一类具有联合治疗作用的cddo/川芎嗪醇杂合物及其制备方法和用途
阅读说明：本技术 一类具有联合治疗作用的cddo/川芎嗪醇杂合物及其制备方法和用途 (CDDO/ligustrazine heterozygote with combined treatment effect and preparation method and application thereof ) 是由 凌勇 钱建强 许中原 孟迟 吴红梅 谢旭东 陶维志 丁倩 张雨婷 于 2021-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医药技术领域,尤其涉及一类具有联合治疗作用的CDDO/川芎嗪醇杂合物及其制备方法和用途,具有通式Ⅰ所示结构：本发明采用双前药策略,利用LAP响应片段亮氨酸酰基对CDDO类药物的CUK进行前药保护,并与川芎嗪醇活性片段进行偶联,形成CDDO/川芎嗪醇杂合物。本发明利用前药在LAP过表达的肝脏炎症组织中,选择性地裂解亮氨酸酰胺键片段,释放出CDDO类药物和川芎嗪醇,从而提高两种药物在肝损伤炎症组织的浓度,增加了炎症治疗作用,降低了药物剂量,改善了CDDO类药物的毒副作用,提高了药物安全性。(The invention relates to the technical field of biomedicine, in particular to a CDDO/ligustrazine heterocomplex with combined treatment effect and a preparation method and application thereof, wherein the CDDO/ligustrazine heterocomplex has a structure shown in a general formula I:)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一类具有联合治疗作用的CDDO/川芎嗪醇杂合物及其制备方法和用途。
背景技术
肝炎是肝脏炎症的统称，主要由饮酒、药物和病毒感染引起。肝炎如果不能被及时的进行合理治疗，甚至会演变成肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌，因此，寻找能有效治疗肝炎的药物成为研究的热点之一。
五环三萜类化合物具有广泛的生物活性，尤其在抗肿瘤、抗炎以及机体免疫调节等方面。研究表明，齐墩果酸(oleanolic acid，OA)对肝脏具有保护作用，且具有抗炎活性。在一系列OA衍生物中，2-腈基-3,12-二氧代齐墩果酸-1,9(11)-二烯-28-羧酸甲酯(CDDO-Me)受到了最多的关注，并已由Reata公司进行治疗病毒肝炎和非酒精性脂肪的临床试验，同系列CDDO类药物均显示出良好的抗肝炎活性，但临床结果表明，该类药物存在严重的心脏毒性，这严重限制了其在临床上的应用，后续的分子机制研究发现CDDO类药物的α-氰基-α,β-不饱和酮(CUK)可通过与Keap结合来激活Nrf2信号通路产生抗炎作用，但CUK活性过高，能与除Keap之外的亲核大分子结合，因而产生较大的毒副作用。若能利用前药模式，对活性结构CUK进行保护，并使其选择性地在疾病部位释放出CDDO类药物，避免其对正常组织的副作用，以降低药物的毒性。
川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是一种生物碱，又名四甲基吡嗪，广泛存在于中药川芎中。TMP具有广泛的药理作用，如抗炎、抗氧化、保护心肌、肝脏保护等，具有良好的临床应用前景。机制研究表明，TMP的抗炎抗氧化功能也与其激活Nrf2信号通路有关。2-羟甲基-3,5,6-三甲基吡嗪(川芎嗪醇)是TMP的体内代谢产物，其具有与TMP类似的抗炎、抗氧化等活性。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一类具有联合治疗作用的CDDO/川芎嗪醇杂合物及其制备方法和用途。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一类具有联合治疗作用的CDDO/川芎嗪醇杂合物，具有通式Ⅰ所示结构：
其中，R代表H、叔丁氧羰基中的一种；R’代表OMe,NHMe,中的一种；n＝0或1。
优选地，所述式I的结构中，R、R’及n选自如下组合：
R＝H,R’＝NHMe,n＝0；
或者R＝H,R’＝OMe,n＝1；
或者R＝叔丁氧羰基,n＝1。
优选结构如表1所示：
表1.式I部分化合物代号及其对应的结构
其中，I1:(4aS,6aR,6bS,8aS,12aS,14aR,14bS)-10-(2-氨基-4-甲基戊酰胺)-11-氰基-N,2,2,6a,6b,9,9,12a-八甲基-14-氧代-12-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲氧基)-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,12,12a,14,14a,14b-十八烷基氢吡喃-4a-氨基甲酸酯；
I2:(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-甲基-10-((4-(2-氨基-4-甲基戊酰胺)苄基)氧基)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-14-氧代-12-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲氧基)-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,12,12a,14,14a,14b-十八烷基氢吡喃-4a-羧酸酯；
I3:叔丁基(1-((4-((((4aR,6aS,6bR,8aS,12aS,12bR,14bS)-2-氰基-8a-(1H-咪唑-1-羰基)-4,4,6a,6b,11,11,14b-七甲基-13-氧代-1-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲氧基)-1,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-十八烷基氢吡喃-3-基)氧代)甲基)苯基)氨基)-4-甲基-1-氧代戊酸-2-基)氨基甲酸酯。
本发明还提供了一类具有联合治疗作用的CDDO/川芎嗪醇杂合物的制备方法，包括如下步骤：
A、以N-Boc保护的L-亮氨酸2在HATU(2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)和DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)存在下与对氨基苄醇1缩合，生成酰胺化合物3，化合物3在三溴化磷的作用下，获得溴代物5；
B、一方面，CDDO原药4与川芎嗪醇经DMF/K2CO3处理得到烯醇中间体8，接着烯醇中间体8与化合物5经醚化反应，得到CDDO-Me与川芎嗪醇的烯醇醚化合物6或Ia；另一方面，烯醇中间体8与N-叔丁氧羰基-L-亮氨酸2经EDCI、DMAP缩合酰化反应得到化合物Ia；
C、最后，中间体6经MeOH/HCl作用去脱Boc导致以高收率形成化合物Ib。
Ia和Ib均属于通式I。
合成路线如下所示：
其中，R代表H、叔丁氧羰基中的一种；R’代表OMe,NHMe,中的一种；n＝0或1。
本发明还提供了一类具有联合治疗作用的CDDO/川芎嗪醇杂合物用于在肝损伤炎症组织中具有选择性靶向治疗的应用。
其中，可实现CDDO原药和川芎嗪醇在体内肝损伤炎症组织中选择性释放作用；可实现CDDO原药和川芎嗪醇在体内肝损伤炎症组织中发挥联合治疗作用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明采用双前药策略，利用LAP响应片段亮氨酸酰基对CDDO类药物的CUK进行前药保护，并与川芎嗪醇活性片段进行偶联，形成CDDO/川芎嗪醇杂合物。
2、本发明利用前药在LAP过表达的肝脏炎症组织中，选择性地裂解亮氨酸酰胺键片段，释放出CDDO类药物和川芎嗪醇，从而提高两种药物在肝损伤炎症组织的浓度，增加了炎症治疗作用，降低了药物剂量，改善了CDDO类药物的毒副作用，提高了药物的安全性。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1(4aS,6aR,6bS,8aS,12aS,14aR,14bS)-10-(2-氨基-4-甲基戊酰胺)-11-氰基-N,2,2,6a,6b,9,9,12a-八甲基-14-氧代-12-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲氧基)-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,12,12a,14,14a,14b-十八烷基氢吡喃-4a-氨基甲酸酯(I1)
将CDDO-NHMe(0.198mmol,110mg)用无水DMF(4ml)溶解，再加入K2CO3(0.396mmol,54.7mg)，N2保护，冰浴，反应12h后，将(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲醇(0.198mmol,30.1mg)用DMF(1ml)溶解，然后在剧烈搅拌下将Boc-亮氨酰氯(0.30mmol,74.7mg)滴加到混合液中，反应2h。待反应完毕后，用CH2Cl2(60mL)萃取水溶液三次，并将有机层经Na2SO4干燥并浓缩，柱分离，得到中间体6a，产率60％。
将中间体6a(0.980mmol,992mg)用盐酸甲醇溶液溶解，室温搅拌12h。待反应完毕后，浓缩，柱分离，得到化合物I1，产率60％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.50(s,1H,NH),7.23(s,1H,NH),5.78(s,1H,CH＝C),5.45(m,2H,CH2),4.97(d,J＝8.0Hz,1H,CH),4.31(t,J＝6.7Hz,2H,CH2),4.01(s,1H,CH),3.47(s,3H,CH3),3.30(s,3H,OCH3),3.07(s,3H,NCH3),3.06(m,1H,CH),2.92(d,J＝4.7Hz,1H,CH),1.99(dd,J＝10.0,4.4Hz,1H,CH),1.89(dd,J＝9.5,4.3Hz,1H,CH),1.79(m,4H,2CH2),1.26(m,12H,4CH2),1.13(d,J＝10.2Hz,6H,2CH3),1.03(m,8H,4CH2),0.97(t,J＝6.5Hz,6H,2CH3),0.91(s,3H,CH3).
实施例2(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-甲基-10-((4-(2-氨基-4-甲基戊酰胺)苄基)氧基)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-14-氧代-12-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲氧基)-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,12,12a,14,14a,14b-十八烷基氢吡喃-4a-羧酸酯(I2)
将4-氨基苯甲醇(0.739g，6mmol)用无水DMF(15mL)溶解，N2保护，接着冷却至0℃，在搅拌中后依次加入DIPEA(1.55g，12mmol)、HATU(1.62g，12mmol)。然后再搅拌10分钟后，加入N-(叔丁氧羰基)-L-亮氨酸2(1.388g，6mmol)。然后将反应体系恢复至室温反应2h。反应完毕后，将反应液用饱和NaCl溶液(3×200mL)洗涤，并用乙酸乙酯(3×150mL)萃取，并将有机层经Na2SO4干燥并浓缩，柱色谱纯化得到化合物3，产率85％。将中间产物3(1.01g，3mmol)用CH2Cl2(30mL)溶解，冰浴搅拌10min后，缓慢滴加入三溴化磷(0.81g，3mmol)，反应1h。反应完毕后，用2mol/L的碳酸氢钠溶液调节pH至7，然后用CH2Cl2萃取，有机层干燥、减压浓缩得到化合物5，产率80％。
将CDDO-Me(0.198mmol,100mg)用无水DMF(4ml)溶解，再加入K2CO3(0.396mmol,54.7mg)，N2保护，冰浴，反应12h后，将(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲醇(0.198mmol,30.1mg)用DMF(1ml)溶解，然后在剧烈搅拌下将中间体5(0.30mmol,119.4mg)滴加到混合液中，反应2h。待反应完毕后，用CH2Cl2(60mL)萃取水溶液三次，并将有机层经Na2SO4干燥并浓缩，柱分离，得到目标化合物6b，产率60％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.63(s,1H,NH),7.49(d,J＝8.2Hz,2H,2ArH),7.25(d,J＝8.0Hz,2H,2ArH),5.79(s,1H,CH＝C),5.37(m,2H,CH2),4.93(d,J＝9.9Hz,1H,CH),4.53(d,J＝10.0Hz,1H,CH),4.28(s,1H,CH),4.22(s,1H,CH),3.60(s,3H,CH3),2.96(dt,J＝13.9,4.1Hz,1H,CH),2.77(d,J＝4.7Hz,1H,CH),2.39(m,9H,3CH3),2.02(d,J＝18.5Hz,2H,CH2),1.72(m,4H,2CH2),1.49(m,10H,5CH2),1.22(m,6H,2CH3),1.08(m,12H,4CH3),0.96(d,J＝9.1Hz,6H,2CH3),0.85(m,15H,5CH3).
将中间体6b(0.11mmol,100mg)用盐酸甲醇溶液溶解，室温搅拌12h。待反应完毕后，浓缩，柱分离，得到化合物I2，产率60％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.64(s,1H,NH),7.65(d,J＝8.5Hz,2H,NH2),7.37(d,J＝8.4Hz,2H,2ArH),5.87(s,1H,ArH)),5.52(d,J＝11.1Hz,1H,ArH),5.42(d,J＝11.1Hz,1H,CH＝C),5.01(d,J＝9.9Hz,1H,OCH),4.60(d,J＝9.9Hz,1H,CH),4.39(d,J＝23.4Hz,2H,OCH2),3.67(s,3H,OCH3),3.54(dd,J＝9.9,3.7Hz,1H,CH),3.36(s,1H,CH),3.02(dd,J＝13.7,4.2Hz,1H,CH),2.85(d,J＝4.7Hz,1H,CH),2.46(d,J＝5.8Hz,9H,3CH3),2.00(dd,J＝8.8,5.7Hz,4H,2CH2),1.81(m,8H,4CH2),1.49(m,6H,3CH2),1.26(s,3H,CH3),1.20(s,3H,CH3),1.16(s,3H,CH3),1.11(s,3H,CH3),1.04(s,3H,CH3),1.01(d,J＝3.3Hz,6H,2CH3),0.97(d,J＝3.4Hz,3H,CH3),0.93(s,3H,CH3).
实施例3叔丁基(1-((4-((((4aR,6aS,6bR,8aS,12aS,12bR,14bS)-2-氰基-8a-(1H-咪唑-1-羰基)-4,4,6a,6b,11,11,14b-七甲基-13-氧代-1-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲氧基)-1,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-十八烷基氢吡喃-3-基)氧代)甲基)苯基)氨基)-4-甲基-1-氧代戊酸-2-基)氨基甲酸酯(I3)
将4-氨基苯甲醇(0.739g，6mmol)用无水DMF(15mL)溶解，N2保护，接着冷却至0℃，在搅拌中后依次加入DIPEA(1.551g，12mmol)、HATU(1.62g，12mmol)。然后再搅拌10分钟后，加入N-(叔丁氧羰基)-L-亮氨酸(1.388g，6mmol)。然后将反应体系恢复至室温反应2h。反应完毕后，将反应液用饱和NaCl溶液(3×200mL)洗涤，并用乙酸乙酯(3×150mL)萃取，并将有机层经Na2SO4干燥并浓缩，柱色谱纯化得到化合物3，产率85％。将中间产物3(1.01g，3mmol)用CH2Cl2(30mL)溶解，冰浴搅拌10min后，缓慢滴加入三溴化磷(0.812g，3mmol)，反应1h。反应完毕后，用2mol/L的碳酸氢钠溶液调节pH至7，然后用CH2Cl2萃取，有机层干燥、减压浓缩得到化合物5，产率80％。
将CDDO-Im(0.198mmol,107mg)用无水DMF(4ml)溶解，再加入K2CO3(0.396mmol,54.7mg)，N2保护，冰浴，反应12h后，将(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲醇(0.198mmol,30.1mg)用DMF(1ml)溶解，然后在剧烈搅拌下将中间体5(0.30mmol,119.4mg)滴加到混合液中，反应2h。待反应完毕后，用CH2Cl2(60mL)萃取水溶液三次，并将有机层经Na2SO4干燥并浓缩，柱分离，得到目标化合物I3，产率62％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.63(s,1H,NH),8.15(m,1H,ArH),7.49(d,J＝8.2Hz,2H,2ArH),7.46(m,1H,ArH),7.26(m,1H,ArH),7.25(d,J＝8.0Hz,2H,2ArH),5.79(s,1H,CH＝C),5.37(m,2H,CH2),4.93(d,J＝9.9Hz,1H,CH),4.53(d,J＝10.0Hz,1H,CH),4.28(s,1H,CH),4.22(s,1H,CH),2.96(dt,J＝13.9,4.1Hz,1H,CH),2.77(d,J＝4.7Hz,1H,CH),2.39(m,9H,3CH3),2.02(d,J＝18.5Hz,2H,CH2),1.72(m,4H,2CH2),1.49(m,10H,5CH2),1.22(m,6H,2CH3),1.08(m,12H,4CH3),0.96(d,J＝9.1Hz,6H,2CH3),0.85(m,15H,5CH3).
实施例4本发明化合物对肝细胞炎症损伤保护试验
采用四甲基氮唑蓝比色法(MTT)体外毒性试验评价了本发明化合物对人肝细胞LO2细胞株保护作用。首先取一瓶处于指数生长期状态良好的LO2细胞，加入0.25％胰蛋白酶消化，使贴壁细胞脱落，制成每毫升含2×104～4×104个细胞的悬液。取细胞悬液接种于96孔板上，每孔180μL，置恒温CO2培养箱中培养24h。换液，加入0.1％四氯化碳进行肝细胞损伤24h，本发明化合物用DMSO溶解后用PBS稀释，受试化合物浓度分别为10和40nM，每孔20μL，培养24h。将MTT加入96孔板中，每孔20μL，培养箱中反应4小时。吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，平板摇床上振摇5分钟。用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸收度，计算细胞存活率。细胞存活率＝受试物组OD值/阴性对照组OD值×100％。
实验结果发现，本发明化合物能够在较低的剂量下(10和40nM)有效逆转肝细胞的损伤，抑制肝细胞死亡，细胞存活率均显著高于模型组，且高于阳性药CDDO+川芎嗪醇的联合给药组。由此说明本发明化合物对损伤的肝细胞具有较强治疗效果。
表二本发明所述化合物对抗肝细胞损伤的细胞活性
实施例5本发明化合物对小鼠肝损伤体内试验
雄性ICR小鼠禁食过夜，第二天腹腔注射CCl4溶液(CCl4：橄榄油＝1：4稀释液，2mL/kg)，每三天注射一次，共注射两次。第七天检测血液中肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)。将肝损伤小鼠分为四组，分别为模型组，阳性药CDDO+川芎嗪醇组(34μmol/kg)，I2(17μmol/kg)，I2(34μmol/kg)。另设置空白对照组(同频率，同体积注射PBS)。5天内给三次药物，腹腔注射，给药后第二天测量血液中肝功能指标ALT和AST。
实验结果发现，本发明化合物I2对肝损伤的小鼠模型具有较强治疗效果，通过检测小鼠血液中肝功能指标ALT和AST，发现本发明化合物I2(17和34μmol/kg)组均具有显著肝损伤治疗效果，肝功能AST指标比模型组降低了6～7倍，ALT指标比模型组降低近7倍，同时显著优于阳性药物CDDO-Me和川芎嗪醇(34μmol/kg)组合治疗组，ALT和AST指标低于阳性药物CDDO-Me和川芎嗪醇组合治疗组的2～3倍，由此说明本发明化合物具有更好的治疗效果，肝功能指标基本恢复到正常水平。因此，本发明化合物具有显著治疗体内肝损伤炎症的作用。
本发明中披露的说明和实践，对于本技术领域的普通技术人员来说，都是易于思考和理解的，且在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，也应视为本发明的保护范围。
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