黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测试剂盒及应用

文档序号:1797433 发布日期:2021-11-05 浏览:8次 >En<

阅读说明:本技术 黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测试剂盒及应用 (Aflatoxin toxigenic bacteria virulence indicator molecule immune rapid detection kit and application ) 是由 张奇 李培武 姜俊 于 2021-05-28 设计创作,主要内容包括:本发明涉及黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测试剂盒。包括孔底包被有黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板、黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子的多克隆抗体、起标准物质作用的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子纯品溶液、察氏培养基、辣根过氧化物酶标记抗体、ELISA显色液与终止液、样品稀释液;所述的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子是指AFT-YJFZ01肽,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。可用于快速定量检测黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01,可用于鉴别比较曲霉属黄曲霉毒素产毒菌株产黄曲霉毒素能力,易操作,实用性强,容易推广应用。(The invention relates to an immune rapid detection kit for aflatoxin toxigenic bacteria virulence indicator molecules. The kit comprises an ELISA plate, a polyclonal antibody, a pure solution of aflatoxin toxigenic indicator molecules, a Chao&#39;s culture medium, a horse radish peroxidase labeled antibody, an ELISA developing solution, a stop solution and a sample diluent, wherein the bottom of the ELISA plate is coated with a nano antibody or a monoclonal antibody of the aflatoxin toxigenic indicator molecules; the aflatoxin toxigenic bacteria virulence indicator molecule is AFT-YJFZ01 peptide, and the amino acid sequence of the aflatoxin toxigenic bacteria virulence indicator molecule is shown in SEQ ID NO. 1. The kit can be used for quickly and quantitatively detecting the aflatoxin toxigenicity-producing indicator molecule AFT-YJFZ01 of the aflatoxin toxigenicity-producing strain, can be used for identifying and comparing the aflatoxin-producing capacity of the aflatoxin toxigenicity-producing strains of aspergillus, and is easy to operate, strong in practicability and easy to popularize and apply.)

黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测试剂盒及 应用

技术领域

本发明涉及黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测试剂盒及应用。

背景技术

黄曲霉毒素毒性强、危害大,是污染食品种类最多的污染物,近年总体呈现污染加重趋势,严重威胁食品安全和人民健康。黄曲霉毒素是自然界毒性最强的一类真菌毒素,其中黄曲霉毒素B1是国际癌症研究组织(International Agency for Research on Cancer,IARC)认定的I类致癌物,已引发过多起人畜群体中毒事件,成为肝癌病例高发的主要原因之一。根据近5年Web of Science检索数据统计:黄曲霉毒素污染食品及原料种类超过了110种,高居污染物首位。然而,迄今国内外仍没有黄曲霉毒素等微生物毒素污染前的分子预警研究范例,难以满足事前预警的迫切需求。

现有黄曲霉毒素预警方法主要是基于黄曲霉毒素检测技术建立,用于毒素污染水平评价或产后污染程度与消费风险评估,一旦检测发现,污染往往已经发生,难以满足事前预警与指导防控的迫切要求。利用黄曲霉毒素检测技术开展污染预警,是欧美等发达国家开展食品安全监管的成功经验。欧盟食品和饲料快速预警系统(Rapid Alert System forFood and Feed, RASFF)就是利用限量标准与检测获得食品与饲料中黄曲霉毒素含量,对各国输入欧盟的食品与饲料进行快速预警。美国研究机构基于黄曲霉毒素检测技术与污染监测数据,研究建立了多元罗吉斯蒂回归分析和叠加高斯处理等预警模型,主要用于评估产后玉米等农产品真菌毒素污染程度与消费风险。

综合国内外近二十年研究进展,当前黄曲霉毒素早期预警分子检测技术缺乏是根本原因。针对这一瓶颈难题,发明人团队经过十多年攻关研究,成功发现了一种黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子及其早期预警作用,成为首个早期预警分子,在此基础上成功发明了黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测试剂盒,并用于鉴别菌株产黄曲霉毒素能力——即产毒力,以及用于发现农田、农产品及饲料中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株,为及时发现黄曲霉毒素污染风险与早防早控提供科学依据。

发明内容

本发明针对现有技术存在的不足,提供黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测试剂盒及其应用,其用于鉴别曲霉属菌株产黄曲霉毒素能力和鉴别农田、农产品、中药材、饲料等产品中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株,容易推广应用。

为解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案为:

提供黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测试剂盒,包括孔底包被有黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板、黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的多克隆抗体、起标准物质作用的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01纯品溶液、察氏培养基或其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基、与黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记抗体、ELISA显色液与终止液、样品稀释液;

所述的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子是指AFT-YJFZ01肽,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

按上述方案,所述的孔底包被有黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板,是通过如下方法制备获得:将上述AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体溶解在ELISA包被缓冲液中,形成0.2-8.0μg/mL的包被液,再加入至酶标板中(以100-200μL/孔),4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后,去除上述酶标板中包被液,再用ELISA常规洗液洗涤酶标板;然后加入ELISA常规封闭液(每孔加200-300μL),放置室温或37℃封闭不少于1h后,再弃去封闭液,再用ELISA常规洗液洗涤酶标板。

所述的ELISA包被缓冲液是指常规碳酸盐缓冲液,配制方法为:称取NaHCO31.465g、 Na2CO3 0.795g,加入去离子水定容至500mL即可。

上述方案中,黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的多克隆抗体为黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01兔源多克隆抗体,所述的辣根过氧化物酶标记抗体为辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体。

上述方案中,黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的多克隆抗体与黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的动物源不同,具体可利用研究获得的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子直接用作抗原,制备获得纳米抗体或单克隆抗体、以及兔源多克隆抗体;

所述的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体,可利用AFT-YJFZ01作为免疫抗原,采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠,再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可制备获得。

所述的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的兔源多克隆抗体,可利用AFT-YJFZ01作为免疫抗原,采用常规方式免疫新西兰大白兔等试验兔,再利用已知常规的兔多克隆抗体制备技术方案即可制备获得。

所述的察氏培养基为常规察氏培养基,可以自配,也可以直接购买商品获得。

所述的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体可以直接购买商品获得。

按上述方案,所述的ELISA显色液是指ELISA常规的双氧水与TMB显色液。

所述的终止液是指ELISA常规的显色终止液:2mol/L硫酸水溶液,配制方法为:取44 mL浓硫酸加入到300mL去离子水中,搅拌到冷却,最后定容至400mL即可。

所述的样品稀释液是指含有0.1%山梨醇和绵糖的0.01mol/L磷酸盐缓冲液,配制方法为:山梨醇与糖各0.5g、NaCL 4.0g、Na2HPO4·12H2O 1.45g、KCL 0.1g、KH2PO4 0.1g,加入去离子水定容至500mL。

提供上述黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测试剂盒的使用方法:

用试剂盒中的察氏培养基适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基培养并制备待鉴别菌株或待鉴别样品的待测液;

将待鉴别菌株的待测液用样品稀释液稀释,将稀释后待鉴别菌株的待测液或上述待鉴别样品的待测液,以每孔100-200μL加入到试剂盒中的酶标板孔中,放置室温或37℃反应不少于1h后,弃去反应后液体,洗涤酶标板;

然后加入试剂盒中AFT-YJFZ01多克隆抗体,每孔加入100-200μL,放置室温或37℃反应不少于1h后,弃去液体,再洗涤酶标板;

然后每孔加入试剂盒中的辣根过氧化物酶标记抗体100-200μL,放置室温或37℃反应不少于1h后,弃去液体,再洗涤酶标板,

然后先后加入试剂盒中的ELISA显色液、终止液,最后通过酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZ01的浓度。

按上述方案,上述方法还包括:检测结果评判:根据酶标仪结果,获得单位体积黄曲霉待测液中黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的含量,分析待鉴别菌株的黄曲霉毒素产毒力。如果待鉴别菌株中黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01浓度越高,则说明鉴别菌株产黄曲霉毒素能力即产毒力越强;

根据酶标仪结果,获得单位体积待鉴别样品液中黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子 AFT-YJFZ01的含量,判定待鉴别样品中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。如果待鉴别样品中黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01浓度高,则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。

按上述方案,用系列浓度的起标准物质作用的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT- YJFZ01纯品溶液(每孔100-200μL),替换待测液,用于制作标准曲线,计算得到待测样品中AFT-YJFZ01的浓度。

按上述方案,上述待鉴别菌株的待测液的制备:待鉴别菌株培养,获得待鉴别菌株的待测液;具体可为:将待鉴别菌株在常规察氏培养基或者其他适宜菌株生长的培养基培养,培养的环境温度为15~35℃,培养时间不少于12h后,取培养基与培养物的混合体充分匀浆,再用无菌水稀释1-10倍,获得待鉴别菌株的待测液;

上述待鉴别样品液的制备:待鉴别样品培养,稀释,获得待鉴别样品的待测液;

具体可为:称量待鉴别样品,转移至样品稀释液中,室温震荡至均匀,制成待测样品均匀分散液,取10-1000μL样品均匀分散液加在含6-600mL常规常规察氏培养基或者其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基中,置于15-35℃下200±50rpm震荡培养,培养6-24h后取样,形成待鉴别样品的待测液。

按上述方案,上述样品为农田、农产品、中药材、饲料等产品。

所述试剂盒可用于鉴别曲霉属菌株产黄曲霉毒素能力,待鉴别菌株中黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子含量越高,则说明鉴别菌株产黄曲霉毒素能力即产毒力越强;所述试剂盒可用于鉴别农田、农产品、中药材、饲料等产品中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株,待鉴别样品中如果黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子含量高,则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株;

所述的黄曲霉菌株产毒力是衡量菌株产生黄曲霉毒素能力的指标,菌株产毒力越强,表明该菌株在相同时间和培养条件下能够产生黄曲霉毒素的量越多。本发明利用研究获得的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子,结合黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体、以及兔源多克隆抗体,并由这些抗体构建成夹心免疫检测方法,并最终组装成试剂盒;试剂盒的应用中,利用黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子测定浓度与菌株产毒力成正相关的特征,从而用于鉴别曲霉属菌株产黄曲霉毒素能力和鉴别农田、农产品及饲料中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株的用途,实用且易推广用,为及时发现黄曲霉毒素污染风险与早防早控提供了关键抓手与科学依据,对促进农业产业高质量发展与保障食品安全具有重要意义。

本发明有益效果在于:

1.提供了可用于黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测试剂盒,可用于快速定量检测黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01,2.可用于鉴别比较曲霉属黄曲霉毒素产毒菌株产黄曲霉毒素能力,3.可用于鉴别农田、农产品及饲料中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株,4.易操作,实用性强,容易推广应用,5.对促进农业产业高质量发展与保障食品安全具有重要意义。

附图说明

图1为黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01免疫快速检测方法标准曲线。

具体实施方式

实施例1试剂盒中可起标准物质作用的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的制备

按照如下配方配置察氏培养基:3%(w/v)蔗糖,0.3%(w/v)NaNO3,0.1%(w/v)K2HPO4,0.05%(w/v)MgSO4·7H2O,0.05%(w/v)KCl,0.001%(w/v)FeSO4,pH6.5,配置获得察氏培养基。随机选取公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》——中国农业科学院硕士学位论文,作者张杏,第33页——公布的产毒菌株HLJ-1、HeNZY-2、HuBha-24、JXZS-29-2、LNct-6、GXfc-34、GDZJ-122-2、JSnt-1、HuNdx-7、 HBHA-8-17等10株,分别接种到上述察氏培养基中,于28℃200rpm/min培养5天后,常规方法充分匀浆、破碎细胞,再用常规的蛋白质纯化系统、蛋白质电泳、免疫亲和等方法,即可纯化获得黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01。试验结果表明,上述产毒菌株培养物中均可以制备得到AFT-YJFZ01,在同样培养条件下,HBHA-8-17制备得到AFT- YJFZ01的量最多,而HLJ-1制备得到AFT-YJFZ01的量最少。

所述的免疫亲和方法,是指用上样液稀释黄曲霉毒素产毒菌细胞破碎液,经常规滤纸过滤后,再连续加到上述免疫亲和柱中,待基本流尽时,再免疫亲和柱常规淋洗液洗涤柱体,最后用pH 2.2的甘氨酸缓冲液或者70%甲醇水溶液洗脱,收集洗脱液后通过常规超滤离心方法及时去除溶液,再用无菌水从超滤离心管中溶解出留在超滤离心管内的蛋白质,即可获得黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01水溶液。

黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的初始获得用发掘方法:

用于发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子AFT-YJFZ01的方法如下:

(1)取黄曲霉强产毒力菌株,培养获得菌株培养物和胞外分泌蛋白质混合物;然后将菌株培养物细胞破碎,获得胞内蛋白质混合物;将上述胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物合并,加入碳二亚胺偶联获得黄曲霉抗原;

(2)将上述黄曲霉抗原免疫试验动物,获得纳米抗体库或单克隆抗体库;

(3)获得不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质合并溶液,利用步骤(2)获得的抗体库中的抗体,检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质,获得系列检测信号;

(4)找出检测信号与上述黄曲霉菌株产毒力呈现正相关的纳米抗体,即黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体,与黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体对应的蛋白质即发掘出的黄曲霉菌株产毒力指示分子。

上述方案中,步骤(1)的黄曲霉强产毒力菌株是通过常规方法从自然界分离、鉴定,或者通过人工改造获得,其产毒力经NY/T 2311—2013标准方法鉴定结果不小于10μg/kg。

步骤(3)中所述的不同产毒力的黄曲霉菌株不少3株,其产毒力经NY/T 2311—2013 标准方法鉴定结果呈现为高、中、低至少3个层次。

所述的黄曲霉强产毒力菌株培养中采用的培养基为察氏培养基或者其他可供黄曲霉正常生长的营养物,培养时间不少于12h,培养的环境温度为15~35℃。

所述的菌株培养物细胞破碎是通过常规液氮研磨或者细胞破碎仪等方法。

所述的碳二亚胺的用量为每1.0mL合并的胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物中,加入碳二亚胺量为0.005~0.1g。

所述的偶联反应指在15~37℃反应2~6h,在4~10℃反应过夜。

所述的免疫是常规免疫方式,接种黄曲霉抗原。所述的试验动物是指小白鼠或者羊驼或者其他具有相似效果的试验动物。

按上述方案,所述的抗体制备流程是指常规的纳米抗体制备技术流程或者常规的基于细胞融合的杂交瘤单克隆抗体制备技术流程。

按上述方案,所述的检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质是指采用常规的WesternBlot技术流程,即将不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质移至硝酸纤维素膜上,再利用上述抗体库中抗体,经直接方法或者间接方法检测,或者采用具有类似功效的其他技术流程。

按上述方案,上述直接方法是指将上述抗体库中抗体通过常规方法与信号材料偶联,再与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应。

按上述方案,上述间接方法是指将上述抗体库中抗体先与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应,然后再利用第二抗体与信号材料偶联物与上述结合到硝酸纤维素膜上的抗体发生免疫结合反应。

上述检测中信号材料是辣根过氧化物酶或者是胶体金或者是荧光材料或者是具有类似功效的其他材料。检测信号是显色反应信号或者是斑点信号或者是荧光信号。

实施例2黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体制备

利用AFT-YJFZ01作为免疫抗原,采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠,再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得。

将上述制备获得的AFT-YJFZ01溶解在常规PBS缓冲液或者生理盐水中至浓度不低于 0.1mg/mL,再和弗氏完全佐剂等体积混合乳化,通过背部皮下或皮内多点注射方式免疫羊驼,之后每隔2-4周加强免疫1次,加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果,至羊驼血清效价不再上升后,随后对免疫羊驼的静脉取血、提取总RNA、合成cDNA、VHH基因的扩增、VHH基因片段的回收、VHH基因与双酶切处理的pCANTAB 5E(his)载体的连接、连接产物电转化、构建纳米抗体基因库以及纳米抗体基因库的拯救等操作按照专利文献CN103866401A的方法完成,最终获得拯救后的纳米抗体基因库。

将上述制备获得的AFT-YJFZ01按8μg/孔、2μg/孔、0.5μg/孔、0.1μg/孔的梯度固定在96孔酶标板等固相载体上,按照专利文献CN103866401A的方法对上述拯救后的纳米抗体基因库进行2-4次淘选,再用AFT-YJFZ01和间接非竞争ELISA鉴定每一噬菌体克隆产生的抗体,阳性结果对应的噬菌体为噬菌体阳性克隆,再将此阳性克隆通过纳米抗体制备的常规方式制备出纳米抗体,即为AFT-YJFZ01的纳米抗体,用于进一步应用研究工作,优选经ELISA方法表征,具有特异性强、亲和力高的纳米抗体。

实施例3黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的单克隆抗体制备

利用AFT-YJFZ01作为免疫抗原,采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠,再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得。

将上述制备获得的AFT-YJFZ01溶解在常规PBS缓冲液或者生理盐水中至浓度不低于 0.1mg/mL,再和弗氏完全佐剂等体积混合乳化,通过背部皮下或皮内多点注射方式BALB/c 鼠,之后每隔2-4周加强免疫1次,加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果,至BALB/c鼠血清效价不再上升后,随后分离免疫小鼠脾细胞、脾细胞与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0融合、半固体培养基对杂交瘤细胞的选择性培养操作参考专利文献CN103849604A的方法完成,待半固体培养基上长出针尖白色斑点后,将白色斑点分别挑取到内置杂交瘤常规培养基的96孔培养板,从而获得单克隆杂交瘤资源库。

参考专利文献CN103849604A的方法获取上述单克隆杂交瘤培养上清即单克隆抗体,将上述制备获得的AFT-YJFZ01按8μg/孔、2μg/孔、0.5μg/孔、0.1μg/孔的梯度固定在96孔酶标板等固相载体上,再用间接非竞争ELISA程序鉴定每一单克隆抗体,挑取阳性克隆,获得AFT-YJFZ01单克隆抗体,并用于进一步应用研究工作,优选经检测具有特异性强、亲和力高的特点的AFT-YJFZ01单克隆抗体。

实施例4黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的兔源多克隆抗体制备

利用AFT-YJFZ01作为免疫抗原,采用常规方式免疫新西兰大白兔等试验兔,再利用已知常规的兔多克隆抗体制备技术方案即可研制获得。

将上述制备获得的AFT-YJFZ01直接用作抗原,以浓度不低于0.1mg/mL的溶液与弗氏完全佐剂等体积混合乳化,通过背部皮下或皮内多点注射方式新西兰大白兔,之后每隔2-4 周加强免疫1次,加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果,至免疫动物血清效价不再上升后,通过常规方法制备获得免疫动物的血清,即为黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的兔源多克隆抗体。

实施例5黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的免疫快速检测方法建立

AFT-YJFZ01的免疫快速检测方法即双抗夹心间接非竞争ELISA方法的基本操作程序:酶标板中包被AFT-YJFZ01的纳米抗体,洗板;加入封闭液封闭,洗板;加入AFT-YJFZ01或待测液反应,洗板;加入AFT-YJFZ01兔源多克隆抗体反应,洗板;加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体反应,洗板;加入显色液反应;加入终止液,酶标仪读取并计算结果。以下工作均采用该基本程序完成。

抗体最佳浓度的确定:采用设计棋盘滴定法同时进行多个平行实验,采用不同浓度的上述纳米抗体包被,另外将上述兔源多克隆抗体设置为不同浓度,最终根据结果确定纳米抗体和兔源多克隆抗体的最佳工作浓度,即在节省抗体用量的原则下选择OD450nm值近似1.0 的点所对应的上述两种抗体浓度,ELISA结果研究表明,虽然上述纳米抗体和兔源多克隆抗体的其他浓度也可以实现检测,但是上述纳米抗体的最佳包被浓度为2.0μg/mL,上述兔源多克隆抗体的最佳浓度为3.0μg/mL。

最佳抗体包被条件的确定:包被是ELISA方法研究的第一步,包被效果的好坏对ELISA的结果有着非常关键的影响。为确定不同包被条件对检测结果的影响,选择了4℃包被过夜、37℃恒温包被2h、37℃恒温包被1h三种不同的条件包被在孔内,检测结果表明,研究的三种包被方式均可以实现包被,4℃下包被过夜为最佳包被条件。

最佳封闭剂的确定:抗体完成包被以后,为了避免酶标板孔未被占用的位点对ELISA 后续的步骤造成干扰,需要利用一些惰性蛋白即封闭剂来占用这些位点,而不适当的封闭剂会与二抗非特异性结合,造成假阳性的情况。本研究采用3%BSA/PBST、3%脱脂奶粉 /PBST、5%脱脂奶粉/PBST三种不同的封闭剂进行封闭,研究结果表明,虽然三种封闭剂均可不同程度的达到封闭的目的,5%脱脂奶粉/PBST的封闭效果最佳,为最佳封闭剂。

封闭时间的确定:研究分别设置37℃恒温封闭1h、2h、3h三种不同的封闭时长进行封闭,检测的结果表明37℃、封闭2h的设置下阳性孔OD450nm值/阴性孔OD450nm值的数值最大,阳性样品OD450nm值>1,因此37℃恒温封闭2h为最佳封闭时间。

上述兔源多克隆抗体反应时间的确定:研究分别采用37℃恒温反应30min、50min、1h 三个反应时长进行反应,检测结果表明:37℃恒温下反应50min为上述兔源多克隆抗体的最佳反应时间。

黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的ELISA标准曲线绘制:将AFT-YJFZ01分子分别稀释至0.00003、0.0003、0.003、0.03、0.3、3、30、300ng/mL,每孔200 μL入孔,采用上述最佳条件绘制AFT-YJFZ01的ELISA标准曲线,结果见图1。在上述最佳优化条件下建立的双抗夹心酶联免疫吸附分析方法的相关系数达0.9980,对AFT-YJFZ01 分子检测限可达到0.1ng/mL,表明该检测方法具有良好的检测灵敏度和准确度。

方法特异性评价:为评价黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的上述免疫检测方法的特异性,研究选取几株与黄曲霉菌具有一定同源性的真菌尖孢镰刀菌、黑曲霉、赭曲霉菌、串珠镰刀菌等,通过对这些真菌培养物的细胞破碎液进行检测,结果见表1,上述方法对与黄曲霉菌有同源性的真菌的蛋白质均无明显的交叉反应,表明建立的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01免疫快速检测方法具有良好的特异性。

表1.黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测方法特异性测定结果

方法重复性评价:为评价上述建立的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01免疫快速检测方法的重复性,随机取4株黄曲霉毒素的产毒菌株——阳性1、阳性2、阳性3、阳性4和1株黄曲霉毒素的不产毒菌株——阴性5研究,对测定结果的板内、板间的数据变异进行分析。上述研究结果见表2、3,经计算板内变异系数为0.5%-3.5%,板间的变异系数为0.9%-5.7%,均在7%以下,因此,上述方法具有良好的重复性。

表2.产毒力指示分子AFT-YJFZ01免疫快速检测方法板内重复性测定结果

表3产毒力指示分子AFT-YJFZ01免疫快速检测方法板间重复性测定结果

方法准确度评价:为了评价上述方法的检测准确度,同时也是为了考察方法的实用性,选择花生和玉米样品为例进行研究评价,在玉米和花生样品中添加黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01,检测结果的回收率越接近100%,说明方法越准确、越实用。该研究结果见表4,结果表明,上述建立的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测方法用于检测花生和玉米中产毒力指示分子AFT-YJFZ01,其回收率达到了82.5%-109.5%,说明该方法准确度高,可以应用到实际样品检测中去,具有良好的实用性。

表4.黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测方法添加回收试验结果

实施例6黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01免疫快速检测试剂盒的组成与保质期

黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01免疫快速检测试剂盒主要由孔底包被有黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板、黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的兔源多克隆抗体、起标准物质作用的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01纯品溶液、察氏培养基、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体、ELISA显色液与终止液、样品稀释液共同组成。

上述孔底包被有黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板的制备方法:将上述AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体溶解在ELISA包被缓冲液碳酸盐溶液中,形成2μg/mL的包被液,再以100-200μL/孔加入至96孔酶标板中,4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后,去除上述酶标板中包被液,再用ELISA常规洗液洗涤酶标板;然后每孔加200-300μL的ELISA常规封闭液,放置室温或37℃封闭不少于 1h后,再弃去封闭液,再用ELISA常规洗液洗涤酶标板,即可获得孔底包被有黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板。

如上所述的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体可通过实例2和实施例3的方式制备获得。

所述的ELISA包被缓冲液是指常规碳酸盐缓冲液,配制方法为:称取NaHCO31.465g、 Na2CO3 0.795g,加入去离子水定容至500mL即可。

所述的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的兔源多克隆抗体可通过实施例 4的方式制备获得。

所述的察氏培养基为常规察氏培养基,可以自配,也可以直接购买商品获得。

所述的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体可以直接购买商品获得。

所述的ELISA显色液是指ELISA常规的双氧水与TMB显色液。

所述的终止液是指ELISA常规的显色终止液2mol/L硫酸水溶液,配制方法为:取44mL浓硫酸加入到300mL去离子水中,搅拌到冷却,最后定容至400mL即可。

所述的样品稀释液是指含有0.1%山梨醇和糖的0.01mol/L磷酸盐缓冲液,配制方法为:山梨醇与糖各0.5g、NaCL 4.0g、Na2HPO4·12H2O 1.45g、KCL 0.1g、KH2PO4 0.1g,加入去离子水定容至500mL。

上述试剂盒的保质期研究结果表明,4℃至少可以保存6个月以上。

实施例7黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01免疫快速检测试剂盒用于鉴别比较黄曲霉毒素的菌株产毒力

第一步,待鉴别菌株的待测液的制备:按菌株产毒力强弱,选取公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》——中国农业科学院硕士学位论文,作者张杏,第33页——公布的产毒菌株HBZHX-21、HBXY-36、HBHA-1-4、GDZJ-6、HeNZY-2、 HuBha-24、JSnt-1、HuNdx-7、GDZJ-108-19、HBHA-8-17等10株,待鉴别菌株在上述试剂盒中的察氏培养基培养,培养的环境温度为15~35℃,培养时间不少于12h后,取培养基与培养物的混合体充分匀浆,再用上述试剂盒的样品稀释液稀释1-10倍,获得待鉴别菌株的待测液。

第二步,上述待鉴别菌株待测液的测定:上述待测液以每孔100-200μL加入到上述试剂盒的酶标板孔中,或者每孔加入上述试剂盒中系列浓度的本发明产毒力指示分子AFT-YJFZ01的溶液100-200μL,放置室温或37℃反应不少于1h后,弃去反应后液体,洗涤酶标板,然后加入上述试剂盒中AFT-YJFZ01兔源多克隆抗体,再每孔加入100-200μL,放置室温或37℃反应不少于1h后,弃去液体,再液洗涤酶标板,然后每孔加入上述试剂盒中的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体100-200μL,放置室温或37℃反应不少于1h后,弃去液体,再洗涤酶标板,然后先后加入上述试剂盒中的ELISA显色液、终止液,最后通过酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZ01的浓度。

根据上述文献结果,HBZHX-21、HBXY-36、HBHA-1-4、GDZJ-6、HeNZY-2、HuBha- 24、JSnt-1、HuNdx-7、GDZJ-108-19、HBHA-8-17等10株菌株的产毒力依次为:0μg/L、 0μg/L、3.8μg/L、4.9μg/L、67.2μg/L、81.7μg/L、192.0μg/L、204.4μg/L、297.4μg/L、 1027.5μg/L,表明HBZHX-21和HBXY-36为不产毒菌株,HBHA-1-4和GDZJ-6等为弱产毒力菌株,HBHA-8-17和GDZJ-108-19等为强产毒菌株。

第三步,鉴别结果评判:待鉴别菌株中黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01 含量越高,则说明鉴别菌株产黄曲霉毒素能力即产毒力越强。按上述试剂盒及其应用技术方案,测定HBZHX-21、HBXY-36、HBHA-1-4、GDZJ-6、HeNZY-2、HuBha-24、JSnt-1、HuNdx-7、GDZJ-108-19、HBHA-8-17等10株菌的AFT-YJFZ01浓度结果依次为:0ng/mL、 0ng/mL、8ng/mL、12ng/mL、49ng/mL、51ng/mL、104ng/mL、115ng/mL、175ng/mL、 536ng/mL,结果同样表明:HBZHX-21和HBXY-36为不产毒菌株,HBHA-1-4和GDZJ-6 等为弱产毒力菌株,HBHA-8-17和GDZJ-108-19等为强产毒力菌株。该测定结果与上述公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》公布的菌株产毒力强弱次序一致,且强产毒力菌株与弱产毒力菌株鉴定结果与文献一致,证明本发明提供的试剂盒及其应用技术方案可以用于鉴别黄曲霉毒素的菌株产毒力,方法简便、易操作,实用性强。

实施例8利用黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01免疫快速检测试剂盒鉴别农田中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株

第一步,待鉴别样品的待测液的制备:选取吉林、辽宁、江西、福建等花生花期根际土壤样品共4份,依次命名为土样-1、土样-2、土样-3、土样-4。依次称量待测的农田土壤样品,粉碎均匀后转移上述试剂盒的样品稀释液中,浓度0.5g/mL,室温震荡至均匀,制成待测样品均匀分散液。取50μL该待测样品均匀分散液,加到30mL的上述试剂盒的察氏培养基中,置于28℃下200rpm震荡培养,培养24h后取样,形成待鉴别样品的待测液。

第二步,上述待鉴别样品待测液的测定:上述待测液以每孔100-200μL加入到上述试剂盒中的酶标板孔中,或者每孔加入上述试剂盒中系列浓度的本发明产毒力指示分子AFT- YJFZ01的溶液100-200μL,放置室温或37℃反应不少于1h后,弃去反应后液体,洗涤酶标板,然后加入上述试剂盒中AFT-YJFZ01兔源多克隆抗体,再每孔加入100-200μL,放置室温或37℃反应不少于1h后,弃去液体,再液洗涤酶标板,然后每孔加入上述试剂盒中的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体100-200μL,放置室温或37℃反应不少于1h后,弃去液体,再洗涤酶标板,然后先后加入上述试剂盒中的ELISA显色液、终止液,最后通过酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZ01的浓度。

第三步,鉴别结果评判:如果待鉴别样品中黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT- YJFZ01浓度高,则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。按上述试剂盒及其应用技术方案,测定土样-1、土样-2、土样-3、土样-4中AFT-YJFZ01浓度结果依次为:0.3 ng/mL、0.2ng/mL、16ng/mL、19ng/mL。该结果表明,土样-1和土样-2中每毫升培养液中含有AFT-YJFZ01的量均在1.0ng以下,不含黄曲霉毒素的强产毒力菌株,其相应农田中花生产后污染风险很低;土样-1和土样-2中每毫升培养液中含有AFT-YJFZ01的量均在10 ng/mL以上,含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株,其相应农田中花生产后污染风险较高。

实施例9利用黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01免疫快速检测试剂盒鉴别农产品中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株

第一步,待鉴别样品的待测液的制备:选取花生、玉米、大米、小麦等农产品样品共4 份,依次称量待测的农田土壤样品,粉碎后转移至上述试剂盒的样品稀释液,浓度0.5g/mL,,室温震荡至均匀,制成待测样品均匀分散液。取100μL该待测样品均匀分散液,加在含50mL的上述试剂盒的察氏培养基中,置于28℃下200rpm震荡培养,培养6h后取样,形成待鉴别样品的待测液。

第二步,上述待鉴别样品待测液的测定:上述待测液以每孔100-200μL加入到上述试剂盒中的酶标板孔中,或者每孔加入上述试剂盒中系列浓度的本发明产毒力指示分子AFT- YJFZ01的溶液100-200μL,放置室温或37℃反应不少于1h后,弃去反应后液体,洗涤酶标板,然后加入上述试剂盒中AFT-YJFZ01兔源多克隆抗体,再每孔加入100-200μL,放置室温或37℃反应不少于1h后,弃去液体,再液洗涤酶标板,然后每孔加入上述试剂盒中的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体100-200μL,放置室温或37℃反应不少于1h后,弃去液体,再洗涤酶标板,然后先后加入上述试剂盒中的ELISA显色液、终止液,最后通过酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZ01的浓度。

第三步,鉴别结果评判:如果待鉴别样品中黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT- YJFZ01浓度高,则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。按上述试剂盒及其应用技术方案,测定的花生、玉米、大米、小麦样品中AFT-YJFZ01浓度结果依次为:12ng/mL、13ng/mL、0.7ng/mL、0ng/mL。该结果表明,花生和玉米样品中每毫升培养液中含有AFT-YJFZ01的量均在10ng以上,其含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株,污染风险较高;大米样品中每毫升培养液中含有AFT-YJFZ01的量在1.0以下,不含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株,污染风险很低;测定的小麦样品中每毫升培养液中含有AFT-YJFZ01的量为0,不含有黄曲霉毒素产毒菌株,基本无黄曲霉毒素污染风险。

实施例10利用黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01免疫快速检测试剂盒鉴别农产品中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株

第一步,待鉴别样品的待测液的制备:选取人参、当归、枸杞等中药材样品共3份,依次称量待测的中药材样品,粉碎后转移至上述试剂盒的样品稀释液,浓度0.5g/mL,室温震荡至均匀,制成待测样品均匀分散液。取50μL该待测样品均匀分散液,加在含30mL的上述试剂盒的察氏培养基中,置于28℃下200rpm震荡培养,培养6h后取样,形成待鉴别样品的待测液。

第二步,上述待鉴别样品待测液的测定:上述待测液以每孔100-200μL加入到上述试剂盒中的酶标板孔中,或者每孔加入上述试剂盒中系列浓度的本发明产毒力指示分子AFT- YJFZ01的溶液100-200μL,放置室温或37℃反应不少于1h后,弃去反应后液体,洗涤酶标板,然后加入上述试剂盒中AFT-YJFZ01兔源多克隆抗体,再每孔加入100-200μL,放置室温或37℃反应不少于1h后,弃去液体,再液洗涤酶标板,然后每孔加入上述试剂盒中的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体100-200μL,放置室温或37℃反应不少于1h后,弃去液体,再洗涤酶标板,然后先后加入上述试剂盒中的ELISA显色液、终止液,最后通过酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZ01的浓度。

第三步,鉴别结果评判:如果待鉴别样品中黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT- YJFZ01浓度高,则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。按上述试剂盒及其应用技术方案,测定的人参、当归、枸杞等中药材样品中AFT-YJFZ01浓度结果依次为:0.3ng/mL、0ng/mL、0ng/mL。该结果表明,测定的人参样品中AFT-YJFZ01浓度均在1.0 以下,不含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株,污染风险很低;测定的当归、枸杞样品中AFT- YJFZ01浓度为0,不含有黄曲霉毒素产毒菌株,基本无黄曲霉毒素污染风险。

实施例11利用黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01免疫快速检测试剂盒鉴别饲料中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株

第一步,待鉴别样品的待测液的制备:从市场上选取待测饲料样品共4份,依次命名为饲料-1、饲料-2、饲料-3、饲料-4。依次称量待测的农田土壤样品,粉碎后转移至上述试剂盒的样品稀释液中,浓度0.5g/mL,室温震荡至均匀,制成待测样品均匀分散液。取100μL该待测样品均匀分散液,加在含200mL的上述试剂盒的察氏培养基中,置于28℃下 200rpm震荡培养,培养24h后取样,形成待鉴别样品的待测液。

第二步,上述待鉴别样品待测液的测定:上述待测液以每孔100-200μL加入到上述试剂盒中的酶标板孔中,或者每孔加入上述试剂盒中系列浓度的本发明产毒力指示分子AFT- YJFZ01的溶液100-200μL,放置室温或37℃反应不少于1h后,弃去反应后液体,洗涤酶标板,然后加入上述试剂盒中AFT-YJFZ01兔源多克隆抗体,再每孔加入100-200μL,放置室温或37℃反应不少于1h后,弃去液体,再液洗涤酶标板,然后每孔加入上述试剂盒中的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体100-200μL,放置室温或37℃反应不少于1h后,弃去液体,再洗涤酶标板,然后先后加入上述试剂盒中的ELISA显色液、终止液,最后通过酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZ01的浓度。

第三步,鉴别结果评判:如果待鉴别样品中黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT- YJFZ01浓度高,则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。按上述试剂盒及其应用技术方案,测定饲料-1、饲料-2、饲料-3、饲料-4中AFT-YJFZ01浓度结果依次为:0.6 ng/mL、22ng/mL、13ng/mL、69ng/mL。该结果表明,饲料-1样品中每毫升培养液中含有AFT-YJFZ01的量在1.0ng/mL以下,不含黄曲霉毒素的强产毒力菌株,其污染风险很低;以50μL样品均匀分散液加在含30mL培养基中为例,饲料-2、饲料-3、饲料-4中每毫升培养液中含有AFT-YJFZ01的量均在10ng/mL以上,含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株,其相应农田中花生产后污染风险较高。

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测试剂盒及应用

<160> 1

<210> 1

<211> 33172

<212> PRT

<213> 黄曲霉

<400> 1

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VTSGFVDGIK DGLRSVTSGF VDGIKDGLRS VTSGFVDGIK DGLRSVTSGF VDGIKDGLRS 3780

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DIATGKVSIA KDYACPWNGG EEVSLKDYAC PWNGGEEVSL KVEYSDAAKE GDPEMYGNNE 4200

TVNKVCAKAN NYCSNQVEGP YSLYSGREPG ICETTPGVKE QTASVVNGTA VIKGFSATGD 4260

YPRGGPGSSS MIGLMQENGP CRGYLEDIAY VLDSGIKGYY DISHFDPDIG LMQENGPCRL 4320

AAEGDPEMYG NNETVNKNAP LSIWMNGGPG SSSMIGLMQE NGPCRNQVEG PYSLYSGRNY 4380

CSNQVEGPYS LYSGRPGGCK DQIIECRQVE GPYSLYSGRQ YGNFSFTRSN QVEGPYSLYS 4440

GRTNASYVGG LVRTVYDMAM EAWSKTVYDM AMEAWSKPGG TVYDMAMEAW SKPGGCKVAL 4500

VYGDRDYACP WNGGEEVSLK VFEAGHEVPA YQPETAYEIF VFEAGHEVPA YQPETAYEIF 4560

HRVSIWTESY GGRYCSNQVE GPYSLYSGRY GPSFTAFFQE QNEKVALVYG DRVEYSDAAK 4620

FRISYKEPGI CETTPGVKFT AFFQEQNEKS IWTESYGGRN YIVVDADSSF WFFESRISYK 4680

EPGIHDDRVS IWTESYGGRY GPSFTAFFQE QNEKVALVYG DRDYAANNYC SNQVEGPYSL 4740

YSGRANNYCS NQVEGPYSLY SGRANNYCSN QVEGPYSLYS GRANNYCSNQ VEGPYSLYSG 4800

RANNYCSNQV EGPYSLYSGR ANNYCSNQVE GPYSLYSGRA NNYCSNQVEG PYSLYSGRAN 4860

NYCSNQVEGP YSLYSGRANN YCSNQVEGPY SLYSGRANNY CSNQVEGPYS LYSGRANNYC 4920

SNQVEGPYSL YSGRANNYCS NQVEGPYSLY SGRANNYCSN QVEGPYSLYS GRANNYCSNQ 4980

VEGPYSLYSG RANNYCSNQV EGPYSLYSGR ANNYCSNQVE GPYSLYSGRA NNYCSNQVEG 5040

PYSLYSGRAN NYCSNQVEGP YSLYSGRANN YCSNQVEGPY SLYSGRDIAT GKVSIAKDYA 5100

CPWNGGEEVS LKDYACPWNG GEEVSLKGDP EMYGNNETVN KVCAKANNYC SNQVEGPYSL 5160

YSGRGGPGSS SMIGLMQENG PCRIGLMQEN GPCRIGLMQE NGPCRISYKE PGICETTPGV 5220

KISYKEPGIC ETTPGVKISY KEPGICETTP GVKISYKEPG ICETTPGVKI SYKEPGICET 5280

TPGVKISYKE PGICETTPGV KISYKEPGIC ETTPGVKNAP LSIWMNGGPG SSSMIGLMQE 5340

NGPCRNAPLS IWMNGGPGSS SMIGLMQENG PCRNAPLSIW MNGGPGSSSM IGLMQENGPC 5400

RNAPLSIWMN GGPGSSSMIG LMQENGPCRN APLSIWMNGG PGSSSMIGLM QENGPCRNAP 5460

LSIWMNGGPG SSSMIGLMQE NGPCRNAPLS IWMNGGPGSS SMIGLMQENG PCRNAPLSIW 5520

MNGGPGSSSM IGLMQENGPC RNAPLSIWMN GGPGSSSMIG LMQENGPCRN APLSIWMNGG 5580

PGSSSMIGLM QENGPCRNAP LSIWMNGGPG SSSMIGLMQE NGPCRPGGCK DQIIECRTVY 5640

DMAMEAWSKT VYDMAMEAWS KTVYDMAMEA WSKTVYDMAM EAWSKTVYDM AMEAWSKTVY 5700

DMAMEAWSKT VYDMAMEAWS KTVYDMAMEA WSKPGGTVYD MAMEAWSKPG GTVYDMAMEA 5760

WSKPGGCKTV YDMAMEAWSK PGGCKTVYDM AMEAWSKPGG CKTVYDMAME AWSKPGGCKT 5820

VYDMAMEAWS KPGGCKTVYD MAMEAWSKPG GCKTVYDMAM EAWSKPGGCK TVYDMAMEAW 5880

SKPGGCKVAL VYGDRDYACP WNGGEEVSLK VALVYGDRDY ACPWNGGEEV SLKVALVYGD 5940

RDYACPWNGG EEVSLKVALV YGDRDYACPW NGGEEVSLKV ALVYGDRDYA CPWNGGEEVS 6000

LKVALVYGDR DYACPWNGGE EVSLKVALVY GDRDYACPWN GGEEVSLKVA LVYGDRDYAC 6060

PWNGGEEVSL KVALVYGDRD YACPWNGGEE VSLKVALVYG DRDYACPWNG GEEVSLKVFE 6120

AGHEVPAYQP ETAYEIFHRV FEAGHEVPAY QPETAYEIFH RVFEAGHEVP AYQPETAYEI 6180

FHRVFEAGHE VPAYQPETAY EIFHRVFEAG HEVPAYQPET AYEIFHRVFE AGHEVPAYQP 6240

ETAYEIFHRV FEAGHEVPAY QPETAYEIFH RVFEAGHEVP AYQPETAYEI FHRVFEAGHE 6300

VPAYQPETAY EIFHRVSIWT ESYGGRVSIW TESYGGRVSI WTESYGGRVS IWTESYGGRV 6360

SIWTESYGGR VSIWTESYGG RVSIWTESYG GRVSIWTESY GGRVSIWTES YGGRVSIWTE 6420

SYGGRVSIWT ESYGGRVSIW TESYGGRYGP SFTAFFQEQN EKYGPSFTAF FQEQNEKYGP 6480

SFTAFFQEQN EKAAWLFEDS QAKADEINQI FDAISYMKAD VPSGSTNITH GRAFPCFDEP 6540

ALKAGMIADA GALASSGYQS TSGLLSLLKA VEQSLDAIRD GHILQQFKFA AGETSAIHPN 6600

IRGFDNEAEF IVWNEIVARI VDVLLDEKIV DVLLDEKNSG ASRLNADHSA IYRLTFTGIL 6660

NDNMAGFYRN GGEKEYNVVY DRNQDIYMPL GGLRNVGFPV VTVAEDAASS SIKSSHPIEV 6720

PVKSSHPIEV PVKRTGDVRP EEDTTLYPVM LGLRTHEIGW EFSEKTKQGL DENTMLTERT 6780

LGLALSDEVK VYATPDQDIE HGRYLASTQM EPTDARYLGE DVFIQGVRQG LLTVEDRGSV 6840

FSIVLKAAQE MFQRQGLDEN TMLTERTDVE SWLKAGMIAD AGALASSGYQ STSGLLSLLK 6900

FAAGETSAIH PNIRLTFTGI LNDNMAGFYR NGGEKEYNVV YDRNGGEKEY NVVYDRNGGE 6960

KEYNVVYDRN GGEKEYNVVY DRNQDIYMPL GGLRVYATPD QDIEHGRYLA STQMEPTDAR 7020

AWYENGITNC VGDNTRCCDS GVEQLVSFSD VSDFKDADAC NGGGIEYDSP ADTPLEFKDN 7080

TCNAPIPVSF PVAPTDTKDP YMFHQANLRD QCNYSLQYTI GNKFAANGNY GSETTAAVIN 7140

NFNGRFTTSA SDGFDGMQVN PRGNGVIEAA AGKGNVAGNI LVIAKITTAD MDGISSWLPT 7200

INGKIYYNCD TPACTVQEWI DTSAGSGDFS NLLATEKKPL GTGTDLWPKL DDLFVWWTTP 7260

ANRLVDWPIV TITHQEMSAN MNAGSSYFVE VGHNMNAGSS YFVEVGHNGN GVIEAAAGKQ 7320

AWVETMVQEF VRSMWPYFTT SASDGFDGMQ VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ 7380

VNPRVIANGN VAGNILVIAK YFTSNGIIPP AITGLHNGDA LRQITGVTLS AKSASDGFDG 7440

MQVNPRDPYM FHQANSDVSD FKEAGLKGII PPAITGLHNG DALRYFTSNG IIPPAITGLH 7500

NEISFNQAWL RLVDWPIVTI THQEMSANFL DRKPLGTGTD LANGNVAGNI LVIAKHQEMS 7560

ANFLDRYNRD QCNYSLQYTI GNKAWYENGI TNCVGDNTRA WYENGITNCV GDNTRAWYEN 7620

GITNCVGDNT RAWYENGITN CVGDNTRAWY ENGITNCVGD NTRAWYENGI TNCVGDNTRA 7680

WYENGITNCV GDNTRAWYEN GITNCVGDNT RDADACNGGG IEYDSPADTP LEFKDADACN 7740

GGGIEYDSPA DTPLEFKDAD ACNGGGIEYD SPADTPLEFK DNTCNAPIPV SFPVAPTDTK 7800

DNTCNAPIPV SFPVAPTDTK DPYMFHQAND PYMFHQANLR DPYMFHQANL RDPYMFHQAN 7860

LRDPYMFHQA NLRDQCNYSL QYTIGNKEIS FNQAWLREIS FNQAWLREIS FNQAWLREIS 7920

FNQAWLREIS FNQAWLREIS FNQAWLREIS FNQAWLRFAA NGNYGSETTA AVINNFNGRF 7980

AANGNYGSET TAAVINNFNG RFAANGNYGS ETTAAVINNF NGRFAANGNY GSETTAAVIN 8040

NFNGRFAANG NYGSETTAAV INNFNGRFAA NGNYGSETTA AVINNFNGRF AANGNYGSET 8100

TAAVINNFNG RFAANGNYGS ETTAAVINNF NGRFAANGNY GSETTAAVIN NFNGRITTAD 8160

MDGISSWLPT INGKITTADM DGISSWLPTI NGKITTADMD GISSWLPTIN GKITTADMDG 8220

ISSWLPTING KITTADMDGI SSWLPTINGK KPLGTGTDLW PKKPLGTGTD LWPKKPLGTG 8280

TDLWPKKPLG TGTDLWPKKP LGTGTDLWPK KPLGTGTDLW PKKPLGTGTD LWPKKPLGTG 8340

TDLWPKKPLG TGTDLWPKKP LGTGTDLWPK KPLGTGTDLW PKKPLGTGTD LWPKLDDLFV 8400

WWTTPANRLD DLFVWWTTPA NRLDDLFVWW TTPANRLDDL FVWWTTPANR LVDWPIVTIT 8460

HQEMSANLVD WPIVTITHQE MSANFLDRLV DWPIVTITHQ EMSANFLDRM NAGSSYFVEV 8520

GHNGNGVIEA AAGKMNAGSS YFVEVGHNGN GVIEAAAGKM NAGSSYFVEV GHNGNGVIEA 8580

AAGKMNAGSS YFVEVGHNGN GVIEAAAGKM NAGSSYFVEV GHNGNGVIEA AAGKMNAGSS 8640

YFVEVGHNGN GVIEAAAGKM NAGSSYFVEV GHNGNGVIEA AAGKMNAGSS YFVEVGHNGN 8700

GVIEAAAGKM NAGSSYFVEV GHNGNGVIEA AAGKTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ 8760

VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ 8820

VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ 8880

VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ 8940

VNPRVIANGN VAGNILVIAK VIANGNVAGN ILVIAKYFTS NGIIPPAITG LHNGDALRAS 9000

HTVDKNGIWS SEVKATDNYI ANAAAAVAKD LLQDIVTWDD KEAGIYLIAR GPLNEGGLYA 9060

ERGTNYVALS LWALESDGAK HTDYSSQEST SYKLGSFELS YTTPVLTGYG NVESPEQPKL 9120

SGQDASAITW KLTGNLGGED YQDKLTGNLG GEDYQDKVRN SAYNYWVPEL PTEGTSPGFS 9180

TSKPGIGFYT AQFDLDLPKQ GFHQPQPPSE SWESGSPLEG LSKSPGSFFV VRSSYDDSAW 9240

VSADLPKTSY DYGSPITETR YPDADYMQYV MDQARNGIWS SEVKVLVLYG GPKASPSYLT 9300

ATPRYLDTLP EIKTLHLEQS PSTPYAQLYV NGYQYGKKAD IVVPFPWGGP GFEKAQLYVN 9360

GYQYGKAQLY VNGYQYGKAT DNYIANAAAA VAKLSGQDAS AITWKLTGNL GGEDYQDKVR 9420

NGIWSSEVKQ GFHQPQPPSE SWESGSPLEG LSKSSYDDSA WVSADLPKYP DADYMQYVMD 9480

QARYPDADYM QYVMDQARAL TNGAGAIKEA IADVLEHLGE NDEDIAVYAP NPFYKGFAPL 9540

EYLGSNFENG ELPKGFDNAG FVMGTSSSLF NQFILRGKMP MPILVADGRH FQLINTAAYW 9600

KIPNVAIAVS GGGYRLNGTD IPNFLKLNLS SFDASGYIDR LPDICNTCFK MPMPILVADG 9660

RNSILEGPDV KSAAALSTSE KDWLQVRSSS LFNQFILRTF LNLGLNKTNT KLPDICNTCF 9720

KTSLTDYWGR SSFDASGYID RSTSEKDWLQ VRGTDIPNFL KLNLGLNKGF DNAGFVMGTS 9780

SSLFNQFEYL GSNFENGELP KMPILVADGR DLYDAVKINT AAYWKSIALG DDFKKALTNG 9840

AGAIKALTNG AGAIKALTNG AGAIKALTNG AGAIKGKMPM PILVADGRGK MPMPILVADG 9900

RGKMPMPILV ADGRGKMPMP ILVADGRGKM PMPILVADGR GKMPMPILVA DGRHFQLINT 9960

AAYWKHFQLI NTAAYWKLPD ICNTCFKLPD ICNTCFKMPI LVADGRMPMP ILVADGRMPM 10020

PILVADGRMP MPILVADGRM PMPILVADGR MPMPILVADG RMPMPILVAD GRMPMPILVA 10080

DGRMPMPILV ADGRMPMPIL VADGRNSILE GPDVKNSILE GPDVKNSILE GPDVKSAAAL 10140

STSEKDWLQV RSAAALSTSE KDWLQVRSAA ALSTSEKDWL QVRSAAALST SEKDWLQVRS 10200

AAALSTSEKD WLQVRSAAAL STSEKDWLQV RSAAALSTSE KDWLQVRSAA ALSTSEKDWL 10260

QVRSAAALST SEKDWLQVRS AAALSTSEKD WLQVRSAAAL STSEKDWLQV RSAAALSTSE 10320

KDWLQVRSAA ALSTSEKDWL QVRSAAALST SEKDWLQVRS AAALSTSEKD WLQVRSAAAL 10380

STSEKDWLQV RSAAALSTSE KDWLQVRSAA ALSTSEKDWL QVRSAAALST SEKDWLQVRS 10440

AAALSTSEKD WLQVRSAAAL STSEKDWLQV RSAAALSTSE KDWLQVRSAA ALSTSEKDWL 10500

QVRSAAALST SEKDWLQVRS AAALSTSEKD WLQVRSAAAL STSEKDWLQV RTNTKLPDIC 10560

NTCFKTNTKL PDICNTCFKT NTKLPDICNT CFKAASLPAS FSGFKALVSH DGTFVADAKE 10620

NSLVWHQQVL GWLNKFNAVF SGTLKGDAGS PVFSPDSKGD AGSPVFSPDS KKIAYWQMAD 10680

ESYEADHRIQ AFVIYPENFD KLFSIPADAG DDYKPKLNPE GLISAPRLPV SEGLSLFNIL 10740

QERMINWIQG SDLGRNAESP YPPFGGASDY DLSPDGKRSE AIPNPSGDVA VFSQSQYSFK 10800

SEAIPNPSGD VAVFSQSQYS FKTAVPINGP DSPGTPEGVK TAVPINGPDS PGTPEGVKGD 10860

AGSPVFSPDS KTLATANKID PELKTLYVYT VGSEETIPSL AADWDRTTSQ WNVLDLKVVT 10920

TDSGDVRWIQ GSDLGRALVS HDGTFVADAK ALVSHDGTFV ADAKGDAGSP VFSPDSKKIA 10980

YWQMADESYE ADHRIAYWQM ADESYEADHR IAYWQMADES YEADHRLFSI PADAGDDYKP 11040

KLFSIPADAG DDYKPKLNPE GLISAPRRSE AIPNPSGDVA VFSQSQYSFK RSEAIPNPSG 11100

DVAVFSQSQY SFKTAVPING PDSPGTPEGV KTAVPINGPD SPGTPEGVKT AVPINGPDSP 11160

GTPEGVKGDA GSPVFSPDSK TTSQWNVLDL KTTSQWNVLD LKAASNFDGD TLVLGYDSGN 11220

GNPETSFMTL MRAGSTIAVT DVQITGGAVG IKASGTCSGP IQSAPTSYWL ADQDHSGDAR 11280

DAGSPKPVVQ IGHEGDVGVA EIQNMRFSVA EILPGAKGDG STDDSASLNA ILANNAANCK 11340

GTCSGPIQSA PTSYWLADQD HSGDARIVGE AWAVITGAGD AFKNSQILIQ NLSHDNSNAI 11400

AVDSKNSQIL IQNLSHDNSN AIAVDSKDNI KNVVLDTTAL SANTKSAPTS YWLADQDHSG 11460

DARVGTIITG DPLDPPVLKV TNSPSNLVWY SISTRYPAEV FLPGGTYQLG KSLGSLVLLD 11520

SSSINSGPVV RDTLVIPPGS RAQPTYAEYS NDQIVNVKSG TCSGPIQSAP TSYWLADQDH 11580

SGDARAGSTI AVTDVQITGG AVGIKAQPTY AEYSNDQIVN VKAQPTYAEY SNDQIVNVKD 11640

AGSPKPVVQI GHEGDVGVAE IQNMRFSVAE ILPGAKNSQI LIQNLSHDNS NAIAVDSKNS 11700

QILIQNLSHD NSNAIAVDSK NSQILIQNLS HDNSNAIAVD SKNSQILIQN LSHDNSNAIA 11760

VDSKDNIKNS QILIQNLSHD NSNAIAVDSK DNIKNSQILI QNLSHDNSNA IAVDSKDNIK 11820

NVVLDTTALS ANTKSAPTSY WLADQDHSGD ARVTNSPSNL VWYSISTRVT NSPSNLVWYS 11880

ISTRAGALLL GKAGVIPESL HQDTVGTFGK DRLETTAGSW ALLGSVVPRG IMDETYYQAL 11940

EFCQRGKTPE GGYAQFLTNK GPLHGIPFIV KIHQTQPYLN AILQVNPDAF KLETTAGSWA 12000

LLGSVVPRNS VVGIKPTVGL TSRTIVSPDG FNWDYGSTRT PEGGYAQFLT NKTTREEGID 12060

AALKVDFYNN LKDYLSEVEN TKAALSEWAD MRALGTETDG SVINPAQREE GIDAALKDAV 12120

YALDAIYGID ARAALSEWAD MRAALSEWAD MRAGVIPESL HQDTVGTFGK AGVIPESLHQ 12180

DTVGTFGKAG VIPESLHQDT VGTFGKAGVI PESLHQDTVG TFGKGIMDET YYQALEFCQR 12240

IHQTQPYLNA ILQVNPDAFK NSVVGIKPTV GLTSRNSVVG IKPTVGLTSR NSVVGIKPTV 12300

GLTSRTIVSP DGFNWDYGST RTTREEGIDA ALKAVWPGDM GVAVPAAFVS TGDLESVKAY 12360

QGYFHSNDDL LNRDGSASYV MPDKDRAVWP GDMGVAVPAA FVSTGDLESV KDSAFPGLWE 12420

ENIYAPSSRG GSGALGLAFS EAKGVYYVDD TATITVSGGG SHRIWYSGAY TLQTNAVPVN 12480

TGRNALQTMY DTQDKNALQT MYDTQDKTTG AFDESGPPLS QKSPDGYTLQ FSVPPGTKSS 12540

EKPSITIDGN NINKTTGAFD ESGPPLSQKI APQFGDLKAL ELIRRFQASW DKSPDGYTLQ 12600

FSVPPGTKIS SFEIQGHFKA VWPGDMGVAV PAAFVSTGDL ESVKAYQGYF HSNDDLLNRA 12660

YQGYFHSNDD LLNRAYQGYF HSNDDLLNRA YQGYFHSNDD LLNRDGSASY VMPDKDGSAS 12720

YVMPDKDRAV WPGDMGVAVP AAFVSTGDLE SVKGVYYVDD TATITVSGGG SHRGVYYVDD 12780

TATITVSGGG SHRISSFEIQ GHFKNALQTM YDTQDKNALQ TMYDTQDKNA LQTMYDTQDK 12840

NALQTMYDTQ DKTTGAFDES GPPLSQKNAL QTMYDTQDKT TGAFDESGPP LSQKNALQTM 12900

YDTQDKTTGA FDESGPPLSQ KNALQTMYDT QDKTTGAFDE SGPPLSQKSP DGYTLQFSVP 12960

PGTKSPDGYT LQFSVPPGTK SSEKPSITID GNNINKSSEK PSITIDGNNI NKSSEKPSIT 13020

IDGNNINKTT GAFDESGPPL SQKDNILPEN LDDGLPSQFV YEKFGPHEYN GDQYTSIIRL 13080

VIDLSGNGGG YILQGYDTFR NVGLVSVSLD GKPSSDPMQG IGGIKQLFPS IVQDGYTRSD 13140

KYAGEYEFQA DLFKSFEPST PAEFQAVLEK YAGEYEFQAD LFKPFAASTP GFDGYFSGSA 13200

RAASTPGFDG YFSGSARYDL NLENKAFNLA HDGHFRHFTS LEEKFFPDLL TKSIAIGGRP 13260

SSDPMQGIGG IKFGPHEYNG DQYTSIIRFG PHEYNGDQYT SIIRQLFPSI VQDGYTRQLF 13320

PSIVQDGYTR QLFPSIVQDG YTRSDKYAGE YEFQADLFKE PGAEGVCETT PGVKFANQMP 13380

NGCQDLISTC KGCQDLISTC KQLPKNPTGV KSAGYTPLKV NGVEYGETRS YSGYVDTSPE 13440

SHTFTALADY ALCAEATNMC RTIFGWDIAE GQKTIFGWDI AEGQKKVYEA GHEVPYYQPI 13500

ASLYKEPGAE GVCETTPGVK LSGLPSLDSR SYSGYVDTSP ESHTFFHNPE TAPITLWLNK 13560

IWPSYKVYEA GHEVPYYQPI ASVNGVEYGE TRTALADYAL CAEATNMCAE GVCETTPGVK 13620

FANQMPNGCQ DLISTCKFAN QMPNGCQDLI STCKFANQMP NGCQDLISTC KFANQMPNGC 13680

QDLISTCKFA NQMPNGCQDL ISTCKFANQM PNGCQDLIST CKKIWPSYKK IWPSYKSAGY 13740

TPLKVNGVEY GETRSAGYTP LKVNGVEYGE TRSAGYTPLK VNGVEYGETR SAGYTPLKVN 13800

GVEYGETRSA GYTPLKVNGV EYGETRSAGY TPLKVNGVEY GETRSAGYTP LKVNGVEYGE 13860

TRSAGYTPLK VNGVEYGETR SAGYTPLKVN GVEYGETRSA GYTPLKVNGV EYGETRSAGY 13920

TPLKVNGVEY GETRTALADY ALCAEATNMC RTALADYALC AEATNMCRTA LADYALCAEA 13980

TNMCRTALAD YALCAEATNM CRTALADYAL CAEATNMCRT ALADYALCAE ATNMCRTALA 14040

DYALCAEATN MCRTALADYA LCAEATNMCR TALADYALCA EATNMCRTIF GWDIAEGQKT 14100

IFGWDIAEGQ KTIFGWDIAE GQKTIFGWDI AEGQKTIFGW DIAEGQKTIF GWDIAEGQKT 14160

IFGWDIAEGQ KTIFGWDIAE GQKTIFGWDI AEGQKTIFGW DIAEGQKTIF GWDIAEGQKT 14220

IFGWDIAEGQ KTIFGWDIAE GQKKVNGVEY GETRVNGVEY GETRVNGVEY GETRYKEPGA 14280

EGVCETTPGV KYKEPGAEGV CETTPGVKYK EPGAEGVCET TPGVKYKEPG AEGVCETTPG 14340

VKYKEPGAEG VCETTPGVKA SDFWANELVT WWNKEAEPSQ EYVSYSHGVF LRFSYEEGEK 14400

FLNKGAKDDV FIKGGSILPM QEVALTTRKA TGDVLFNTKN AHGQEILLRN HNVLSAIPQE 14460

PYRQYQLSTV GLPAMQQYNT LGFHQCRSSE AEPSQEYVSY SHGVFLRTLG GSVDLTFYSG 14520

PTQAEVTKWA SVIDATKSEA EPSQEYVSYS HGVFLRAEPS QEYVSYSHGV FLRAEPSQEY 14580

VSYSHGVFLR AEPSQEYVSY SHGVFLRAEP SQEYVSYSHG VFLRASDFWA NELVTWWNKE 14640

AEPSQEYVSY SHGVFLREAE PSQEYVSYSH GVFLREAEPS QEYVSYSHGV FLRFSYEEGE 14700

KFLNKGGSIL PMQEVALTTR GGSILPMQEV ALTTRNAHGQ EILLRNAHGQ EILLRNHNVL 14760

SAIPQEPYRN HNVLSAIPQE PYRNHNVLSA IPQEPYRNHN VLSAIPQEPY RNHNVLSAIP 14820

QEPYRSEAEP SQEYVSYSHG VFLRWASVID ATKWASVIDA TKDPSINDDS VMIYAPAVRF 14880

LDEALTYPPP KGIQINDPSI NDDSVMIYAP AVRIASAMLD EEDEKYFNVK NGDQSPPSAL 14940

GPLPSVIERP SINDDSVMIY APAVRTDYSV CGETTIFKVY LTGESYAGQY IPYIASAMLD 15000

EEDEKVYLTG ESYAGQYIPY IASAMLDEED EKYFNVKIAS AMLDEEDEKT DYSVCGETTI 15060

FKNGDQSPPS ALGPLPSVIE RVYLTGESYA GQYIPYTLIA GAGLLGTAHT ERETTIFKNG 15120

DQSPPSALGP LPSVIERTDV QKALHVPRDD SVMIYAPAVR FLDEALTYPP PKGIQINDPS 15180

INDDSVMIYA PAVRGIQIND PSINDDSVMI YAPAVRGIQI NDPSINDDSV MIYAPAVRGI 15240

QINDPSINDD SVMIYAPAVR IASAMLDEED EKIASAMLDE EDEKYFNVKI ASAMLDEEDE 15300

KYFNVKIASA MLDEEDEKYF NVKIASAMLD EEDEKYFNVK IASAMLDEED EKYFNVKIAS 15360

AMLDEEDEKY FNVKIASAML DEEDEKYFNV KNGDQSPPSA LGPLPSVIER TDYSVCGETT 15420

IFKNGDQSPP SALGPLPSVI ERTDYSVCGE TTIFKNGDQS PPSALGPLPS VIERVYLTGE 15480

SYAGQYIPYI ASAMLDEEDE KYFNVKAHIL PPNGRDLNPN GSQFITPGGK DLNPNGSQFI 15540

TPGGKNDPVA VFDGSVIPKE AGLVPFQVSP TTKFHVLTAQ LSFPRFRDLN PNGSQFITPG 15600

GKLDRPPVIP LPPSDSDVTA FRNDPVAVFD GSVIPKPVAV FDGSVIPKTI SNVVDNELAR 15660

TTNGIVSTNE SGRDPVAVFD GSVIPKFALS TWARILPATS QVSTKAHILP PNGRAHILPP 15720

NGRAHILPPN GRDLNPNGSQ FITPGGKFAL STWARFALST WARFHVLTAQ LSFPRFHVLT 15780

AQLSFPRFRD LNPNGSQFIT PGGKFRDLNP NGSQFITPGG KFRDLNPNGS QFITPGGKND 15840

PVAVFDGSVI PKTISNVVDN ELARTISNVV DNELARTISN VVDNELARTT NGIVSTNESG 15900

RDWSDSYYQG PAFKFGLGAD NTLAFEVVTA DGQLVTASRG VGSDAWTVSE SGRITNEYVP 15960

QLEAVTPGSG CYQNEGNFRN VLENNPTGMA SVLRSKWDPN NFFYVLKTTA LTDLGIAYKV 16020

SAGVMGYQIL NAAHAKVSYT EYDSYYDHYN KYMGPLPYGN LAVATYQYGG RWDPNNFFYV 16080

LKDWSDSYYQ GPAFKGVGSD AWTVSESGRG VGSDAWTVSE SGRGVGSDAW TVSESGRGVG 16140

SDAWTVSESG RITNEYVPQL EAVTPGSGCY QNEGNFRNVL ENNPTGMASV LRNVLENNPT 16200

GMASVLRVSA GVMGYQILNA AHAKVSAGVM GYQILNAAHA KVSAGVMGYQ ILNAAHAKVS 16260

AGVMGYQILN AAHAKVSAGV MGYQILNAAH AKVSAGVMGY QILNAAHAKV SAGVMGYQIL 16320

NAAHAKVSYT EYDSYYDHYN KYMGPLPYGN LAVATYQYGG RALMNGAGAI KDAGYETSIT 16380

DYWGRDFFNH VTIKDGNWTT CVGCAILSRG FVPLEYVGSK HVYDAVQDKP TVYGFVPLEY 16440

VGSKTNTQVP DACTQCFQKQ ADMPMPLLVA DGRTAFSDIL AKSIALTDTF KILDSATYYK 16500

ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK 16560

ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK DAGYETSITD YWGRDAGYET SITDYWGRDA 16620

GYETSITDYW GRDAGYETSI TDYWGRDAGY ETSITDYWGR DFFNHVTIKD FFNHVTIKDF 16680

FNHVTIKDFF NHVTIKGFDN AGFVMGTSSS LFNQFMPLLV ADGRMPLLVA DGRMPMPLLV 16740

ADGRMPMPLL VADGRMPMPL LVADGRMPMP LLVADGRMPM PLLVADGRMP MPLLVADGRM 16800

PMPLLVADGR QADMPMPLLV ADGRQADMPM PLLVADGRQA DMPMPLLVAD GRQADMPMPL 16860

LVADGRTSIT DYWGRAHDDT VNYLYEELKK ATAFAVATYA NDLSSIPKGG DPNNVVALGG 16920

HTDSVEAGPG INDDGSGIIS NLVIAKGPYS AIVGISLEDG QKNLGCSEAD YPSDVEGKQP 16980

QVHLWSNADQ TLKTMTYSPS VEVTADVAVV KTTYNVVAQT KVGDEEIEAK AHDDTVNYLY 17040

EELKKAHDDT VNYLYEELKK AHDDTVNYLY EELKKQPQVH LWSNADQTLK TMTYSPSVEV 17100

TADVAVVKAG QFPISANDGA TSTKAGVLSW SYTWSPADKE AASAALAAGY KFDGVTWDEE 17160

NWLLKFDPSA AIYPWTSGRF VGGASTDAFA DPKLLPEEGI YITPNLPPQI PYVKPSAAIY 17220

PWTSGRVVLT LTGIEPSTIY TAEEENQVRA YVASDSELEY VTWTVDNRGD WEVTSILSID 17280

QERTLIPADK IPTGKTLSTN EEGYETSAVR VSQTNPTVTL SLLNIASKYP ILFTPYGGPG 17340

AQEVTKDGTD GWLDNLLSMK TLSTNEEGYE TSAVRKFYDS MYTERTLIPA DKIPTGKATS 17400

GGTSAAAPVF AGLVGMLNDA RDFTDITAGS SIGCDGVNPQ TGKGFPDVAA HSLTPRPDVA 17460

AHSLTPRPNS ALPQVLSNSY GDEEQTVPEY YAKSALPQVL SNSYGDEEQT VPEYYAKSYG 17520

DEEQTVPEYY AKVCNLIGLM GLRLKDLVLS LAWYQESAVS KATSGGTSAA APVFAGLVGM 17580

LNDARATSGG TSAAAPVFAG LVGMLNDARA WYQESAVSKA WYQESAVSKD FTDITAGSSI 17640

GCDGVNPQTG KGFPDVAAHS LTPRGFPDVA AHSLTPRGFP DVAAHSLTPR SALPQVLSNS 17700

YGDEEQTVPE YYAKVCNLIG LMGLRDAEEE PYDWSNEGRG ISDGIDWQAG YSAVQKMDDA 17760

EQYEATSRNI YIQSATLDGK PYSKSLNYIP VEDFDYKTLE YSYDDFTIAQ MARTMINPQD 17820

YTGENPLWKD NGIFVNSRSI NGYPLPGGAF VRMDDAEQYE ATSRTLEYSY DDFTIAQMAR 17880

DIDFGENGDG IKDYVPNTQI PVTVAANTFP GGQEGFIDFV KFQESPEGAD FWGARTKVTI 17940

SPELSIRVFQ TAFGPAGTML TYEPIVRADA IVAAIRLAED HINWVEIRVT ISPELSIRHE 18000

LGVDEIWRDI DFGENGDGIK DIDFGENGDG IKFQESPEGA DFWGARLAED HINWVEIRAG 18060

VKPSNYVGDI FGTLGGTPDF GPGRCDVATT DVYYSGKSKY TAEGYEAATK TASNFDQPHS 18120

DESALQHLRY CASAQEDNAT LQALLRYTAE GYEAATKYVD AGGFEPSIKL QALLRSKYTA 18180

EGYEAATKTA SNFDQPHSDE SALQHLRGHL TAMTGDGVND APSLKTAALV QGASDSGHFK 18240

TGTLTANQLS IRAYGIVVAT AKTGDGVNDA PSLKMLTGDA LAIAKLAIEH EVDAHGKIEN 18300

MLSHLSKDKS ETETETEIEI SNKIKEIQEA GDVRLSDELE DDNAPIGFET TKSVEIAQLH 18360

SEVEALVEKY TVTAGELTSD FKEVEVEKEW TKTETKTEIE IERIKEIQEA GDVRASSDDS 18420

NYGWEDSKGI QDAGVIATAK IGAQSTVLLK NFGEIGDASE YVYPEGLERY TPPNFSSWTR 18480

VNEFVDVQRA VDIVSQMTLT EKDSPNWDVD SDALPAIPEG AKEIPVGYSA ADIDTNRGVD 18540

YQPGGSSNLA DPIADAEGCK RNTLAFFSGN EVINDGPSSK YGLVEIDDGK VKTLADFDAL 18600

KYGLVEIDDG KVKDLMQAMA DFGPKFPGGN NLEGDTLDGR TGEVYASAVI VSKYPSNLDA 18660

WIPVDGSALS LKYVEVGNED NLNDGLDSYK FQAFYDAIKE QTYTGSFYVK ASLGHPEPWT 18720

VKDLMQAMAD FGPKELPSGP YFVSLYTGEV FKGISPEAHQ SLTTFTRLYP DDNLAFIQAG 18780

ISDEKQLLLA GGGWDGKSLF VSVYSVGTTD YRLYYTPTAE KPLAGLRGIS PEAHQSLTTF 18840

TRQLLLAGGG WDGKDSLSEA IAYAKGGGGG TFGVVMESTH RIANECQNQE LFWALRSQGG 18900

TAVIEEFPSW YEFYQKYVVP NAVTVGNAHF AATRSSGQGT LSLWTRAVTV GNAHFAATRG 18960

GGGGTFGVVM ESTHRGGGGG TFGVVMESTH RGGGGGTFGV VMESTHRIAN ECQNQELFWA 19020

LRSSGQGTLS LWTRYVVPNA VTVGNAHFAA TRYVVPNAVT VGNAHFAATR YVVPNAVTVG 19080

NAHFAATRAS SVSGVITLSD GRTTADSDGN FSFENVRVQD ETWELSDGSY ITKYDWSDFI 19140

NSAKYEEFEV PAGTLVKIWQ IGTLDRAYTQ YTETSVYGML KDGDLVTQQN ELQGKHEGWI 19200

DEAAVQEAKL HYGAYSIKSN LFNSYSENQV LLPASVYGSY KETYGSAAGW DKLADALAAS 19260

SLPEAWWGEN YEPLLNIKGG GGGTFGVVIE STHRIANECQ NQDLFWALRV EPQLSFVAAV 19320

IKYVTSNAVS VGVTHFAGSR AVFETAEGRG GGGGTFGVVI ESTHRYVTSN AVSVGVTHFA 19380

GSRDAEVAPP NDPVDPMAPD SSTKFEGYLP DARGSTGNVL VDVSHVLPSF RVGISWLSTE 19440

KLSITATGGD GNGDSQIYVQ KGAVNWEDGY RDAEVAPPND PVDPMAPDSS TKDSVKEDDY 19500

EDLFNYICAK KFTDTPVLYG PKMLDDAGIY LITDLSSPSE SINRSDGQCS DLLKQQLSFV 19560

MNQWYEKYGA YSVCSPKTLP AIESKKFTDT PVLYGPKMLD DAGIYLITDL SSPSESINRS 19620

DGQCSDLLKA DAAGSHGEAL NEVQAKAKAD AAGSHGEALN EVQAKLEAAE QALSEARVGA 19680

LESQLSTEQD AIKEAAESAG TTHSQQLQEL RDALEAAEAA AKIQEQLKGQ TPLPILVADG 19740

RNNILEGPDV KSHLSVVDGG EDGQNIPLHP LIQPERTIDY WTELVDTVKT STTLPEVCSK 19800

AMLNGAGALK AMLNGAGALK AMLNGAGALK AMLNGAGALK AMLNGAGALK GQTPLPILVA 19860

DGRINLGLNK NNILEGPDVK SHLSVVDGGE DGQNIPLHPL IQPERTFINL GLNKTSLTDY 19920

WGRFNVDETA FTGAWGRIGS LAITDVSLPF FKIQGISNPS GALSSGGLGE PKVQNGAVTW 19980

ESDPNRATTV YGESIKSIYA INSGRELDTQ HIHPPDSYFV SPLTRGFTEI DELWNGVTAE 20040

TNAAQDLRQA QVAHDFWQKF YHQVVELNRK DAELTDAGVK LNTGAVIPVL VRELDTQHIH 20100

PPDSYFVSPL TRLNTGAVIP VLVRLNTGAV IPVLVRQAQV AHDFWQKQAQ VAHDFWQKAI 20160

NDYIDSQLDK KGVQISTNIP KSSPWIMLGG SYPGMRYQSL EYQQSLCYRL FSLALKISIP 20220

IDHEDPSMGT YQNRAINDYI DSQLDKKCSS HDDCSDELAC TDGVCACTAD SAVTCSWEGH 20280

CAGAKLNLQY QASGDAKKSL VDFSAARGDN PSILGLRSAV TCSWEGHCAG AKIGTTIDDI 20340

KCTADSAVTC SWEGHCAGAK CTADSAVTCS WEGHCAGAKC TADSAVTCSW EGHCAGAKCT 20400

ADSAVTCSWE GHCAGAKAFP DVAAQGMNFA VYDKELYNIG DYQADANSGS KIAFASYLEE 20460

YARQGLQDIT LGASIGCTGR YADLENFENY LAPWAKAFPD VAAQGMNFAV YDKAFPDVAA 20520

QGMNFAVYDK ELYNIGDYQA DANSGSKYAD LENFENYLAP WAKYADLENF ENYLAPWAKA 20580

GSSPTDIISG ISDKTDALDS AIKKVEQAID DIIAKSAADG LASAITSKSG DDISTTDALA 20640

LPEPVQALTK SPTDIISGIS DKTDALDSAI KAQNDPNAFG VVAARLGACP PGKETALLGD 20700

KPNAFGVVAA RQNDPNAFGV VAARAATYCP ENIEKIENQS DADGYSSCST LKLTGLTTLT 20760

TLSFAALTKS DKLNVIDFPK VGSIEFTALP QLQSLDFTKL NVIDFPKTVN GGFQIARGVA 20820

AWLFERLSFG SIDLENANIN RSLSFIPGVL YDGSPIGKQE STFAAVERSC FEIGKFVDPL 20880

IGSNNGGNVF AGASLPYGMA KGWTQGGSNA DVVLTDAYVK VGISYISTDR AGNWQNLYKA 20940

QHPFLTIVDP EAQSRSVFSQ NESVAAGLKT TAVLFDEGKE ICLAALGRAL VIVSDSIRTD 21000

TIHGVGQNSF YKASHPIEVP VKASHPIEVP VKIMSILLGG AIPDDLKPLV LFDSVTKTAT 21060

ESEPSLSDIE KTGYVNYNVD TTNLRKHNPL VLFDSVTKTS PFPYDSKKHN PLVLFDSVTK 21120

KHNPLVLFDS VTKKHNPLVL FDSVTKTGYV NYNVDTTNLR APTPPDFSLG YIQSKIEQDG 21180

SESLLTNEYA PLKGYAFIWN MPAQGRTSGW GGNPGGYRYQ LASYLRDYLD EYLVFPPAGV 21240

QPQKIYVTGE SYAGRVDHLP DVPFDVGEMY SGLVPIDKDD KNFQELFGIK KTPLDDFRAD 21300

DVLEVNPLAD PEVVSYFRLD ADAITAQYFG NDAPWYRSDY ASFLYGPYRL VFAPQEEKAT 21360

WDGVDADKIR FQYPGDLFDQ GTTIRFTGDA ATVNSIAARP DSDEIYFGGQ FEKNLEVLSL 21420

TKHVAAYSFG SKAWTALGGG VNGPVHKNLA LLDGKDLTDY LMKSYELPDG QVITIGNERV 21480

APEEHPVLLT EAPINPKQEY DESGPSIVHR QEYDESGPSI VHRVAPEEHP VLLTEAPINP 21540

KVAPEEHPVL LTEAPINPKV APEEHPVLLT EAPINPKAEL PEGYPESSAN PAFRDIQYLE 21600

NYQGQGYSGP AVKFVTVTEE TDPDLFWALR LSLGDSGACK DAEVEPANWG VEGRLGGAQL 21660

FTSRTVSLVE DGSNTPATLS AGTFARSLVD IYRTVSLVED GSNTPATLSA GTFARAYVEM 21720

MQCTDEKEPL VRLEKDLPGT TLSSKYYGYG GGNPLGPAQG IGFANELIAR LEKDLPGTTL 21780

SSKLSEAGHS VLLIEKTPIE SDATSYLNDR GGPMGTYLVS ASERVILSAG TFGTPKAVIT 21840

DIVNQQRLIN QVELSEDKTI ARGGSNNFGI VTRLLLSDAM WYTRERPSAQ LLSGKFDTLG 21900

TSGPTAKLAN AYTWEGGRAV ADRIPLAIHD EVSPVGDTDA LLERAPVVQY ALNRDGYMGY 21960

HGVPQIPIYA YKAIHDEVSP VGDTDALLER AIHDEVSPVG DTDALLERAI HDEVSPVGDT 22020

DALLERDGYM GYHGVPQIPI YAYKLAEESA ALGVKVNPII LTGDMWRVSD NAGLGDWVPN 22080

PDRFPDGLTP LVEDVTKALG GTSTINGMAY TRSQLSDYAA ATVKAEDVQI DVWQKALGGT 22140

STINGMAYTR EIGFTVQEDN TDGKIDFGSA PNIVNAIAED RNSPVWPDGI QQTYEYPNRA 22200

STNMITSNSG AGLVPQDENR IGGSAGTELQ SDKITGEVWP VLMAYGQKSA ISQYGDSFAK 22260

SQSDFESEFS TAKVNAGIGI GPDDLVSFIK GNAMDHFSSI MERYGPTYAA YFLDQNEKAI 22320

TETQYEEAKD LTLDLPDIGL QYAGTVKTVA ALINWRNIWD GTTAQNVKKE DLETSSYSFS 22380

GDGKVDFASL QSAATQSTTY SNAPAVKTCS LVFLFPKKED LETSSYSFSG DGKFDGILGL 22440

GFDTISVNKY GSGSLSGFVS QDTLKWYSVY DLGNGAVGLA KDAYSPHEIY SRIFEQLEGM 22500

SLSKTYEVVG NVYKDQVLKD VALIKAVPGT AQQAAAIKDA GEFDVERGTV VTNDQCGGAS 22560

SVRLHLVTAE EADIKIIYDM PDGSSCKGID VAKPTGRVNG VWTVTHSPFE GLSALKSAMT 22620

LPRVNGVWTV THSPFEGLSA LKVPTVLMSP WVGKSIDQFF NDAKNVAPDD PDHSITGGNQ 22680

QVYSTYHPNA KESTLHLVLR IQDKEGIPPD QQRIQDKEGI PPDQQRIQDK EGIPPDQQRD 22740

VSLVANHIDT VGKTAATVNT WTGGWSDSKA IGTYQNSGLS QYTVRYSEGV HFPARTVANW 22800

LVREVAGDVD NAVNPAWRLG AGVQGFEAYE AANAQGLRLD GGVIEDFAQK NPDLSSTSDT 22860

TDVIRGPDEP YSGQYDEERQ FISVTNPTGA EPVPKFLSEL LEDEYFTKFV NIWLENTDYE 22920

SAANDPHLSK LLEYDIASGT PVYRNNNQGL EALTISPDGK VYAISDQDDT GPWIRDAYQN 22980

DFAARVDPST AVDYNHYSDA ADRSGDVQTL QFAWALQHLS ERTGNQTGQL GTYFNKNINM 23040

LLYGTDDCSG KGMVFSIDAQ GEKNINMLLY GTDDCSGKNP NPDQAFLQVR FWVATGDSSK 23100

AALDALQQSI YLQPKFSDGN GLFYQYERVA VAGYDDTTGG VGPLLAQKAI AIALQSSHRQ 23160

TGSVDGYAYT DANKNDLITY LKSVVENNND GLTAAYRVAP NSGAYLNEAD FRSLPLIVGN 23220

SDQEGKANEQ PTWVYRSDYQ ECADAPGQKF GATGDEYREP SNDPNPPETY SKVALLFSER 23280

LADGSIPTRS ISSDEDSAET EQSDSSDPKV AIIDGLADPW RTMGVGYATN DDSTIRDVPI 23340

MQELNTNTIR DVDPIVIKVE TGVIKPGMVV TFAPANVTTE VKIVVIGHVD SGKDDADLQE 23400

LGAKSSAFAF RKDPSDAIPS IPSIPISYKE AIPFLKEAAE IDSHWERDDY MPFIEVPRDD 23460

YMPFIEVPRA LQGVDELVEK DALHPQFDNF YQEQPKASYG AGVTIQDRDL SVFFTRINDL 23520

LPVYVELLQK AALTNMVNAA KGEITPEQYE KIINEPTAAA IAYGLDKQLT SEEIWQAEEK 23580

LDKPAGDYTI RDYSNNWESG ALKLAPNQMT GSLDATYLKL APNQMTGSLD ATYLKCASDG 23640

SAETCSWEGH CKCASDGSAE TCSWEGHCKC ASDGSAETCS WEGHCKCASD GSAETCSWEG 23700

HCKCASDGSA ETCSWEGHCK LAAISVEPGK ASELGCSSGD LDCLCKVGEC AQMCISNMNA 23760

KGTLLSSNQG SQAADVKNDD DFLNYGISSK APSVITYDEA TKYEAAGITV HKDDYLPFID 23820

MPSEVTQIDA KIPMALDDWP TLSNMIFSGK DNFDTSSVTH RGYQINFLSN SAKDNIQGIT 23880

KPAIRDNIQG ITKPAIGPLG LSPKLQLWDT AGQERAEDYL LNPSPKNFGI GQDIQPKIDA 23940

TTNPGMRQLG LAMLGNKLVI DGLKEVTEIP ATADASRVNV DYTEVPRLAV NMVPFPRYCD 24000

LILGEWRDQI KDVLRIDYIG GGDLFRGSSP NVLYKSANWT PPEGIVRAAS TGSMAEQYTK 24060

AATGTYASST TVYKAENQAV AVGRALVEGS TFAKALYSSA ATGTYASSTT VYKATGTYAS 24120

STTVYKATTV YGESIKAYAD GYVQIVQTYA ASTGSMAEQY TKDLTWSYAA LLTANNRFNV 24180

DETAFTGAWG RGQSAQGASP GVVIASPSKI GADGQSAQGA SPGVVIASPS KIGSLAITDV 24240

SLPFFKIQGI SNPSGALSSG GLGEPKKYTV PSTCGVKPSG ALSSGGLGEP KQAILNNIGA 24300

DGQSAQGASP GVVIASPSKS DPDYFYTWTR SIYAINSGRT GTYASSTTVY KTVGSSCPYC 24360

DSQAPQVRVQ NGAVTWESDP NRVQNGAVTW ESDPNRKPDY FYTWTRYTVP STCGVKSSAA 24420

TGTYASSTTV YKGAVTWESD PNRIVGSISQ LGSWNPSSAT ALSAVQSDVW RDINTVLGSI 24480

HTFDPQNIGA DGQSAQGASP GVVIASPSKA ASTGSMAEQY TKAENQAVAV GRAENQAVAV 24540

GRALVEGSTF AKALVEGSTF AKALYSSAAT GTYASSTTVY KAYADGYVQI VQTYAASTGS 24600

MAEQYTKDLT WSYAALLTAN NRDLTWSYAA LLTANNRIQG ISNPSGALSS GGLGEPKIQG 24660

ISNPSGALSS GGLGEPKNIG ADGQSAQGAS PGVVIASPSK PDYFYTWTRQ AILNNIGADG 24720

QSAQGASPGV VIASPSKQAI LNNIGADGQS AQGASPGVVI ASPSKQAILN NIGADGQSAQ 24780

GASPGVVIAS PSKQAILNNI GADGQSAQGA SPGVVIASPS KQAILNNIGA DGQSAQGASP 24840

GVVIASPSKQ AILNNIGADG QSAQGASPGV VIASPSKQAI LNNIGADGQS AQGASPGVVI 24900

ASPSKQAILN NIGADGQSAQ GASPGVVIAS PSKQAILNNI GADGQSAQGA SPGVVIASPS 24960

KQAILNNIGA DGQSAQGASP GVVIASPSKQ AILNNIGADG QSAQGASPGV VIASPSKQAI 25020

LNNIGADGQS AQGASPGVVI ASPSKQAILN NIGADGQSAQ GASPGVVIAS PSKSAVQSDV 25080

WRSAVQSDVW RSAVQSDVWR SAVQSDVWRS AVQSDVWRSD PDYFYTWTRS DPDYFYTWTR 25140

SDPDYFYTWT RSDPDYFYTW TRSDPDYFYT WTRSDPDYFY TWTRSIYAIN SGRSIYAINS 25200

GRSIYAINSG RTVGSSCPYC DSQAPQVRTV GSSCPYCDSQ APQVRVQNGA VTWESDPNRV 25260

QNGAVTWESD PNRVQNGAVT WESDPNRVQN GAVTWESDPN RVQNGAVTWE SDPNRVQNGA 25320

VTWESDPNRV QNGAVTWESD PNRVQNGAVT WESDPNRVQN GAVTWESDPN RVQNGAVTWE 25380

SDPNRVQNGA VTWESDPNRV QNGAVTWESD PNRVQNGAVT WESDPNRVQN GAVTWESDPN 25440

RKVQNGAVTW ESDPNRKVQN GAVTWESDPN RKVQNGAVTW ESDPNRKASM VWEEAQQVSG 25500

KAVSPSFEDV WSQPRDGAGQ MFIPLNPNAY SPNTLNKDVG GPIEDQNSLQ VGDRFGFDLF 25560

DPTKGPTLLE DFIFRHGGPN FEQLPINQPR HVDGFGIHLF SYLDTQLNRL FYNSLTPAEQ 25620

QFVVDAIRNN VIIQLNRQDL FEAIEAGRSL TPAEQQFVVD AIRSVTSGFV DGIKVGFLAS 25680

VETPASIEAA SELSKTTDVG TFGQKDVHGF ATRIVPEEYV PITKFVTDNG DSKASMVWEE 25740

AQQVSGKASM VWEEAQQVSG KASMVWEEAQ QVSGKASMVW EEAQQVSGKA SMVWEEAQQV 25800

SGKASMVWEE AQQVSGKAVS PSFEDVWSQP RAVSPSFEDV WSQPRAVSPS FEDVWSQPRA 25860

VSPSFEDVWS QPRAVSPSFE DVWSQPRDGA GQMFIPLNPN AYSPNTLNKD GAGQMFIPLN 25920

PNAYSPNTLN KHGGPNFEQL PINQPRHGGP NFEQLPINQP RHGGPNFEQL PINQPRHGGP 25980

NFEQLPINQP RLFSYLDTQL NRNNVIIQLN RNNVIIQLNR NNVIIQLNRS VTSGFVDGIK 26040

SVTSGFVDGI KAAALAELVW SGNRAELVWS GNRASNSLQY VNVQVKDAYS PHEIYSREYL 26100

VANGVQAQAL VPKGIMLDTG RGVQAQALVP KHIVGATAPL WGEQVDDINV SHIVGATAPL 26160

WGEQVDDINV SSMIFEQLEG MSLSKVIPEI DMPSHSSSGW KYNVMANPDA NTPNFNYGGN 26220

GGSWCAPYKT YEVVGNVYKD IEADLQHAET VWGALHAFLV MWEDIALSAD NAHDVPKAAA 26280

LAELVWSGNR AAALAELVWS GNRAAALAEL VWSGNRAAAL AELVWSGNRA SNSLQYVNVQ 26340

VKASNSLQYV NVQVKASNSL QYVNVQVKAS NSLQYVNVQV KDAYSPHEIY SRDAYSPHEI 26400

YSRDAYSPHE IYSRDAYSPH EIYSRDAYSP HEIYSRDAYS PHEIYSRDAY SPHEIYSREY 26460

LVANGVQAQA LVPKEYLVAN GVQAQALVPK EYLVANGVQA QALVPKGIML DTGRIFEQLE 26520

GMSLSKIFEQ LEGMSLSKIF EQLEGMSLSK IFEQLEGMSL SKTYEVVGNV YKYNVMANPD 26580

ANTPNFNYGG NGGSWCAPYK YNVMANPDAN TPNFNYGGNG GSWCAPYKYN VMANPDANTP 26640

NFNYGGNGGS WCAPYKYNVM ANPDANTPNF NYGGNGGSWC APYKATSGGT SAAAPVFAGL 26700

VGMLNDARAW YQESAVSKDF TDITAGSSIG CDGVNPQTGK GFPDVAAHSL TPRPDVAAHS 26760

LTPRPNSALP QVLSNSYGDE EQTVPEYYAK SALPQVLSNS YGDEEQTVPE YYAKSNSYGD 26820

EEQTVPEYYA KSYGDEEQTV PEYYAKYLDQ QITAETKAWY QESAVSKAWY QESAVSKAWY 26880

QESAVSKAWY QESAVSKGFP DVAAHSLTPR GFPDVAAHSL TPRGFPDVAA HSLTPRGFPD 26940

VAAHSLTPRG FPDVAAHSLT PRPDVAAHSL TPRSALPQVL SNSYGDEEQT VPEYYAKYLD 27000

QQITAETKYL DQQITAETKA NEQPTWVYRF FCPTDYLIDV RGTPSVLTEQ GLVKLGVPGN 27060

ELAIEIGSTG DYNARQGTPS VLTEQGLVKS LPLIVGNSDQ EGKTFQGTPS VLTEQGLVKY 27120

PVVQNPVTLA ESSCQSVFNP NIPKNPSAGP GWDQAKPTNG PLAKFQGTPS VLTEQGLVKA 27180

NEQPTWVYRA NEQPTWVYRG TPSVLTEQGL VKNPSAGPGW DQAKPTNGPL AKSLPLIVGN 27240

SDQEGKSLPL IVGNSDQEGK SLPLIVGNSD QEGKARNHGT STVAPQVQAS VYRASVDISN 27300

VDTYSSTEVA NDDSFQQVGK ATFLVWDQQR KASVDISNVD TYSSTEVAND DSFQQVGKNH 27360

GTSTVAPQVQ ASVYRSSTEV ANDDSFQQVG KTLYLTDTDA GVPMIDPRTV YAFDVSEDGS 27420

YLKVASNGYV ITGAGKARNH GTSTVAPQVQ ASVYRARNHG TSTVAPQVQA SVYRATFLVW 27480

DQQRATFLVW DQQRATFLVW DQQRKASVDI SNVDTYSSTE VANDDSFQQV GKTVYAFDVS 27540

EDGSYLKVAS NGYVITGAGK VASNGYVITG AGKIENQSDA DGYSSCSTLK LTGLTTLTTL 27600

SFAALTKSAS SLNSIGDTFK SDKLNVIDFP KSLNSIGDTF KVGSIEFTAL PQLQSLDFTK 27660

TVNGGFQIAR LNVIDFPKGQ LGFWGNKGTY SGDLQLNGVK LNVIDFPKSD KLNVIDFPKS 27720

DKLNVIDFPK TVNGGFQIAR TVNGGFQIAR AVGSDEWTVR LGITYTTYSK MTNDYISALT 27780

KSEMLAEQDK MTNDYISALT KSTITTPWKS VVENNNDGLT AAYRVAPNSG AYLNEADFRY 27840

FYGDNYATLR SGAYLNEADF RTAVGSDEWT VRLGITYTTY SKMTNDYISA LTKMTNDYIS 27900

ALTKMTNDYI SALTKSEMLA EQDKMTNDYI SALTKSEMLA EQDKMTNDYI SALTKSEMLA 27960

EQDKMTNDYI SALTKSVVEN NNDGLTAAYR SVVENNNDGL TAAYRSVVEN NNDGLTAAYR 28020

SVVENNNDGL TAAYRETTMF VLQGFGASMA RLNALQGGRL VQNDFNTLLR QDILGGMVDS 28080

YTDPKTGETT QIHARYGLEA AVPLMYESTG LGLGDMTKVS VADVKIDYIG GGDLFRLVQN 28140

DFNTLLRQDI LGGMVDSYTD PKYGLEAAVP LMYESTGLGL GDMTKALEAY KVNGKAVDFS 28200

GHDEFQGKEP SNDPNPPETY SKFGATGDEY RSDYQECADA PGQKYIARPD IMKSTLPDLS 28260

EVIKVNGKEV GQFKSVDNFH LLTVYAVDFS GHDEFQGKFG ATGDEYRYIA RPDIMKFLDE 28320

ALTYPPPKGI QINDPSINDD SVMIYAPAVR IASAMLDEED EKYFNVKNGD QSPPSALGPL 28380

PSVIERPSIN DDSVMIYAPA VRTDYSVCGE TTIFKTVDDE EGVAAQFKIA SAMLDEEDEK 28440

FLDEALTYPP PKFLDEALTY PPPKGIQIND PSINDDSVMI YAPAVRGIQI NDPSINDDSV 28500

MIYAPAVRIA SAMLDEEDEK IASAMLDEED EKYFNVKIAS AMLDEEDEKY FNVKNGDQSP 28560

PSALGPLPSV IERNGDQSPP SALGPLPSVI ERAGAVAAVV YNNEKHGIPG GGIATGAEGI 28620

KLVLGDAVPE SAAPMGLTPP TKSDKELVSS SAFQSHVKSF EGFPKRLVAH SVATYARIAD 28680

LGKEEYNHPT RAGAVAAVVY NNEKHGIPGG GIATGAEGIK HGIPGGGIAT GAEGIKLVLG 28740

DAVPESAAPM GLTPPTKLVL GDAVPESAAP MGLTPPTKLV LGDAVPESAA PMGLTPPTKS 28800

DKELVSSSAF QSHVKFTDTP VLYGPKKFTD TPVLYGPKML DDAGIYLITD LSSPSESINR 28860

QQLSFVMNQW YEKYGAYSVC SPKSDGQCSD LLKWDVDLYS RLITDLSSPS ESINRDLSSP 28920

SESINRKFTD TPVLYGPKKF TDTPVLYGPK QQLSFVMNQW YEKQQLSFVM NQWYEKCDVA 28980

TTDVYYSGKG GTPDFGPGRS KYTAEGYEAA TKVATIGSAT FARYCASAQE DNATLQALLR 29040

YTAEGYEAAT KYVDAGGFEP SIKSKYTAEG YEAATKVATI GSATFARVAT IGSATFARYV 29100

DAGGFEPSIK DADACNGGGI EYDSPADTPL EFKDNTCNAP IPVSFPVAPT DTKEISFNQA 29160

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ATNDDSTIRC ASDGSAETCS WEGHCKCASD GSAETCSWEG HCKLILPGEL AK 33172

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