一种鸡精液冷冻保存及人工输精用试剂盒及其使用方法
阅读说明：本技术 一种鸡精液冷冻保存及人工输精用试剂盒及其使用方法 (Kit for chicken semen cryopreservation and artificial insemination and use method thereof ) 是由 陈继兰 李云雷 宗云鹤 孙研研 袁经纬 于 2021-08-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种鸡精液冷冻保存及人工输精用试剂盒,包括DJ-I液、DJ-II液、DJ-III液、DMEM液、甘油、冻精细管,本发明的有益效果是,本试剂盒中的稀释液能够为鸡精子提供较好的生存环境,并且添加试剂盒中的冷冻保护剂后能够成功的进行鸡精液冷冻保存,通过应用本发明的鸡精液冷冻保存的试剂盒进行冷冻保存的鸡精液,解冻后受精率可达60％以上,满足鸡遗传资源保种的需要。(The invention discloses a kit for chicken semen cryopreservation and artificial insemination, which comprises DJ-I liquid, DJ-II liquid, DJ-III liquid, DMEM liquid, glycerol and a frozen semen tubule, and has the beneficial effects that diluent in the kit can provide a better living environment for chicken semen, and the frozen chicken semen can be successfully preserved after a cryoprotectant in the kit is added, so that the fertilization rate can reach more than 60% after thawing of the chicken semen preserved by using the kit for chicken semen cryopreservation, and the requirement of chicken genetic resource conservation is met.)
技术领域
本发明涉及家禽保种生物技术领域，具体涉及一种鸡精液冷冻保存及人工输精用试剂盒及其使用方法。
背景技术
精液冷冻保存是利用液氮(-196℃)或者干冰(-79℃)等作为冷源，将精液经过稀释、平衡、添加冷冻保护剂、再平衡等处理后，快速降温，抑制精子的新陈代谢，使精子能够长时间保存在超低温下，解冻升温后精子能够恢复受精能力，精液冷冻保存是畜禽易位保种的重要技术手段，在濒危物种的保护和重要经济动物的快速扩繁中具有重要的应用价值，然而，受家禽精子独特形态结构特征等因素的制约，目前家禽精液冷冻保存技术发展缓慢，亟待建立稳定高效的冷冻技术体系。
精液冷冻及应用流程一般分为精液的稀释、平衡、冷冻、解冻、去甘油和人工输精等，影响家禽精液冷冻效率的因素主要是冷冻技术参数，包括冷冻保护剂类型和浓度、稀释液的成分和浓度、冷却速度、精液包装类型和解冻温度等；目前，许多稀释液被用于冷冻精液的制作，包括5％～7％葡萄糖溶液、1％NaCl溶液和葡萄糖卵黄溶液，以及Lake型精液稀释液和BHSV型精液稀释液等，但其实际效果不太理想；实际研究证明，配制pH、渗透压、能量物质和抗氧化物等成分含量适宜的稀释液对于减少冷冻损伤、保护鸡精子活力和受精能力至关重要，影响鸡冷冻精液生产和鸡遗传资源保护工作成效；精液冷冻用到的稀释液种类也较多，包括初步平衡稀释液、冷冻保护液、去甘油稀释液、输精稀释液等等，配制和质控过程复杂，需要特定仪器和耗材，容易导致配制效果不稳定等，因此目前急需建立一种鸡精液冷冻保存试剂盒，能够高效、高质量、高便捷地实现鸡精液的冷冻保存，提高鸡冷冻精液制备的工作成效。
发明内容
本发明提供一种适用于鸡精液冷冻保存的试剂盒，能够有效的对鸡精液进行冷冻保存尤其适用于鸡细管冷冻精液的生产和人工授精以及精液超低温冷冻后的长期保存以及长途运输后人工输精，解冻后受精率可达到60％以上。
实现上述目的本发明的技术方案为，一种鸡精液冷冻保存及人工输精用试剂盒，包括：
DJ-I液，其为不含有渗透性保护剂的稀释液，pH 7.0～7.4，渗透压在340～390mOsm/kg，用作平衡稀释液；
DJ-II液，其为含有渗透性保护剂的稀释液，pH 7.0～7.4，渗透压在340～390mOsm/kg，用作冷冻保护液；
DJ-III液，其为不含有渗透性保护剂的稀释液，pH 7.0～7.4，渗透压在340～390mOsm/kg，用作去甘油稀释液；
DMEM液，其为高糖型细胞培养基，用作输精稀释液；
甘油，其为分析纯≥99.9％，与DJ-II液联合使用用作冷冻保护剂；
冻精细管，用于分装精液进行冷冻。
对本技术方案的进一步补充，按照1L体积计算，所述DJ-I液的制备方法为：称取葡萄糖5.5～5.8g、L-谷氨酸钠14～15g、柠檬酸钾1.10～1.25g、乙酸镁0.85～0.88g、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸31～32g，加超纯水定容至1L，氢氧化钠调节pH至7.0～7.4，过滤法除菌，在-20℃密封保存。
对本技术方案的进一步补充，按照1L体积计算，所述DJ-II液的制备方法为：葡萄糖7.4～8.2g、L-谷氨酸钠19.5～20.0g、乙酸钾5.2～5.3g、乙酸镁0.75～0.78g、聚乙烯吡咯烷酮2.7～2.9g、甘油0.13～0.14L，加超纯水定容至1L，氢氧化钠调节pH至7.0～7.4，过滤法除菌，在-20℃密封保存；其中，甘油现用现加，4℃暂存。
对本技术方案的进一步补充，按照1L体积计算，按照1L体积计算，所述DJ-III液的制备方法为：D-果糖5.5～5.8g、L-谷氨酸钠18～19g、柠檬酸钾1.3～1.4g、乙酸镁0.70～0.78g、三羟甲基甲胺基乙磺酸5.2～5.5g、醋酸钠5.2～5.5g，加超纯水定容至1L，氢氧化钠调节pH至7.0～7.4，过滤法除菌，-20℃密封保存。
对本技术方案的进一步补充，所述DJ-I液，DJ-II液，DJ-III液，DMEM液的体积比为1:2:8:4。
对本技术方案的进一步补充，所述冻精细管的规格为0.25mL或者0.50mL，
一种鸡精液冷冻保存及人工输精用试剂盒的使用方法，采用背腹部按摩法采集公鸡精液置于1.5mL离心管中，吸取200μL鲜精与预热至37℃的200μL DJ-I液稀释轻轻混合均匀，放置在4℃平衡20～30min，随后加入400μL DJ-II液稀释轻轻混合均匀，放置在4℃平衡10～20min，随后装入冻精细管中，放入程序化冷冻仪进行降温冷冻，冷冻程序设置为4℃～-44℃，速率为12℃/min，-44℃～-120℃，速率为40℃/min，随后投入液氮保存，解冻时，将冻精细管从液氮取出然后在10s内浸入4℃的水中3min，冷冻精液完全解冻后，倒入5mL离心管中，测定体积，分5～7次总共加入2～3倍体积的DJ-III液，每次间隔2～3min，随后在4℃离心8～10min，其中离心力为600g，去除上清，保留精子沉淀，添加与解冻精液体积相等的DMEM液重悬沉淀，检测活力后可用于人工输精。
其有益效果在于，本试剂盒中的稀释液能够为鸡精子提供较好的生存环境，并且添加试剂盒中的冷冻保护剂后能够成功的进行鸡精液冷冻保存，通过应用本发明的鸡精液冷冻保存的试剂盒进行冷冻保存的鸡精液，解冻后用于人工输精，受精率可达到60％以上，满足鸡遗传资源保种的需要。
具体实施方式
一种鸡精液冷冻保存及人工输精用试剂盒，主要包括：
DJ-I液，其为不含有渗透性保护剂的稀释液，pH 7.0～7.4，渗透压在340～390mOsm/kg，用作平衡稀释液；
DJ-II液，其为含有渗透性保护剂的稀释液，pH 7.0～7.4，渗透压在340～390mOsm/kg，用作冷冻保护液；
DJ-III液，其为不含有渗透性保护剂的稀释液，pH 7.0～7.4，渗透压在340～390mOsm/kg，用作去甘油稀释液；
DMEM液，其为高糖型细胞培养基，用作输精稀释液；
甘油，其为分析纯≥99.9％，与DJ-II液联合使用用作冷冻保护剂，；
冻精细管，其规格为0.25mL或者0.50mL，用于分装精液进行冷冻。
上述在使用时，所述DJ-I液，DJ-II液，DJ-III液，DMEM液的体积比为1:2:8:4。
其中，按照1L体积计算，所述DJ-I液的制备方法为：称取葡萄糖5.5～5.8g、L-谷氨酸钠14～15g、柠檬酸钾1.10～1.25g、乙酸镁0.85～0.88g、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸31～32g，加超纯水定容至1L，氢氧化钠调节pH至7.0～7.4，过滤法除菌，在-20℃密封保存；按照1L体积计算，所述DJ-II液的制备方法为：葡萄糖7.4～8.2g、L-谷氨酸钠19.5～20.0g、乙酸钾5.2～5.3g、乙酸镁0.75～0.78g、聚乙烯吡咯烷酮2.7～2.9g、甘油0.13～0.14L，加超纯水定容至1L，氢氧化钠调节pH至7.0～7.4，过滤法除菌，在-20℃密封保存；其中，甘油现用现加，4℃暂存；按照1L体积计算，所述DJ-III液的制备方法为：D-果糖5.5～5.8g、L-谷氨酸钠18～19g、柠檬酸钾1.3～1.4g、乙酸镁0.70～0.78g、三羟甲基甲胺基乙磺酸5.2～5.5g、醋酸钠5.2～5.5g，加超纯水定容至1L，氢氧化钠调节pH至7.0～7.4，过滤法除菌，-20℃密封保存。
一种鸡精液冷冻保存及人工输精用试剂盒的使用方法，采用背腹部按摩法采集公鸡精液置于1.5mL离心管中，吸取200μL鲜精与预热至37℃的200μL DJ-I液稀释轻轻混合均匀，放置在4℃平衡20～30min，随后加入400μL DJ-II液稀释轻轻混合均匀，放置在4℃平衡10～20min，随后装入冻精细管中，放入程序化冷冻仪进行降温冷冻，冷冻程序设置为4℃～-44℃，速率为12℃/min，-44℃～-120℃，速率为40℃/min，随后投入液氮保存，解冻时，将冻精细管从液氮取出然后在10s内浸入4℃的水中3min，冷冻精液完全解冻后，倒入5mL离心管中，测定体积，分5～7次总共加入2～3倍体积的DJ-III液，每次间隔2～3min，随后在4℃离心8～10min，其中离心力为600g，去除上清，保留精子沉淀，添加与解冻精液体积相等的DMEM液重悬沉淀，检测活力后可用于人工输精。
实施例1、应用试剂盒进行北京油鸡公鸡精液冷冻保存的效果
一、鸡精液的采集与质量检测
剪去公鸡肛门周围的羽毛，采用背腹部按摩法采集40周龄健康北京油鸡公鸡的新鲜精液置于1.5ml的离心管中，通过相差显微镜或者计算机辅助精子分析系统进行精液质量评定，无污染，精子活力大于50％，精子密度大于16亿/mL的合格精液才能进行后续操作。
二、精液稀释、平衡与冷冻
取出试剂盒中DJ-I液取适量在37℃预热，吸取200μL鲜精与200μL DJ-I液轻轻混合均匀，标号后放置4℃下平衡30min，随后添加4℃的DJ-II液400μL，轻轻混匀后4℃平衡10min，随后将离心管中的精液分装入试剂盒中的精液细管，标记和封口后放入程序化冷冻仪进行降温冷冻，冷冻程序设置为4℃～-44℃，速率为12℃/min；-44℃～-120℃，速率为40℃/min，程序结束后投入液氮保存。
三、解冻、去甘油
将精液细管从液氮里拿出浸入4℃的水中解冻3min，倒入离心管中，测定体积后加入2倍体积的4℃的DJ-III液，分5次添加，每次间隔2min，轻轻混和均匀，随后在4℃离心8～10min，离心力为600g，，去除上清，得到精子沉淀。
四、精液品质检测与受精率的测定
向上述步骤收集到的精子沉淀中添加与解冻精液等体积的4℃DMEM液重悬沉淀，相差显微镜或者是计算机辅助精子分析系统检测精子活力后进行人工输精，每只白来航母鸡输精量约为1亿个精子，第一次连续输精2天，以后每隔两天输精一次，收集种蛋后孵化，统计受精率和孵化率；以新鲜精液的精液品质和输精组受精率和孵化率作为对照。
五、试验结果
结果如表1所示：采用本发明试剂盒进行北京油鸡公鸡精液冷冻后，在新鲜精液与解冻精液的精子活力与其他精子动力学参数测定中，冷冻后，北京油鸡的精子活力下降了22.4％，冷冻后精子直线速率和曲线速率小幅度下降、直线性升高；
表1北京油鸡新鲜精液(冷冻前)与冷冻精液(冷冻后)精子运动参数
指标
冷冻前平均值
冷冻后平均值
平均值变化(％)
精子活力(％)
70.9
48.5
22.4
直线速率(μm/s)
32.3
31.1
1.1
曲线速率(μm/s)
58.2
52.9
5.3
直线性(％)
56.1
60.4
4.3
新鲜精液和冷冻保存精液输精获得种蛋的受精率和孵化率结果如表2所示，在上述试验研究基础上，采用本发明试剂盒进行北京油鸡公鸡精液冷冻后，所获得的受精率为72.3％，且受精蛋孵化率和健雏率无显著差异，可以满足精液冷冻用于北京油鸡种质资源保存的需求。
表2北京油鸡公鸡新鲜精液与冷冻精液人工输精的受精率和孵化性能
实施例2、应用试剂盒进行白来航公鸡精液的冷冻保存的效果
一、鸡精液的采集与质量检测
按照实施例1的方法采集40周龄健康白来航公鸡的精液。
二、精液稀释、平衡与冷冻
操作同实施例1。
三、解冻、去甘油
操作同实施例1。
四、精液品质检测与受精率的测定
操作同实施例1。
五、试验结果
如表3所示，采用本发明试剂盒进行白来航公鸡精液冷冻后，在新鲜精液与冷冻精液的精子活力与其他精子动力学参数测定中，冷冻后，白来航公鸡的精子活力下降了40.7％，冷冻后精子直线速率和曲线速率下降、直线性升高；
表3白来航鸡新鲜精液(冷冻前)与冷冻精液(冷冻后)精子运动参数
指标
冷冻前平均值
冷冻后平均值
平均值变化幅度(％)
精子活力(％)
72.5
31.8
40.7
直线速率(μm/s)
33.8
31.7
1.9
曲线速率(μm/s)
61.7
49.7
11.9
直线性(％)
54.4
64.2
9.8
如表4所示，采用本发明试剂盒进行白来航公鸡精液冷冻后，所获得的受精率为60.6％，且受精蛋孵化率和健雏率无显著差异，可以满足精液冷冻用于白来航种质资源保存的需求。
表4白来航公鸡新鲜精液与冷冻精液人工输精的受精率和孵化性能
实施例3、应用试剂盒进行洛岛红公鸡精液的冷冻保存
一、鸡精液的采集与质量检测
按照实施例1的方法采集40周龄健康洛岛红公鸡的精液。
二、精液稀释、平衡与冷冻
操作同实施例1。
三、解冻、去甘油
操作同实施例1。
四、精液品质检测与受精率的测定
操作同实施例1。
五、试验结果
如表5所示，采用本发明试剂盒进行洛岛红公鸡精液冷冻后，在新鲜精液与冷冻精液的精子活力与其他精子动力学参数测定中，冷冻后，洛岛红公鸡的精子活力下降了41.5％，冷冻后精子曲线速率下降，直线速率和直线性升高。
表5洛岛红鸡新鲜精液(冷冻前)与冷冻精液(冷冻后)精子运动参数
指标
冷冻前平均值
冷冻后平均值
平均值变化幅度(％)
精子活力(％)
81.3
39.8
41.5
直线速率(μm/s)
31.4
35.4
4.0
曲线速率(μm/s)
62.9
53.9
9.0
直线性(％)
49.9
65.9
16.0
如表6所示，采用本发明试剂盒进行洛岛红公鸡精液冷冻后，所获得的受精率为60.0％，且受精蛋孵化率和健雏率无显著差异，可以满足精液冷冻用于洛岛红鸡种质资源保存的需求。
表6洛岛红公鸡新鲜精液与冷冻精液人工输精的受精率和孵化性能
对照例1：Lake型精液稀释液用于洛岛红鸡精液冷冻保存的效果
Lake型精液稀释液的制备
Lake型精液稀释液包括LakePC稀释液，Lake7.1稀释液和LC稀释液。
LakePC稀释液的制备如下：乙酸镁0.7g/L、谷氨酸钠19.2g/L、乙酸钾5.0g/L、果糖8.0g/L、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸1.0g/L、聚乙烯吡咯烷酮3.0g/L、还原型谷胱甘肽0.5g/L，所用溶剂为超纯水；
Lake7.1稀释液的制备如下：乙酸镁0.8g/L、谷氨酸钠15.2g/L、柠檬酸钾1.28g/L、果糖6.0g/L、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸30.5g/L、聚乙烯吡咯烷酮3.0g/L、还原型谷胱甘肽0.5g/L，所用溶剂为超纯水；
LC稀释液的制备如下：乙酸镁0.8g/L、谷氨酸钠19.2g/L、柠檬酸钾1.28g/L、乙酸钠5.1g/L、果糖6.0g/L、三羟甲基甲胺基乙磺酸5.0g/L、聚乙烯吡咯烷酮3.0g/L、还原型谷胱甘肽0.5g/L，所用溶剂为超纯水；
上述稀释液分别用NaOH调节稀释液的pH至7.1，渗透压在340～410mOsm/kg，配制后的稀释液通过过滤法除菌，并4℃密闭保存待用。
二、鸡精液的采集与质量检测
按照实施例1的方法采集40周龄健康洛岛红公鸡的精液。
三、精液稀释、平衡与冷冻
吸取200μL鲜精与等量LakePC稀释液轻轻混合，标号后放置在4℃平衡20min，然后，分别缓慢添加含有冷冻保护剂甘油的LakePC稀释液(鲜精：LakePC稀释液＝1:2，甘油终浓度为11％)，混匀后4℃平衡10min，随后进行冻精细管包装，放入程序化冷冻仪进行降温冷冻，冷冻程序设置为在5℃～-35℃下，速率为7℃/min；-35℃～-140℃，速率为20℃/min，冷冻程序结束后投入液氮保存。
四、精液品质检测和受精能力测定
将冻精细管从液氮里拿出快速浸入4℃的水中，解冻3min，采用计算机辅助精子分析系统测定解冻后精子活力，随后对白来航母鸡进行人工输精，每只母鸡输精量约为1亿个精子，收集种蛋孵化统计受精率和孵化率。
五、试验结果
结果如表7所示，采用Lake型精液稀释液进行洛岛红公鸡精液冷冻，解冻后的精子获得了8.8％的受精率。
表7应用Lake型精液稀释液制作洛岛红鸡冷冻精液的精子活力与受精率
冷冻前精子活力(％)
解冻后精子活力(％)
去甘油后精子活力(％)
受精率(％)
88.7
72.3
25.0
8.8
对照例2：BHSV型家禽精液稀释液用于鸡精液冷冻保存的效果一、BHSV型家禽精液稀释液的制备
按照如下配方制备BHSV型稀释液：乙酸镁0.7g/L、谷氨酸钠28.5g/L、乙酸钾5.0g/L、葡萄糖5.0g/L、肌醇2.5g/L、所用溶剂为超纯水。
二、鸡精液的采集与质量检测
按照实施例1的方法采集40周龄健康洛岛红公鸡的精液。
三、精液稀释、平衡与冷冻
吸取200μL鲜精与400μLBHSV型稀释液室温稀释，轻轻混合，标号后放置于4℃平衡1h，随后加入含有6％DMF的BHSV型稀释液(最终稀释1:3)，混匀后4℃平衡15min，随后进行冻精细管包装，放入程序化冷冻仪进行降温冷冻，冷冻程序设置为：在5℃～-35℃下，速率为7℃/min；-35℃～-140℃，速率为20℃/min，冷冻程序结束后投入液氮保存。
四、精液品质检测和受精能力测定
方法同实施例1。
五、试验结果
结果如表8所示，采用BHSV型稀释液进行洛岛红公鸡的精液冷冻，解冻后的精子仅获得了10.0％的受精率。
表8应用BHSV型精液稀释液制作洛岛红鸡冷冻精液的精子活力与受精率
冷冻前精子活力(％)
解冻后精子活力(％)
受精率(％)
85.0
36.0
10.0
综合了上述实施例和对照例的结果如表9，可见采用本发明试剂盒进行三个品种的公鸡精液冷冻后，所获得的受精率高于其它类型稀释液，本发明所提供的鸡精液冷冻试剂盒及其使用方法简单易行，能够提供精子活力和受精率较高且稳定的鸡冷冻精液，对于促进鸡遗传资源保护及优良公鸡的高效利用具有重要意义。
表9不同稀释液用于鸡精液冷冻后受精结果
稀释液类型
应用品种
受精率(％)
本发明试剂盒
北京油鸡
72.3
本发明试剂盒
白来航
60.6
本发明试剂盒
洛岛红
60.0
Lake型
洛岛红
8.8
BHSV型
洛岛红
10.0
上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。
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