一种复方褐藻糖胶组合物
阅读说明：本技术 一种复方褐藻糖胶组合物 (Compound fucoidan composition ) 是由 朱荣 于 2021-07-30 设计创作，主要内容包括：本申请公开了一种复方褐藻糖胶组合物,所述复方褐藻糖胶包括以下组分：褐藻糖胶和法地榄仁果提取物。本发明在直接对癌细胞进行抑制和消灭的同时可激发其他免疫细胞的活性,进一步对抗癌细胞,通过两种途径共同抑制和杀灭癌细胞,提高抗癌作用和效果,疗效较佳。(The application discloses a compound fucoidan composition, which comprises the following components: fucoidan and Terminalia catappa fruit extract. The invention can directly inhibit and eliminate the cancer cells and simultaneously stimulate the activity of other immunocytes to further resist the cancer cells, inhibit and kill the cancer cells by two ways, improve the anticancer effect and have better curative effect.)
技术领域
本发明属于抗癌药物技术领域，具体涉及一种复方褐藻糖胶组合物。
背景技术
乳腺癌是危害妇女健康最常见的恶性肿瘤之一。调查发现，乳腺癌的发病率在过去50年时间里呈逐渐上升趋势，约占妇女肿瘤的31％。虽然现在广泛使用的综合治疗方法(手术、化疗、放疗、内分泌治疗)已经大大降低了乳腺癌的死亡率，但乳腺癌患者中，仍有约三分之一以上具有术后易复发和易远处转移的特点，对内分泌治疗不敏感，其治疗效果和预后差，且化疗毒副反应明显，至今仍缺乏令人满意的综合治疗方案。而天然化合物毒副作用小，具有靶向杀伤肿瘤细胞的特点，是目前抗肿瘤研究的热点。因此从中寻找抗乳腺癌转移的天然药物具有重要意义。
研究报道，在海带食用量较大的日本和韩国，其乳腺癌的发病率仅占西方国家的1/9，尤其在日本冲绳县居民食用海带量居日本首位，而冲绳县的癌症发病率却居全日本最低。海带中含有一种由糖醛酸、甘露糖和岩藻糖等单糖反复排列组成的多糖物质，能够诱导癌细胞自杀，进而起到抗癌的作用，此多糖物质为褐藻糖胶。
近年来，研究发现，褐藻糖胶对乳腺癌细胞、肺癌细胞、人膀胱癌细胞和黑色素瘤细胞等均有明显抑制作用，只能直接作用于癌细胞，对其他免疫细胞的活性激发影响不大，由此抗癌效果不明显。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种复方褐藻糖胶组合物，在直接对癌细胞进行抑制和消灭的同时可激发其他免疫细胞的活性，进一步对抗癌细胞，通过两种途径共同抑制和杀灭癌细胞，提高抗癌作用和效果，疗效较佳。
为了完成上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种复方褐藻糖胶组合物，所述复方褐藻糖胶包括以下组分：褐藻糖胶和法地榄仁果提取物。
作为对本发明的进一步改进，所述褐藻糖胶和所述法地榄仁果提取物的重量配比为2:1。
作为对本发明的进一步改进，所述褐藻糖胶和法地榄仁果提取物制成片剂、胶囊剂或颗粒剂。
作为对本发明的进一步改进，所述褐藻糖胶和法地榄仁果提取物制成胶囊剂。
作为对本发明的进一步改进，所述胶囊剂的制备方法包括：
S1：通过复合酶酶解法从藻粉中提取褐藻糖胶粗品；
S2：将褐藻糖胶粗品进一步沉淀、脱蛋白、脱色以及去除小分子物质后得到较纯的褐藻糖胶，备用；
S3：以法地榄仁果为原料，洗净，去核，经热风烘干，晾凉，接着鲜果粉碎，经压滤去处渣滓，高温灭菌后即可得到法地榄仁果提取液，备用；
S4：制作囊体，以明胶、甘油和纯化水为囊体原料，将甘油和纯化水注入溶胶罐内，搅拌并加热至50-70℃，再加入明胶，继续搅拌20-30min后真空脱泡，得到囊体，在50-60℃保温，备用；
S5：将步骤S2和步骤S3的提取物作为内容物，与步骤S4所制备的囊体经过压丸、定型、洗丸、风干、练丸和分装步骤，制得含有褐藻糖胶和法地榄仁果提取物的软胶囊。
作为对本发明的进一步改进，所述步骤S1中，复合酶酶解法的提取酶分别为纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶和木聚糖酶，其用量比分别为1:2:2:2。
作为对本发明的进一步改进，所述步骤S2中，采用乙醇分级进行沉淀，其乙醇的浓度为70%-80%。
作为对本发明的进一步改进，所述步骤S5的压丸中，开启成型机，调整囊壳厚度，设定明胶盒温度为60-70℃，调节模具的装填量，胶液展布在转动的胶皮轮上自动制成胶皮，然后将胶皮装入机头上的一对滚模之间，采用石蜡油对胶皮进行润滑，在供料系统将称量好的褐藻糖胶和法地榄仁果提取液通过喷体完成注料的同时，滚模旋压完成胶囊的封囊，压制出一定装量及形状的胶囊。
作为对本发明的进一步改进，所述步骤S5中，褐藻糖胶和法地榄仁果提取物分别独立密封在软胶囊内。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过褐藻糖胶直接对癌细胞进行抑制和消灭，同时又通过法地榄仁果激发其他免疫细胞的活性，进一步对抗癌细胞，通过两种途径共同抑制和杀灭癌细胞，能显著控制血管增生，降低癌细胞扩散及转移的机率，诱导癌细胞自我毁灭、抑制癌细胞增生和转移、减轻放化疗副作用、强化全身抑制炎症反应，增加全身免疫力，疗效较佳。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例
本发明提供的一种复方褐藻糖胶组合物，包括以下组分：褐藻糖胶和法地榄仁果提取液，其中，褐藻糖胶和法地榄仁果提取液的重量配比为2:1，即褐藻糖胶为75%时，法地榄仁果提取液可为25%或更少，剩下的容量可添加其他药用辅料，褐藻糖胶和法地榄仁果提取液制成软胶囊剂，褐藻糖胶和法地榄仁果提取物分别独立密封在软胶囊内，防止混合相关物质之间发生化学反应，导致成分发生改变，影响后期的疗效，制备包括以下步骤：
a）通过复合酶酶解法从藻粉中提取褐藻糖胶粗品；即向藻粉中加入纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶和木聚糖酶进行酶解，其用量比分别为1:2:2:2，PH为5.0，温度30℃，提取时间为3h,再升温灭酶后过滤。
b）将褐藻糖胶粗品进一步沉淀、脱蛋白、脱色以及去除小分子物质后得到较纯的褐藻糖胶，备用；在沉淀阶段，采用乙醇分级进行沉淀，利用海藻酸、海带淀粉和褐藻糖胶在不同浓度乙醇中溶解度不同的性质来分离纯化出褐藻糖胶，其最佳的乙醇的浓度为70%-80%，当乙醇浓度为20%-30%时，海藻酸容易析出，当乙醇浓度为60时，海带淀粉易于溶解，而当乙醇的浓度为70%-80%，褐藻糖胶能够析出；在脱蛋白阶段，通过盐酸法，三氯乙酸法或者采用Savage法进行脱蛋白，优选采用Savage法，该法条件较为温和，对多糖结构的破坏性较小；在脱色阶段，主要有醇洗法、活性炭吸附法、强氧化剂氧化脱色法和色谱柱吸附脱色法，优选采用色谱柱吸附脱色法即利用离子交换树脂或者大孔树脂等吸附脱色，其主要采用DEAE-纤维素离子交换剂，主要步骤为，采用10mm×300mm的色谱柱，上样量为每次50mg左右褐藻糖胶，溶解于约2mL的平衡液中，洗脱液流速15ml/h，10min收集一管，每管取0.1mL，硫酸苯-酚法检测。
c）以法地榄仁果为原料，洗净，去核，经热风烘干，晾凉，接着鲜果粉碎，经压滤去处渣滓，高温灭菌后即可得到法地榄仁果提取液，备用；
d）制作囊体，以明胶、甘油和纯化水为囊体原料，将甘油和纯化水注入溶胶罐内，搅拌并加热至60℃，再加入明胶，继续搅拌25min后真空脱泡，得到囊体，在55℃保温，备用；
e）将步骤b)和步骤c)的提取物作为内容物，与步骤d)所制备的囊体经过压丸、定型、洗丸、风干、练丸和分装步骤，制得含有褐藻糖胶和法地榄仁果提取物的软胶囊，其中，在压丸步骤中，开启成型机，调整囊壳厚度，设定明胶盒温度为65℃，调节模具的装填量，胶液展布在转动的胶皮轮上自动制成胶皮，然后将胶皮装入机头上的一对滚模之间，采用石蜡油对胶皮进行润滑，在供料系统将称量好的褐藻糖胶和法地榄仁果提取液通过喷体完成注料的同时，滚模旋压完成胶囊的封囊，压制出一定装量及形状的胶囊；在定型步骤中，将压制成型的胶丸进入滚筒干燥设备进行吹风干燥，使胶丸硬化成型，其环境温度为25℃，湿度为30%，干燥时间为20h。
试验例
1.实验动物
本研究使用的实验动物为清洁级雌性SD大鼠28只，每只体重100g，购自国家动物中心，自然光线光照，分笼饲养，每笼7只，给予适当温度及湿度控管、充份供应饲料与饮水。
2.药品
1)采用本发明方法进行提取的褐藻糖胶以及本发明方法提取的法地榄仁果提取物,2)配制MTT(噻唑蓝)溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50 mLPBS(PH7.4)搅拌混匀30min，用0.22μm的微孔滤器过滤除菌，无菌条件下分装,4℃保存。
3.细胞培养
乳腺癌细胞4T1购自国家细胞库，4T1细胞培养于含有15%胎牛血清的DMEM高糖培养液（PH:7.2-7.5）培养，培养液中含有0.2%NaHCO3、100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640完全培养液，在含有5%CO2及饱和水蒸气的37℃培养箱中培养，每天更换一次培养液，2天传代1次，培养期间定期以倒立式显微镜观察细胞形态的完整性与生长速度。
3.建立动物模型
(1)取对数期生长的4T1细胞,0.25%胰酶+0.02%EDTA消化1min，培养液终止消化,800-1000/min低速离心2-5min后去掉上清液，然后用DMEM培养液制成细胞悬液，调整细胞浓度为3-5×107个/ml。
(2)移植时采取皮下注射的方法,1m注射器6号针头接种细胞于大鼠的左侧前肢腋下靠背部，共接种28只大鼠，每个接种部位1m1。
(3)每日观察小鼠一般生活状况，一周后观察各组小鼠的肿瘤生长速度。
(4)以瘤体直径=3mm为成瘤阳性,28只实验鼠全部成瘤，将成瘤阳性的小鼠随机分为4组,每组7只。
(5)当肿瘤接种后3周，移植瘤生长达肉眼可见时，即瘤体直径达到2-3mm时开始进行干预实验，采用腹腔内注射的方式分组给药，实验动物分为以下四个组
a）低剂量组:5 mg/kg.bw褐藻糖胶，用生理盐水配制,0.2ml/只；
b）高剂量组:10mg/kg.bw褐藻糖胶，用生理盐水配制,0.2ml/只；
c）阴性对照组:生理盐水,0.2ml/只；
d）实验组：褐藻糖胶和法地榄仁果提取液的混合液，用生理盐水配制，0.2ml/只；每两天给药一次,持续20天。
(6)观测各组大鼠移植瘤生长的成瘤率、潜伏期、瘤重大小、体积、有无转移等情况。定人每隔3天用游标卡尺测量肿瘤最大直径a、横径b，按V=1/2×a×b2的公式计算肿瘤体积V，并根据肿瘤体积的变化描绘移植瘤生长曲线。
(7)最后一次给药后48h，拉颈处死小鼠，分离得瘤体，称重，部分瘤组织加入液氮匀浆提取蛋白；部分瘤组织放入10%中性福尔马林中固定24h，常规酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，作4μm厚连续切片，石蜡切片常规染色。
4.结果
4.1褐藻糖胶和法地榄仁果提取液对实验鼠肿瘤生长的影响
当肿瘤接种后3周，实验鼠的移植瘤生长达到2-3mm时，随机分组后各组小鼠肿瘤体积之间无显著性差异(P＞0.05)。随着褐藻糖胶干预实验的进行，对照组小鼠活动逐渐减少，毛色变暗，反应欠灵敏，而褐藻糖胶和法地榄仁果提取液的实验组大鼠反应灵敏，进食、活动与治疗前无明显差别。各处理组肿瘤体积均逐渐增大，其中对照组肿瘤体积增长最为迅速，褐藻糖胶处理组肿瘤体积增长逐渐减慢，高剂量褐藻糖胶(10mg/kg.bw)组比褐藻糖胶处理组更慢，而褐藻糖胶和法地榄仁果提取液最慢，干预实验结束后低剂量褐藻糖胶组、高剂量褐藻糖胶组以及实验组的肿瘤体积分别为:1.44+0.26cm3、1.10±0.21cm3和0.8±0.16cm3，与对照组(2.10±0.48cm3)比较差别有统计学意义(P＜0.05)。另外，实验结束后各组肿瘤的平均重量比较，均有显著差别(P＜0.05)。
4.2褐藻糖胶和法地榄仁果提取液对移植瘤组织细胞凋亡的影响
对各组大鼠肿瘤组织进行石蜡切片，用TUNEL试剂盒染色检测凋亡细胞，实验组瘤组织内凋亡细胞数量明显多于对照组和其他组，差别有统计学意义(P＜0.01)，并且高剂量褐藻糖胶(10mg/kg.bw)处理组的凋亡细胞数与低剂量褐藻糖胶(5mg/kg.bw)处理组比较也有显著性差异(P＜0.01)。
4.3移植瘤组织Bc-2、Bax蛋白的表达
提取各组小鼠移植瘤组织的蛋白，进行Western blot检测。结果表明，与对照组比较，各褐藻糖胶处理组瘤组织内Bcl-2蛋白水平明显减少(P＜0.05)，实验组的Bax表达增高(P＜0.05)，各褐藻糖胶处理组瘤组织内Bcl-2/Bax比值显著下降，而实验组的Bcl-2/Bax比值明显低于低剂量褐藻糖胶处理组(P＜0.05)。
4.4褐藻糖胶和法地榄仁果提取液对大鼠乳腺癌生长的影响
经过褐藻糖胶和法地榄仁果提取液共同作用的实验组平均瘤重均低于模型组，实验组的瘤重抑制率达到54.8%，高剂量褐藻糖胶组的瘤重抑制率达到44.7%，低剂量褐藻糖胶组为28.2%，结果表明，褐藻糖胶和法地榄仁果提取液的组合能更好的抑制移植瘤的生长。
4.5褐藻糖胶和法地榄仁果提取液对外周血NK细胞的影响
NK细胞在介导细胞免疫和杀伤肿瘤细胞中发挥关键作用，所以我们采用流式细胞仪检测外周血NK细胞活性，以明确褐藻糖胶和法地榄仁果提取液对NK细胞活化的影响，褐藻糖胶和法地榄仁果提取液干预组外周血TCRαβ和CD161a阳性的NK细胞活性明显高于其他三组，说明法地榄仁果提取液能激活NK细胞的活性。
4.6法地榄仁果提取液对T淋巴细胞亚群的影响
为探讨法地榄仁果提取液对T细胞介导的免疫反应的影响，检测了外周血T淋巴细胞亚群数量，包括CD4+、CD8+以及Foxp3+Treg细胞。结果显示，与模型组相比，褐藻糖胶和法地榄仁果提取液干预组外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞比例均相对于单独使用褐藻糖胶有所升高，相反具有免疫抑制活性的Foxp3+Treg细胞的比例却出现下降，说明法地榄仁果提取液能够增强大鼠体内抗肿瘤免疫反应，而降低免疫抑制。
5.结论
综合以上研究结果，本具体实施方式中，褐藻糖胶和法地榄仁果提取液的共同作用可以调节大鼠的免疫力，激活免疫细胞的活性，增强抗肿瘤免疫，缓解肿瘤的免疫抑制，相对于单单褐藻糖胶，本发明使用两种物质更能增强其他免疫细胞的活性和降低癌细胞扩散及转移的机率，诱导癌细胞自我毁灭、抑制癌细胞增生和转移、减轻放化疗副作用、强化全身抑制炎症反应，增加全身免疫力，疗效较佳。
虽然本发明已利用上述较佳实施例进行说明，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围之内，相对上述实施例进行各种变动与修改仍属于本发明所保护的范围。
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