一种白芷荧光快速检测技术
阅读说明：本技术 一种白芷荧光快速检测技术 (Radix angelicae fluorescence rapid detection technology ) 是由 刘青 陈含笑 罗莎 张晓菊 王丹 位笑娜 黄继红 于 2021-08-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种白芷荧光快速检测技术,属于荧光检测技术领域,包括如下步骤：(1)母液制备；(2)全波长扫描；(3)选择三维荧光光谱测试条件；(4)三维荧光检测；(5)三维荧光图谱进行分析；(6)质量检测；(7)荧光检测方法的适用性的考察；(8)判定白芷的荧光检测样品浓度的限度；(9)考察放置时间对其荧光强度的影响。本申请是通过三维荧光方法建立一套快速、特异性强的白芷质量指纹图谱是提高中药材白芷质量的一种新方法。(The invention discloses a radix angelicae fluorescence rapid detection technology, belongs to the technical field of fluorescence detection, and comprises the following steps: (1) preparing mother liquor; (2) scanning at full wavelength; (3) selecting three-dimensional fluorescence spectrum test conditions; (4) three-dimensional fluorescence detection; (5) analyzing the three-dimensional fluorescence spectrum; (6) detecting the quality; (7) investigating the applicability of a fluorescence detection method; (8) judging the limit of the concentration of the fluorescence detection sample of the angelica dahurica; (9) the influence of the standing time on the fluorescence intensity was examined. The application is a new method for improving the quality of the Chinese medicinal material angelica dahurica by establishing a set of rapid and high-specificity angelica dahurica quality fingerprint by a three-dimensional fluorescence method.)
技术领域
本发明属于荧光检测技术领域，具体涉及一种白芷荧光快速检测技术。
背景技术
由于中药材一般作为农作物进行栽培生产，所以其质量容易受到环境因素等影响，产生质量的不稳定性。所以中药材的质量管控一直是中药现代化的重要一环，同样，也是我国中药材进军世界的重要门槛。白芷是我国常用40种大宗药材之一，产量及用量都很大，特别是产地分布较广，除了杭白芷、川白芷、祁白芷、禹白芷四大产地外，东北，山东，云南等地也有栽培。不同产地的白芷如何评价质量，就格外重要。
目前中药材的质量管控主要通过药典进行规范，2020年最新的药典上对白芷的检测方法主要是性状鉴定、薄层色谱法鉴定、浸出物的高效液相色谱法鉴定，这三种方法。性状鉴定法鉴定时主要依靠主观判断，要求鉴定者有丰富的中药材鉴定经验，否则错误率或失误率较高；薄层色谱法没办法对样品中的成分含量作出判断，只能定性；高效液相色谱法是目前比较常用的定性定量效果较好的检测手段，然而检测时间较长。白芷的质量管理指纹图谱，还可以使用紫外、红外检测法。然而紫外特异性差，红外图谱过于复杂，不容易进行判断。
发明内容
本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种白芷荧光快速检测技术。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种白芷荧光快速检测技术，包括如下步骤：
(1)将禹白芷粉碎后过60目筛，准确称取5g干燥的禹白芷粉末，加入50mL甲醇，常温下浸泡，静置3h，抽滤得到每毫升相当于0.1g植物白芷的提取液作为母液；
(2)对步骤(1)中的提取液进行全波长扫描，然后观察扫描结果；
(3)根据步骤(2)的全波长扫描结果选择三维荧光光谱测试条件；
(4)通过步骤(3)中所述的条件采用三维荧光检测白芷提取液得到三维荧光图谱；
(5)针对三维荧光图谱进行分析，找出特征峰；
(6)对特征峰样品进行溶解后，然后在Ex 320nm、Ex 330nm条件下，测定特征峰样品的二维荧光图谱，再将荧光图谱代入禹白芷的荧光图谱中，即可完成禹白芷的质量检测；
(7)分别取四种产地白芷粉末1g，用10mL甲醇浸泡3h后过滤，进行荧光检测，以考察荧光检测方法的适用性；
(8)将白芷甲醇浸取液母液配制成不同浓度，在Ex 330nm/Em 410nm处测定荧光强度，以考察浓度对荧光强度的影响，从而判定白芷的荧光检测样品浓度的限度；
(9)配制白芷甲醇提取液，同一份母液，置于10mL离心管内，用封口膜封紧，每隔3h在Ex320nm、Ex330nm、Ex340nm、Ex350nm条件下进行一次荧光检测，分别标号为N1、N2、N3、N4、N5、N6，考察放置时间对其荧光强度的影响。
进一步地。步骤(1)中所述的母液浓度为0.1g/mL。
进一步地，步骤(8)中所述的不同浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1g/mL。
本发明相比现有技术具有以下优点：
1、用了白芷中主要有效成分是香豆素类化合物这一特征，香豆素类化合物具有较大的共轭体系，是自然界中荧光性很强的一类。所以本方法检测限度低，只需要很少的样品量即能达到检测结果。
2、荧光方法针对不同的化合物有特定的吸收波长及发射波长，所以选择性强，比如白芷的检测特定条件为激发波长(Ex)范围：300～330nm，采样间隔10nm，Ex Slit 5nm；发射波长(Em)范围375～650nm，采样间隔5nm，Em Slit 5nm；积分时间0.1s。
3、荧光方法一般不受外界因素的影响，比如温度，湿度，溶剂等条件，并且操作人员使用简便。
4、荧光方法对样品没有损耗，标准品或者检测样品都可回收，不会像其他检测方法产生大量有机溶剂废液。
5、荧光方法检测速度快，1分钟内可以得到荧光检测图谱，而其他类的检测方法需要时间较长，薄层色谱法15分钟左右，高效液相法1个小时左右。
6、通过三维荧光方法建立一套快速、特异性强的白芷质量指纹图谱是提高中药材白芷质量的一种新方法。
附图说明
图1为本申请的多波长下白芷提取液的荧光图谱；
图2为本申请的三维荧光光谱测试条件下白芷提取液的三维荧光图谱；
图3为本申请的欧前胡素荧光图谱；
图4为本申请的异珊瑚菜素荧光图谱；
图5为本申请的禹白芷三维荧光图谱；
图6为本申请的川白芷三维荧光图谱；
图7为本申请的杭白芷三维荧光图谱；
图8为本申请的祁白芷三维荧光图谱；
图9为本申请的不同浓度白芷津液荧光图谱；
图10为本申请的四种发射光下六个时间段的荧光结果。
具体实施方式
一种白芷荧光快速检测技术，包括如下步骤：
(1)分别将禹白芷、川白芷、杭白芷、祁白芷粉碎后过60目筛，准确称取5g干燥的禹白芷粉末，加入50mL甲醇，常温下浸泡，静置3h，抽滤得到每毫升相当于0.1g植物白芷的提取液作为母液(视作0.1g/mL)；
(2)对提取液进行全波长扫描，根据扫描结果可以看到在Ex 300～330nm范围内有两个荧光峰，且出峰较为明显，而当激发波长增大时，发射波长在500nm附近的荧光峰变得不再明显(见图1)；
(3)选择的三维荧光光谱测试条件为：激发波长(Ex)范围：300～330nm，采样间隔10nm，Ex Slit 5nm；发射波长(Em)范围375～650nm，采样间隔5nm，Em Slit 5nm；积分时间0.1s；
(4)通过上述条件使用三维荧光检测白芷提取液得到以下特征图谱(见图2)；
(5)针对三维图谱上的两个特征峰进行分析，发现分别为白芷中欧前胡素与异珊瑚菜素的特征吸收峰；
(6)将10mg欧前胡素样品用甲醇溶解，置于50mL容量瓶内，定容至刻度，得到0.2mg/mL的欧前胡素溶液；取88.9mg异珊瑚菜素用少量甲醇溶解，定容至100mL，再用移液枪准确移取2.3mL所配置的异珊瑚菜素溶液于10mL容量瓶内，定容至10mL，得到浓度为2.04mg/mL的异珊瑚菜素溶液。在Ex320nm、Ex 330nm条件下，得到欧前胡素和异珊瑚菜素的二维荧光图谱分别为图3和图4；
(7)通过将两种香豆素的荧光图谱代入禹白芷提取液的荧光图谱，发现两种香豆素的荧光图谱出峰位置与禹白芷的荧光图谱出峰位置基本吻合，说明白芷Ex 330nm/Em410nm处荧光峰包含异珊瑚菜素，Ex 320nm/Em 490nm处荧光峰包含欧前胡素；
(8)欧前胡素与异珊瑚菜素均为白芷中含量较大的香豆素类化合物，其中欧前胡素的含量为2020版《中国药典》所规定的评价白芷质量标准；
(9)由于白芷中主要有效成分为呋喃香豆素类化合物，在紫外光照射下可产生荧光，因此，其荧光越强则可表示其中的有效成分含量越高，即其药效越好；
(10)分别取四种产地白芷粉末1g，用10mL甲醇浸泡3h后过滤，进行荧光检测，可以发现本方法适用于不同产地白芷的质量检测，自图5～图8依次为：禹白芷、川白芷、杭白芷、祁白芷；
(11)新制的白芷甲醇浸取液母液配置成不同浓度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.1g/mL)，在Ex 330nm/Em 410nm处测定荧光强度，以考察浓度对荧光强度的影响，不同浓度白芷的甲醇浸液二维荧光图谱如图9所示；
(12)由检测结果可知且0.08、0.1g/mL的试液荧光强度基本相同，说明该浓度梯度下，白芷试液的荧光发生了淬灭，导致浓度越高而荧光强度越小；
(13)白芷的荧光检测样品浓度限度应该为0.02-0.08g/mL；
(14)配置白芷甲醇提取液，考察放置时间对其荧光强度的影响。同一份母液，置于10mL离心管内，用封口膜封紧，每隔3h在Ex320nm、Ex330nm、Ex340nm、Ex350nm条件下进行一次荧光检测，分别标号为N1、N2、N3、N4、N5、N6，荧光图谱如图10；
(15)由图可见不同荧光强度下，六个时间点的检测结果基本重合，证明本方法在时间因素影响下变化极小。
荧光方法针对不同的化合物有特定的吸收波长及发射波长，所以选择性强，比如白芷的检测特定条件为激发波长(Ex)范围：300～330nm，采样间隔10nm，Ex Slit 5nm；发射波长(Em)范围375～650nm，采样间隔5nm，Em Slit 5nm；积分时间0.1s；本方法中能够凸显白芷中重要的活性成分-欧前胡素和异珊瑚菜素；白芷样品的荧光检测样品浓度限度应该为0.02-0.08g/mL。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，但本发明不以所示限定实施范围，凡是依照本发明的构想所作的改变，或修改为等同变化的等效实施例，仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的保护范围内。