用于从乙酰-CoA生产异丁烯的改进手段和方法
阅读说明：本技术 用于从乙酰-CoA生产异丁烯的改进手段和方法 (Improved means and methods for production of isobutene from acetyl-CoA ) 是由 R·夏约 M·阿尼斯莫瓦 F·马丁 F·科拉斯 O·马哈茂德 于 2020-03-19 设计创作，主要内容包括：重组生物体或微生物,(A)其中在所述生物体或微生物中：(i)将乙酰-CoA酶促转化成乙酰乙酰-CoA,(ii)将乙酰乙酰-CoA酶促转化成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA,(iii)将3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA酶促转化成3-甲基戊烯二酰-CoA,(iv)将3-甲基戊烯二酰-CoA酶促转化成3-甲基巴豆酰-CoA,和(v)其中所述3-甲基巴豆酰-CoA通过以下方式转化成异丁烯：(a)将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-甲基巴豆酸,然后将其进一步酶促转化成所述异丁烯；或(b)将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酰-CoA,然后将其进一步酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酸,然后将其进一步酶促转化成3-膦氧基-3-甲基丁酸,然后将其进一步酶促转化成所述异丁烯；(B)其中所述重组生物体或微生物具有增加的超过衍生其的生物体或微生物的辅酶A(CoA)池,这是由于：(i)增加的泛酸摄取；和/或(ii)增加的泛酸向CoA的转化。此外,描述了这种重组生物体或微生物用于生产异丁烯的用途。此外,描述了通过在合适的培养基中在合适的条件下培养这样的重组生物体或微生物来生产异丁烯的方法。(A recombinant organism or microorganism, (a) wherein in said organism or microorganism: (i) enzymatically converting acetyl-CoA to acetoacetyl-CoA, (ii) enzymatically converting acetoacetyl-CoA to 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA, (iii) enzymatically converting 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA to 3-methylpentadienyl-CoA, (iv) enzymatically converting 3-methylpentadienyl-CoA to 3-methylcrotonyl-CoA, and (v) wherein said 3-methylcrotonyl-CoA is converted to isobutylene by: (a) enzymatically converting 3-methylcrotonyl-CoA into 3-methylcrotonic acid, which is then further enzymatically converted into said isobutene; or (b) enzymatically converting 3-methylcrotonyl-CoA into 3-hydroxy-3-methylbutyryl-CoA, which is then further enzymatically converted into 3-hydroxy-3-methylbutyric acid, which is then further enzymatically converted into 3-phosphinyloxy-3-methylbutyric acid, which is then further enzymatically converted into said isobutene; (B) wherein the recombinant organism or microorganism has an increased pool of coenzyme A (CoA) over the organism or microorganism from which it is derived due to: (i) increased pantothenate uptake; and/or (ii) increased conversion of pantothenate to CoA. Furthermore, the use of such recombinant organisms or microorganisms for the production of isobutene is described. Furthermore, a method for producing isobutene by culturing such a recombinant organism or microorganism in a suitable medium under suitable conditions is described.)
本发明涉及能够将乙酰-CoA酶促转化成异丁烯的重组生物体或微生物，(A)其中在所述生物体或微生物中：(i)将乙酰-CoA酶促转化成乙酰乙酰-CoA，(ii)将乙酰乙酰-CoA酶促转化成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA，(iii)将3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA酶促转化成3-甲基戊烯二酰-CoA，(iv)将3-甲基戊烯二酰-CoA酶促转化成3-甲基巴豆酰-CoA，和(v)其中所述3-甲基巴豆酰-CoA通过以下方式转化成异丁烯：(a)将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-甲基巴豆酸，然后将其进一步酶促转化成所述异丁烯；或(b)将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酰-CoA，然后将其进一步酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酸，然后将其进一步酶促转化成3-膦氧基-3-甲基丁酸，然后将其进一步酶促转化成所述异丁烯；(B)其中所述重组生物体或微生物具有增加的超过其衍生自的生物体或微生物的辅酶A(CoA)池，这是由于：(i)增加的泛酸摄取；和/或(ii)增加的泛酸向CoA的转化。此外，本发明涉及这种重组生物体或微生物用于生产异丁烯的用途。此外，本发明涉及通过在合适的培养基中在合适的条件下培养这样的重组生物体或微生物来生产异丁烯的方法。
目前，大量化合物源自石化产品。烯烃(例如，如乙烯、丙烯、不同的丁烯或戊烯)用于塑料工业中，例如用于生产聚丙烯或聚乙烯，以及用于化学工业的其他领域和燃料领域中。丁烯以四种形式存在，其中之一是异丁烯(isobutene)(也称为异丁烯(isobutylene))，进入甲基叔丁基醚(MTBE)的组成中，MTBE是汽车燃料的抗爆添加剂。异丁烯也可用于生产异辛烯，异辛烯又可还原为异辛烷(2,2,4-三甲基戊烷)；异辛烷的极高辛烷值使其成为所谓的“汽油”发动机的最佳燃料。烯烃(如异丁烯)目前是通过石油产品的催化裂化(或在己烯的情况下，由煤或天然气中的Fischer-Tropsch工艺的衍生物)生产的。因此，生产成本与石油价格密切相关。此外，催化裂化有时与相当大的技术困难相关，这增加了工艺复杂性和生产成本。
在与地球化学循环相协调的可持续工业运营的背景下，需要通过生物途径生产烯烃，如异丁烯。第一代生物燃料包括乙醇的发酵生产，因为发酵和蒸馏过程已经存在于食品加工业中。第二代生物燃料的生产正处于探索阶段，特别包括长链醇(丁醇和戊醇)、萜烯、直链烷烃和脂肪酸的生产。最近的两篇综述提供了该领域研究的一般概述：Ladygina等(Process Biochemistry 41(2006)，1001)和Wackett(Current Opinions in ChemicalBiology 21(2008)，187)。
已经描述了酵母小红酵母(Rhodotorula minuta)将异戊酸转化成异丁烯(Fujii等(Appl.Environ.Microbiol.54(1988)，583))，但该反应的效率远不允许工业应用。Fukuda等(BBRC 201(1994)，516)阐明了反应机理并涉及细胞色素P450酶，该酶通过还原氧化铁基FeV＝O使异戊酸脱羧。通过这种途径大规模生物合成异丁烯似乎非常不利，因为它需要合成和降解一分子亮氨酸以形成一分子异丁烯。此外，催化反应的酶使用血红素作为辅因子，不太适合在细菌中的重组表达和酶参数的改进。由于所有这些原因，这条途径似乎不太可能作为工业开发的基础。其他微生物已被描述为勉强能够从异戊酸天然生产异丁烯；获得的产率甚至低于用小红酵母获得的产率(Fukuda等(Agric.Biol.Chem.48(1984)，1679))。
Gogerty等(Appl.Environm.Microbiol.76(2010)，8004-8010)和van Leeuwen等(Appl.Microbiol.Biotechnol.93(2012)，1377-1387)描述了通过酶促转化从乙酰乙酰-CoA生产异丁烯，其中所提出途径的最后一步是通过使用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶转化3-羟基-3-甲基丁酸(也称为3-羟基异戊酸(HIV))。
这种从3-羟基-3-甲基丁酸生产异丁烯的反应也描述于WO2010/001078，其概括地描述了通过生物过程产生烯烃的方法，特别是从3-羟基链烷酸酯类型的分子生产末端烯烃(特别是丙烯、乙烯、1-丁烯、异丁烯或异戊烯)。
WO2012/052427还描述了一种通过生物过程产生烯烃的方法，特别是描述了一种从3-羟基链烷酸酯类型的分子生产烯烃(例如丙烯、乙烯、1-丁烯、异丁烯或异戊烯)的方法。在这个内容中，WO2012/052427中还描述了从3-羟基-3-甲基丁酸生产异丁烯的反应。
WO 2016/042012描述了生产所述3-羟基-3-甲基丁酸的方法。特别地，WO 2016/042012描述了用于生产3-羟基-3-甲基丁酸的方法，包括将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-甲基巴豆酸的步骤以及将由此产生的3-甲基巴豆酸进一步酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酸的步骤。
在Gogerty等(loc.cit.)和van Leeuwen等(loc.cit.)中，提出经由3-羟基-3-甲基丁酰-CoA转化3-甲基巴豆酰-CoA来生产3-羟基-3-甲基丁酸。为了进一步提高从可再生资源生产异丁烯的方法的效率和可变性，通过提供包括酶促转化3-甲基巴豆酸(也称为3-甲基-2-丁烯酸、3,3-二甲基丙烯酸或异戊烯酸)转化成异丁烯的异丁烯生产方法来研发用于提供异丁烯及其前体的可替换途径。
特别地，在WO 2017/085167中，已经描述了用于生产异丁烯的方法，包括将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯，其中3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯是通过使用与FMN异戊二烯转移酶相关的FMN-依赖性脱羧酶来实现的，其中所述FMN异戊二烯转移酶利用二甲基烯丙基磷酸(DMAP)将黄素辅因子(FMN或FAD)的异戊二烯化催化成黄素衍生的辅因子，而这些酶已被人为地用于最终导致产生异丁烯的途径中。此外，在WO2017/085167中，已经描述了方法，其中这样的方法进一步包括(a)通过将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-甲基巴豆酸来提供3-甲基巴豆酸，或(b)通过将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸来提供3-甲基巴豆酸。
WO 2017/085167还描述了这种为从3-甲基巴豆酰-CoA经由3-甲基巴豆酸或从3-羟基异戊酸(HIV)经由3-甲基巴豆酸生产异丁烯而开发的方法可以嵌入到从乙酰-CoA开始生产异丁烯的途径，乙酰-CoA是许多生化反应中使用的代谢中的中心成分和重要的关键分子。相应的反应示意图如图1所示。
WO 2018/206262中，描述了使用二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)代替DMAP时，通过使用与FMN异戊二烯转移酶相关的FMN-依赖性脱羧酶，将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯。
此外，WO 2018/206262描述了通过使用与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN-依赖性脱羧酶实现3-甲基巴豆酸向异丁烯的酶促转化，其中所述FMN异戊二烯基转移酶将黄素辅因子(FMN或FAD)利用二甲基烯丙基磷酸(DMAP)和/或二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的异戊二烯化催化成黄素衍生的辅因子，其是上述从乙酰-CoA到异丁烯的整个代谢途径的关键步骤。已经发现了在这个关键步骤中，二甲基烯丙基磷酸(DMAP)和/或二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)的可用性以及黄素辅因子FMN的可用性是限制因素，而在WO 2018/206262中，描述了改进的方法，通过增加二甲基烯丙基磷酸(DMAP)和/或二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的池/量，以确保异戊二烯化的黄素辅因子(FMN或FAD)的有效生物合成。
虽然，如上所述，现有技术中已经描述了通过生物系统中的酶促转化生产异丁烯的各种方法，从而允许使用可再生资源作为原材料，但仍然需要改进这些方法的效率和有效性，以便提高产量并使其具有商业吸引力。
本发明通过提供能够将乙酰-CoA酶促转化成异丁烯的重组生物体或微生物满足了这种需求，
(A)其中在所述生物体或微生物中：
(i)将乙酰-CoA酶促转化成乙酰乙酰-CoA，
(ii)将乙酰乙酰-CoA酶促转化成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA，
(iii)将3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA酶促转化成3-甲基戊烯二酰-CoA，
(iv)将3-甲基戊烯二酰-CoA酶促转化成3-甲基巴豆酰-CoA，和
(v)其中通过以下方式将所述3-甲基巴豆酰基-CoA转化成异丁烯：
(a)将3-甲基巴豆酰基-CoA酶促转化成3-甲基巴豆酸，然后将其进一步酶促转化成所述异丁烯；或
(b)将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酰-CoA，然后将其进一步酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酸，然后将其进一步酶促转化成3-膦氧基-3-甲基丁酸，然后将其进一步酶促转化成所述异丁烯；
(B)其中所述重组生物体或微生物具有增加的超过其衍生自的生物体或微生物的辅酶A(CoA)池，这是由于：
(i)增加的泛酸摄取；和/或
(ii)增加的泛酸向CoA的转化。
此外，本发明提供了如上定义的重组生物体或微生物用于生产异丁烯的用途。
此外，本发明提供了通过在合适的条件下在合适的培养基中培养如上定义的重组生物体或微生物来生产异丁烯的方法。
最后，本发明提供了一种在重组生物体或微生物中从乙酰-CoA生产异丁烯的方法，包括：
(A)(i)将乙酰-CoA酶促转化成乙酰乙酰-CoA，
(ii)将所述产生的乙酰乙酰-CoA酶促转化成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA，
(iii)将所述产生的3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA酶促转化成3-甲基戊烯二酰-CoA，
(iv)将所述产生的3-甲基戊烯二酰-CoA酶促转化成3-甲基巴豆酰-CoA，和
(v)通过以下方式将所述产生的3-甲基巴豆酰基-CoA转化成异丁烯：
(a)将3-甲基巴豆酰基-CoA酶促转化成3-甲基巴豆酸，然后将其进一步酶促转化成所述异丁烯；或
(b)将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酰-CoA，然后将其进一步酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酸，然后将其进一步酶促转化成3-膦氧基-3-甲基丁酸，然后将其进一步酶促转化成所述异丁烯；
(B)其中所述方法进一步包括：
从CoA通过酶促提供乙酰-CoA，
(C)其中所述方法进一步包括通过在合适的条件下在合适的培养基中培养重组生物体或微生物来提供辅酶A(CoA)，其中所述重组生物体或微生物具有增加的超过其衍生自的生物体或微生物的辅酶A(CoA)池，这是由于：
(i)增加的泛酸摄取；和/或
(ii)增加的泛酸向CoA的转化。
本发明基于通过在用于异丁烯生产的细胞中提供和维持高乙酰-CoA池来增加异丁烯产量的概念，其中通过确保细胞增加的泛酸摄取和/或增加的泛酸向CoA的转化来保持高乙酰-CoA池。
乙酰-CoA是辅酶A(CoASH或CoA)的乙酰化形式。CoA的化学结构如图2中所示。CoA由通过酰胺键与维生素泛酸连接的β-巯基乙胺基团和3'-磷酸化ADP组成。在乙酰-CoA中，乙酰-CoA的乙酰基与β-巯基乙胺基团的巯基取代基连接。这种硫酯键是一种“高能”键，特别有反应性。
根据本发明的重组生物体或微生物以及方法对于体外或体内的大规模异丁烯生产特别有用，特别是对于商业化生产。因此，本发明涉及用于大规模生产的方法，特别是异丁烯的商业生产，其中所述方法包括如上所述的步骤。
乙酰-CoA酶促转化成异丁烯
如上所述，已经描述了经由3-甲基巴豆酸从3-甲基巴豆酰-CoA或经由3-甲基巴豆酸从3-羟基异戊酸(HIV)生产异丁烯的方法(参见图1以及图3中为概览显示的右边途径路线)。利用这些途径和酶促转化的方法以及重组生物体和微生物已特别描述于WO 2017/085167和WO 2018/206262。
此外，已经描述了通过3-羟基-3-甲基丁酰-CoA从3-甲基巴豆酰-CoA生产异丁烯的方法，然后将其进一步酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酸，然后将其进一步酶促转化成3-膦氧基-3-甲基丁酸，然后将其进一步酶促转化成所述异丁烯(参见图3中所示的左边的途径路线)。此外，对于这些途径，已经描述了它们可以嵌入用于从乙酰-CoA生产异丁烯的途径中。利用这些途径和酶促转化的方法以及重组生物体和微生物已特别描述于WO2010/001078、WO2012/052427和WO 2016/042012。
因此，在现有技术中，也描述了能够将乙酰-CoA酶促转化成异丁烯的相应重组生物体或微生物，其利用上述途径。用于通过不同的可能的途径从乙酰-CoA酶促转化成异丁烯的其他可能的途径图示于图1和图3中。图3显示了本发明相关的主要途径。然而，如上所示，存在其他可能的途径，并且本发明也涉及这些将乙酰-CoA酶促转化成异丁烯的途径。
在下文中，更详细地描述了如现有技术WO 2017/085167、WO 2018/206262、WO2010/001078、WO2012/052427和WO 2016/042012中分别描述的以及如图1和图3图示的单个酶促转化的主要反应。
然而，本发明不限于这些主要反应，而且还涉及现有技术文件WO 2017/085167、WO2018/206262、WO2010/001078、WO2012/052427和WO 2016/042012中所述的用于将乙酰-CoA转化成异丁烯的单独步骤的所有其他途径。这些文件的公开内容，特别是关于用于其中所述途径的单独转化的酶的优选实施方案，特此以其整体按引用并入。因此，在优选实施方案中，优选使用选自这些现有技术文件中所述的优选实施方案的酶，并结合各自的酶转化。因此，这同样适用于以下描述的本发明的酶促转化，如分别在WO 2017/085167、WO 2018/206262、WO2010/001078、WO2012/052427和WO 2016/042012中阐述的。
乙酰-CoA酶促转化成乙酰乙酰-CoA
根据本发明，可以通过不同的途径来实现乙酰-CoA转化成乙酰乙酰-CoA。一种可能是首先将乙酰-CoA转化成丙二酰-CoA(如图1中所示的步骤XIV)，然后将所述丙二酰-CoA和乙酰-CoA进一步缩合成乙酰乙酰-CoA(如图1中所示的步骤XV)。另一种可能是在单个酶促反应中将两分子的乙酰-CoA直接缩合成乙酰乙酰-CoA(如图1中所示的步骤XIII)。
将乙酰-CoA促转化成丙二酰-CoA优选使用乙酰-CoA羧化酶(EC 6.4.1.2)(如图1中所示的步骤XIV)。这种自然发生反应利用ATP将CO2固定在乙酰-CoA上，从而产生丙二酰-CoA。
此外，将丙二酰-CoA和乙酰-CoA促缩合成所述乙酰乙酰-CoA优选使用乙酰乙酰-CoA合酶(EC 2.3.1.194)(如图1中所示的步骤XV)。这是自然发生反应并在脱羧反应中缩合丙二酰-CoA和乙酰-CoA。
或者，将乙酰-CoA酶促转化成所述乙酰乙酰-CoA由单个酶促反应组成，其中通过两分子的乙酰-CoA酶促缩合成乙酰乙酰-CoA，从而将乙酰-CoA直接转化成乙酰乙酰-CoA。优选，通过使用乙酰-CoA乙酰转移酶(EC2.3.1.9)来实现这个酶促转化。这个反应是自然发生反应(如图1中所示的步骤XIII)。
乙酰乙酰-CoA酶促转化成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA
乙酰乙酰-CoA酶促转化成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA是乙酰乙酰-CoA和乙酰-CoA酶促缩合成所述3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA(参见图1的步骤IX)。
这种缩合优选使用3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶(也称为HMG-CoA合酶)。HMG-CoA合酶归类于EC 2.3.3.10(之前，已将HMG-CoA合酶归类为EC 4.1.3.5，但已经转至EC2.3.3.10)。术语“HMG-CoA合酶”是指能够催化其中乙酰-CoA与乙酰乙酰-CoA缩合形成3-羟基-3-甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)的反应的任何酶。HMG-CoA是甲羟戊酸途径的一部分。已经鉴定了几条用于异戊烯焦磷酸(IPP)合成的途径，即，甲羟戊酸途径和2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸/1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(MEP/DOXP)途径。HMG-CoA合酶催化乙酰-CoA与乙酰乙酰-CoA的生物Claisen缩合，并且是酰基缩合酶超家族的成员，所述超家族包括β-酮硫解酶、脂肪酸合酶(β-酮酰基载体蛋白合酶)和聚酮合酶。
3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA酶促转化成3-甲基戊烯二酰-CoA
3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA酶促转化成3-甲基戊烯二酰-CoA是自然发生的酶促脱水反应，并且其例如通过归类为3-甲基戊烯二酰-辅酶A水合酶(EC 4.2.1.18)的酶来催化。因此，3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA酶促转化成3-甲基戊烯二酰-CoA优选使用3-甲基戊烯二酰-辅酶A水合酶(EC 4.2.1.18)(如图1的步骤VIII所示的)。
3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA转化成3-甲基戊烯二酰-CoA也可以通过利用3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A脱水酶活性来实现，所述脱水酶活性已经例如在黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)中鉴定并由liuC基因编码(Li等，Angew.Chem.Int.编辑，52(2013)，1304-1308)。源自黄色粘球菌的3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A脱水酶具有Uniprot登录号Q1D5Y4。
3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA酶促转化成3-甲基戊烯二酰-CoA还可以通过利用3-羟酰-CoA脱水酶或烯醇-CoA水合酶来实现。3-羟酰-CoA脱水酶和烯醇-CoA水合酶催化相同的反应，其中一种酶的名称表示相应反应的一个方向，而另一个名称表示逆向反应。由于反应是可逆的，因此可以使用两种酶名称。3-羟酰-CoA脱水酶和烯酰-CoA水合酶属于归类为EC4.2.1.-的酶。
3-甲基戊烯二酰-CoA酶促转化成3-甲基巴豆酰-CoA
3-甲基戊烯二酰-CoA转化成3-甲基巴豆酰-CoA可以通过不同的酶来催化，例如，利用(i)甲基巴豆酰-CoA羧化酶(EC 6.4.1.4)；或(ii)香叶酰-CoA(geranoyl-CoA)羧化酶(EC 6.4.1.5)(如图1的步骤VII中所示的)。
在另一个优选实施方案中，通过3-甲基戊烯二酰-CoA脱羧酶(例如，由liuB基因编码的黄色粘球菌的3-甲基戊二酰-CoA脱羧酶)来催化3-甲基戊烯二酰-CoA通过脱羧转化成3-甲基巴豆酰-CoA。这个基因编码具有两个亚基AibA和AibB的酶(Li等，Angew.Chem.Int.编辑，52(2013)，1304-1308)。
3-甲基巴豆酰-CoA经由3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯
3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酸可以例如通过不同的途径来实现，例如，通过以下所述的和图1中所示的(如图1中所示的步骤VIa、步骤VIb或步骤VIc)三种可替换的酶促途径来实现。
因此，可以通过以下方式将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-甲基巴豆酸
(a)单酶促反应，其中将3-甲基巴豆酰-CoA直接转化成3-甲基巴豆酸，优选利用CoA转移酶(EC 2.8.3.-)，优选丙酸:乙酸-CoA转移酶(EC2.8.3.1)、乙酸CoA转移酶(EC2.8.3.8)或琥珀酰-CoA:乙酸-CoA转移酶(EC 2.8.3.18)(如图1中所示的步骤VIa)；
(b)单酶促反应，其中将3-甲基巴豆酰-CoA直接转化成3-甲基巴豆酸，优选利用硫酯水解酶(EC 3.1.2.-)，优选乙酰-CoA水解酶(EC 3.1.2.1)、ADP依赖性短链酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.18)或酰基-CoA水解酶(EC3.1.2.20)(如图1中所示的步骤VIb)；或
(c)双酶促步骤，包括
(i)首先将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-甲基巴豆酰磷酸；和
(ii)然后将由此获得的3-甲基巴豆酰磷酸酶促转化成所述的3-甲基巴豆酸(如图1中所示的步骤VIc)。
关于(c)，通过包括(i)首先将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-甲基巴豆酰磷酸；和(ii)然后将由此获得的3-甲基巴豆酰磷酸酶促转化成所述的3-甲基巴豆酸的双酶促步骤来实现3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-甲基巴豆酸。
例如，可以通过使用磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)或磷酸乙酰转移酶(EC2.3.1.8)来实现3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酰磷酸。
例如，可以通过利用归类为EC 2.7.2.-的酶(即，磷酸转移酶)来实现3-甲基巴豆酰磷酸转化成3-甲基巴豆酸。该酶利用羧基作为受体。因此，3-甲基巴豆酰磷酸转化成3-甲基磷酸例如可以利用使用羧基作为受体的酶(EC 2.7.2.-)来实现。在优选实施方案中，3-甲基巴豆酰磷酸转化成3-甲基巴豆酸通过使用丙酸激酶(EC 2.7.2.15)、乙酸激酶(EC2.7.2.1)、丁酸激酶(EC 2.7.2.7)或支链脂肪酸激酶(EC 2.7.2.14)来实现。
如上所述，3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酸可以通过两种可替换的转换来实现，其中将3-甲基巴豆酰直接转化成3-甲基巴豆酸。
优选，在一个实施方案中，通过利用属于硫酯水解酶家族的酶(在下文中称为硫酯酶(EC 3.1.2.-))，通过将3-甲基巴豆酰-CoA的硫酯碱水解成3-甲基巴豆酸，将3-甲基巴豆酰-CoA直接转化成3-甲基巴豆酸；如图1中所示的步骤VIb。
硫酯酶(TE；也称为硫酯水解酶)是归类为EC 3.1.2的酶。目前硫酯酶归类为EC3.1.2.1到EC 3.1.2.30，同时将尚未归类/未归类的TE分组为属于EC 3.1.2.-的酶。Cantu等(Protein Science 19(2010)，1281-1295)描述了存在23个硫酯酶家族，关于一级结构，其彼此无关。然而，认为同一家族的所有成员具有基本上相同的三级结构。硫酯酶水解羰基和硫原子之间的硫酯键。
在优选实施方案中，根据本发明所用的用于将3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酸的硫酯酶选自：
-乙酰-CoA水解酶(EC 3.1.2.1)；
-棕榈酰-CoA水解酶(EC 3.1.2.2)；
-3-羟基异丁酰-CoA水解酶(EC 3.1.2.4)；
-油酰-[酰基-载体-蛋白]水解酶(EC 3.1.2.14)；
-ADP依赖性短链酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.18)；
-ADP依赖性中链酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.19)；
-1,4-二氢-2-萘酰-CoA水解酶(EC 3.1.2.28)；和
-酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.20)。
在更优选的实施方案中，根据本发明使用的硫酯酶/硫酯水解酶(EC3.1.2.-)是乙酰-CoA水解酶(EC 3.1.2.1)、ADP依赖性短链酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.18)、1,4-二氢-2-萘酰-CoA水解酶(EC 3.1.2.28)和酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.20)。
在可替换的实施方案中，将3-甲基巴豆酰-CoA直接转化成3-甲基巴豆酸，优选通过利用属于CoA转移酶家族的酶(EC 2.8.3.-)，其能够将3-甲基巴豆酰-CoA的CoA基团转移至羧酸(如图1中所示的步骤VIa)。
在来自所有血统的生物体中都发现了CoA-转移酶。大部分CoA-转移酶属于两个公知的酶家族(在下文中称为家族I和II)，并且存在第三个家族，其已经在细菌的厌氧代谢途径中鉴定。描述不同家族的概述可以在Heider(FEBS Letters 509(2001)，345-349)中找到。
优选，根据本发明所用的用于将3-甲基巴豆酰-CoA直接转化成3-甲基巴豆酸的CoA-转移酶选自：
-丙酸:乙酸-CoA转移酶(EC 2.8.3.1)；
-乙酸CoA-转移酶(EC 2.8.3.8)；和
-丁酸-乙酰乙酸CoA-转移酶(EC 2.8.3.9)。
在更优选的实施方案中，CoA转移酶(EC 2.8.3-)是丙酸:乙酸-CoA转移酶(EC2.8.3.1)、乙酸CoA-转移酶(EC 2.8.3.8)和琥珀酰-CoA:乙酸CoA-转移酶(EC 2.8.3.18)。
用于提供3-甲基巴豆酸的可替换路径
如上所示，可以通过乙酰-CoA酶促转化成乙酰乙酰-CoA(如图1中所示的步骤XIV、步骤XV、步骤XIII)、乙酰乙酰-CoA酶促转化成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA(图1的步骤IX)、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA酶促转化成3-甲基戊烯二酰-CoA(图1的步骤VIII)、3-甲基戊烯二酰-CoA酶促转化成3-甲基巴豆酰-CoA(图1的步骤VII)和3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-甲基巴豆酸，可以从乙酰-CoA通过酶促提供3-甲基巴豆酸(然后将其进一步酶促转化成异丁烯，如以下进一步详细描述的)。
在可替换的路径中，根据本发明，可以通过另一条可能的途径从乙酰-CoA提供3-甲基巴豆酸。在这条途径中，如上所述，将乙酰CoA酶促转化成乙酰乙酰-CoA。
根据这条可替换的路径，随后将乙酰乙酰-CoA酶促转化成乙酰乙酸(图1的步骤Va或Vb)，将乙酰乙酸进一步酶促转化成丙酮(图1的步骤IV)，将丙酮进一步酶促转化成3-羟基异戊酸(HIV)(图1的步骤III)，然后将其进一步酶促转化成所述的3-甲基巴豆酸。
以下更详细地描述这条可替换途径的单独酶促步骤。
乙酰乙酰-CoA酶促转化成乙酰乙酸
可以通过两条不同的路径实现乙酰乙酰-CoA转化成乙酰乙酸。一个可能性是通过将乙酰乙酰-CoA的CoA硫酯水解成乙酰乙酸，将乙酰乙酰-CoA转化成乙酰乙酸(如图1中所示的步骤Va)。在另一个更优选的方面中，在乙酸酯上转移乙酰乙酰-CoA的CoA基团，导致乙酰乙酸和乙酰-CoA的形成(如图1中所示的步骤Vb)。
如所述的，在一个方面中，乙酰乙酰-CoA的CoA硫酯水解，获得了乙酰乙酸。根据本发明的这个方面，通过优选利用天然催化这个反应的乙酰乙酰-CoA水解酶(EC 3.1.2.11)来实现乙酰乙酰-CoA酶促转化成乙酰乙酸。
如所述的，在另一个更优选的可能性中，在乙酸上转移乙酰乙酰-CoA的CoA基团，导致乙酰乙酸和乙酰-CoA的形成。根据本发明的这种可能性，通过优选利用能够在乙酸上转移乙酰乙酰-CoA的CoA基团的酶来实现乙酰乙酰-CoA酶促转化成乙酰乙酸。
优选，这样的能够在乙酸上转移乙酰乙酰-CoA的酶属于CoA转移酶家族(EC2.8.3.-)。
因此，本发明涉及一种通过利用能够在乙酸酯上转移乙酰乙酰-CoA的CoA基团的酶(优选CoA转移酶(EC 2.8.3.-))将乙酰乙酰-CoA酶促转化成乙酰乙酸的方法。优选的可以用于本发明方法中的催化乙酰乙酰-CoA转化成乙酰乙酸的酶的实例是归类为乙酸CoA转移酶(EC 2.8.3.8)的酶。
乙酰乙酸酶促转化成丙酮
乙酰乙酸转化成丙酮图示于图1的步骤IV中。这个反应是脱羧反应，并且是在能够产生丙酮的生物体(即梭状芽孢杆菌属(Clostridia)的生物体)中自然发生的反应。根据本发明，乙酰乙酸转化成所述丙酮优选利用乙酰乙酸脱羧酶(EC 4.1.1.4)。
丙酮和乙酰-CoA酶促缩合成3-羟基异戊酸(HIV)
丙酮和乙酰-CoA缩合成所述3-羟基异戊酸(HIV)图示于图1的步骤III中。这个缩合优选利用能够催化丙酮的氧代(oxo)(即，C＝O)基团的碳原子和乙酰-CoA(特别是乙酰-CoA的甲基)之间形成共价键的酶。根据这个反应方案，丙酮的氧代基作为亲电子试剂反应，而乙酰-CoA的甲基作为亲核试剂反应。
能够将丙酮和乙酰-CoA酶促缩合成3-羟基异戊酸(HIV)的酶是本领域已知的并且例如已描述于WO 2011/0322934。
优选，丙酮和乙酰-CoA酶促缩合成3-羟基异戊酸(HIV)中使用的酶是具有HMG CoA合酶(EC 2.3.3.10)活性的酶和/或PksG蛋白和/或具有C-C键断裂/缩合裂解酶(优选归类为异丙基苹果酸合酶(EC 2.3.3.13)，如高柠檬酸合酶(EC 2.3.3.14)或4-羟基-2-酮戊酸醛缩酶(EC 4.1.3.39))活性的酶，如HMG CoA裂解酶(EC 4.1.3.4)。
3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸
3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸图示于图1的步骤II中。这种转化优选利用催化β-羟酸(即，例如，3-羟基异戊酸(HIV))脱水成α,β-不饱和酸(即，例如，3-甲基巴豆酸)的酶。属于“脱水”通常是指涉及除去H2O的反应。优选，这样的酶属于水-裂解酶(EC4.2.-.-)家族。归类为EC 4.2.-.-(即，水-裂解酶)的此类酶的优选实例为：
乌头酸酶(EC 4.2.1.3)；
延胡索酸酶(EC 4.2.1.2)；和
烯酰-CoA水合酶/脱水酶(EC 4.2.1.17)。
3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯
3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯图示于图1的步骤I中。这种转化可以通过利用与FMN异戊二烯转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶的脱羧来实现。“脱羧”通常是除去羧基并释放二氧化碳(CO2)的化学反应。
利用与FMN异戊二烯转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯依赖于由两种酶催化的两个连续步骤的反应，即，与FMN异戊二烯转移酶(其提供修饰的黄素辅因子)相关的FMN依赖性脱羧酶(催化3-甲基巴豆酸实际脱羧成异丁烯)。
黄素辅因子优选是FMN或FAD。FMN(黄素单核苷酸；也称为核黄素-5’-磷酸)是通过酶核黄素激酶从核黄素(维生素B2)产生的生物分子并作为各种反应的辅基。FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)是氧化还原辅因子，更具体的是辅基，参与代谢中的几个重要反应。
因此，在3-甲基巴豆酸转化成异丁烯中，在第一步中，将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成(修饰的)黄素衍生的辅因子。这种修饰通过所述FMN异戊二烯转移酶来催化。FMN异戊二烯转移酶将黄素辅因子(FMN或FAD)的黄素环异戊二烯成(修饰的)异戊二烯化的黄素辅因子。更具体地，FMN异戊二烯转移酶利用二甲基烯丙基磷酸(DMAP)或二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)将黄素辅因子(FMN或FAD)的异戊二烯化催化成黄素衍生的辅因子。
在第二步中，通过所述FMN依赖性脱羧酶经由基于1,3-偶极环加成的机制催化3-甲基巴豆酸实际转化成异丁烯，其中所述FMN依赖性脱羧酶利用由相关的FMN异戊二烯转移酶提供的异戊二烯化的黄素辅因子(FMN或FAD)。
在优选实施方案中，所述将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成(修饰的)黄素衍生的辅因子(利用二甲基烯丙基磷酸(DMAP)或二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP))的FMN异戊二烯转移酶是苯丙烯酸脱羧酶(PAD)型蛋白，或密切相关的原核生物酶UbiX，这是参与原核生物中的泛醌生物合成的酶。
在大肠杆菌中，蛋白UbiX(也称为3-辛异戊二烯-4-羟基苯甲酸羧基-裂解酶)已经显示出参与泛醌生物合成的第三步。
在优选实施方案中，通过含FMN蛋白质苯丙烯酸脱羧酶(PAD)催化黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成相应(修饰的)黄素衍生的辅因子。参与将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成相应的黄素衍生的辅因子的酶最初被注解为脱羧酶(EC 4.1.1.-)。一些苯丙烯酸脱羧酶(PAD)现在被注解为EC 2.5.1.-的黄素异戊二烯转移酶。对于黄素异戊二烯转移酶，能够催化本文所述的酶促反应的酶最近也被注解为EC 2.5.1.129的黄素异戊二烯转移酶。
在更优选的实施方案中，3-甲基巴豆酸转化成异丁烯利用苯丙烯酸脱羧酶(PAD)型蛋白，如将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成相应(修饰的)黄素衍生的辅因子的FMN异戊二烯转移酶，其中所述苯丙烯酸脱羧酶(PAD)型蛋白源自白色念珠菌(Candida albicans)(Uniprot登录号Q5A8L8)、黑曲霉(Aspergillus niger)(Uniprot登录号A3F715)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Uniprot登录号P33751)或格蒂隐球菌(Cryptococcusgattii)(Uniprot登录号E6R9Z0)。
在另一个优选实施方案中，通过也称为UbiX(最初注解为EC 4.1.1.-)的含FMN蛋白3-辛异戊二烯-4-羟基苯甲酸羧基-裂解酶催化黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成相应(修饰的)黄素衍生的辅因子。如上所述，参与将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成相应(修饰的)黄素衍生的辅因子的酶最初被注解为脱羧酶。一些苯丙烯酸脱羧酶(PAD)现在被注解为EC2.5.1.-的黄素异戊二烯转移酶。
如上所述，对于黄素异戊二烯转移酶，能够催化本文所述的酶促反应的酶最近也被注解为EC 2.5.1.129的黄素异戊二烯转移酶。
在更优选的实施方案中，将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯利用3-辛无儿媳-4-羟基苯甲酸羧基-裂解酶(也称为UbiX)作为FMN异戊二烯转移酶，其将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成相应(修饰的)黄素衍生的辅因子，其中所述3-辛异戊二烯-4-羟基苯甲酸羧基-裂解酶(也称为UbiX)源自大肠杆菌(Escherichia coli)(Uniprot登录号P0AG03)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Uniprot登录号A0A086WXG4)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(Uniprot登录号A0A072ZCW8)或肠杆菌(Enterobacter sp.)DC4(Uniprot登录号W7P6B1)。
在另一个优选实施方案中，通过源自大肠杆菌的分别由kpdB和ecdB(分别为Uniprot登录号A0A023LDW3和Uniprot登录号P69772)编码的Ubx-样黄素异戊二烯转移酶和源自肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniase)的由kpdB编码的Ubx-氧黄素异戊二烯转移酶来催化黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成相应(修饰的)黄素衍生的辅因子。
在另一个优选实施方案中，通过黄素异戊二烯转移酶催化黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成相应(修饰的)黄素衍生的辅因子。
如上所述，通过FMN依赖性脱羧酶经由基于1,3-偶极环加成的机制催化实际脱羧，即3-甲基巴豆酸转化成异丁烯，其中所述FMN依赖性脱羧酶利用由上述任一种相关的FMN异戊二烯转移酶提供的异戊二烯化黄素辅因子(FMN或FAD)。
在优选实施方案中，通过阿魏酸脱羧酶(FDC)催化所述FMN依赖性脱羧酶催化3-甲基巴豆酸脱羧成异丁烯。阿魏酸脱羧酶(FDC)术语类别EC 4.1.1.-的酶。
在甚至更优选的实施方案中，3-甲基巴豆酸转化成异丁烯利用阿魏酸脱羧酶(FDC)，其源自酿酒酵母(Uniprot登录号Q03034)、肠杆菌(Uniprot登录号V3P7U0)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)(Uniprot登录号Q45361)、黑曲霉(Uniprot登录号A2R0P7)或都柏林念珠菌(Candida dubliniensis)(Uniprot登录号B9WJ66)。
在另一个更优选的实施方案中，3-甲基巴豆酸转化成异丁烯利用原儿茶酸脱羧酶(EC 4.1.1.63)。
在本发明的优选实施方案中，本发明的方法中使用的PCA脱羧酶是源自以下的PCA脱羧酶：肺炎克雷伯菌(Uniprot登录号B9AM6)、细鞘丝藻属(Leptolyngbya sp).(Uniprot登录号A0A0S3U6D8)或嗜酸杆菌(Phascolarctobacterium)sp.(Uniprot登录号R6IIV6)。
在另一个优选实施方案中，所述将3-甲基巴豆酸脱羧成异丁烯的FMN依赖性脱羧酶是与以上阿魏酸脱羧酶(FDC)密切相关的酶，即3-聚异戊二烯-4-羟基苯甲酸脱羧酶(也称为UbiD)。3-聚异戊二烯-4-羟基苯甲酸脱羧酶属于归类为EC 4.1.1.-的UbiD脱羧酶家族。
在更优选的实施方案中，3-甲基巴豆酸转化成异丁烯利用源自以下的3-聚异戊二烯-4-羟基苯甲酸脱羧酶(UbiD)：Hypocrea atroviridis(UniProt登录号G9NLP8)、Sphaerulina musiva(UniProt登录号M3DF95)、罗克福尔青霉(Penecillinum requeforti)(UniProt登录号W6QKP7)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)f.sp.lycopersici)(UniProt登录号W9LTH3)、库德里阿兹威氏酵母(Saccharomyces kudriavzevii)(UniProt登录号J8TRN5)、酿酒酵母、寄生曲霉(Aspergilus parasiticus)、白色念珠菌、Grosmanniaclavigera、大肠杆菌(Uniprot登录号P0AAB4)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)(Uniprot登录号D5DTL4)、甲烷热杆菌属(Methanothermobacter)CaT2(Uniprot登录号T2GKK5)、龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae)1518(Uniprot登录号X8EX86)或阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)(Uniprot登录号V3DX94)。
在另一个更优选的实施方案中，3-甲基巴豆酸转化成异丁烯利用UbiD-样脱羧酶，其源自链霉菌属(Streptomyces sp)(UniProt登录号A0A0A8EV26)。
在甚至更优选的实施方案中，源自链霉菌属的UbiD-样脱羧酶是包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21至少n％相同的序列的酶，n为10至100的整数，优选10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、94、94、95、96、97、98或99，和其中酶具有将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的酶活性。
关于序列同一性的确定，以下内容应适用：当被比较的序列具有不同长度时，同一性程度是指较短序列中与较长序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比或较长序列中与较短序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。优选地，是指较短序列中与较长序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。序列同一性的程度可以根据本领域公知的方法使用优选合适的计算机算法(如CLUSTAL)来确定。
例如，使用Clustal分析方法来确定特定序列是否与参考序列至少60％相同时，可以使用默认设置或设置优选如下：Matrix：blosum 30；开放缺口罚分：10.0；延伸缺口罚分：0.05；延迟发散：40；缺口分离距离：8，用于氨基酸序列的比较。对于核苷酸序列比较，最好将延伸缺口罚分设置为5.0。
在优选实施方案中，将ClustalW2用于比较氨基酸序列。在成对比较/比对的情况下，优选选择以下设置：蛋白质权重矩阵：BLOSUM 62；缺口开放：10；缺口延伸：0.1。在多重比较/比对的情况下，优选选择以下设置：蛋白质重量矩阵：BLOSUM 62；缺口开放：10；缺口延伸：0.2；缺口距离：5；无末端缺口。
优选，在整个序列长度上计算同一性程度。
用于将3-甲基巴豆酰-CoA经由3-羟基3-甲基丁酰-CoA、3-羟基-3-甲基丁酸和3- 膦氧基-3-甲基丁酸酶促转化成异丁烯的可替换路径
如上所述，根据本发明，在一条可能的路径中，将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成异丁烯，将3-甲基巴豆酰-CoA通过3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯。这条路径如上所述。
在可替换的路径中，可以通过另一条可能的路径来提供异丁烯，其中将3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-羟基-3-甲基丁酰-CoA，然后将其进一步酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酸，然后将其进一步酶促转化成3-膦氧基-3-甲基丁酸，然后将其进一步酶促转化成所述异丁烯。以下描述这些单独的步骤。3-甲基巴豆酰-CoA经由3-羟基-3-甲基丁酰-CoA酶促转化 成3-羟基-3-甲基丁酸
根据本发明，3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酸包括步骤：
(a)将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酰-CoA；和
(b)将由此产生的3-羟基-3-甲基丁酰-CoA进一步酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酸。
根据上述方法步骤(a)的3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酰-CoA可以例如通过使用以下酶来实现
(i)3-羟基丙酰-CoA脱水酶(EC 4.2.1.1.116)；
(ii)3-羟基丁酰-CoA脱水酶(EC 4.2.1.55)；
(iii)烯醇-CoA水合酶(EC 4.2.1.17)；
(iv)3-羟基辛酰-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2.1.59)
(v)巴豆酰-[酰基-载体-蛋白]水合酶(EC 4.2.1.58)
(vi)3-羟基癸酰-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2.1.60)
(vii)3-羟基棕榈酰-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2.1.61)
(viii)长链-烯醇-CoA水合酶(EC 4.2.1.74)
(ix)3-甲基戊二酰-CoA水合酶(EC 4.2.1.18)。
3-羟基3-甲基丁酰-CoA转化成3-羟基-3-甲基丁酸(步骤(b))可以通过直接转化或替换地通过经由3-羟基-3-甲基丁酰磷酸酯的两步反应来实现。
直接转化可以例如利用以下的酶来实现
(i)硫酯酶(EC 3.1.2)；或
(ii)CoA-转移酶(EC 2.8.3)
两步转化可以如下概括：
(i)3-羟基-3-甲基丁酰-CoA+H3PO4→3-羟基-3-甲基丁酰磷酸酯+CoA
(ii)3-羟基-3-甲基丁酰磷酸酯+ADP→3-羟基-3-甲基丁酸+ATP
3-羟基-3-甲基丁酰-CoA转化成3-羟基-3-甲基丁酰磷酸酯可以例如通过使用磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)或磷酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.8)来实现。
3-羟基-3-甲基丁酰磷酸酯转化成3-羟基-3-甲基丁酸可以例如通过使用丁酸激酶(EC 2.7.2.7)、支链脂肪酸激酶(EC 2.7.2.14)、丙酸激酶(EC 2.7.2.15)或乙酸激酶(EC2.7.2.1)来实现。
用于将3-甲基巴豆酰-CoA经由3-甲基巴豆酸酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酸的可 替换路径
在上述根据本发明将3-甲基巴豆酰-CoA经由3-羟基-3-甲基丁酰-CoA转化成3-羟基-3-甲基丁酸的可替换路径中，也可以将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酸，仍然经由3-甲基巴豆酸。
因此，根据本发明，将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酸包括步骤：
(a)将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-甲基巴豆酸；和
(b)将由此产生的3-甲基巴豆酸进一步酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酸。
3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酸可以通过直接转化来实现，其优选利用属于硫酯水解酶家族(在以下称为硫酯酶(EC 3.1.2))或CoA转移酶家族(EC 2.8.3)的酶。
以上已经描述了硫酯酶。关于优选的实施方案，同样适用以上所述的和以下简短概括的。TE(也称为硫酯水解酶)是归类为EC 3.1.2的酶。目前，硫酯酶归类为EC 3.1.2.1至EC 3.1.2.27。
在优选实施方案中，用于将3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酸的→硫酯酶选自：
-乙酰-CoA水解酶(EC 3.1.2.1)；
-棕榈酰-CoA水解酶(EC 3.1.2.2)；
-3-羟基异丁酰-CoA水解酶(EC 3.1.2.4)；
-油酰-[酰基-载体-蛋白]水解酶(EC 3.1.2.14)；
-ADP依赖性短链酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.18)；
-ADP依赖性中链酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.19)；和
-酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.20)
关于CoA-转移酶(EC 2.8.3)及其优选实施方案，同样适用以上所述的。
在可替换的实施方案中，3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酸可以通过以下转化来实现：首先包括3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酰-磷酸酯，和随后将3-甲基巴豆酰-磷酸酯转化成3-甲基巴豆酸。
3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酰-磷酸酯可以例如通过使用磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)或磷酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.18)来实现。
3-甲基巴豆酰-磷酸酯转化成3-甲基巴豆酸可以例如通过使用归类为EC 2.7.2的酶(即，磷酸转移酶)来实现。这样的酶利用羧基作为受体。在优选实施方案中，3-甲基巴豆酰-磷酸酯转化成3-甲基巴豆酸通过使用丁酸激酶(EC 2.7.2.7)、支链脂肪酸激酶(EC2.7.2.14)、丙酸激酶(EC 2.7.2.15)或乙酸激酶(EC 2.7.2.1)来实现。
根据本发明，将步骤(a)中获得的3-甲基巴豆酸进一步酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酸。这个转化可以例如通过利用属于水-裂解酶(EC 4.2.1)的酶，特别是乌头酸水合酶(EC 4.2.1.3)或马来酸水合酶(EC 4.2.1.31)或2-甲基柠檬酸脱水酶(EC 4.2.1.79)来实现。该反应图示于图3中。
3-羟基-3-甲基丁酸经由3-膦氧基-3-甲基丁酸酶促转化成异丁烯
根据本发明，3-羟基-3-甲基丁酸可以进一步转化成异丁烯。这个转化可以例如通过利用脱羧酶，特别是甲羟戊酸二磷酸(MDP)脱羧酶来实现。这个转化在现有技术中已有描述，例如，在WO 2010/001078、WO 2012/052427和Gogerty等(Appl.Environm.Microbiol.76(2010)，8004-8010)中。
更具体地，根据本发明，可以通过具有脱羧酶活性的单一酶，将3-羟基-3-甲基丁酸转化成异丁烯。优选，根据本发明，3-羟基-3-甲基丁酸转化成异丁烯可以通过甲羟戊酸二磷酸(MDP)脱羧酶(E.C.4.1.1.33)来实现。
如上所述，WO 2010/001078描述了一种通过用具有脱羧酶活性的酶酶促转化3-羟基链烷酸(如，例如，3-羟基-3-甲基丁酸)来生产烯烃(如，例如，异丁烯)的方法。WO 2010/001078中已经描述了通常通过将3-羟基链烷酸转化成相应的3-膦氧基链烷酸，随后将其脱羧形成相应的烯烃来进行3-羟基链烷酸到烯烃的转化。
在WO 2012/052427中，已经发现了不同的脱羧酶，特别是甲羟戊酸二磷酸(MDP)脱羧酶，以不同效率催化上述的两个步骤，即，一些脱羧酶以高于其他脱羧酶的效率催化第一步，而一些脱羧酶显示出偏向第二步，即，脱羧步骤，并且因此如WO 2010/001078中所述的3-羟基链烷酸转化成烯烃的效率可以通过组合相应的酶来显著提高。因此，优选使用两种不同的MDP脱羧酶用于这个转化，并且特别是选自WO 2010/001078中所述优选实施方案的MDP脱羧酶。
提高CoA水平对异丁烯生产细胞的影响
如上所述，本发明是基于通过提供和维持高的用于异丁烯生产的细胞中的乙酰-CoA池来增加异丁烯产量和/或提高异丁烯生产速率的概念，其中通过确保细胞增加的泛酸摄取和/或增加的泛酸向CoA的转化，将乙酰-CoA池保持高的。
增加细胞的泛酸摄取和/或增加泛酸转化成CoA不仅具有在细胞中维持高的乙酰-CoA池用于异丁烯生产的有益作用。此外，增加CoA池对整体细胞功能具有促进作用，最终导致关于异丁烯生产的有益作用。
实际上，已知CoA起到辅因子的作用，用于细胞代谢中的各种氧化和生物合成反应。辅酶A及其硫酯(例如，乙酰-CoA、乙酰乙酰-CoA、丙二酰-CoA、琥珀酰-CoA、HMG-CoA等)是各种代谢途径、基因表达的调控、生长和细胞增殖必需的。此外，如上所述，导致异丁烯产生的代谢途径包括一系列酰基-CoA中间体的生化转化。
因此，本发明的重组生物体或微生物的特征还在于其具有增加的CoA池，这对异丁烯生产株的细胞生长和/或异丁烯生产和/或稳定性具有整体的积极影响。这些积极作用通过已知的由CoA调控的或依赖于CoA含量的生物机制和过程来实现，例如，作为底物或辅因子的CoA的可用性、蛋白质的调控、优化的游离CoA和CoA硫酯之间的平衡。在优选实施方案中，根据本发明的重组生物体或微生物的特征在于其具有增加的异丁烯代谢途径的一种或几种酰基硫酯中间体的池，包括乙酰-CoA、乙酰乙酰-CoA、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA(Hmg-CoA)、3-甲基戊烯二酰-CoA、3-羟基-3-甲基丁酰-CoA、3-甲基巴豆酰-CoA。
从CoA酶促提供乙酰-CoA
在本发明的重组生物体或微生物中，可以通过不同路径来提供乙酰-CoA，因为其是许多生化反应中使用的代谢中的中心成分。
在优选实施方案中，通过使用CoA，优选本发明的重组生物体或微生物的增加的CoA池的辅酶A(CoA)，来酶促提供乙酰-CoA。
在更优选的实施方案中，通过使用乙酸乙酰化CoA，优选利用乙酰-CoA合成酶或酰基-CoA合成酶，来酶促提供乙酰-CoA。
在优选实施方案中，乙酰-CoA合成酶(也称为乙酸-CoA连接酶)是归类为EC6.2.1.1的酶。乙酰-CoA合成酶(EC 6.2.1.1)是催化以下反应的酶：
ATP+乙酸酯+CoA＝AMP+二磷酸+乙酰-CoA
已知这种酶来自各种生物体，包括真核和原核生物体，如植物、动物、真菌和细菌。已经在醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)、东乡伊蚊(Aedes togoi)、Aliivibriofischeri、苋菜属(Amaranthus sp.)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、牛(Bos taurus)、日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、细小裸藻(Euglena gracilis)、Haloarcula marismortui、智人(Homo sapiens)、大麦(Hordeum vulgare)、Ignicoccus hospitalis、土拨鼠(Marmotamonax)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina sp.)、热自养甲烷嗜热杆菌(Methanothermobacter thermautotrophicus)、索氏甲烷丝菌(Methanothrixsoehngenii)、嗜热乙酸甲烷丝菌(Methanothrix thermoacetophila)(SwissProt登录号A0B8F1)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、小家鼠(Mus musculus)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、绵羊(Ovis aries)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、Phycomyces blakesleeanus、辐射松(Pinus radiata)、豌豆(Pisum sativum)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)(UniProt登录号Q6EMJ3)、Pyrobaculum aerophilum、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)、球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)、Roseovarius sp.、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、菠菜(Spinaciaoleracea)、红豆杉属(Taxus sp.)和玉米(Zea mays)中描述了这种酶。
在优选实施方案中，乙酰-CoA合成酶(EC 6.2.1.1)是由具有UniProt登录号P27550的acs编码的大肠杆菌MG1655衍生的酶(SEQ ID NO:22)。因此，在本发明的优选实施方案中，乙酰-CoA合成酶(EC 6.2.1.1)是包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22至少n％相同的序列的酶，n为10至100的整数，优选10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，和其中酶具有将CoA和乙酸酯转化成乙酰-CoA的酶活性，即，通过使用乙酸酯乙酰化CoA。关于序列同一性的确定，同样适用以上所述的。
如上所述，在另一个优选实施方案中，通过利用酰基-CoA合成酶，通过使用乙酸将CoA乙酰化来酶促地提供乙酰-CoA。
在优选实施方案中，酰基-CoA合成酶是归类为EC 6.2.1.2的酶。这些短/中链酰基-CoA合成酶(EC 6.2.1.2)(也称为丁酸-CoA连接酶，adK、IvaK、丁酰-CoA合成酶、脂肪酸硫激酶(中链)、酰基-激活酶、脂肪酸延长酶、脂肪酸激活没、脂肪酰基辅酶A合成酶、丁酸-CoA连接酶、丁酰-辅酶A合成酶、L-(+)-3-羟基丁酰CoA连接酶或丁酸:CoA连接酶(形成AMP))是催化以下反应的酶：
已知这种酶来自各种生物体，包括真核和原核生物体，如动物、真菌和细菌。该酶已经例如描述于牛(Bos taurus)、大观贝氏菌(Byssochlamys spectabilis)、豚鼠(Caviaporcellus)、盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)(UniProt登录号Q54CJ4)、智人(Homo sapiens)、Methanosarcina acetivorans(UniProt登录号Q8TLW1)、小家鼠(Musmusculus)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、绵羊(Ovis aries)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)(UniProt登录号O74725)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)和野猪(Sus scrofa)。
在优选实施方案中，短/中链酰基-CoA合成酶(EC 6.2.1.-)是由具有UniProt登录号P38135的fadK或ydiD(SEQ ID NO:23)编码的大肠杆菌MG1655衍生的酶。因此，在本发明的优选实施方案中，短/中链酰基-CoA合成酶(EC 6.2.1.-)是包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23至少n％相同的序列的酶，n为10至100的整数，优选10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，和其中酶具有将CoA和乙酸酯转化成乙酰-CoA的酶活性，即，通过使用乙酸酯乙酰化CoA。关于序列同一性的确定，同样适用以上所述的。
用于大肠杆菌衍生的短/中链酰基-CoA合成酶的生理底物是对十二酸酯、己酸酯和辛酸酯具有最大活性的短链酸。
在优选实施方案中，酰基-CoA合成酶是归类为EC 6.2.1.3的酶。这些长链酰基-CoA合成酶(EC 6.2.1.3)是催化以下反应的酶：
已知这种酶来自各种生物体，包括真核和原核生物体，如动物、植物、真菌和细菌。该酶例如已经描述于Agrypnus binodulus、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、Babesia bovis(TrEMBL登录号Q6QLU3)、Brassica napus、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、弧形茎菌(Caulobacter vibrioides)、Chaenocephalus aceratus、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、大肠杆菌(Escherichia coli)、Geobacillus thermodenitrificans、智人(Homo sapiens)、Komagataella pastoris、Luciola cruciata、高山被孢霉(Mortierella alpina)(UniProt登录号C8KHM6)、小家鼠(Mus musculus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、革首南极鱼(Notothenia coriiceps)、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、火龙果(Photinuspyralis)、豌豆(Pisum sativum)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)(UniProt登录号Q5CD72)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、野猪(Sus scrofa)、Iberian Guadyerbas×Landrace杂交种、假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、角豆(Tribolium castaneum)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、榆属(Ulmus sp.)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和玉米(Zea mays)。
在优选实施方案中，长链酰基-CoA合成酶(EC 6.2.1.3)是由具有UniProt登录号P69451的fadD(SEQ ID NO:24)编码的大肠杆菌MG1655衍生的酶。因此，在本发明的优选实施方案中，短/中链酰基-CoA合成酶(EC
6.2.1.3)是包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24至少n％相同的序列的酶，n为10至100的整数，优选10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，和其中酶具有将CoA和乙酸酯转化成乙酰-CoA的酶活性，即，通过使用乙酸将CoA乙酰化。关于序列同一性的确定，同样适用以上所述的。
增加CoA池
根据本发明的重组生物体或微生物的特征在于具有由于衍生其的生物体或微生物的增加的辅酶A(CoA)池，同时这种增加的辅酶A(CoA)池是由于：
(i)增加的泛酸摄取；和/或
(ii)增加的泛酸向CoA的转化。
如本发明中使用的术语“增加的辅酶A(CoA)池”笼统地表示重组(遗传修饰的)生物体或微生物中的CoA的含量和/或可用性高于相应的未修饰的生物体或微生物。在优选实施方案中，在本发明的内容中，“增加的辅酶A(CoA)池”表示遗传修饰的重组生物体或微生物中的CoA的含量和/或可用性比相应的未修饰的生物体或微生物高至少1％，2％，5％，7％或10％，优选高至少20％，更优选高至少30％或50％，甚至更优选高至少70％或80％，和特别优选高至少90％或100％。在甚至更优选的实施方案中，与相应的未修饰的生物体或微生物相比，CoA的含量和/或可用性增加至少150％，至少200％或至少500％。在特别优选的实施方案中，CoA的含量和/或可用性比相应的未修饰的生物体或微生物高至少2倍，和更优选高至少5倍。
如本发明中使用的术语“增加的泛酸摄取”笼统地表示摄取，即泛酸从重组(遗传修饰的)生物体或微生物的外部转移至内部，高于相应的未修饰的生物体或微生物中的。在优选实施方案中，在本发明的内容中，“增加的泛酸摄取”表示与相应的未修饰的生物体或微生物相比，泛酸从遗传修饰的重组生物体或微生物的外部转移至内部高至少1％，2％，5％，7％或10％，优选高至少20％，更优选高至少30％或50％，甚至更优选高至少70％或80％，和特别优选高至少90％或100％。在甚至更优选的实施方案中，与相应的未修饰的生物体或微生物相比，泛酸从遗传修饰的重组生物体或微生物的外部转移至内部增加高至少150％，至少200％或至少500％。在特别优选的实施方案中，泛酸从遗传修饰的重组生物体或微生物的外部转移至内部比相应的未修饰的生物体或微生物高至少2倍，5倍，7倍和更优选高至少10倍。
如本发明使用的术语“增加的泛酸向CoA的转化”笼统地表示重组(遗传修饰的)生物体或微生物中以下描述的相应酶的表达和/或活性高于相应的未修饰的生物体或微生物中的。在优选实施方案中，在本发明的内容中，“增加的泛酸向CoA的转化”表示遗传修饰的重组生物体或微生物中以下描述的相应酶的表达和/或活性比相应的未修饰的生物体或微生物中的高至少1％，2％，5％，7％或10％，优选高至少20％，更优选高至少30％或50％，甚至更优选高至少70％或80％，和特别优选高至少90％或100％。在甚至更优选的实施方案中，与相应的未修饰的生物体或微生物相比，遗传修饰的重组生物体或微生物中以下描述的相应酶的表达和/或活性高至少150％，至少200％或至少500％。在特别优选的实施方案中，遗传修饰的重组生物体或微生物中以下描述的相应酶的表达和/或活性比相应的未修饰的生物体或微生物高至少至少2倍，5倍，7倍和更优选高至少10倍。
用于与衍生其的生物体或微生物相比测量(增加的)泛酸摄取和用于测量(增加的)泛酸转化成CoA是本领域技术人员公知的。因为增加的泛酸摄取和/或增加的泛酸向CoA的转化最终导致超过衍生其的生物体或微生物的增加的CoA池，因此还优选可以通过间接测量(增加的)CoA池来测量超过衍生其的生物体或微生物的(增加的)泛酸摄取和(增加的)泛酸转化成CoA。
用于测量超过衍生其的生物体或微生物的(增加的)CoA池和/或乙酰-CoA的方式和方法是本领域技术人员公知的并且描述于文献中。
用于测量(增加的)CoA池和/或乙酰-CoA的测试已经描述于例如Rock等(J.Bacteriol.185(11)，3410-3415(2003)；参见，特别是其中的第3412页)；Lin等(Biotechnol.Prog.20(5)，1599-1604(2004)，参见，特别是其中的第1600页)；和Vadali等(Metab.Eng.6(2)，133-139(2004)；参见，特别是第135页)。
不受理论束缚，在下面的实施例部分中给出了这种测定增加的CoA池的实例，并且可以例如如下进行：
一种定量CoA(和/或其硫酯中间体)的可能性因此首先提取化合物并随后通过LC-MA或HPLC分析来分析。
因此，对于提取，一种可能性是从发酵罐直接取样120μL细菌培养物并在真空下通过膜滤器过滤。在过滤后立即将滤器放入铝箔中并插入液氮中，以停止所有代谢反应。然后，将含有滤器的铝箔储存在-80℃，直至提取。在Falcon管中在-80℃下在15min中用2mL冷的MeOH/H2O(80/20)混合物(从膜滤器)提取胞内代谢物。然后，取出上清液并转移至新的试管中。按照刚刚描述的相同过程(除了在-80℃下的两次提取时间以及将离心步骤缩短至5min)，用1mL冷的MeOH/H2O混合物进行膜滤器的第二次提取。将合并的上清液(约3mL)通过0.2μm注射器滤器过滤并通过Speed-Vac浓缩器将2.4mL蒸发至干。然后，将干的提取物用120μL ACN/H2O(50/50，v/v)重新溶解，通过0.2μm注射器滤器再次过滤并转移至HPLC小瓶中，用于LC-MS分析。
在与Q-Exactive质谱仪(ThermoFisher Scientific，Massachusetts，USA)偶联的UHPLC系统上以负电离模式进行LC-MS分析。对于LC部分，使用在25℃下调节的BEH酰胺柱(1.7μm，2.1×100mm，Waters)。流速设置为0.5mL/min，注入2μL样品。流动相由二元梯度(A：甲酸铵(10mM)+0.1％氢氧化铵和B：乙腈)组成：在1.5分钟内从95％B开始，然后在8.5分钟内降至55％B并在2分钟内保持在55％B，然后回到初始条件。总分析时间为19min。在质量级别，分析在负离子模式下以全质谱+ddMS2模式进行。如果需要，考虑80<m/z<1200Da之间的离子组，并且所有强度大于1e5的离子都使用35eV的碰撞能量进行碎裂，以获得额外的结构信息。在相同的LC/MS条件下记录目标化合物的校准曲线。使用Xcalibur v3.0.63软件(ThermoFisher Scientific)进行数据分析。
或者，另一种分析可能性是HPLC分析。
两种LC方法可用于检测和定量辅酶A衍生化合物。
第一种LC方法通过与Multiple波长检测仪(MWD)(Agilent，Santa Clara，USA)偶联的HPLC 1260系统进行。通过与调节到30℃的C18柱(3.5μm，4.6×100mm，Agilent)偶联的Zorbax Eclipse进行分离。移动相由等度洗脱组成，在10min内使用pH5(95％)的乙腈(5％)和磷酸盐缓冲液(100mM)。流速设置为1.5mL/min并注入5μL样品。
第二种方法用与二极管阵列检测仪(DAD)(Agilent，Santa Clara，USA)偶联的HPLC 1260系统进行。将在调节到30℃的ZorbaxsbAq柱(5μm，4.6×250mm，Agilent)用于分离代谢物。注入5μL样品。流速设定为1.5mL/min。移动相由二元梯度组成(A：乙腈；和B：H2SO4 8.4mM)，从100％B开始，并随后降至30％B直至8min，并在1min内保持在30％B。在这1min 30％B期间，流速提至2mL/min。9min后，二元梯度在2min内返回初始条件(即，100％B和1.5mL/min的流速)并在3min内停留在100％B。总运行时间为14min。
在两种LC方法中，在λ260nm下进行目标代谢物的检测并在所用的各自LC条件下记录纯化合物的校准曲线。
通常，具有超过衍生其的生物体或微生物的增加的辅酶A(CoA)池的重组生物体或微生物(尽管这种增加的辅酶A(CoA)池是由于(i)增加的泛酸摄取；和/或(ii)增加的泛酸向CoA的转化)可以通过不同的重组修饰来实现，其在下文中进一步更详细地描述。
通常，以通过特定蛋白质的重组表达来实现(i)增加的泛酸摄取和/或(ii)增加的泛酸向CoA的转化。
通常，在这个内容中的“重组”表示生物体或微生物的人工遗传修饰，通过添加、除去或修饰染色体或染色体外基因或调控基序，如启动子，或通过生物体的融合，或通过添加任何类型的载体，例如，质粒。术语“重组表达”表示涉及遗传修饰的蛋白质产生，优选以产生相对于宿主是外源或异源来源的蛋白质，即，其不是在生产宿主中天然产生的，或产生修饰的或突变的内源性蛋白质。在本发明的内容中的“重组表达”优选是“超表达”。在这个内容中的“超表达(overexpression)”或“超表达(overexpressing)”表示宿主生物体中的蛋白质的重组表达，优选源自不同于在其中表达的生物体，与所述宿主生物体或微生物中发生的所述蛋白质的天然表达相比，增加至少10％和优选增加20％，50％，100％，500％和可能更多。这个定义还包括其中不存在所述蛋白质的天然表达的情况。
因此，简而言之，根据本发明的导致增加的泛酸摄取；和/或增加的泛酸向CoA的转化的重组表达可能是由于(1)各自优选的内源性基因的超表达，(2)引入各自的异源基因和/或(3)具有增加的活性的突变蛋白的表达，例如，超过衍生其的各自酶的增加的催化相应反应的活性或增加的转运子活性。
不受理论束缚，用于测量表达蛋白质(水平)的方法和测定可以通过测量相应蛋白质的含量来进行。相应的方法是本领域技术人员公知的并且包括蛋白质印迹、ELISA等。在另一个实施方案中，通过测量相应RNA的含量来进行表达(水平)的测量。相应的方法是本领域技术人员公知的并且包括例如Northern印迹。
此外，用于测量分别超过各自从其衍生的酶和转运子的增加的催化相应反应的酶活性或增加的转运子活性的方法和测定是本领域技术人员公知的。
增加泛酸摄取
根据本发明，可以通过增加重组生物体或微生物的泛酸(即，CoA的前体)摄取来实现增加的CoA池。优选，可以通过泛酸摄取转运子的重组表达来实现增加的泛酸摄取。
泛酸摄取和泛酸摄取转运子是本领域技术人员已知的并且现有技术中已有描述。特别地，细菌中的泛酸摄取和泛酸摄取转运子是充分描述的(Leonardi等(Progress inLipid Reasearch 44，125-153(2005))。
已知泛酸实际上被所有细菌摄取并且是缺乏从头生物合成泛酸的那些所必需的，如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、乳酸杆菌(Lactobacillus lactis)和流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzae)。在大肠杆菌中，泛酸摄取通过泛酸通透酶来介导，也称为PanF蛋白，由panF基因编码。PanF利用钠-共转运机制从培养基浓缩泛酸。预测PanF含有12个由短的亲水性链连接的跨膜疏水性结构域，短的亲水性链是蛋白质的主要促进剂超家族的其他阳离子依赖性通透酶的特征性拓扑基序。转运系统对于泛酸是高度特异性的，具有0.4μM的Kt和1.6pmol/min/108细胞的最大速度。已经发现了大肠杆菌中的PanF蛋白的超表达导致泛酸摄取速率增加10倍并且伴随着泛酸的稳态胞内浓度升高。泛酸从大肠杆菌流出，大肠杆菌排泄大量已经从头合成的泛酸。泛酸排泄在不能摄取维生素的psnF突变体中仍然是有活性的，这表明了摄取是单向的，并且指出存在一个独特且无特征的外流系统。
因此，已知泛酸转运子来自各种生物体，包括真核和原核生物体，如酵母和细菌。该酶已经描述于例如大肠杆菌(其中泛酸转运由泛酸通透酶PanF介导(由基因panF编码；UniProt登录号P16256))、乳酸杆菌(Lactobacillus lactis)(乳酸杆菌乳酸乳脂亚种(Lactobacillus Lactococcus lactis subsp.Cremoris)(MG1363株)；酶PanT由基因panT编码；Uniprot登录号A2RIQ0)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(株ATCC204508/S288c；酶Fen2由基因fen2编码；UniProt登录号P25621)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(株972/ATCC 24843；酶Liz1由基因liz1编码；UniProt登录号O43000)。
因此，在更优选的实施方案中，泛酸摄取转运子是由基因panF编码的称为PanF的大肠杆菌衍生的转运子。Leonardi(Progress in Lipid Reasearch44，125-153(2005))描述了大肠杆菌中的PanF的超表达导致泛酸摄取速率增加10倍并且伴随着泛酸的稳态胞内浓度升高。大肠杆菌衍生的转运子的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:1中。在其他更优选的实施方案中，泛酸摄取转运子是称为Fen2的酿酒酵母衍生的转运子，粟酒裂殖酵母衍生的转运子Liz1或乳酸杆菌衍生的转运子PanT。酿酒酵母衍生的转运子、粟酒裂殖酵母衍生的转运子或乳酸杆菌衍生的转运子的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQID NO:4中。
因此，在本发明的优选实施方案中，泛酸摄取转运子是包含选自SEQ ID NO:1至4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1至4任一个至少n％相同的序列的转运子，n为10至100的整数，优选10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、94、94、95、96、97、98或99，其中转运子具有将泛酸转运至细胞中的活性。
关于序列同一性的确定，同样适用以上所述的。
增加泛酸转化成CoA
根据本发明，可以通过增加的泛酸向CoA的转化来实现增加的CoA池。泛酸是CoA生物合成的起始分子。从泛酸开始生物合成CoA图示于图4中，显示了辅酶A(CoA)的生物合成的各个步骤。如从图4可以得出，在如下5个随后的步骤中从泛酸酶促产生CoA：
第一，泛酸酶促转化成4’-磷酸泛酸；
第二，所述4’-磷酸泛酸和L-半胱氨酸酶促转化成4’-磷酸泛酰-L-半胱氨酸；
第三，所述4’-磷酸泛酰-L-半胱氨酸酶促转化成泛酰巯基乙胺-4-磷酸；
第四，所述泛酰巯基乙胺-4-磷酸酶促转化成脱磷-CoA；和
第五，所述脱磷-CoA酶促转化成CoA。
图5也说明了这五个步骤，同时这张图显示了用于从泛酸转化成CoA的关键酶及其在细菌、酵母和哺乳动物中各自的名称。在下文中，更详细地描述这些各个步骤。
泛酸酶促转化成4’-磷酸泛酸
可以通过利用泛酸激酶来实现泛酸酶促转化成4’-磷酸泛酸。在优选实施方案中，泛酸激酶是归类为EC 2.7.1.33的酶。泛酸激酶(EC 2.7.1.33)是催化以下反应的酶：
ATP+(R)-泛酸＝ADP+(R)-4’-磷酸泛酸。
已知这种酶来自各种生物体，包括真核和原核生物体，如植物、动物、真菌和细菌。该酶已经描述于拟南芥(Arabidopsis thaliana)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、Brassicanapus、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(UniProt登录号Q839J7)、大肠杆菌(Escherichia coli)、大猩猩(Gorilla beringei)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、智人(Homo sapiens)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)(UniProt登录号B5XYG3)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、Morganellamorganii、小家鼠(Mus musculus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、Orchesella cincta、Picrophilus torridus(UniProt登录号Q6L2I5)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(UniProt登录号Q9HWC1)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、菠菜(Spinacia oleracea)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(UniProt登录号Q6G7I0)、链霉菌(Streptomyces peucetius)(UniProt登录号D2K764)、Thermococcuskodakarensis(UniProt登录号Q5JHF1)和海栖热袍菌(Thermotoga maritima)。在细菌、酵母和哺乳动物中，泛酸激酶分别被称为CoaA、Cab1、PanK和CoaX；对于概括，参见图5。
泛酸激酶在文献中被描述为CoA合成的限速酶(Liu等，Biotechnol Biofuels 10(41)(2017))。已知泛酸激酶编码基因受到辅酶A的逆向控制，从而限制其胞内浓度。已知在其氨基酸序列的第106位具有突变(即R106A)的大肠杆菌衍生的泛酸激酶编码基因CoaA的突变形式对这种反馈抑制不太敏感，从而允许在体内增加CoA池，特别是通过外源性添加代谢前体，即泛酸盐(Rock等，Journal of Bacteriology 18(11)(2003)；Vallari等，Journalof Bacteriology 170(9)(1988))。此外，最近描述了泛酸激酶表达基因PanK的过度表达(US 8,143,035 B2；Vadali等，Biotechnol.Prog.20(2004)；Vadali等，MetabolicEngineering 6(2004))。
因此，在优选实施方案中，泛酸激酶(EC 2.7.1.33)是由coaA编码的大肠杆菌衍生的酶(SEQ ID NO:5)。因此，在本发明的优选实施方案中，泛酸激酶(EC 2.7.1.33)是包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5至少n％相同的序列的酶，n为10至100的整数，优选10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、94、94、95、96、97、98或99，和其中酶具有将泛酸转化成4’-磷酸泛酸的酶活性。
在本发明另一个优选实施方案中，泛酸激酶(EC 2.7.1.33)是由coaA编码的大肠杆菌衍生的酶的变体，所述酶包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5至少n％相同的序列，n为10至100的整数，优选10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、94、94、95、96、97、98或99，和其中酶具有将泛酸转化成4’-磷酸泛酸的酶活性。其中泛酸激酶的特征在于与衍生其的相应序列相比，优选与SEQ ID NO:5相比，其显示了一个置换、缺失和/或插入，和其中这种置换、缺失和/或插入发生在对应于SEQ ID NO:5所示氨基酸序列中的位置R106的位置。
优选，所述泛酸激酶变体是其中SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列中第106位或对应于该位置的位置的氨基酸残基缺失或用丙氨酸置换。
相应的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:6中。
位于对应于SEQ ID NO:5所示氨基酸中所示位置的位置的氨基酸残基可以通过本领域已知的方法由本领域技术人员来鉴定。例如，可以通过将询问序列与SEQ ID NO:5中所示的序列进行比对并通过鉴定对应于以上所示的SEQ ID NO:5的位置的位置来鉴定这样的氨基酸残基。比对可以用本领域技术人员已知的方式和方法来进行，例如，通过使用已知的计算机算法，如Lipman-Pearson方法(Science 227(1985)，1435)或CLUSTAL算法。优选在这样的比对中，将最大同源性分配给氨基酸序列中存在的保守氨基酸残基。
在优选实施方案中，将ClustalW2用于比较氨基酸序列。在配对比较/比对的情况中，优选选择以下设置：蛋白质权重矩阵：BLOSUM 62；缺口开口：10；缺口延伸：0.1。在多个比较/比对的情况中，优选选择以下设置：蛋白质权重矩阵：BLOSUM 62；缺口开口：10；缺口延伸：0.2；缺口距离：5；无末端缺口。
优选，在整个序列长度上计算同一性程度。
因此，在本发明的优选实施方案中，泛酸激酶是包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6至少n％相同的序列的酶，n为10至100的整数，优选10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、94、94、95、96、97、98或99，和其中酶具有将泛酸转化成4’-磷酸泛酸的酶活性。
此外，来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(Choudhry等，Antimocrobial Agents and Chemotherapy 47(6)(2003))的泛酸激酶CoaA和推定的来自炭疽杆菌(Bacillus anthracis)的泛酸激酶CoaA与真核panK蛋白适度相关，而与大肠杆菌CoaA无关。特别地，来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的CoaA不受CoA抑制，同时已知这种生物体具有相当大的CoA池。关于来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的CoaA，还可参见http://parts.igem.org/Part:BBa_K1692021。
此外，已知来自幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的基因CoaX不受CoA和乙酰-CoA影响(Brand和Strauss,Journal of BiologicalChemistry 21(2005))。
因此，在优选实施方案中，泛酸激酶(EC 2.7.1.33)是由coaA编码的金黄色葡萄球菌衍生的酶(SEQ ID NO:7)、由coaX编码的幽门螺杆菌衍生的酶(SEQ ID NO:8)或由coaX编码的枯草芽孢杆菌衍生的酶(SEQ ID NO:9)。
因此，在本发明的优选实施方案中，泛酸激酶(EC 2.7.1.33)是包含SEQ ID NO:7至9的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7至9任一个至少n％相同的序列的酶，n为10至100的整数，优选10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、94、94、95、96、97、98或99，和其中酶具有将泛酸转化成4’-磷酸泛酸的酶活性。
4’-磷酸泛酸和L-半胱氨酸酶促转化成4’-磷酸泛酰-L-半胱氨酸
根据本发明，可以通过将4’-磷酸泛酸和L-半胱氨酸酶促转化成4’-磷酸泛酰-L-半胱氨酸的酶的重组表达来实现增加的泛酸向CoA的转化，优选通过利用磷酸泛酰半胱氨酸合成酶。磷酸泛酰半胱氨酸合成酶优选是归类为EC 6.3.2.5的酶。磷酸泛酰半胱氨酸合成酶(EC 6.3.2.5)，也称为磷酸泛酸-半胱氨酸连接酶(CTP)，是催化以下反应的酶：
CTP+(R)-4’-磷酸泛酸+L-半胱氨酸＝CMP+二磷酸+N-[(R)-4’-磷酸泛酰]-L-半胱氨酸
已知这种酶来自各种生物体，包括真核和原核生物体，如动物和细菌。该酶已经例如描述于鸭嘴兽(Anas platyrhynchos)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、智人(Homo sapiens)、Methanocaldococcus jannaschii(UniProt登录号Q58323)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、Morganella morganii、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、褐家鼠(Rattus norvegicus)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。在酵母和哺乳动物中，磷酸泛酰半钢氨酸合成酶被分别称为Cab2和PPCS；对于概括，参见图5。在大肠杆菌和大部分细菌中，在多步方法中通过双功能Dfp(也称为CoaBC)黄素蛋白催化从4’-磷酸泛酸和L-半胱氨酸合成泛酰巯基乙胺-4-磷酸(对应于以下进一步描述的CoA生物合成的第3步)(对于概括，参见图5)。两种酶促活性，PPCS和PPCDS，位于双功能(融合)蛋白的C-末端和N-末端结构域内。
相反，链球菌属(Streptococcus)和肠球菌属(Enterococcus)的细菌具有两个分开的开放阅读框(PRF)，预测来编码CoaB和CoaC(Gerdes，Journal of Bacteriology 184(16)(2002))。
磷酸泛酰半胱氨酸合成酶(EC 6.3.2.5)也已经例如描述于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中。
因此，在优选实施方案中，磷酸泛酰半胱氨酸合成酶(EC 6.3.2.5)，是由coaB编码的肠球菌衍生的酶(SEQ ID NO:10)或由cab2编码的酿酒酵母衍生的酶(SEQ ID NO:11)。因此，在本发明的优选实施方案中，磷酸泛酰半胱氨酸合成酶(EC 6.3.2.5)是包含SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11至少n％相同的序列的酶，n为10至100的整数，优选10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、94、94、95、96、97、98或99，和其中酶具有将4’-磷酸泛酸和L-半胱氨酸转化成4’-磷酸泛酰-L-半胱氨酸的酶促活性。关于序列同一性的确定，同样适用以上所述的。
如上所述，在大肠杆菌和大部分真细菌以及例如肺炎链球菌中，在多步方法中通过双功能Dfp(也称为CoaBC)黄素蛋白催化从4’-磷酸泛酸和L-半胱氨酸合成泛酰巯基乙胺-4-磷酸(对应于以下进一步描述的CoA生物合成的第3步)(对于概括，参见图5)。因此，在优选实施方案中，具有磷酸泛酰半胱氨酸合成酶/4’-磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶活性的双功能酶是大肠杆菌衍生的酶CoaBC(SEQ ID NO:12)或肺炎链球菌衍生的酶CoaBC(SEQ ID NO:13)。因此，在本发明的优选实施方案中，具有磷酸泛酰半胱氨酸合成酶/4’-磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶活性的双功能酶是包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列或与SEQID NO:12或SEQ ID NO:13至少n％相同的序列的酶，n为10至100的整数，优选10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、94、94、95、96、97、98或99，和其中酶具有将4’-磷酸泛酸和L-半胱氨酸转化成泛酰巯基乙胺-4-磷酸的酶促活性。关于序列同一性的确定，同样适用以上所述的。关于大肠杆菌衍生的双功能蛋白CoaBC(Dfp)结构信息和定点诱变数据是可用的(Kupke,J.Biol.Chem 276(2001)；Kupke,Eur.J.Biochem.271(2004))。
4’-磷酸泛酰-L-半胱氨酸酶促转化成泛酰巯基乙胺-4-磷酸
根据本发明，可以通过将4’-磷酸泛酰-L-半胱氨酸酶促转化成泛酰巯基乙胺-4-磷酸的酶的重组表达，优选利用4’-磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶，来实现增加的泛酸向CoA的转化。在优选实施方案中，4’-磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶是归类为EC 4.1.1.36的酶。4’-磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.36)，也称为磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶，是催化以下反应的酶：
N-[(R)-4’-磷酸泛酰]-L-半胱氨酸＝泛酰巯基乙胺4’-磷酸+CO2
已知这种酶来自各种生物体，包括真核和原核生物体，如植物、动物和细菌。该酶已经例如描述于鸭嘴兽(Anas platyrhynchos)、产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、牛(Bos taurus)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、马(Equus caballus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、智人(Homo sapiens)、Methanocaldococcus jannaschii、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、烟草(Nicotiana tabacum)、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、水稻(Oryza sativa)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和野猪(Sus scrofa)。在酵母和哺乳动物中，4’-磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶分别被称为Cab3和PPCDC；对于概括，参见图5。
如上所述，在CoA生物合成的第2步的内容中，链球菌属(Streptococcus)和肠球菌属(Enterococcus)的细菌具有分开的预测来编码CoaB和CoaC的基因(Genschel,MolecularBiology and Evolution 21(7)(2004))。
4’-磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.36)也已经描述于酿酒酵母。
因此，在优选实施方案中，4’-磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.36)是由coaC编码的肠球菌衍生的酶(SEQ ID NO:14)或由cab4编码的酿酒酵母衍生的酶(SEQ ID NO:15)。因此，在本发明的优选实施方案中，4’-磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.36)是包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15至少n％相同的序列的酶，n为10至100的整数，优选10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、94、94、95、96、97、98或99，和其中酶具有将4’-磷酸泛酰-L-半胱氨酸转化成泛酰巯基乙胺-4-磷酸的酶活性。关于序列同一性的确定，同样适用以上所述的。
如上所述，在大肠杆菌和大部分真细菌中，在多步骤过程中通过双功能Dfp(也称为CoaBC)从4’-磷酸泛酸和L-半胱氨酸催化泛酰巯基乙胺-4-磷酸的合成(对于概括，参见图5)。因此，关于具有磷酸泛酰半胱氨酸合成酶/4’-磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶活性的双功能酶的优选实施方案，同样适用以上在CoA生物合成的第3步内容中列出的。
泛酰巯基乙胺-4-磷酸酶促转化成脱磷-CoA
根据本发明，通过催化泛酰巯基乙胺-4-磷酸酶促转化成脱磷-CoA的酶的重组表达，优选利用泛酰巯基乙胺-磷酸腺苷酰转移酶，实现增加的泛酸向CoA的转化。在优选实施方案中，泛酰巯基乙胺-磷酸腺苷酰转移酶是归类为EC 2.7.7.3的酶。泛酰巯基乙胺-磷酸腺苷酰转移酶(EC 2.7.7.3)，也称为泛酰巯基乙胺-磷酸腺苷酰转移酶是催化以下反应的酶：
ATP+泛酰巯基乙胺4’-磷酸＝二磷酸+3’-脱磷-CoA
已知这种酶来自各种生物体，包括真核和原核生物体，如植物、动物和细菌。该酶已经例如描述于Anas sp.、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)(UniProt登录号Q3JW91)、白色念珠菌(Candida albicans)(UniProt登录号B9WCR8)、Columba sp.、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(UniProt登录号P44805)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)(UniProt登录号O26010)、智人(Homo sapiens)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(UniProt登录号P9WPA5)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(UniProt登录号Q9I6D1)、Pyrococcus abyssi、褐家鼠(Rattus norvegicus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(UniProt登录号P63820)、变形链球菌(Streptococcus mutans)(UniProt登录号Q8DVH2)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(UniProt登录号Q8DNE6)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、野猪(Sus scrofa)和嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)。在细菌和酵母中，泛酰巯基乙胺-磷酸腺苷酰转移酶分别被称为CoaD和Cab4。这种酶也被称为PPAT和KdtB；对于概括，参见图5。
已知源自大肠杆菌的CoaD被CoA反馈抑制，其与ATP、泛酰巯基乙胺-4-磷酸(其底物)和脱磷-CoA(其产物)是竞争性的(Leonardi等，Progress in Lipid Research 44:125-153(2005))。
因此，在优选实施方案中，泛酰巯基乙胺-磷酸腺苷酰转移酶(EC 2.7.7.3)是由coaD编码的大肠杆菌(Uniprot号P0A6I6)衍生的酶。
因此，在本发明的优选实施方案中，泛酰巯基乙胺-磷酸腺苷酰转移酶(EC2.7.7.3)是包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与SEQ ID NO:18至少n％相同的序列的酶，n为10至100的整数，优选10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、94、94、95、96、97、98或99，和其中酶具有将泛酰巯基乙胺-4-磷酸转化成脱磷-CoA的酶活性。关于序列同一性的确定，同样适用以上所述的。
如上所述，已知金黄色葡萄球菌具有相当大的CoA池。因此，在优选的实施方案中，泛酰巯基乙胺-磷酸腺苷酰转移酶(EC 2.7.7.3)是由coaD编码的金黄色葡萄球菌(株MW2)(Uniprot号P63820)衍生的酶(SEQ ID NO:16)或由coaD编码的鼻疽伯克霍尔德菌(株1710b)(Uniprot号Q3JW91)衍生的酶。因此，在本发明的优选实施方案中，泛酰巯基乙胺-磷酸腺苷酰转移酶(EC 2.7.7.3)是包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与SEQID NO:16或SEQ ID NO:17至少n％相同的序列的酶，n为10至100的整数，优选10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、94、94、95、96、97、98或99，和其中酶具有将泛酰巯基乙胺-4-磷酸转化成脱磷-CoA的酶活性。关于序列同一性的确定，同样适用以上所述的。来自金黄色葡萄球菌(株MW2)的CoaD的氨基酸序列(Uniprot号P63820)和来自鼻疽伯克霍尔德菌(株1710b)的CoaD的氨基酸序列(Uniprot号Q3JW91)具有约47％的序列同一性。
脱磷-CoA酶促转化成CoA
根据本发明，通过将脱磷-CoA酶促转化成CoA的酶的重组表达，优选利用脱磷-CoA激酶，来实现增加的泛酸向CoA的转化。
在优选实施方案中，脱磷-CoA激酶是归类为EC 2.7.1.24的酶。脱磷-CoA激酶(EC2.7.1.24)是催化以下反应的酶：
ATP+3’-脱磷-CoA＝ADP+CoA
已知这种酶来自各种生物体，包括真核和原核生物体，如植物、动物和细菌。该酶已经例如描述于绿头鸭(Anas platyrhynchos)、Aquifex aeolicus、鸽属(Columba sp.)、产氨短杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)(UniProt登录号P0A6I9)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(UniProt登录号P44920)、智人(Homo sapiens)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)(UniProt登录号Q5ZVH3)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)(UniProt登录号D5MBE3)、野猪(Sus scrofa)和嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)。在细菌和酵母中，脱磷-CoA激酶分别被称为CoaE和Cab5。这种酶也被称为YacE；对于概括，参见图5。
在优选实施方案中，泛酸激酶(EC 2.7.124)是由coaE编码的大肠杆菌衍生的酶(SEQ ID NO:19)或由cab5编码的酿酒酵母衍生的酶(SEQ ID NO:20)。因此，在本发明的优选实施方案中，脱磷-CoA激酶(EC 2.7.1.24)是包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20至少n％相同的序列的酶，n为10至100的整数，优选10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、94、94、95、96、97、98或99，和其中酶具有将脱磷-CoA转化成CoA的酶活性。关于序列同一性的确定，同样适用以上所述的。已经描述了大肠杆菌衍生的脱磷-CoA激酶(EC 2.7.1.24)的结构(O’Toole等，Protein Science 12(2003))。
增加乙酰-CoA的产量和通量
在优选实施方案中，通过以下进一步表征本发明的重组生物体或微生物
a)具有磷酸转酮酶(phosphoketolase)活性；
b)(i)通过失活(inactivation)编码磷酸果糖激酶的基因或通过与未修饰的微生物相比降低磷酸果糖激酶活性而具有减少的或失活的Embden-Meyerhof-Parnas途径(EMPP)；或
(ii)不具有磷酸果糖激酶活性
和
c)(i)通过失活编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或通过与非修饰的微生物相比降低葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性而具有减少的或失活的戊糖磷酸途径(PPP)的氧化分支；或
(ii)不具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。
相应的重组生物体或微生物最近已描述于WO 2013/007786中。该文件的公开内容，特别是关于其中所述酶的优选实施方案，将其全部按引用并入。因此，在优选实施方案中，优选使用选自WO 2013/007786中所述的优选实施方案的酶。
如本发明中使用的术语“磷酸转酮酶活性”表示能够根据以下反应将D-木酮糖-5-磷酸转化成D-甘油醛-3-磷酸的酶活性：
D-木酮糖-5-磷酸+磷酸→D-甘油醛-3-磷酸+乙酰-磷酸+水
或能够催化以上所示反应且还能够根据以下反应将D-果糖-6-磷酸转化成D-赤藓糖-4-磷酸的酶活性：
D-果糖-6-磷酸+磷酸→乙酰磷酸+D-赤藓糖-4-磷酸+水
前一种磷酸转酮酶通常归类为EC 4.1.2.9，而后一种归类为EC 4.1.2.22。两种类型的磷酸转酮酶都可以用于本发明的范围中。可以通过本领域已知的测定来测量这种酶活性。WO 2013/007786中给出了这样的测定的实例。
在本发明的内容中，具有磷酸转酮酶活性的生物体或微生物可以例如是天然具有磷酸转酮酶活性的生物体或微生物或不是天然具有磷酸转酮酶活性且已经经过遗传修饰来表达磷酸转酮酶的生物体或微生物或天然具有磷酸转酮酶活性且已经经过遗传修饰(例如，用编码磷酸转酮酶的核酸(例如，载体)转化)以提高所述微生物中的磷酸转酮酶活性的生物体或微生物。内在地(即，天然地)具有磷酸转酮酶活性的生物体或微生物是本领域已知的并且其中任何一种可以用于本发明的内容中。在本发明的内容中还可能的是生物体或微生物是天然不具有磷酸转酮酶活性但经过遗传修饰来包含允许磷酸转酮酶表达的核苷酸序列的生物体或微生物。相似地，生物体或微生物还可以是天然具有磷酸转酮酶活性但经过遗传修饰以增强磷酸转酮酶活性(例如，通过引物编码磷酸转酮酶的外源性核苷酸序列)的生物体或微生物。以下将详细地描述生物体或微生物为表达目标酶的遗传修饰。
根据本发明的生物体或微生物中表达的磷酸转酮酶可以是天然产生的磷酸转酮酶或可以是源自天然产生的磷酸转酮酶的磷酸转酮酶，例如，通过引入突变或其他改变，其例如改变或提高酶活性、稳定性等。因此，在优选实施方案中，本发明的重组生物体或微生物是已经经过遗传修饰来具有提高的磷酸转酮酶活性的生物体或微生物。用于改变和/或提高蛋白质的所需酶活性的方法是本领域技术人员公知的并且包括例如随机诱变或定点诱变和随后选择所需特性的酶或以下将进一步更详细描述的所谓“定向进化”方法。
根据本发明的生物体或微生物优选进一步通过具有减少或失活的Embden-Meyerhof-Parnas途径(EMPP)来表征，这通过失活编码磷酸果糖激酶的基因或通过与未修饰的生物体或微生物相比降低磷酸果糖激酶活性或通过不具有磷酸果糖激酶活性来实现。因此，生物体或微生物是天然具有包括磷酸果糖激酶活性的EMPP但已经进行修饰(特别是遗传修饰)使得磷酸果糖激酶活性被完全消除或使得与相应的非修饰生物体或微生物比较降低的生物体或微生物，或生物体或微生物是天然不具有磷酸果糖激酶活性的生物体或微生物。
“磷酸果糖激酶活性”表示将ATP和果糖-6-磷酸转化成ADP和果糖-1,6-二磷酸的酶活性(EC 2.7.1.11)。这种酶活性可以通过本领域已知的测定来测量，例如，Kotlarz等(Methods Enzymol.(1982)90，60-70)所述的。
术语“通过具有减少或失活的Embden-Meyerhof-Parnas途径(EMPP)来表征的生物体或微生物，这通过失活编码磷酸果糖激酶的基因或通过与未修饰的生物体或微生物相比降低磷酸果糖激酶活性来实现”优选是指其中与通过导致所述失活或降低的生物体或微生物的遗传修饰实现其中失活编码磷酸果糖激酶的基因或与非修饰生物体或微生物相比磷酸果糖激酶活性降低的生物体或微生物。
在优选实施方案中，本发明的重组生物体或微生物是通过失活编码磷酸果糖激酶的基因而具有失活的Embden-Meyerhof-Parnas途径的重组生物体或微生物。本
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