绵羊高渗络合剂精液稀释保存液及其应用方法
阅读说明：本技术 绵羊高渗络合剂精液稀释保存液及其应用方法 (Sheep hypertonic complexing agent semen dilution preserving fluid and application method thereof ) 是由 张永成 周宁聪 李俊龙 何辉杰 刘洁 乌日嘎 屈建军 仇春娟 马云慧 乌德乐呼 于 2021-09-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种配制简便的绵羊高渗络合剂精液稀释保存液及其应用方法,该保存液是由2.4g二水柠檬酸三钠、1.0g葡萄糖、0.8g脲、0.05g KCl和0.02g EDTA-Na-(2)与双重蒸馏水定容至100mL配制而成。本发明中的保存液能够供给精子能量来源的养分,提供缓冲剂,增加精液量,便于大量输精,是提高绵羊情期受胎率的新型有效制剂。采用本发明中的稀释保存精液较用常规稀释液,在同等条件下,精子活力提高25％,顶体完整率提高15％。母羊情期受胎率提高10～15％,情期受胎率可达80％以上。本发明中的绵羊精液稀释保存液能够提高种公羊的利用率,扩大良种肉羊覆盖面,提高养殖效益,增加养羊收益。(The invention discloses a sperm dilution preservation solution of sheep hypertonic complexing agent with simple preparation and an application method thereof, and the preservation solution is prepared from 2.4g trisodium citrate dihydrate, 1.0g glucose, 0.8g urea, 0.05g KCl and 0.02g EDTA-Na 2 And then the solution is prepared by diluting the solution with double distilled water to a constant volume of 100 mL. The preservation solution can supply nutrients for sperm energy sources, provide a buffering agent, increase the amount of sperm, facilitate mass insemination, and is a novel effective preparation for improving the estrus conception rate of sheep. Compared with the conventional diluent, the sperm diluted and preserved in the invention has the advantages that the sperm motility is improved by 25 percent and the acrosome integrity is improved by 15 percent under the same condition. The estrus conception rate of the ewes is improved by 10-15%, and the estrus conception rate can reach more than 80%. The sheep semen dilution and preservation solution can improve the utilization rate of stud rams, enlarge the coverage of fine breed mutton sheep, improve the breeding benefit and increase the sheep breeding benefit.)
技术领域
本发明属于绵羊精液保存液技术领域，具体的说是涉及一种绵羊高渗络合剂精液稀释保存液及其应用方法。
背景技术
在肉羊养殖业，现有技术中普遍存在的一个问题就是良种公羊相对缺乏，从而造成养殖效益低下，而且这也是制约肉羊产业高质量发展的瓶颈。家畜精液的保存是充分利用优良种公畜的主要措施之一，而精子休眠是延长精液保存期的重要条件，冷冻精液中的精子呈冷冻休眠状态，以牛为代表的家畜冷冻精液在-196℃可保存数十年，该技术已被广泛应用。但绵羊的精液耐冻性差，从而造成绵羊冷冻精液的配种受胎率较低，所以研究一种能够常温保存绵羊精液的保存液成为必然。现有技术中通用的常规绵羊精液稀释液是由二水柠檬酸三钠1.4克、葡萄糖3.0克加双重蒸馏水至100ml组成，这种稀释液保存时间短，受胎率低。经研究发现，促使公畜的精子休眠，除降低温度外，其它一些因素也有使精子休眠的作用，其中高渗压就对绵羊精子的休眠作用显著，如何利用高渗压影响绵羊精子的休眠作用这一特性，研究出一种在常温下延长精液保存期并稀释扩大精液量的保存液成为肉羊养殖业迫切的需求。
发明内容
本发明为了克服现有技术中存在的不足，提供一种绵羊高渗络合剂精液稀释保存液及其应用方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：本发明公开了一种绵羊高渗络合剂精液稀释保存液，其是由2.2g～2.6g二水柠檬酸三钠、0.8g～1.2g葡萄糖、0.6g～1.0g脲、0.03g～0.07g KCl和0.01g～0.03g EDTA-Na2与双重蒸馏水定容至100mL配制而成。
作为本发明的优选实施方式，本发明中的绵羊高渗络合剂精液稀释保存液是由2.2g～2.6g二水柠檬酸三钠、0.8g～1.2g葡萄糖、0.6g～1.0g脲、0.03g～0.07g KCl和0.01g～0.03g EDTA-Na2与双重蒸馏水定容至100mL配制而成。
作为本发明的最佳实施方式，本发明中的绵羊高渗络合剂精液稀释保存液是由2.4g二水柠檬酸三钠、1.0g葡萄糖、0.8g脲、0.05g KCl和0.02g EDTA-Na2与双重蒸馏水定容至100mL配制而成。渗透压为350～370mosm/L；EDTA-Na2是一种络合剂，化学式是C10H14N2Na2O8，它有六个配位原子，其作用是重金属解毒，抗氧增效剂、稳定剂及软化剂，可以防止玻璃样结晶体析出。
本发明还公开了一种绵羊高渗络合剂精液稀释保存液的应用方法，该应用方法具体包括如下步骤：
(1)器皿准备：玻璃、陶瓷类器皿，常规洗涤后再用去离子水冲洗，高温高压灭菌；橡胶类用具用质量浓度为75％的酒精消毒后，在装有紫外线灯的保温箱30℃中蒸发8h以上。
(2)配制保存液：取二水柠檬酸三钠2.4g、葡萄糖1.0g、脲0.8g、KCl 0.05g和EDTA-Na20.02g与双重蒸馏水定容至100mL制成保存液；滤过除菌，无菌操作灌封安瓶，备用。
(3)精液采集：细菌污染会降低精液的保存效果，在采集精液时，假阴道涂润滑剂，装卸集精杯均在酒精灯火焰上方20cm处进行，假阴道阴茎入口采精前后及时用无菌纱布遮盖，严格履行无菌操作的采精程序。
(4)精液稀释：取按无菌操作要求采集的精液，精子活力为0.7以上，密度中等，精子畸形率低于15％的精液供使用；用配制好的保存液与精液在16℃等温条件下进行稀释，精液的稀释倍数根据精液的质量和需要决定。
(5)稀释精液的保存：稀释后的精液吸入灭菌玻璃注射器内，注射器的吸嘴用折弯封闭的针头戴上，防止空气与精液接触，室温下缓冲30min，用3～4层毛巾包裹后放入0～8℃的环境条件下保存。
(6)稀释精液的复苏：稀释精液从0～8℃的环境条件下取出，在室温中放置30min，然后在38℃温度条件下温育30min；经过温育后的精子运动速度和运动形态均得到改善。
(7)输精：38℃温育30min后，检查精子活力不低于0.6，精子运动形态正常，则保存的精液不再复苏，直接输精于母羊的子宫颈口内，自然插入，越深越好；绵羊高渗络合剂保存的精液每次输精有效精子数为4000～8000万个。
(8)受胎：行为观察三个发情周期，若未见发情则用B超仪做超声检查是否有胎盘。
本发明的有益效果是：本发明对绵羊高渗络合剂精液保存稀释液的应用项目进行研发，研发出一种配制简便的绵羊高渗络合剂精液稀释保存液，也是一种低温大倍稀释绵羊精液的保存液，该保存液由柠檬酸钠、络合物、无机盐类和含氮化合物等组成。用本发明中的稀释保存精液较用常规稀释液，在同等条件下，精子活力提高25％，顶体完整率提高15％。本发明中的绵羊高渗络合剂精液保存稀释液能够供给精子能量来源的养分，提供缓冲剂，增加精液量，便于大量输精，是提高绵羊情期受胎率的新型有效制剂。绵羊高渗络合剂精液保存稀释液就是利用了高渗压对动物精子的休眠作用这一特性，在0～8℃的低温下延长精液保存期，与用常规稀释液稀释的精液输精相比，用高渗络合剂精液保存稀释液保存的精液输精，母羊情期受胎率提高10～15％，情期受胎率可达80％以上。本发明中的绵羊高渗络合剂精液保存稀释液能够提高种公羊的利用率，扩大良种肉羊覆盖面，提高养殖效益，增加养羊收益。综上所述，通过本发明对绵羊高渗络合剂精液保存稀释液的研发应用，可极大的延长绵羊精液的保存和使用期，便于开展家畜改良育种工作，不但能够充分提高种公羊的利用率，还能够提高母畜受胎率，对大力推广家畜人工授精工作意义重大。
本发明能够提高精液保存效果：精子休眠是延长精液保存期的重要手段，高渗透压对动物精子有休眠作用。本发明就是利用高渗透压对动物精子的休眠作用这一特性，在低温0～8℃下延长精液保存期，1∶3、1∶5、1∶10倍稀释后的精液，3天后的活力仍可达到0.6～0.7。同时使用高渗介质保存精液，既可以提高精子顶体的完整率，又能够延长精子同等活力的时间，而且相对于同期等渗介质保存，精子的运动速度快，运动形态好。在同等输精条件下，本发明中的绵羊高渗络合剂精液稀释保存液与等渗溶液稀释相比，用本发明高渗络合剂溶液保存的精液，母羊情期受胎率提高10～15％，情期受胎率可达80％以上。
本发明能够提高种公羊的利用：现有技术中的常规精液按1∶2～4低倍稀释，通过人工授精技术，一只公羊一年可配母羊100～300只以上，比用公羊本交提高10～20倍以上。采取本发明中的高渗络合剂溶液稀释保存精液按1∶20～50的高倍稀释，通过人工授精技术，一只公羊一年可配种母羊2000～6000只以上，比本交提高约200倍。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明作详细描述。
实施例：本发明公开了一种绵羊高渗络合剂精液稀释保存液，其是由2.4g二水柠檬酸三钠、1.0g葡萄糖、0.8g脲、0.05g KCl和0.02g EDTA-Na2与双重蒸馏水定容至100mL配制而成。
本发明还公开了一种绵羊高渗络合剂精液稀释保存液的应用方法，该应用方法具体包括如下步骤：(1)器皿准备：配制本发明绵羊高渗络合剂精液稀释保存液涉及的器具有：能够保证无菌操作的超净工作台、用于精确称量的分析天平、过滤溶液时用于抽吸的水循环真空泵、用于检测精子活力和顶体完整率的生物显微镜、用于高温高压灭菌的高压消毒锅和能够过滤细菌和杂质的砂芯漏斗。玻璃、陶瓷类器皿，常规洗涤后再用去离子水冲洗，高温高压灭菌，橡胶类用具用质量浓度为75％的酒精消毒后，在装有紫外线灯的保温箱30℃中蒸发8h以上；(2)配制保存液：取二水柠檬酸三钠2.4g、葡萄糖1.0g、脲0.8g、KCl0.05g和EDTA-Na20.02g与双重蒸馏水定容至100mL制成保存液；滤过除菌，无菌操作灌封安瓶，备用；(3)精液采集：细菌污染会降低精液的保存效果，在采集精液时，假阴道涂润滑剂，装卸集精杯均在酒精灯火焰上方20cm处进行，假阴道阴茎入口采精前后及时用无菌纱布遮盖，严格履行无菌操作的采精程序；(4)精液稀释：取按无菌操作要求采集的精液，精子活力为0.7以上，密度中等，精子畸形率低于15％的精液供使用；用配制好的保存液与精液在16℃等温条件下进行稀释，精液的稀释倍数根据精液的质量和需要决定；(5)稀释精液的保存：稀释后的精液吸入灭菌玻璃注射器内，注射器的吸嘴用折弯封闭的针头戴上，防止空气与精液接触，室温下缓冲30min，用3～4层毛巾包裹后放入0～8℃的环境条件下保存；(6)稀释精液的复苏：稀释精液从0～8℃的环境条件下取出，在室温中放置30min，然后在38℃温度条件下温育30min；经过温育后的精子运动速度和运动形态均得到改善；(7)输精：38℃温育30min后，检查精子活力不低于0.6，精子运动形态正常，则保存的精液不再复苏，直接输精于母羊的子宫颈口内，自然插入，越深越好；绵羊高渗络合剂保存的精液每次输精有效精子数为4000～8000万个；(8)受胎：行为观察三个发情周期，若未见发情则用B超仪做超声检查是否有胎盘。
(1)本发明绵羊高渗络合剂精液稀释保存液与现有技术中对照组保存液的保存效果比较：
试验组：高渗络合剂稀释保存液
对照组：二水柠檬酸钠1.4g、葡萄糖3.0g，加双重蒸馏水至100mL
稀释倍数1∶5
经检验，差异P＜0.01，差异极显著。
(2)本发明绵羊高渗络合剂精液稀释保存液与现有技术中对照组保存液的母羊受胎效果比较：
试验组：高渗络合剂稀释保存液
对照组：二水柠檬酸钠1.4g、葡萄糖3.0g，加双重蒸馏水至100mL
稀释倍数1∶5
采用本发明中的高渗络合剂稀释液保存精液使精子顶体完整率提高，精子维持同等活力的时间延长，以及精子复苏后比同期等渗保存精子的运动速度快，运动形态好，受胎率高，已经得到证实。通过测定高渗络合剂保存精液输精母羊的受胎率，能够为推广应用精液高渗络合剂保存技术提供依据，了解生产中使用高渗络合剂精液保存的问题和推广应用的可能性。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制。本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
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