Fgl2在制备妊娠期糖尿病诊断和预后的试剂中的应用
阅读说明：本技术 Fgl2在制备妊娠期糖尿病诊断和预后的试剂中的应用 (Application of FGL2 in preparation of reagent for diagnosis and prognosis of gestational diabetes ) 是由 漆洪波 栾晓瑾 付雍 童超 于 2021-07-19 设计创作，主要内容包括：本发明涉及FGL2在制备妊娠期糖尿病诊断和预后的试剂中的应用,属于疾病诊断领域。本发明通过检测FGL2基因和蛋白表达水平,可以及早判断和预示是否存在GDM,并且通过监测FGL2表达水平的变化可以判断GDM的进程,预示是否存在GDM子代胚胎和胎盘发育不良,以及反映GDM患者治疗效果和预后,为患者的疾病风险及治疗方案提供重要依据。(The invention relates to an application of FGL2 in preparation of a reagent for diagnosis and prognosis of gestational diabetes, belonging to the field of disease diagnosis. According to the invention, by detecting the expression level of FGL2 gene and protein, whether GDM exists can be judged and predicted as early as possible, and the process of GDM can be judged by monitoring the change of the expression level of FGL2, whether the embryo and placenta dysplasia of GDM filial generation exists is predicted, the treatment effect and prognosis of GDM patients are reflected, and an important basis is provided for the disease risk and treatment scheme of the patients.)
技术领域
本发明属于疾病诊断领域，具体涉及FGL2在制备妊娠期糖尿病诊断和预后的试剂中的应用。
背景技术
妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus,GDM)是指妊娠期间首次发生的糖耐量受损或者血糖升高。GDM是最常见的妊娠并发症之一，在全球育龄期妇女中的患病率约为16.9％。目前，推荐的GDM诊断标准是：孕妇在妊娠24-28周进行75g口服葡萄糖耐量实验(OGTT),空腹血糖≤5.1mmol/L、口服葡萄糖1小时后血糖≤10.0mmol/L、口服葡萄糖2小时后血糖≤8.5mmol/L，任意一点血糖值达到或超过以上标准即可诊断为GDM。迄今为止，关于GDM发病机制的研究主要集中于：妊娠期间的胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能障碍导致的胰岛素分泌不足。已知妊娠期间雌激素，孕酮和皮质醇水平升高，会诱导胰岛素抵抗。除此之外，各种免疫细胞(包括如巨噬细胞，树突状细胞和Th1细胞)功能失调并在母体蜕膜和胎盘中释放炎症介质也可以诱导胰岛素抵抗和损伤β细胞功能，从而导致GDM的发生。GDM严重威胁了母婴的健康，GDM孕妇易患妊娠期高血压和子痫前期，新生儿易患高胆红素血症、巨大儿和呼吸窘迫综合征等。因此，早期诊断和干预对GDM的预防至关重要。由于GDM的发病机理复杂，并且在妊娠期间缺乏可靠的筛查和监测的生物学指标，因此，寻找预防、诊断和治疗GDM的潜在分子靶点具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供FGL2在制备妊娠期糖尿病诊断和预后的试剂中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、FGL2在制备妊娠期糖尿病诊断和预后的试剂中的应用，所述FGL2的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，所述FGL2来源于血液。
作为优选的技术方案之一，所述FGL2的编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.2
作为优选的技术方案之一，所述FGL2的基因和蛋白的表达水平与妊娠期糖尿病的发展呈正相关。
作为优选的技术方案之一，所述所述FGL2的基因和蛋白的表达水平与妊娠期糖尿病孕妇宫内胎儿的发育和胎盘功能呈负相关。
作为优选的技术方案之一，所述诊断和预示具体为妊娠期糖尿病的筛查、辅助诊断、疗效评价、预后评估或复发监控。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种新的GDM有效检测标志物。本发明通过检测FGL2(Fibrinogen-Like Protein 2，纤维蛋白原样蛋白2)蛋白表达水平，可以及早判断和预示是否存在GDM，并且通过监测FGL2表达水平的变化来判断GDM的进程。并且，通过检测FGL2基因和蛋白表达水平的变化，可预示是否存在GDM子代胚胎和胎盘发育不良，以及反映GDM患者治疗效果和预后。本发明只需通过制备血清即可进行检测，患者在医院就医进行常规查血检验时就可一并进行，无需特殊设备，操作简便。本发明通过检测FGL2基因或FGL2蛋白在GDM小鼠和正常妊娠小鼠蜕膜中的表达水平，为深入研究GDM发病机理提供靶分子。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为GDM患者血清中FGL2表达水平。
图2为GDM患者OGTT血糖值与FGL2表达水平相关性分析。
图3为GDM小鼠血清中FGL2表达水平。
图4为GDM小鼠OGTT血糖值与FGL2表达水平相关性分析。
图5为GDM小鼠子代胚胎的吸收情况。
图6为GDM小鼠子代胚胎和胎盘与FGL2表达水平相关性分析。
图7为GDM小鼠蜕膜中FGL2基因和蛋白表达水平。
具体实施方式
下面结合具体的优选实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
FGL2蛋白在正常孕妇和GDM孕妇中的表达
(1)GDM动物模型的建立
实验动物为6～8周健康雌性C57小鼠20只，6～8周健康雄性C57小鼠10只。
将雌鼠随机分为2组，GDM组(n＝10)和control组(n＝10)。适应性喂养1周后与雄鼠按2∶1比例合笼，次日清晨检查阴栓，若观察到阴栓则标记为妊娠0.5d。于孕12.5d予模型组腹腔注射链脲佐霉素(Streptozocin，STZ)150mg/kg，予control组腹腔注射等体积PBS缓冲液。于孕16.5d行OGTT试验，若模型组血糖异常升高，则造模成功。
(2)制备检测血清
GDM孕妇和正常孕妇的血液样本来自重庆医科大学附属第一医院产科。将GDM孕妇和正常孕妇、GDM孕鼠和正常孕鼠的血样置于37℃孵箱放置20min，然后3000rpm离心10min，小心收集上层清亮液体备用。
(3)检测FGL2蛋白表达水平
采用Biolegend试剂盒说明书进行。操作步骤如下：所有试剂在使用前均恢复室温，并在室温下静置20min。①配制蛋白标准品及检测样品：蛋白标准品采用Assay BufferA进行梯度稀释，浓度分别是40ng/ml，20ng/ml，10ng/ml，5ng/ml，2.5ng/ml，0ng/ml；待测血清用Assay Buffer A进行10倍稀释并充分混匀。②免疫反应：用300μL洗涤液洗涤ELISA上样板4次，然后加入50μL Assay buffer A和50μL①中配制好的标准品和检测样品，混匀，封板，在室温孵育2h。接着，弃去每孔废液，用300μL洗板4次，拍干后于每孔内加入100μL FGL2detection antibody，封板后室温摇床孵育1h。然后，弃去每孔废液并洗涤，拍干后加入100μL Anti-rabbit IgG-HRP二抗，封板后室温摇床孵育1h。洗板后每孔加入100μL SubstrateSolution F，封板后室温避光孵育30min，每孔加入100μL Stop Solution终止反应。③OD值检测：立即于波长450nm处检测吸光度值并记录，最后根据标准品绘制标准曲线并计算出样品浓度。
(4)结果
结果如图1、2和3所示，NP(normal pregnancy)为正常妊娠孕妇的样本，GDM为经OGTT试验确诊为GDM患者的样本。从图1中可以看出，GDM患者的血清中FGL2的表达水平较正常孕妇显著提高，差异具有统计学意义。并且，将FGL2的表达水平分别与OGTT试验服糖0h、1h、2h时的血糖值进行相关性分析，结果显示FGL2的表达水平与各时间点的血糖值呈正比(图2)。此外，动物实验结果同样展示了，与control组孕鼠相比，GDM小鼠体内FGL2的表达水平显著升高(图3)，并且FGL2的表达水平与各时间点的血糖值也呈正比(图4)。此结果说明，通过检测FGL2蛋白表达水平，可以及早判断和预示是否存在GDM，并且通过监测FGL2表达水平的变化来判断GDM的进程。
实施例2
FGL2基因和蛋白表达水平与GDM子代胚胎和胎盘发育的关系
(1)评估GDM小鼠子代胚胎和胎盘的发育情况
按照实施例1中的方法构建GDM组和control组动物模型。于孕18.5d安乐死两组孕鼠，取出孕鼠的胚胎和胎盘，观察子代胚胎和胎盘的吸收情况，并称重。
(2)检测孕鼠蜕膜组织中FGL2 mRNA表达水平
分离GDM组和control组孕鼠的蜕膜组织，用TRIzol法提取总RNA，紫外分光光度计测量RNA浓度。采用逆转录试剂盒(TAKARA)合成cDNA。利用TB Green荧光染料(TAKARA)、cDNA、引物配制PCR反应体系。
反应条件为95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火20s，共40个循环。Ct值应用2-ΔΔCt方法处理，FGL2的相对表达量按照内参(GAPDH)的表达量进行标准化处理。
FGL2引物序列为：
5'-CTCAAAGAAGTGCGGACCCTCAAG-3'(SEQ ID NO.3)；
3'-TCGGCTGTCTCTGCTCCATTCC-5'(SEQ ID NO.4。
(3)检测孕鼠蜕膜组织中FGL2蛋白表达水平
收集的孕鼠蜕膜组织使用RIPA裂解液(Beyotime Biotechnology)提取总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度。配制10％分离胶和4％浓缩胶，将制备好的蛋白样品加入凝胶上样孔中，电泳起始电压为80V，待蛋白样品电泳到分离胶后将电压调整为110V，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。利用恒定电流250mA转膜90min，将目的蛋白转移至PVDF膜。将膜用5％BSA室温封闭1h，FGL2鼠单克隆抗体(1:200，Abnova)、Tubulin抗体(1:1000，Beyotime Biotechnology)4℃孵育过夜。TBS-T洗涤膜，用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1:5000，Beyotime Biotechnology)在室温下孵育1h。利用化学发光法(ECL，Vazyme)检测蛋白质含量，在显像仪下曝光并拍摄照片。使用ImageJ软件对每个条带的灰度值进行定量分析。
(4)结果
结果如图5、6和7所示，与control组相比，GDM组孕鼠的子代胚胎吸收率增加(图5)，并且，将两组孕鼠血清FGL2的表达水平分别与子代胚胎和胎盘的重量进行相关性分析，结果显示FGL2的表达水平与胚胎和胎盘的重量均呈反比(图6)，FGL2蛋白表达水平随胚胎和胎盘的重量减少而升高。此外，与control组蜕膜组织相比，GDM蜕膜组织中FGL2 mRNA和蛋白相对表达水平均升高，差异具有统计学意义(图7)。结果说明，通过检测FGL2蛋白表达水平，可判断GDM孕妇宫内胎儿的发育和胎盘功能是否异常，或是通过监测FGL2蛋白表达水平反映GDM患者治疗效果和预后。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 重庆医科大学附属第一医院
<120> FGL2在制备妊娠期糖尿病诊断和预后的试剂中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1320
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaagctgg ctaactggta ctggctgagc tcagctgttc ttgccactta cggttttttg 60
gttgtggcaa acaatgaaac agaggaaatt aaagatgaaa gagcaaagga tgtctgccca 120
gtgagactag aaagcagagg gaaatgcgaa gaggcagggg agtgccccta ccaggtaagc 180
ctgcccccct tgactattca gctcccgaag caattcagca ggatcgagga ggtgttcaaa 240
gaagtccaaa acctcaagga aatcgtaaat agtctaaaga aatcttgcca agactgcaag 300
ctgcaggctg atgacaacgg agacccaggc agaaacggac tgttgttacc cagtacagga 360
gccccgggag aggttggtga taacagagtt agagaattag agagtgaggt taacaagctg 420
tcctctgagc taaagaatgc caaagaggag atcaatgtac ttcatggtcg cctggagaag 480
ctgaatcttg taaatatgaa caacatagaa aattatgttg acagcaaagt ggcaaatcta 540
acatttgttg tcaatagttt ggatggcaaa tgttcaaagt gtcccagcca agaacaaata 600
cagtcacgtc cagttcaaca tctaatatat aaagattgct ctgactacta cgcaataggc 660
aaaagaagca gtgagaccta cagagttaca cctgatccca aaaatagtag ctttgaagtt 720
tactgtgaca tggagaccat ggggggaggc tggacagtgc tgcaggcacg tctcgatggg 780
agcaccaact tcaccagaac atggcaagac tacaaagcag gctttggaaa cctcagaagg 840
gaattttggc tggggaacga taaaattcat cttctgacca agagtaagga aatgattctg 900
agaatagatc ttgaagactt taatggtgtc gaactatatg ccttgtatga tcagttttat 960
gtggctaatg agtttctcaa atatcgttta cacgttggta actataatgg cacagctgga 1020
gatgcattac gtttcaacaa acattacaac cacgatctga agtttttcac cactccagat 1080
aaagacaatg atcgatatcc ttctgggaac tgtgggctgt actacagttc aggctggtgg 1140
tttgatgcat gtctttctgc aaacttaaat ggcaaatatt atcaccaaaa atacagaggt 1200
gtccgtaatg ggattttctg gggtacctgg cctggtgtaa gtgaggcaca ccctggtggc 1260
tacaagtcct ccttcaaaga ggctaagatg atgatcagac ccaagcactt taagccataa 1320
<210> 2
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys Leu Ala Asn Trp Tyr Trp Leu Ser Ser Ala Val Leu Ala Thr
1 5 10 15
Tyr Gly Phe Leu Val Val Ala Asn Asn Glu Thr Glu Glu Ile Lys Asp
20 25 30
Glu Arg Ala Lys Asp Val Cys Pro Val Arg Leu Glu Ser Arg Gly Lys
35 40 45
Cys Glu Glu Ala Gly Glu Cys Pro Tyr Gln Val Ser Leu Pro Pro Leu
50 55 60
Thr Ile Gln Leu Pro Lys Gln Phe Ser Arg Ile Glu Glu Val Phe Lys
65 70 75 80
Glu Val Gln Asn Leu Lys Glu Ile Val Asn Ser Leu Lys Lys Ser Cys
85 90 95
Gln Asp Cys Lys Leu Gln Ala Asp Asp Asn Gly Asp Pro Gly Arg Asn
100 105 110
Gly Leu Leu Leu Pro Ser Thr Gly Ala Pro Gly Glu Val Gly Asp Asn
115 120 125
Arg Val Arg Glu Leu Glu Ser Glu Val Asn Lys Leu Ser Ser Glu Leu
130 135 140
Lys Asn Ala Lys Glu Glu Ile Asn Val Leu His Gly Arg Leu Glu Lys
145 150 155 160
Leu Asn Leu Val Asn Met Asn Asn Ile Glu Asn Tyr Val Asp Ser Lys
165 170 175
Val Ala Asn Leu Thr Phe Val Val Asn Ser Leu Asp Gly Lys Cys Ser
180 185 190
Lys Cys Pro Ser Gln Glu Gln Ile Gln Ser Arg Pro Val Gln His Leu
195 200 205
Ile Tyr Lys Asp Cys Ser Asp Tyr Tyr Ala Ile Gly Lys Arg Ser Ser
210 215 220
Glu Thr Tyr Arg Val Thr Pro Asp Pro Lys Asn Ser Ser Phe Glu Val
225 230 235 240
Tyr Cys Asp Met Glu Thr Met Gly Gly Gly Trp Thr Val Leu Gln Ala
245 250 255
Arg Leu Asp Gly Ser Thr Asn Phe Thr Arg Thr Trp Gln Asp Tyr Lys
260 265 270
Ala Gly Phe Gly Asn Leu Arg Arg Glu Phe Trp Leu Gly Asn Asp Lys
275 280 285
Ile His Leu Leu Thr Lys Ser Lys Glu Met Ile Leu Arg Ile Asp Leu
290 295 300
Glu Asp Phe Asn Gly Val Glu Leu Tyr Ala Leu Tyr Asp Gln Phe Tyr
305 310 315 320
Val Ala Asn Glu Phe Leu Lys Tyr Arg Leu His Val Gly Asn Tyr Asn
325 330 335
Gly Thr Ala Gly Asp Ala Leu Arg Phe Asn Lys His Tyr Asn His Asp
340 345 350
Leu Lys Phe Phe Thr Thr Pro Asp Lys Asp Asn Asp Arg Tyr Pro Ser
355 360 365
Gly Asn Cys Gly Leu Tyr Tyr Ser Ser Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys
370 375 380
Leu Ser Ala Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Tyr His Gln Lys Tyr Arg Gly
385 390 395 400
Val Arg Asn Gly Ile Phe Trp Gly Thr Trp Pro Gly Val Ser Glu Ala
405 410 415
His Pro Gly Gly Tyr Lys Ser Ser Phe Lys Glu Ala Lys Met Met Ile
420 425 430
Arg Pro Lys His Phe Lys Pro
435
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcaaagaag tgcggaccct caag 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcggctgtct ctgctccatt cc 22