鼠体重、脾指数及吞噬指数的影响如表8所示。

表8云牛膝粗多糖对免疫抑制小鼠体重、脾指数、及吞噬指数的影响

与模型组比较，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001。

吞噬指数：小鼠碳廓清实验中，通过对比小鼠吞噬指数来判断AAP是否具有单核-巨噬细胞免疫功能。由表8可得，与模型组相比，本专利云牛膝粗多糖有极显著性差异(**p<0.01)，对比专利云牛膝粗多糖虽然吞噬指数有所增高，但无显著性差异。

脾脏指数：脾指数测量中，与模型组相比，本专利云牛膝粗多糖有极显著性差异(**p<0.01)，对比专利云牛膝粗多糖有显著性差异(*p<0.05)。

因此，本发明的牛膝粗多糖相比于对比专利中的云牛膝粗多糖，具有更好的提高免疫力功能。

实施例10

本实施例为实施例1提取的云牛膝多糖粗品与专利申请号为CN201610283822.4中的云牛膝多糖粗品之间的降血糖活性对比。

1)试验药物：实施例1提取的云牛膝多糖粗品；

2)对比药物：专利申请号为CN201610283822.4中的云牛膝多糖粗品。

3)实验方法：基本同实施例6，给药相同剂量的情况下，比较两种结构的云牛膝多糖的降血糖功能。

实验结果如下：

云牛膝粗多糖对高血糖模型动物空腹血糖的影响如表9-1所示。

表9-1云牛膝粗多糖对高血糖模型动物空腹血糖的影响

与对照组相比，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001。

云牛膝粗多糖对高血糖模型动物糖耐量的影响如表9-2所示。

表9-2云牛膝粗多糖对高血糖模型动物糖耐量的影响

与对照组相比，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001。

由表9-1可知，小鼠经灌胃给药本专利云牛膝粗多糖和比较专利云牛膝粗多糖，连续灌胃30d，测定各组小鼠的空腹血糖值，与模型组相比，本专利云牛膝多糖的血糖下降百分率具有极显著性差异(^***p<0.001)，对比专利云牛膝多糖具有显著性差异(^*p<0.05)。

由表9-2可知，小鼠经口给药予本专利云牛膝多糖和对比专利云牛膝多糖，连续灌胃30d后，各剂量组小鼠的糖耐量与对照组作比较，本专利云牛膝多糖的糖耐量具有极显著性差异(***p<0.001)，对比专利云牛膝多糖具有显著性差异(*p<0.05)。

因此，本专利云牛膝粗多糖与对比专利云牛膝粗多糖相比，降糖活性更优异。

实施例11

本实施例为实施例1提取的云牛膝多糖粗品与专利申请号为CN201610283822.4中的云牛膝多糖粗品之间的保肝活性对比。

1)试验药物：实施例1提取的云牛膝多糖粗品；

2)对比药物：专利申请号为CN201610283822.4中的云牛膝多糖粗品。

3)实验方法：基本同实施例7，给药相同剂量的情况下，比较两种结构的云牛膝多糖的保肝功能。

实验结果如下：

云牛膝多糖对血清TC、LDL和TBIL的影响如表10所示。

表10云牛膝粗多糖对血清TC、LDL和TBIL的影响

与模型对照组比较差异具有统计学意义，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001。

实验末，与模型对照组大鼠的血清LDL-C、TBIL和TC含量比较，本专利云牛膝粗多糖均有极显著性差异(^**p<0.01)，比较专利云牛膝多糖仅TC有显著性差异(^*P<0.05)。因此本专利云牛膝多糖与对比专利云牛膝多糖相比，保肝活性更为优异。

实施例12

本实施例为实施例1中提取的云牛膝多糖纯品的免疫活性测试。

经测定，实施例1提取的云牛膝多糖的单糖包括葡萄糖和果糖，其结构单元为：

其中，n₁＝0～6，n₂＝0～3，n₃＝0～3。

云牛膝多糖分子量范围为1～3KD。

用上述结构的云牛膝多糖纯品进行免疫功能测定，依据《增强免疫力功能评价方法(征求意见稿)保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定》进行设计，选择单核-巨噬细胞功能测定中的小鼠碳廓清实验来判断是否具有单核-巨噬细胞免疫功能。

一、试验材料

1)实验动物：清洁级ICR种小鼠，6～8周龄，18～22g；性别：雄性；每组10只。

2)试验药物：云牛膝多糖纯品组1：n₁＝0，n₂＝0，n₃＝0时的结构的多糖纯品；云牛膝多糖纯品组2：n₁＝1，n₂＝1，n₃＝1时的结构的多糖纯品；云牛膝多糖纯品组3：n₁＝6，n₂＝3，n₃＝3时的结构的多糖纯品。

二、实验方法：基本同实施例4。

三、实验结果

吞噬指数：小鼠碳廓清实验中，通过对比小鼠吞噬指数来判断AAP是否具有单核-巨噬细胞免疫功能。空白对照组、模型组、3个云牛膝多糖纯品组的吞噬指数为5.45±1.10、4.31±1.24、8.93±1.11、7.93±2.11、7.63±1.71。

脾脏指数：脾指数测量中，空白对照组、模型组、3个云牛膝多糖纯品组脾指数分别为0.003030±0.000715、0.002256±0.000472、0.005977±0.000643、0.006057±0.000553、0.005821±0.000431。AAP对免疫抑制小鼠体重、脾指数、及吞噬指数的影响如表11所示。

表11AAP对免疫抑制小鼠体重、脾指数、及吞噬指数的影响

与模型组比较，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001。

其中脾指数，与模型组相比，云牛膝多糖纯品组具有极显著性差异(**p<0.01)。因此本实施例的结构单元包括果糖和葡萄糖的三个云牛膝多糖纯品组，都有提高免疫力的功能。

实施例13

本实施例为实施例1提取的云牛膝多糖纯品与专利申请号为CN201610283822.4中的云牛膝多糖纯品之间的免疫活性对比实验。

经测定，实施例1提取的云牛膝多糖的单糖包括葡萄糖和果糖，其结构单元为：

1)试验药物：云牛膝多糖纯品组1：n₁＝0，n₂＝0，n₃＝0时的结构的多糖纯品；云牛膝多糖纯品组2：n₁＝1，n₂＝1，n₃＝1时的结构的多糖纯品；云牛膝多糖纯品组3：n₁＝6，n₂＝3，n₃＝3时的结构的多糖纯品；

2)对比药物：专利申请号为CN201610283822.4中的云牛膝多糖纯品(对比专利云牛膝多糖)，该结构的云牛膝多糖的单糖结构单元包括葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸。

3)实验方法：基本同实施例4，比较两种结构的云牛膝多糖的免疫功能。

4)实验结果：

吞噬指数：小鼠碳廓清实验中，通过对比小鼠吞噬指数来判断AAP是否具有单核-巨噬细胞免疫功能。空白对照组、模型组、3个本专利云牛膝多糖组、对比专利云牛膝多糖组的吞噬指数为5.45±1.10、4.31±1.24、8.93±1.11、7.93±2.11、7.63±1.716.16±0.51。本专利云牛膝多糖组相比于比较专利中的云牛膝多糖吞噬指数更高。

脾脏指数：脾指数测量中，空白对照组、模型组、云牛膝多糖纯品组脾指数分别为0.003030±0.000715、0.002256±0.000472、0.005977±0.000643、0.006057±0.000553、0.005821±0.000431、0.003937±0.000944。AAP对免疫抑制小鼠体重、脾指数、及吞噬指数的影响如表12所示。

表12 AAP对免疫抑制小鼠体重、脾指数、及吞噬指数的影响

与模型组比较，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001，因此，本发明的云牛膝多糖与对比专利中的云牛膝多糖有更好的提高免疫力功能。

实施例14

本实施例为实施例1提取的云牛膝多糖纯品与专利申请号为CN201610283822.4中的云牛膝多糖纯品之间的降血糖活性对比。

经测定，实施例1提取的云牛膝多糖的单糖包括葡萄糖和果糖，其结构单元为：

1)试验药物：云牛膝多糖纯品组1：n₁＝0，n₂＝0，n₃＝0时的结构的多糖纯品；云牛膝多糖纯品组2：n₁＝1，n₂＝1，n₃＝1时的结构的多糖纯品；云牛膝多糖纯品组3：n₁＝6，n₂＝3，n₃＝3时的结构的多糖纯品；

2)对比药物：专利申请号为CN201610283822.4中的云牛膝多糖纯品(对比专利云牛膝多糖)，该结构的云牛膝多糖的单糖结构单元包括葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸；

3)实验方法：同实施例6，比较两种结构的云牛膝多糖的降血糖功能。

实验结果如下：

云牛膝多糖对高血糖模型动物空腹血糖的影响如表13-1所示。

表13-1云牛膝多糖对高血糖模型动物空腹血糖的影响

与对照组相比，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001，由表13-1可知，小鼠经灌胃给药本专利云牛膝多糖和对比专利云牛膝多糖，连续灌胃30d，测定各组小鼠的空腹血糖值，与模型对照组相比，本专利云牛膝多糖的血糖下降百分率具有极显著性差异(^***p<0.001)，对比专利云牛膝多糖具有显著性差异(^*p<0.05)。

云牛膝多糖对高血糖模型动物糖耐量的影响如表13-2所示。

表13-2云牛膝多糖对高血糖模型动物糖耐量的影响

由表13-2可知，小鼠经口给药予本专利云牛膝多糖和对比专利云牛膝多糖，连续灌胃30d后，各剂量组小鼠的糖耐量与模型对照组作比较，本专利云牛膝多糖的糖耐量具有极显著性差异(^***p<0.001)，对比专利云牛膝多糖具有显著性差异(^*p<0.05)。本专利云牛膝多糖与对比专利云牛膝多糖相比，降糖活性优于比较专利的云牛膝多糖。

实施例15

本实施例为实施例1提取的云牛膝多糖纯品与专利申请号为CN201610283822.4中的云牛膝多糖纯品之间的保肝活性对比。

经测定，实施例1提取的云牛膝多糖的单糖包括葡萄糖和果糖，其结构单元为：

1)试验药物：云牛膝多糖纯品组1：n₁＝0，n₂＝0，n₃＝0时的结构的多糖纯品；云牛膝多糖纯品组2：n₁＝1，n₂＝1，n₃＝1时的结构的多糖纯品；云牛膝多糖纯品组3：n₁＝6，n₂＝3，n₃＝3时的结构的多糖纯品；

2)对比药物：专利申请号为CN201610283822.4中的云牛膝多糖纯品(对比专利云牛膝多糖)，该结构的云牛膝多糖的单糖结构单元包括葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸；

3)实验方法：同实施例7，比较两种结构的云牛膝多糖的保肝功能。

实验结果如下：

云牛膝多糖对血清TC、LDL和TBIL的影响如表14所示。

表14云牛膝多糖对血清TC、LDL和TBIL的影响

与模型对照组比较差异具有统计学意义，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001。如表14所示，实验末，模型对照组大鼠的血清LDL-C、TBIL和TC含量与正常对照组相比均显著升高，经统计分析，差异具有统计学意义(^*P<0.05)，证明构建的亚急性酒精性肝损伤模型成立。由LDL-C、TBIL和TC含量对比结果可知，本发明的云牛膝多糖与对比专利云牛膝多糖相比，保肝活性均更为优异。

已经根据优选实施例对本发明作了描述。应当理解的是前面的描述和实施例仅仅为了举例说明本发明而已。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。