阅读说明：本技术 化合物的微生物生产 (Microbial production of compounds ) 是由 安德鲁·P·克莱因 C·D·里夫斯 C·J·帕栋 V·F·福尔摩斯 于 2020-03-13 设计创作，主要内容包括：提供了经修饰宿主细胞,其通过工程化改造以在一种外源试剂存在下减少产物表达至不可检测水平,而在另一外源试剂存在下提高该产物的表达。修饰的酵母菌株宿主细胞不表达可检测水平的用于生成产物的前体或底物。该产物可为大麻素或其前体,底物可为己酸盐/酯。还提供了采用该经修饰宿主细胞制备产物的方法。经修饰宿主细胞可为酵母菌株,例如酿酒酵母(S.cerevisiae)。(Modified host cells are provided that are engineered to reduce expression of a product to undetectable levels in the presence of one exogenous agent, and to increase expression of the product in the presence of another exogenous agent. The modified yeast strain host cell does not express detectable levels of the precursor or substrate used to produce the product. The product may be a cannabinoid or a precursor thereof and the substrate may be a hexanoate salt. Methods of making products using the modified host cells are also provided. The modified host cell may be a yeast strain, such as saccharomyces cerevisiae (s.)

具体实施方式

本文提供了可用于生产异源产物的重组或经修饰宿主细胞，以及使用该宿主细胞的方法。重组或经修饰宿主细胞包含异源遗传通路，该通路可被一种或多种外源试剂差异调控。重组宿主细胞提供了如下益处：在一组条件下，将异源产物表达减少至极低以下，优选不可检测水平，而在第二组条件下，使得该异源产物强烈表达。在一些实施方式中，宿主细胞经工程化改造以表达大麻素途径中的异源酶。在一些实施方式中，宿主细胞是酵母细胞。

包含异源遗传通路的经修饰宿主细胞

在一个方面，本文提供了包含产生异源产物的异源遗传通路的宿主细胞。在一些实施方式中，异源遗传通路包括被外源试剂调控的遗传调控元件，例如核酸序列。在一些实施方式中，外源试剂起到调控异源遗传通路表达的作用。因此，在一些实施方式中，外源试剂可为基因表达调控物。

在一些实施方式中，外源试剂可用作宿主细胞的碳源。例如，同一外源试剂既可调控异源遗传通路的表达，又可为宿主细胞提供生长所需的碳源。在一些实施方式中，外源试剂是葡萄糖。在一些实施方式中，外源试剂是半乳糖。在一些实施方式中，外源试剂是麦芽糖。

在一些实施方式中，遗传调控元件是核酸序列，例如启动子。在一些实施方式中，遗传调控元件是葡萄糖响应型启动子或被葡萄糖阻遏型启动子。在一些实施方式中，葡萄糖负调控异源遗传通路的表达，从而降低异源产物的生产。示例性的葡萄糖阻遏型启动子包括：pMAL11、pMAL12、pMAL13、pMAL21、pMAL22、pMAL31、pMAL32、pMAL33、pCAT8、pHXT2、pHXT4、pMTH1和pSUC2。

表1：示例性葡萄糖阻遏型启动子序列

启动子	序列
		pMAL11	SEQ ID NO:
pMAL12	SEQ ID NO:
		pMAL13	SEQ ID NO:
pMAL21	SEQ ID NO:
		pMAL22	SEQ ID NO:
pMAL31	SEQ ID NO:
		pMAL32	SEQ ID NO:
pMAL33	SEQ ID NO:
		pCAT8	SEQ ID NO:
pHXT2	SEQ ID NO:
		pHXT4	SEQ ID NO:
pMTH1	SEQ ID NO:
		pSUC2	SEQ ID NO:

在一些实施方式中，遗传调控元件是半乳糖响应型启动子。在一些实施方式中，半乳糖正调控异源遗传通路的表达，从而提高异源产物的生产。在一些实施方式中，半乳糖响应型启动子是GAL1启动子。在一些实施方式中，半乳糖响应型启动子是GAL10启动子。在一些实施方式中，半乳糖响应型启动子是GAL2、GAL3或GAL7启动子。在一些实施方式中，异源遗传通路包括Westfall等所描述的半乳糖响应型调控元件(PNAS(2012)vol.109:E111-118)。在一些实施方式中，宿主细胞缺乏gal1基因，不能代谢半乳糖，但半乳糖仍然能够诱导半乳糖调控型基因。

表2：示例性GAL启动子序列

启动子	序列
		pGAL1	SEQ ID NO:
pGAL10	SEQ ID NO:
		pGAL2	SEQ ID NO:
pGAL3	SEQ ID NO:
		pGAL7	SEQ ID NO:
pGAL4	SEQ ID NO:

在一些实施方式中，用于控制用于基因表达的半乳糖调控系统被重新设置以使其在半乳糖存在下不再被诱导。相反，该基因只有在培养基中存在阻遏物时才会表达，所述阻遏物在某些菌株中可为赖氨酸，或在其他菌株中为麦芽糖。

在一些实施方式中，遗传调控元件是麦芽糖响应型启动子。在一些实施方式中，麦芽糖负调控异源遗传通路的表达，从而提高异源产物的生产。在一些实施方式中，麦芽糖响应型启动子选自下组：pMAL1、pMAL2、pMAL11、pMAL12、pMAL31和pMAL32。可将麦芽糖遗传调控元件设计为根据培养基中麦芽糖存在与否，既活化某些基因的表达，又阻遏其他基因的表达。基因表达的麦芽糖调控以及麦芽糖响应型启动子描述于美国专利公开号2016/0177341中，纳入本文作为参考。麦芽糖代谢的遗传调控描述于Novak等“MaltoseTransport and Metabolism in S.cerevisiae”(“酿酒酵母中的麦芽糖转运以及代谢”，Food Technol.Biotechnol.42(3)213–218(2004))。

表3：示例性MAL启动子序列

启动子	序列
		pMAL1	SEQ ID NO:
pMAL2	SEQ ID NO:
		pMAL11	SEQ ID NO:
pMAL12	SEQ ID NO:
		pMAL31	SEQ ID NO:
pMAL32	SEQ ID NO:

在一些实施方式中，异源遗传通路由麦芽糖和半乳糖调节子的组合调控。

在一些实施方式中，异源遗传通路由赖氨酸调控。LYS基因的调控描述于例如Feller等(Eur.J.Biochem.261,163-170(1999))。

在一些实施方式中，重组宿主细胞不包含或表达极低水平(例如不可检测量)的形成异源产物所需的前体。在一些实施方式中，前体是异源遗传通路中的酶的底物。

大麻素通路

在另一方面，宿主细胞包含产生大麻素或大麻素前体的异源遗传通路。在一些实施方式中，该前体为大麻素通路中的底物。在一些实施方式中，该前体为己酰-CoA合酶(HCS)、四酮合酶(TKS)或橄榄醇酸环化酶(OAC)。在一些实施方式中，大麻素通路中的前体、底物或中间体为己酸盐/酯、橄榄醇或橄榄醇酸。在一些实施方式中，前体为己酸盐/酯。在一些实施方式中，宿主细胞所含前体、底物或中间体的量不足以产生大麻素或大麻素前体。在一些实施方式中，宿主细胞包含的己酸盐/酯的水平或量不足以生产超过10mg/L量的大麻素。在一些实施方式中，异源遗传通路编码至少两种选自下组的酶：己酰-CoA合酶(HCS)、四酮合酶(TKS)和橄榄醇酸环化酶(OAC)。大麻素通路描述于Keasling等(WO 2018/200888)。

在一些实施方式中，宿主细胞是酵母菌株。在一些实施方式中，酵母菌株为Y27600、Y27602、Y27603或Y27604株。

酵母菌株

在一些实施方式中，可用于本方法的酵母包括：已保藏于微生物保藏机构(例如IFO、ATCC等)且属于如下种属的酵母：芽孢酵母属(Aciculoconidium)、食神酵母属(Ambrosiozyma)、节束酵母属(Arthroascus)、双极酵母(Arxiozyma)、阿舒氏酵母(Ashbya)、贝加瓦酵母(Babjevia)、本森顿酵母(Bensingtonia)、葡状子囊(Botryoascus)、(Botryozyma)、酒香酵母属(Brettanomyces)、布氏弹孢酵母(Bullera)、布勒担孢菌(Bulleromyces)、假丝酵母(Candida)、固囊酵母(Citeromyces)、棒孢酵母(Clavispora)、隐球酵母(Cryptococcus)、孢囊线黑粉酵母(Cystofilobasidium)、德巴利氏酵母(Debaryomyces)、德克酵母(Dekkara)、双球菌(Dipodascopsis)、双足囊菌(Dipodascus)、伊氏酵母(Eeniella)、内生霉菌(Endomycopsella)、丝囊霉属(Eremascus)、假囊酵母(Eremothecium)、担孢酵母(Erythrobasidium)、费勒姆菌(Fellomyces)、丝状杆菌(Filobasidium)、半乳糖酵母(Galactomyces)、地霉属(Geotrichum)、小季氏酵母(Guilliermondella)、有孢汉逊氏酵母(Hanseniaspora)、汉逊氏酵母(Hansenula)、哈瑟酵母(Hasegawaea)、胶珊瑚属(Holtermannia)、霍氏菌(Hormoascus)、海波毕赤酵母(Hyphopichia)、伊沙酵母(Issatchenkia)、克勒克氏酵母(Kloeckera)、克勒克氏孢属(Kloeckeraspora)、克鲁维氏酵母(Kluyveromyces)、(Kondoa)、(Kuraishia)、(Kurtzmanomyces)、白冬孢酵母(Leucosporidium)、油脂酵母(Lipomyces)、洛德酵母(Lodderomyces)、马拉色菌(Malassezia)、梅奇酵母(Metschnikowia)、穆拉克酵母(Mrakia)、粘液霉菌(Myxozyma)、拿逊氏酵母(Nadsonia)、中川酵母(Nakazawaea)、针孢酵母(Nematospora)、荣养酵母(Ogataea)、卵孢酵母(Oosporidium)、管囊酵母(Pachysolen)、褐孔菌(Phachytichospora)、发夫酵母(Phaffia)、毕赤酵母(Pichia)、红冬孢酵母(Rhodosporidium)、红酵母(Rhodotorula)、糖酵母(Saccharomyces)、类糖酵母(Saccharomycodes)、复膜孢糖酵母(Saccharomycopsis)、赛特囊菌(Saitoella)、坂口酵母(Sakaguchia)、接合酵母(Saturnospora)、裂芽酵母(Schizoblastosporion)、裂殖糖酵母(chizosaccharomyces)、许旺氏酵母(Schwanniomyces)、锁掷酵母(Sporidiobolus)、掷孢酵母(Sporobolomyces)、原孢酵母(Sporopachydermia)、(Stephanoascus)、梗孢酵母(Sterigmatomyces)、拟梗孢酵母(Sterigmatosporidium)、类酵母类共生菌(Symbiotaphrina)、合轴酵母(Sympodiomyces)、合孢子菌(Sympodiomycopsis)、有孢圆酵母(Torulaspora)、(Trichosporiella)、丝孢酵母(Trichosporon)、三角酵母(Trigonopsis)、筑屋菌(Tsuchiyaea)、阿顿尼奥酵母(Udeniomyces)、华尔多菌(Waltomyces)、威克酵母(Wickerhamia)、拟威克酵母(Wickerhamiella)、拟威尔酵母(Williopsis)、接合糖酵母(Yamadazyma)、亚罗酵母(Yarrowia)、接合囊酵母(Zygoascus)、接合糖酵母(Zygosaccharomyces)、接合拟威尔酵母(Zygowilliopsis)和接合集美酵母(Zygozyma)等等。

在一些实施方式中，菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、非洲粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、布鲁塞尔德克酵母(Dekkera bruxellensis)、乳酪克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis，原称乳酪酵母(Saccharomyces lactis))、马科斯克鲁维酵母(Kluveromyces marxianus)、解腺嘌呤阿氏酵母(Arxula adeninivorans)或多晶汉逊酵母(Hansenula polymorphs，也称安氏毕赤酵母(Pichia angusta))。在一些实施方式中，宿主微生物是假丝酵母属菌株，例如解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、高里假丝酵母(Candida guilliermondii)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、伪热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)或糙皮桦假丝酵母(Candida utilis)。

在特定实施方式中，菌株为酿酒酵母。在一些实施方式中，宿主细胞是选自下组的酿酒酵母菌株：面包酵母、CEN.PK、CEN.PK2、CBS 7959、CBS 7960、CBS 7961、CBS 7962、CBS7963、CBS 7964、IZ-1904、TA、BG-1、CR-1、SA-1、M-26、Y-904、PE-2、PE-5、VR-1、BR-1、BR-2、ME-2、VR-2、MA-3、MA-4、CAT-1、CB-1、NR-1、BT-1和AL-1。在一些实施方式中，酿酒酵母菌株选自下组：PE-2、CAT-1、VR-1、BG-1、CR-1和SA-1。在特定实施方式中，酿酒酵母菌株为PE-2。在另一特定实施方式中，酿酒酵母菌株为CAT-1。在另一特定实施方式中，酿酒酵母菌株为BG-1。

在一些实施方式中，菌株为适于工业发酵的微生物。在特定实施方式中，使微生物适应于在因糖和盐类、酸度、亚硫酸盐和细菌污染或其组合引起的高溶剂浓度、高温、扩展的底物应用、营养限制、渗透胁迫下生存，这些均是工业发酵环境中所知的胁迫条件。

在一些实施方式中，酵母菌株为Y27598、Y27599、Y27600、Y27601、Y27602、Y27603、Y27604或Y25618株。示例性的酵母菌株如下表4所示。

表4：酵母菌株

混合物

在另一方面，提供了本文所述宿主细胞和本文所述培养基的混合物。在一些实施方式中，培养基包含本文所述的外源试剂。在一些实施方式中，该培养基包含外源试剂，所述试剂减少异源产物的产生。在一些实施方式中，减少异源产物产生的外源试剂是葡萄糖或麦芽糖。

在一些实施方式中，该培养基包含外源试剂，所述试剂增加异源产物的产生。在一些实施方式中，增加异源产物产生的外源试剂是半乳糖。在一些实施方式中，培养基包含制备异源产物所需的前体或底物。在一些实施方式中，制备异源产物所需的前体为己酸盐/酯。在一些实施方式中，培养基包括：增加异源产物生产的外源试剂以及制备该异源产物所需的前体或底物。在一些实施方式中，增加异源产物生产的外源试剂是半乳糖，制备异源产物所需的前体或底物是已酸盐/酯。

制备宿主细胞的方法

在另一方面，提供了制备本文所述经修饰宿主细胞的方法。在一些实施方式中，该方法包括用本文所述的异源核酸构建体转化宿主细胞，该构建体编码由本文所述的异源遗传通路表达的蛋白质。转化宿主细胞的方法描述于“Laboratory Methods in Enzymology:DNA”(酶学实验方法：DNA)，Jon Lorsch编，529卷，(2013)；美国专利号9,200,270，授予Hsieh,Chung-Ming等，以及本文引用的参考文献。

生产异源产物的方法

在另一方面，提供了生产本文所述异源产物的方法。在一些实施方式中，该方法减少异源产物的表达。在一些实施方式中，该方法包括在包含外源试剂的培养基中培养包含本文所述异源遗传通路的宿主细胞，其中所述外源试剂减少该异源产物的表达。在一些实施方式中，外源试剂是葡萄糖或麦芽糖。在一些实施方式中，该方法获得少于0.001mg/L的异源产物。在一些实施方式中，异源产物是大麻素或大麻素前体。

在一些实施方式中，该方法减少大麻素产物或其前体的表达。在一些实施方式中，该方法包括在包含外源试剂的培养基中培养包含本文所述异源大麻素通路的宿主细胞，其中所述外源试剂减少大麻素或其前体的表达。在一些实施方式中，外源试剂是葡萄糖或麦芽糖。在一些实施方式中，该方法生产少于0.001mg/L的大麻素或其前体。

在一些实施方式中，该方法增加异源产物的表达。在一些实施方式中，该方法包括在包含外源试剂的培养基中培养包含本文所述异源遗传通路的宿主细胞，其中所述外源试剂增加该异源产物的表达。在一些实施方式中，外源试剂是半乳糖。在一些实施方式中，该方法还包括在制备异源产物所需的前体或底物的存在下培养该宿主细胞。

在一些实施方式中，该方法增加大麻素产物或其前体的表达。在一些实施方式中，该方法包括在包含外源试剂的培养基中培养包含本文所述异源大麻素通路的宿主细胞，其中所述外源试剂增加大麻素或其前体的表达。在一些实施方式中，外源试剂是半乳糖。在一些实施方式中，该方法还包括在制备异源大麻素产物或其前体所需的前体或底物的存在下培养该宿主细胞。在一些实施方式中，制备异源大麻素产物或其前体所需的前体为己酸盐/酯。在一些实施方式中，外源试剂和制备异源大麻素产物或其前体所需的前体或底物的组合产生的大麻素产率高于使用单独外源试剂的情况。

在一些实施方式中，大麻素或其前体是大麻二酚酸(CBDA)、CBD、大麻萜酚酸(CBGA)或CBG。

核酸

由于遗传密码的固有简并性，编码基本上相同或功能等价多肽的其他多核苷酸也可用于克隆和表达编码本文所述异源遗传通路中蛋白质组分的多核苷酸。

本领域普通技术人员理解修饰编码序列以提高其在特定宿主中的表达是有利的。遗传密码冗余地包含64种可能的密码子，但大部分生物体通常只采用这些密码子中的一部分。在某一物种中最常用的密码子被称为最优密码子，而那些不常有的则被划分为稀有或低利用度密码子。密码子可以被取代以反映宿主的优选密码子使用，这一过程有时被称为“密码子优化”或“物种密码子偏好控制”。

可制备包含特定原核或真核宿主优选密码子的优化编码序列(Murray等，1989,Nucl Acids Res.17:477-508)，以例如提高翻译速度或产生具有所需特征(例如更长半衰期)的重组RNA转录物(与未优化序列所产生的转录物相比)。也可修饰翻译终止密码子以反映宿主的偏好。例如，酿酒酵母和哺乳动物的典型终止密码子分别是UAA和UGA。单子叶植物的典型终止密码子是UGA，而昆虫和大肠杆菌通常使用UAA作为终止密码子(Dalphin等人，1996，Nucl Acids Res.24:216-8)。

本领域技术人员应理解由于遗传密码的简并性质，可用核苷酸序列不同的多种DNA分子来编码本公开给定的酶。此处参考编码前述生物合成酶的天然DNA序列仅为说明本公开的实施方式，本公开中包括任何序列的DNA分子，其编码本公开方法中采用的酶蛋白和多肽的氨基酸序列。以类似的方式，多肽通常能够耐受其氨基酸序列中一个或多个氨基酸的取代、缺失和插入而不会丧失或显著丧失所需活性。本公开包括与本文所述蛋白质具有不同氨基酸序列的多肽，只要该经修饰的或变体多肽具有参比多肽的酶合成代谢或分解代谢活性。此外，本文所示DNA序列编码的氨基酸序列仅是为了说明本公开的实施方式。

此外，可用于本文所提供组合物和方法的酶的同源物也包括在本公开中。在一些实施方式中，当氨基酸序列具有至少约30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性时，两种蛋白质(或蛋白质的区域)基本上是同源的。为了确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的百分比相同性，可以为了最佳比较目的而对序列进行比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列的之一或两条中引入缺口以达到最佳对齐，并且出于比较目的可以不考虑非同源序列)。在一个实施方式中，为了比较目的而比对的参比序列的长度为参比序列长度的至少30％，通常至少40％，更通常至少50％、60％，甚至更通常至少70％、80％、90％或100％。然后比较对应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的(如本文所用，氨基酸或核酸的“相同性”等同于氨基酸酸或核酸“同源性”)。考虑到用于两个序列的最佳比对而需要引入的缺口数和每个缺口的长度，两条序列之间的百分比相同性与序列共有相同位置的数目相关。

当“同源”用于蛋白质或肽时，认识到不相同的残基位置通常因保守的氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是指其中的一个氨基酸残基被具有类似化学性质(例如电荷或疏水性)侧链(R基团)的另一氨基酸残基取代。一般来说，保守氨基酸取代不会实质性地改变蛋白质的功能特性。在两个或多个氨基酸序列通过保守取代彼此不同时，可向上调整序列同一性百分比或同源性程度以纠正取代的保守性质。进行该调整的方式是本领域普通技术人员熟知的(参见例如Pearson W.R.,1994,Methods in Mol Biol 25:365-89)。

以下六组每组含有相互保守取代的氨基酸：1)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)，和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

多肽的序列同源性(也称作序列同一性百分比)通常采用序列分析软件测定。用于比较分子序列与包含获自不同生物体的大量序列的数据库的典型算法是计算机程序BLAST。在检索包含来自大量不同生物体的序列的数据库时，通常比较氨基酸序列。

此外，编码前述酶(或任何其他本文所述(或控制或调整其表达的任何调控元件))的任何基因可通过基因/蛋白质工程化改造技术优化，例如定向进化或合理诱变，这些均是本领域普通技术人已知的。这种作用允许本领域普通技术人员优化宿主细胞(例如酵母)中酶的表达和活性。

此外，编码这些酶的基因可从其他真菌和细菌种类中鉴别并被表达以调控该通路。多种生物体可以作为这些酶的来源，包括但不限于：酵母(Saccharomyces spp.)，包括酿酒酵母和葡萄汁酵母(S.uvarum)；克鲁维酵母(Kluyveromyces spp.)，包括耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)和马克斯克鲁维酵母；毕赤酵母(Pichia spp.)；汉逊酵母(Hansenula spp.)，包括多形汉逊酵母(H.polymorpha)；假丝酵母(Candida spp.)、毛孢子菌(Trichosporon spp.)；接合糖酵母(Yamadazyma spp.)，包括具柄接合糖酵母(Y.spp.Stipitis)、比勒陀利亚有孢酵母(Torulaspora pretoriensis)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)；裂殖酵母(Schizosaccharomyces spp.)，包括粟酒裂殖酵母(S.pombe)；隐球菌(Cryptococcus spp.)；曲霉(Aspergillus spp.)；脉孢菌(Neurospora spp.)；或黑粉菌(Ustilago spp.)。厌氧真菌的基因来源包括但不限于：梨囊鞭菌(Piromyces spp.)、根囊鞭菌(Orpinomyces spp.)或新美鞭菌(Neocalimastixspp.)。有用的原核酶的来源包括但不限于大肠杆菌、运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、梭菌、棒杆菌(Corynebacterium spp.)、假单胞菌、乳球菌、肠杆菌和沙门氏菌。

本领域普通技术人员已知的技术可适用于鉴别其他同源基因和同源酶。通常，可通过功能分析鉴别类似(analogous)基因和/或类似酶，它们将具有功能相似性。本领域普通技术人员已知的技术可适用于鉴别类似基因和类似酶。例如，为了鉴别同源或类似ADA基因、蛋白质或酶，技术可包括但不限于：基于ADA基因/酶的已公开序列采用引物通过PCR来克隆基因，或者采用设计用于扩增ADA基因之间的保留区的简并引物进行简并PCR来克隆基因。同时，本领域普通技术人员能够采用技术来鉴别具有功能同一性或相似性的同源或类似基因、蛋白质或酶。技术包括通过对所述活性进行体外酶测定来检查细胞或细胞培养物中酶的催化活性(例如，如本文或Kiritani，K.的“Branched-Chain Amino Acids MethodsEnzymology”(支链氨基酸方法，酶学，1970中所述)；然后通过纯化分离出具有上述活性的酶；通过埃德曼(Edman)降解等技术测定酶的蛋白质序列；对可能的核酸序列设计PCR引物；通过PCR扩增所述DNA序列；以及克隆所述核酸序列。为了识别同源或相似(similar)基因和/或同源或相似酶，类似基因和/或类似酶或蛋白质，技术还包括将有关候选基因或酶的数据与诸如BRENDA、KEGG或MetaCYC等数据库进行比较。可根据本文的教导，在前述的数据库中鉴别候选基因或酶。

在一些实施方式中，核酸序列编码的蛋白质或多肽与本文所述异源遗传通路所编码的蛋白质或酶的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方式中，核酸序列编码的蛋白质或多肽与HCS、TKS或OAC的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

培养和发酵方法

用于微生物培养物维持或生长的材料和方法为微生物学或发酵学领域的技术人员所熟知(参见，例如，Bailey等,“Biochemical Engineering Fundamentals”，《生物化学工程基础》，第二版，McGraw Hill出版社，纽约，1986)。取决于宿主细胞、发酵和工艺的具体要求，必须要考虑合适的培养基、pH、温度以及对有氧、微氧或厌氧条件的需求。

生产本文所述异源产物的方法可在位于合适容器中的合适培养基(例如补充或不补充泛酸盐)中进行，所述容器可包括但不限于细胞培养板、烧瓶或发酵罐。此外，这些方法能够以本领域已知的任何发酵规模进行以支持微生物产物的工业化生产。可采用任何合适的发酵罐，其包括搅拌釜发酵罐、气升式发酵罐、鼓泡式发酵罐或其任意组合。在利用酿酒酵母作为宿主细胞的特定实施例中，菌株可在发酵罐中生长，如Kosaric等人在《Ullmann工业化学大全》(Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry，第六版，第12卷398-473页,威利-VCH出版社有限公司(Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KDaA)，德国因海姆)中详细描述的那样。

在一些实施方式中，培养基是能够在其中供养(即保持生长和活力)产生异源产物的经遗传修饰微生物的任何培养基。在一些实施方式中，培养基是包含可同化的碳、氮和磷酸盐/酯源的水性培养基。这类培养基还可以包括适当的盐、矿物质、金属和其他营养物。在一些实施方式中，将碳源和各种必需的细胞营养物增量或连续地加入发酵培养基，并且每种所需营养素基本上保持在生长细胞有效同化所需的最低水平，例如，根据基于将碳源转化为生物质的细胞代谢或呼吸功能的预定细胞生长曲线。

用于培养微生物的合适条件和合适培养基是本领域中熟知的。在一些实施方式中，合适的培养基还补充有一种或多种其他试剂，例如，诱导剂(例如，当编码基因产物的一种或多种核苷酸序列处于诱导型启动子的控制之下)，阻遏剂(例如，当编码基因产物的一种或多种核苷酸序列处于阻抑型启动子的控制之下)，或者选择试剂(例如用于选择包含遗传修饰的微生物)。

在一些实施方式中，碳源是单糖(简单糖)、二糖、多糖、不可发酵的碳源，或其中一种或多种的组合。合适单糖的非限制性例子包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖及其组合。合适二糖的非限制性例子包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖及其组合。合适多糖的非限制性例子包括淀粉、胶原、纤维素、壳聚糖以及其组合。合适的不可发酵碳源的非限制性例子包括乙酸盐和甘油。

培养基中的碳源(例如葡萄糖)浓度应能促进细胞生长，但不应过高而导致抑制所用微生物的生长。通常，培养伴随所加水平能够实现所需生长和生物质水平的碳源(例如葡萄糖)进行。异源产物的生产也可在这些培养条件下发生，但处于不可测水平(检测限约为<0.1g/l)。在其他实施方式中，培养基中的碳源(例如葡萄糖)浓度大于约1g/L，优选大于约2g/L，更优选大于约5g/L。此外，培养基中的碳源(例如葡萄糖)浓度通常小于约100g/L，优选小于约50g/L，更优选小于约20g/L。应注意到所指培养成份浓度可指起始和/或进行中的成份浓度。在某些情况下，希望允许培养基在培养中发生碳源耗竭。

能够用于合适培养基中的可同化氮源包括但不限于：简单氮源、有机氮源和复合氮源。此类氮源包括无水氨、铵盐和动物、植物和/或微生物源的物质。合适的氮源包括但不限于蛋白质水解产物、微生物生物质水解产物、蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、脲和氨基酸。培养基中的氮源浓度通常大于约0.1g/L，优选大于约0.25g/L，更优选大于约1.0g/L。然而，加入培养基中的氮源高于一定浓度时对微生物生长不利。由此，培养基中的氮源浓度小于约20g/L，优选小于约10g/L，更优选小于约5g/L。此外，在某些情况下，希望允许培养基在培养中发生氮源耗竭。

有效培养基可含有诸如无机盐、维生素、痕量金属或生长促进剂等其他化合物。此类其他混合物也能够存在于有效培养基中的碳、氮或矿物质源中，或特地加入培养基中。

培养基还可包含合适的磷酸源。此类磷酸源包括无机磷酸源和有机磷酸源。优选磷酸源包括但不限于磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、或磷酸氢二钠和磷酸氢二钾、磷酸铵及其混合物。培养基中的磷酸源浓度通常大于约0.1g/L，优选大于约2.0g/L，更优选大于约5.0g/L。然而，加入培养基中的磷酸盐高于一定浓度时对微生物生长不利。因此，培养基中的磷酸盐浓度通常小于约20g/L，优选小于约15g/L，更优选小于约10g/L。

合适的培养基还可以包括镁源，优选以生理上可接受的盐的形式，例如七水硫酸镁，尽管也可使用提供类似镁量浓度的其他镁源。培养基中的镁浓度通常大于约0.5g/L，优选大于约1.0g/L，更优选大于约2.0g/L。然而，加入培养基中的镁高于一定浓度时对微生物生长不利。因此，培养基中的镁浓度通常小于约10g/L，优选小于约5g/L，更优选小于约3g/L。此外，在某些情况下，希望允许培养基在培养中发生镁源耗竭。

在一些实施方式中，培养基还可包括生物学上可接受的螯合剂，例如柠檬酸三钠的二水合物。在此情况下，培养基中的螯合剂浓度大于约0.2g/L，优选大于约0.5g/L，更优选大于约1g/L。然而，加入培养基中的螯合剂高于一定浓度时对微生物生长不利。因此，培养基中的螯合剂浓度通常小于约10g/L，优选小于约5g/L，更优选小于约2g/L。

培养基最初也可包括生物学上可接受的酸或碱，以维持培养基所需的pH值。生物学上可接受的酸包括但不限于盐酸、硫酸、硝酸、磷酸及其混合物。生物学上可接受的碱包括但不限于氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾及其混合物。在一些实施方式中，所用碱为氢氧化铵。

培养基还可包括生物学上可接受的钙源，包括但不限于氯化钙。通常，培养基中钙源(例如二水氯化钙)的浓度为约5mg/L至约2000mg/L，优选约20mg/L至约1000mg/L，更优选约50mg/L至约500mg/L。

培养基也可包括氯化钠。通常，培养基中氯化钠的浓度为约0.1g/L至约5g/L，优选约1g/L至约4g/L，更优选约2g/L至约4g/L。

在一些实施方式中，培养基还可包括微量金属。此类微量金属可以作为储备溶液添加到培养基中，为方便起见，所述储备溶液可与培养基的其余部分分开制备。加入培养基中的此类微量金属溶液的量通常大于约1ml/L，优选大于约5ml/L，更优选大于约10ml/L。然而，加入培养基中的微量金属高于一定浓度时对微生物生长不利。因此，加入培养基中的此类微量金属溶液的量通常小于约100ml/L，优选小于约50ml/L，更优选小于约30ml/L。应当注意的是，除了在储备溶液中添加微量金属之外，还可以单独添加各种组分，每种组分都在独立对应于微量金属溶液上述范围所规定的组分量范围内。

培养基可包括其他维生素，例如泛酸盐、生物素、钙、泛酸盐、肌醇、盐酸吡哆醇和盐酸硫胺素。此类维生素可作为储备溶液添加到培养基中，为方便起见，所述储备溶液可与培养基的其余部分分开制备。然而，加入培养基中的维生素高于一定浓度时对微生物生长不利。

本文所述发酵方法可在常规培养模式下执行，其包括但不限于分批、补料分批、细胞循环、连续和半连续。在一些实施方式中，发酵以分批补料模式进行。在此情况下，培养过程中培养基的一些成分被耗竭，包括发酵生产阶段的泛酸盐。在一些实施方式中，培养物可在例如生产阶段的开始时补充相对高浓度的此类组分，以便在需要添加之前在一段时间内支持生长和/或生产。通过添加因培养消耗水平的这些成分，在整个培养过程中保持这些成分的优选范围。培养基中成分的水平可通过(例如)定期取样培养基和分析浓度来监测。或者，一旦开发了标准培养程序，可在整个培养过程中的特定时间，以与已知水平相对应的时间间隔进行添加。如本领域技术人员将认识到的，随着培养基的细胞密度增加，培养期间营养素的消耗率增加。此外，为了避免将外来微生物引入培养基，使用本领域已知的无菌添加方法进行添加。此外，在培养过程中可添加少量消泡剂。

培养基的温度可以是适合遗传修饰细胞生长和/或产生感兴趣化合物的任何温度。例如，在用接种物接种培养基之前，可将培养基置于约20-约45℃的温度范围内并保持该范围，优选温度在约25-约40℃范围内，更优选在约28-32℃的范围内。

可通过向培养基添加酸或碱来控制培养基的pH值。在此情况下，当氨用于控制pH值时，它还可以方便地作为培养基中的氮源。优选地，pH保持在约3.0至约8.0，更优选地保持在约3.5至约7.0，且最优选地保持在约4.0至约6.5。

在一些实施方式中，在培养期间监测培养基的碳源浓度，例如葡萄糖浓度。可使用已知技术监测培养基的葡萄糖浓度，例如，使用葡萄糖氧化酶试验或高压液相色谱法，其可用于监测上清液(例如培养基的无细胞组分)中的葡萄糖浓度。如前所述，碳源浓度应保持在细胞生长抑制发生的水平以下。尽管这种浓度可能因生物体而异，但对于作为碳源的葡萄糖而言，当葡萄糖浓度大于约60g/L时，细胞生长受到抑制，并且可以通过试验轻松确定。因此，当葡萄糖被用作碳源时，优选将葡萄糖供给发酵罐并保持在检测限以下。或者，培养基中的葡萄糖浓度保持约1g/L-约100g/L，更优选约2g/L-约50g/L，更优选约5g/L-约20g/L。尽管碳源浓度可通过例如添加基本上纯的葡萄糖溶液维持在所需水平内，但可接受且可优选的是通过添加原始培养基的等份来保持培养基的碳源浓度。使用原始培养基的等份是有利的，因为其还可同时保持培养基中其他营养物质(例如氮源和磷源)的浓度。同样，通过添加微量金属溶液的小份，可在培养基中保持微量金属浓度。

实施例

实施例1：以大麻素合成通路工程化改造的宿主细胞

对酵母进行工程化改造以表达大麻素合成通路的一部分。如图4所示，己酰-CoA合酶(HCS)、四酮合酶(TKS)和橄榄醇酸环化酶(OAC)以己酸盐/酯为底物启始橄榄醇酸合成。HCS使用己酸盐/酯作为底物形成己酰-CoA，随后己酰-CoA作为TKS的底物形成丙二酰-CoA，而丙二酰-CoA进一步作为OAC的底物形成橄榄醇酸。将编码HCS、TKS和OAC的各序列插入酿酒酵母细胞中，各编码序列均在GAL启动子的控制下。因此，只有当酵母在半乳糖存在下生长时，这些酶各自的合成才会被诱导。如表4、图2和图3所示，制备了数种构建体(以及产生的酵母菌株)，其中一些仅表达HCS、TKS和OAC的子集，而其他构建体和酵母菌株包含GAL启动子控制下的HCS、TKS和OAC各自至少一个拷贝。表4、图2和图3有助于理解图1所示数据所测试的是何种菌株。

在大麻素通路的情况下，可投料己酸盐/酯以提供生产大麻素聚酮前体所需的己酰辅酶A底物(见图4)。野生型酵母产生极低水平的己酸盐/酯，因此如果不投料，大麻素的产量会大大减少。图1显示了大麻素前体橄榄醇和橄榄醇酸的水平，这些大麻素前体是由经工程化改造以可开关控制地表达通路基因(HCS、TKS和OAC)并在三种条件下生长的各种酵母菌株产生的。在前两种情况下，不向菌株添加己酸盐/酯，碳源为葡萄糖(gluc；关闭通路表达)或半乳糖(gal；打开通路表达)。在第三种情况下(最右)，以半乳糖为碳源，其活化通路基因，并将己酸盐/酯给予酵母。可以看出，当半乳糖是碳源并将己酸盐/酯给予酵母时，会产生大量大麻素前体。另一方面，当葡萄糖为碳源从而关闭大麻素通路的表达，并且未给予己酸盐/酯时，大麻素的产生低于测试的检测限(<0.001mg/L)。本实施例表明使用两个正交开关系统(半乳糖诱导通路表达和己酸盐/酯的添加)来确保完全关闭橄榄醇和橄榄醇酸的生产。将必须外源供给通路前体与基因开关(例如，诱导型启动子或阻遏型启动子)相结合的类似正交切换系统可用于控制引入酵母的其他异源通路。

实施例2：酵母转化方法

在优化的醋酸锂(LiAc)转化中，使用标准分子生物学技术将每个DNA构建体整合到酿酒酵母(CEN.PK113-7D)中。简而言之，细胞在30℃的酵母提取物蛋白胨葡聚糖(YPD)培养基中摇动(200rpm)过夜，在100mL YPD中稀释至OD₆₀₀为0.1，并使其生长至OD₆₀₀为0.6–0.8。对于每次转化，通过离心收集5mL培养物，在5mL无菌水中洗涤，再次旋降，在1mL 100mMLiAc中重新悬浮，并转移至微量离心管。将细胞旋降(13000×g)30秒，去除上清液，并将细胞重新悬浮由如下组成的转化混合物中：240μL 50％PEG、36μL1M LiAc、10μL煮沸鲑鱼精子DNA和74μL供体DNA。对于需要表达内切酶F-Cph1的转化，供体DNA包括携带在酵母TDH3启动子下表达的F-CphI基因的质粒。这将切割着陆坪中的F-CphI内切酶识别位点，以促进感兴趣目标基因的整合。在42℃下热休克40分钟后，细胞在YPD培养基中恢复过夜，然后接种在选择性培养基上。通过集落PCR以特异于整合的引物确认DNA整合。

实施例2：包含适于快速基因工程化改造以生产非分解代谢性化合物的基因开关系统的基础菌株的产生。

为了产生一种能够被快速工程化改造以生成任意天然化合物的菌株，对原始酵母分离物CEN.PK113-7D实施了数个工程化改造步骤。首先，将兆核酸酶蛋白整合到染色体中，以便在随后的几轮转化中实现基于核酸酶的工程化改造。其次，工程化改造了七个染色体位点以获得能够使用经验证的核酸酶高效整合未来DNA构建体的核苷酸序列。第三，添加了麦芽糖响应型基因开关，以控制由GAL启动子(pGALx)驱动的基因表达。将所得菌株Y46850作为底盘，可将用于天然化合物生物合成的设计物快速原型化入其中。

麦芽糖响应型基因开关的发明和用途先前描述于WO2016210350；US201615738555；以及US201615738918中，各自通过引用整体并入本文。简言之，基因开关使异源、非分解代谢通路能够根据麦芽糖和温度在开启和关闭状态之间切换(图5)。当菌株在麦芽糖存在和≤28℃的温度下生长时，所有pGALx驱动基因的表达将被关闭，允许细胞资源转而用于生物质的产生，即生长。相反，当该菌株在没有麦芽糖且在≥30℃的温度下生长时，所有pGALx驱动基因的表达都将开启，从而能够将所给予的蔗糖高产率转化为非分解代谢产物。

麦芽糖开关是基于GAL80的开关，其中麦芽糖响应型启动子驱动GAL80的表达(pMALx>GAL80)。基于GAL80的开关的一个挑战是，在发酵过程中重新激活Gal80p活性的突变将关闭生物合成生产，这是一个受自然选择青睐的事件。开发了两种主要方法来减少GAL80再活化。第一种是：当麦芽糖耗竭且温度为≥30℃时，将UBR1靶向的降解决定子(degron，D)与温度敏感的GAL80(GAL80ts1)融合以加速Gal80蛋白降解。第二种是：通过将基于麦芽糖结合蛋白(MBP)的降解决定子融合到GAL80蛋白的C末端，使GAL80蛋白进一步失稳。当存在麦芽糖时，GAL80p-MBP突变融合蛋白是稳定的；然而，当麦芽糖耗竭时，GAL80蛋白会迅速降解。使用MBP突变体的另一个益处是，具有D_GAL80ts1_MBP的菌株在关闭状态条件下的生长过程中表现出显著较低的GAL基因表达“泄漏”。

实施例3：能够生产大麻萜酚酸(CBGA)的菌株的产生

通过三个步骤将能够产生大麻素CBGA的一组基因导入菌株Y46850(表5和图6)。第一步，将构建物整合到染色体基因座以表达来自栽培大麻(Cannibis sativa)的三个异源基因AAE、TKS和OAC，以及运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)PDC基因和两个内源性酿酒酵母ACS1和ALD6基因，所有这些基因均使用pGALx启动子。第二步，将构建物整合到染色体基因座以表达酿酒酵母甲羟戊酸通路的七个内源性基因(ERG10、ERG13、HMG1的催化结构域、ERG12、ERG8、MVD1和IDI1)。第三步，将构建物整合入染色体基因座以表达尖角链霉菌(Streptomyces aculeolatus)GPPS和栽培大麻CBGa合酶(CBGAS)基因。CBGAS基因需要广泛的N末端工程化改造，以使其以催化活性形式表达，并且不抑制酵母的生长。该工程化改造的描述另有出处(即将提交的关于DPL1-PT4工程化改造和TM78-hop嵌合发生的专利申请)。如下文酵母培养条件部分所述，当给予蔗糖和己酸的混合物时，所得菌株Y61508能够产生CBGA。

值得注意的是，参与己酸生产的基因尚未被工程化改造入该菌株。内源性酵母代谢产生的己酸或己酰-CoA的量可以忽略不计，这意味着这些菌株依赖于外源供应己酸来产生大麻素(图6)。

表5：

实施例4：能够生产大麻二酚酸(CBDA)的菌株的产生

大麻二酚酸合酶(CBDAS)是一种氧化环化酶，可产生碳-碳键，将CBGA的香叶基部分折叠成六元环。CBDAS属于小檗碱-桥酶(Berberine-Bridge Enzyme)家族，采用活性部位中的二共价结合黄素单核苷酸来利用分子氧，并且每个反应循环还产生一分子过氧化氢(H₂O₂)。大麻中的CBDAS具有二硫键，是糖基化的，并且天然分泌到毛状体的质外体空间，其被认为涉及通过H₂O₂生成来防止自身毒性。在酵母中功能性表达CBDAS的另一个挑战是其≈4.5–5的窄pH值范围。

酵母表面展示是一种经典的分子生物学技术，其中感兴趣的蛋白质位于酵母细胞的外表面，允许蛋白质直接与培养基相互作用。表面展示满足CBDAS活性的要求，因为表面蛋白质是糖基化的(来自高尔基体)，并且发酵培养基的pH值较低。表面展示比分泌更优选，因为将蛋白质泵入液体培养基可能导致起泡问题。为了设计用于CBDAS表面展示的蛋白构建体，我们选择酵母细胞壁甘露糖蛋白(mannoprotein)CWP2来提供信号序列，选择SAG1作为载体蛋白(图7和表5)。该构建体被整合到菌株Y61508的近等基因同胞中以产生菌株Y66085。

实施例5：酵母培养条件

对于96孔板规格的常规菌株表征，将酵母菌落挑到1.1-mL/孔容量的96孔“预培养板”中，每个孔填充360μL预培养培养基。预培养培养基的组成如下：pH值为5.05的鸟籽培养基(Bird Seed Media，BSM，最初由van Hoek等(2000)描述)，Biotechnology andBioengineering，第68卷，第517-523页)，含有14g/L蔗糖、7g/L麦芽糖、3.75g/L硫酸铵和1g/L赖氨酸。细胞在28℃的高容量微量滴定板培养箱中以1000rpm摇动和80％湿度培养3天，直到培养物达到碳耗竭。

通过从饱和培养物中提取14.4μL，并稀释至每孔容量为2.2-mL的96孔“生产板”，每孔加入360μL生产培养基，对生长饱和培养物进行继代培养。生产培养基由含40g/L蔗糖、3.75g/L硫酸铵和2mM己酸的BSM(pH 5.05组成。在提取和分析之前，将生产培养基中的细胞在30℃，1000rpm和80％湿度的条件下，在高容量微量滴定板摇动器中培养3天。

实施例6：大麻素提取和滴度测定的分析方法

在生产板孵育结束时，向每个孔中添加甲醇，使最终浓度为67％(v/v)甲醇。添加非渗透性密封，并以1000rpm的转速摇动平板30秒，以裂解细胞并提取大麻素。平板在200×g下离心30秒，形成颗粒细胞碎片。将300μL澄清样品移入容量为1.1mL的96孔空板中，并用箔封密封。样品板在-20℃下储存，直至分析。

使用带有Accupore Polar Premium 2.6μm C18柱(100 x 2.1mm)的ThermoVanquish系列UPLC-UV系统分离大麻二酚酸(CBDA)和大麻萜酚酸(CBGA)。流动相为含0.1％甲酸水溶液的5mM甲酸铵与0.1％甲酸的乙腈溶液的梯度流动相，流速为1.2ml/min。使用纯标准品在提取溶剂中按重量制备校准曲线。

实施例7：两种正交开关系统的验证

对于一些生物分子，例如大麻素，因管控要求产生了在菌株繁殖所需的生长期期间对低生产状态中极低或不可检测生产的需要。为此，将遗传编码的麦芽糖响应型开关与大麻素生物合成对外源供应己酸的依赖性相结合。

当菌株Y61508在不含麦芽糖但存在己酸的条件下生长时，观察到CBGA滴度最高，生物质积累最低(图8)，这与细胞资源进入这一非分解代谢途径相一致。当蔗糖被麦芽糖取代时，CBGA滴度降低，生物质积累增加。当不再供应外源己酸时，CBGA滴度也降低，生物质积累增加。对于不同的产CBGA菌株Y66316，观察到非常相似的结果(图9)。

重要的是，当这些菌株在4％麦芽糖存在但没有外源供应己酸的情况下生长时，观察到最高的生物质积累和最低的CBGA滴度。在此条件下，大麻素产量低于测试的检测限(<0.001mg/L)。该实施例表明使用两种正交开关系统来确保完全关闭大麻素生产，并引导细胞资源，而不是生物质积累，即生长。

为了扩大这一发现，我们在相同条件下测试了产CBDA菌株Y66085。同样，麦芽糖的缺乏和己酸的外源供应使细胞完全转变为大麻素生产，而以生长为代价(图10)。通过以麦芽糖替代蔗糖或去除外源供应己酸，CBDA滴度降低且生物质增加。该实施例表明两种正交开关系统的使用扩展到了多个工程化改造生产不同大麻素的菌株。

应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有发表物(包括GenBank登录号)、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。