一种裙带菜成熟孢子囊叶的保存方法
阅读说明：本技术 一种裙带菜成熟孢子囊叶的保存方法 (Method for preserving mature sporangium leaves of undaria pinnatifida ) 是由 李静 逄少军 苏丽 李晓东 单体锋 于 2021-06-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及经济褐藻裙带菜种质资源收集及育种领域,具体的说是一种裙带菜成熟孢子囊叶的保存方法。将裙带菜成熟的孢子囊叶用滤纸擦拭,去除孢子囊叶表面多余的水分,再用干净的滤纸包裹,放入到样品袋中密封,随后放置到4℃条件下保存数十天后,仍能采集得到裙带菜正常的游孢子。该保存方法的建立有利于进一步保证裙带菜种质资源的收集、保存及种苗培育工作的顺利进行。(The invention relates to the field of collection and breeding of economic brown algae undaria pinnatifida germplasm resources, in particular to a method for preserving mature sporangium leaves of undaria pinnatifida. Wiping mature sporangium leaves of the undaria pinnatifida with filter paper, removing excessive water on the surfaces of the sporangium leaves, wrapping with clean filter paper, sealing in a sample bag, and then storing at 4 ℃ for tens of days to obtain normal zoospores of the undaria pinnatifida. The establishment of the preservation method is beneficial to further ensuring the smooth operation of collection and preservation of the germplasm resources of the undaria pinnatifida and the cultivation of seedlings.)
技术领域
本发明涉及经济褐藻裙带菜种质资源收集及育种领域，具体的说是一种裙带菜成熟孢子囊叶的保存方法。
背景技术
裙带菜为我国重要的经济海藻，年产量为17万吨(干重)，除了食用价值之外，在化工、医药、水产饵料等产业方面均具有广泛应用。裙带菜为一年生海藻，其生活史分为大型孢子体世代及微观配子体世代。大型孢子体在性成熟时会在茎部发育形成孢子囊叶，孢子囊叶为裙带菜的生殖器官，能够形成大量孢子囊。孢子囊通过减数分裂会产生游孢子，游孢子放散后附着萌发为雌、雄配子体。微观配子体是裙带菜种质保存的主要形式，也是开展裙带菜杂交育种工作的重要资源。因此，要持续不断地开展裙带菜种质资源的收集、保存工作首要是进行游孢子的成功采集。在实际工作中，需要前往裙带菜自然分布及养殖海区进行成熟孢子囊叶的采集，然后通过运输方式到达有条件的室内进行游孢子释放及采集工作。有时因天气或交通原因，无法及时到达室内开展采集工作，导致孢子囊叶腐烂变质，无法顺利完成种质资源的收集及进一步保存的工作，造成人力、财力资源浪费。为了避免上述情况的发生，亟需建立一种行之有效的裙带菜孢子囊叶保存方法，以保证裙带菜种质资源收集工作的成功，进而对种质资源的保存及种苗培育工作的开展都具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种裙带菜成熟孢子囊叶的保存方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种裙带菜成熟孢子囊叶的保存方法，将裙带菜成熟的孢子囊叶用滤纸擦拭，使其表面达到无多余水分的状态，而后再利用滤纸将擦拭后的孢子囊叶包裹，包裹后放入到样品袋中密封，随后低温保存数5-20天，取出仍能采集获得正常的游孢子。
其中，采用低温、密封保存裙带菜孢子囊叶的方式，能够有效延缓孢子囊叶腐烂及脱水，可以达到延长保存期限的目的。
所述滤纸包裹时，每个裙带菜个体的孢子囊叶包裹在一起。
所述成熟的孢子囊叶是指形成了成熟孢子囊，可成功释放游孢子的裙带菜孢子囊叶。
所述低温保存为放置到4℃条件下保存。
所述低温保存后取出，再经无菌海水冲洗其表面，以去除表层已经受损的孢子囊群，冲洗完成后，将孢子囊叶浸入到消毒海水中，0.5-2h后，可进行游孢子的采集。
采集的游孢子，置于含有1/2PES培养基中，于8-12℃，光强5-15μmol photons m- 2s-1，光周期为12:12(L:D)的条件下培养，可以营养生长,长期保存；置于含有PES培养基中，于15-18℃，光强30-40μmol photons m-2s-1，光周期为12:12(L:D)的条件下培养，直到雌、雄配子体形成卵囊和精子囊，完成受精过程形成幼孢子体。
所述游孢子即为裙带菜的生殖细胞。游孢子萌发后能够形成配子体，在低温低光条件下配子体可以营养生长，长期保存；通过提高温度和光强，可以促进配子体发育，完成受精过程形成幼孢子体。
进一步的说，配子体营养生长，能够实现裙带菜种质资源的长期保存；而配子体发育、受精形成幼孢子体能够完成裙带菜种苗培育过程。
所述裙带菜配子体进行营养生长，需置于1/2PES培养基中，于8-12℃，光强5-15μmol photons m-2s-1，光周期为12:12(L:D)的条件下培养；所述的裙带菜配子体完成发育、受精形成幼孢子体的过程，需置于PES培养基中，于15-18℃，光强30-40μmol photons m-2s-1，光周期为12:12(L:D)的条件下培养，直到雌、雄配子体形成卵囊和精子囊，完成受精过程形成幼孢子体。
消毒海水为经过121℃，0.1Mpa灭菌处理后的自然海水。
本发明所具有的优点：
本发明方法的实施对象为海洋藻类裙带菜，为活体藻类生殖器官的短暂保存方法，实施应用阶段，充分考虑到海洋藻类特殊的生存环境及繁殖特点，具有操作简便，实用性强的特点。
裙带菜的生存介质为海水，其自然种群分布在海洋潮间或潮下带，养殖群体分布在沿海养殖区，与其他物种(如陆地植物、动物等)相比，在种质资源的收集和保存方面具有明显差异和较大困难。若裙带菜形成成熟的生殖器官(孢子囊叶)，孢子囊叶长时间离水而不加处理，则极易出现脱水、腐烂及死亡的现象；而孢子囊叶离水后再复水，则会导致生殖细胞(游孢子)的集中大量放散。因此，裙带菜成熟的孢子囊一旦离水，在采集游孢子之前，则不能再重新放入海水中培养，若孢子囊叶长时间离水，则需设置特定条件以有效延长孢子囊寿命。
进而由于上述问题本发明充分考虑到孢子囊叶保存过程中，腐烂现象的发生。将擦拭干净的孢子囊叶放入低温4℃条件下可以有效延缓孢子囊叶腐烂现象的发生。
上述本发明充分考虑到孢子囊叶保存过程中，脱水现象的发生。通过采用滤纸包裹，放入样品袋密封保存的方式，有效避免了孢子囊叶脱水。
附图说明
图1为本发明实施例提供的在不同保存条件下保存3天后孢子囊叶呈现出明显不同的状态图。
图2为本发明实施例提供的保存条件1下，保存不同天数的孢子囊叶所释放的游孢子的萌发率及其发育形成的配子体的受精率。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
实施例1
将大连海域采集的成熟裙带菜孢子囊叶，用滤纸擦拭其表面，去除表面残留的水分及附着物(包括泥沙及附生的杂藻等)，使其达到表面无多余水分的程度，随后分别进行不同条件及天数的保存处理(参见表1)。
不同条件为：
条件1：将孢子囊叶用滤纸擦拭到表面无多余水分的程度，而后经滤纸包裹，包裹后放入到样品袋中密封，于4℃保存不同天数；
条件2：将孢子囊叶用滤纸擦拭到表面无多余水分的程度，而后经滤纸包裹，包裹后放入到样品袋中密封，于18℃保存3天；
条件3：将孢子囊叶用滤纸擦拭到表面无多余水分的程度，后直接于4℃保存3天。
表1为不同条件及天数的保存处理结果
保存条件
条件设置
保存天数
1
4℃，密封
3、10、18
2
18℃，密封
3
3
4℃，无密封
3
将经过保存后的裙带菜孢子囊叶取出，用消毒海水冲洗表面，去除表面受损的孢子囊群后，将其放入无菌海水中，放散0.5-2h后，吸取游孢子液到含有PES培养液的、直径为9cm的培养皿中，采集3个培养皿，放置于15-18℃，光强30-40μmol photons m-2s-1，光周期为12:12(L:D)的条件下培养24h后，统计游孢子的萌发率；继续培养14-20天后，统计配子体的受精率。同时，采集未经保存处理的孢子囊叶(保存0天)所释放的游孢子，以其萌发率和后期培养的配子体的受精率作为实验对照。
萌发率统计方法为：将培养皿放置在倒置显微镜下，在40×10倍的放大倍数下，统计视野中萌发的游孢子占游孢子总数的百分比，总共统计5个视野。萌发的游孢子为出现萌发管的游孢子。
受精率的统计方法为：培养皿放置在倒置显微镜下，在10×10倍的放大倍数下，统计视野中受精的卵子占排放卵子总数的百分比，总共统计5个视野(参见图1和图2)。
结果如下：
在不同保存条件下保存3天，孢子囊叶呈现出明显不同的状态(如图1所示)。
保存条件1(图1，a)：孢子囊叶状态良好，未出现明显失水和腐烂现象，失水率为7.072.00％，可成功释放游孢子。
保存条件2(图1，b)：孢子囊叶腐烂明显，失水率为11.05±1.90％,无法释放游孢子。
保存条件3(图1，c)：孢子囊叶脱水严重，失水率高达70.04±1.43％，无法释放游孢子。
在保存条件1下保存3、10及18天的孢子囊叶，均成功释放了游孢子，游孢子的萌发率及发育形成的配子体的受精率结果如图2所示。
结果显示保存超过一定的冷藏天数后(3天)，随着孢子囊叶冷藏天数的增加，所采集到的游孢子萌发率逐渐降低。在冷藏3天的孢子囊叶上所采集的游孢子与未经冷藏的孢子囊叶上所采集的游孢子在萌发率方面无显著差异，而在冷藏10天和18天的孢子囊叶上所采集的游孢子萌发率显著降低。但是，萌发后的游孢子基本都可以完成后续发育、受精过程，因此，在受精率方面，各冷藏天数之间无显著差异。
游孢子能够顺利萌发，则表明其为存活状态，通过提供合适的培养条件，萌发的游孢子所形成的配子体可以不断营养生长，达到裙带菜种质资源长期保存的目的；亦可以通过提供发育条件，使游孢子萌发形成的配子体完成发育、受精过程从而形成幼孢子体，达到种苗培育的目的。该发明方法，对于裙带菜种质资源的收集、保存及种苗培育工作具有重要实用意义。此保存方法可在海上采集裙带菜孢子囊叶过程中使用，也同样适用于性成熟的海带目其他经济海藻物种，如海带。
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