基于y分子筛载体的炉甘石止血复合物及其制备
阅读说明：本技术 基于y分子筛载体的炉甘石止血复合物及其制备 (Calamine hemostatic compound based on Y molecular sieve carrier and preparation thereof ) 是由 王颖莉 张丽丽 杨冬花 张馨予 王家信 刘凯丽 王艳 于 2021-09-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于Y分子筛载体的炉甘石止血复合物,是将用于制备Y分子筛的含有硅源、钠源和铝源的碱性水溶液在从常温至60℃的至少3个温度阶段下持续搅拌一定时间,得到形成晶核的分子筛前驱体溶液,再加入棉纤维和炉甘石,于密闭反应釜中加热至90～100℃晶化反应得到的在棉纤维上合成Y分子筛,原位负载炉甘石药物的止血复合物。本发明通过Y分子筛-炉甘石-棉纤维多重止血材料的复合,得到了一种快速止血、凝血性能更好,凝血活酶时间明显缩短的止血材料,可以作为外用止血材料应用于各种创面的止血处理中。(The invention discloses a Y molecular sieve carrier-based calamine hemostatic compound, which is a hemostatic compound prepared by continuously stirring alkaline aqueous solution containing silicon source, sodium source and aluminum source for preparing a Y molecular sieve at least 3 temperature stages from normal temperature to 60 ℃ for a certain time to obtain a molecular sieve precursor solution for forming crystal nuclei, adding cotton fibers and calamine, heating to 90-100 ℃ in a closed reaction kettle, performing crystallization reaction to obtain a Y molecular sieve synthesized on the cotton fibers, and loading calamine medicine in situ. The invention obtains the hemostatic material with fast hemostasis, better blood coagulation performance and obviously shortened thromboplastin time by compounding the Y molecular sieve-calamine-cotton fiber multiple hemostatic materials, and can be used as an external hemostatic material to be applied to the hemostasis treatment of various wounds.)
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域，涉及一种医用止血材料，特别是涉及一种由多重止血材料复合得到的止血复合物及其制备方法。
背景技术
创伤造成的出血是日常突发事故、医疗救治及军事战争中极为常见的状况。国内外研究人员进行了许多关于快速止血材料的研究，在较早的时期，主要是利用不可吸收材料来护理伤口，如天然或人工纱布与绷带。
近些年来，研究人员从成本低、止血速率快的物质入手，通过改性修饰得到性能提高的止血敷料，或者通过与其他物质的结合，得到生物安全性高或具备抗菌性能的复合止血材料。
众多学者利用具有多孔结构或者大比表面积的物质快速吸收血液中的水分，以达到迅速止血的效果。如孙伟庆等(MPH止血微球的制备及其结构表征[J]. 中国卫生产业,2015, 12(02): 144-146.)利用改变产品物理形貌的交叉乳化处理手段，赋予淀粉原料微观的立体网络交联结构，同时实现快速吸收血液水分并激活内源性凝血途径，提高凝血效果。刘长瑜(氧化纳米纤维素/海藻酸钠复合止血材料制备与性能研究[D]. 哈尔滨工业大学高分子化学与物理所, 2016.)研究的氧化纳米纤维素/海藻酸钠复合止血材料，集氧化纳米纤维素材料的高结晶度、高比表面积、生物相容性与海藻酸钠的生物降解性、温和的凝胶条件等优点于一体。
作为多孔材料的分子筛，是一种具有微孔结构的硅铝酸盐，有较大的比表面积、规则有序的孔道结构，以其优异的吸附离子交换性能与孔道选择能力，被广泛应用于工业生产的催化、石油化工的裂化等领域，也因其强吸附能力、分子尺度的微孔结构、内部电场作用以及良好的生物相容性，受到医用材料研究人员的关注。
Y型分子筛属于八面沸石分子筛，具有双六元环连接的孔道体系，较大的孔体积和比表面积，强酸性和良好的热与水热稳定性。其多元环构成的笼及通过孔道贯穿的笼与笼提供了大量的空穴与空间，使其的比表面积远大于一般的物质颗粒。当创伤处出血时，可以在短时间内快速吸收血液中的液体成分，相对提高血液中红细胞、血小板和凝血因子等的浓度；分子筛在吸收液体成分时会产生放热现象，其热量可以增强血小板的凝聚速度，促使伤口表面形成止血痂。毕宏达等(沸石对猪致命性血管损伤模型的止血作用[J]. 西北国防医学杂志, 2006(03): 164-166.)在其研究中指出，沸石分子筛在快速吸收血液中液体成分的同时，可以增加血凝块的强度与抗张力，实现快速止血。
目前，美国Z-Medica公司生产了以沸石为止血有效成分的QuikClot，我国研制了以A型钙型沸石分子筛为有效成分的速效止血粉。
但是，分子筛最大的不足是其在止血时放出的热量，可使局部升温最高达100℃，导致组织或神经灼伤。刘宇等(速效止血粉治疗急性创伤性出血的临床随访[J]. 中国全科医学, 2010, 13(29): 3346-3347.)在对速效止血粉的治疗临床随访中指出，也要注意产品在接触创面时渗入血管形成血栓的问题，止血后需彻底清创缝合。
CN 107661536A公开了一种含分子筛的多级孔复合止血剂及其制备方法和应用，其利用Ca-MCM-48介孔分子筛-壳聚糖的多级孔复合微球，通过田菁粉的造孔作用，使止血剂具有更大的表面积和孔容，达到快速止血的效果；壳聚糖的引入，解决了分子筛在止血中大量放热的问题；采用喷雾造粒的方法制备成微球，有利于创面清理。但是，微球状的止血颗粒仍然存在使用时受压破碎而进入血液的可能。
学者们进而提出了通过分子筛牢固生长在支撑载体上的复合方法，以解决分子筛被血液冲走的问题。范杰等(A tightly-bonded and flexible mesoporous zeolite-cotton hybrid hemostat[J]. Nature Communications, 2019, 10(1).)制备了一种紧密结合的介孔菱沸石分子筛(mesoporous zeolite Chabazite-type，mCHA)-棉纤维止血材料，该止血材料以棉纤维作为结构支架，通过打断原先的生长骨架，可以增加多种吸附物的吸附与扩散，在微孔结构基础上创造出介孔；所采用的无粘结剂合成方法可以避免粘结剂稀释分子筛活性成分、堵塞孔道；不同于将沸石悬浊液直接滴在棉纤维上，其采用的合成方法利用棉纤维上的活性羟基与沸石化学键合实现二者的紧密结合，解决了分子筛易脱落导致止血效果降低和形成血栓的问题，同时有效缓解了沸石的放热问题，提高了止血性能和安全性。
进而，创面暴露在空气中，存在有细菌感染的风险，会引起炎症和局部血管扩张，不利于伤口止血愈合，且伤口恢复时期也有并发炎症的可能。所以，理想的止血材料在具有良好的凝血性能的基础上，还应该具有抗菌消炎的功效。
Zn2+、Ag+等金属离子可以与细菌膜和膜蛋白结合，破坏细菌的结构和负责电子转移的酶，从而达到抗菌效果。Hou等(Influences of mesoporous zinc-calcium silicateon water absorption, degradability, antibacterial efficacy, hemostaticperformances and cell viability to microporous starch based hemostat[J].Materials science & engineering, C. Materials for Biogical applications,2017, 76: 340-349.)利用模板法合成了介孔硅酸锌钙(mesoporous zinc-calciumsilicate，m-ZCS)，并以其掺入微孔淀粉(microporous starch，MS)制备m-ZCS/MS复合材料，m-ZCS的掺入不仅明显增强了产品的吸水性能，还有利于Zn2+的释放，提高其抗菌效果，得到止血功效高、可降解、具备抗菌活性的止血剂。
复方炉甘石洗剂作为一种常规的消炎药剂，具有抑菌、止痒、轻度防腐和收敛的功效。炉甘石的主要成分是天然碳酸锌，高温煅制后分解成氧化锌。炉甘石性味甘温无毒，《本草纲目》记载其功能“止血、消肿毒、生肌明目、去翳退赤、收敛除烂”，是中医眼科及皮肤外科的常用药物。炉甘石起到抑菌作用的同样是锌元素。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于Y分子筛载体的炉甘石止血复合物，通过Y分子筛-炉甘石-棉纤维多重止血材料的复合，得到一种快速止血、凝血性能更好，凝血活酶时间明显缩短的止血材料。
本发明所述的基于Y分子筛载体的炉甘石止血复合物是采用下述方法制备得到的：
1）、将用于制备Y分子筛的硅源加入到含有钠源和铝源的碱性水溶液中，混合得到分子筛前驱体溶液；
2）、将所述分子筛前驱体溶液在从常温至60℃的至少3个温度阶段下持续搅拌一定时间，以得到形成晶核的分子筛前驱体溶液；
3）、在形成晶核的分子筛前驱体溶液中加入棉纤维和炉甘石，于密闭反应釜中加热至90～100℃进行晶化反应，制备得到基于Y分子筛载体的炉甘石止血复合物。
其中，优选地，本发明是将所述分子筛前驱体溶液分别在25℃、45℃和60℃下恒温搅拌12～24h。
具体地，本发明所述制备方法中，优选是按照摩尔比Na2O∶Al2O3∶SiO2∶H2O=(0.5～0.9)∶(0.1～0.4)∶1∶(40～80)混合得到分子筛前驱体溶液的。
进一步地，本发明所述制备方法中，是按照m(炉甘石)∶m(棉纤维)∶m(SiO2)=(0.06～0.18)∶(0.5～0.9)∶1，在所述分子筛前驱体溶液中加入棉纤维和炉甘石。
其中，所述的硅源可以包括但不限于是硅溶胶、白炭黑、正硅酸乙酯、硅酸钠等各种常规的硅源材料，本发明优选使用硅溶胶或白炭黑。
所述的铝源可以包括但不限于是偏铝酸钠、硅铝微球等各种常规的铝源材料，本发明优选使用偏铝酸钠。
优选地，本发明是采用加一层棉纤维，撒一层炉甘石的方式，将棉纤维和和炉甘石加入到形成晶核的分子筛前驱体溶液中。
进一步地，本发明所述晶化反应时间优选为24～36h。
将本发明上述制备得到的反应产物以水洗涤、干燥后，即可制备得到本发明基于Y分子筛载体的炉甘石止血复合物。
本发明制备的基于Y分子筛载体的炉甘石止血复合物可以作为外用止血材料，应用于各种创面的止血处理中。
创伤的快速止血是日常生活与战创伤院前的关键救治环节，高效且安全的止血材料是实现快速止血的主要途径。本发明基于“分子筛/棉纤维/炉甘石”三重止血材料，利用Y分子筛的强吸附能力、棉纤维的散放热及炉甘石可的消炎抗菌性能，制备得到了一种具有高止血性能、良好生物安全性的抗菌外用止血复合物。
本发明使晶化反应前的分子筛前驱体溶液预先形成大量晶核，加入棉纤维和炉甘石进行原位合成，使晶核逐渐长大为纳米微晶，最终得到了生长在棉纤维上的负载炉甘石药物的平均粒径更小、结晶度更好的Y分子筛。
本发明制备的基于Y分子筛载体的炉甘石止血复合物的活化部分凝血活酶时间(APPT)相比于常规止血药物明显缩短，凝血酶原时间(PT)较常规止血药物有所提高，主要通过激活内源性凝血途径促进止血，对外源性凝血途径没有显著影响，与常规止血药物相比具有更高效的凝血性能，是一种高效、安全的抗菌止血复合物。
附图说明
图1是实施例1和对照例1制备样品的XRD图。
图2是实施例1和对照例1制备样品的SEM图。
图3是实施例1制备样品焙烧后的XRD图。
图4是不同止血材料的APTT和PT检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步的详细描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，从而使本领域技术人员能很好地理解和利用本发明，而不是限制本发明的保护范围。
本发明实施例和对比例中涉及到的实验方法、生产工艺、仪器以及设备，其名称和简称均属于本领域内常规的名称，在相关用途领域内均非常清楚明确，本领域内技术人员能够根据该名称理解常规工艺步骤并应用相应的设备，按照常规条件或制造商建议的条件进行实施。
本发明实施例和对比例中使用的各种原料或试剂，并没有来源上的特殊限制，均为可以通过市售购买获得的常规产品。也可以按照本领域技术人员熟知的常规方法进行制备。
实施例1。
在带有聚四氟乙烯内衬的容器中依次加入30mL去离子水，2.33g氢氧化钠，0.2g氯化钠，1.99g偏铝酸钠，40%硅溶胶4.33mL，室温下搅拌60min。
之后将容器置于25℃水浴锅中，恒温搅拌24h，再将水浴锅温度升至45℃，恒温搅拌24h，最后升温至60℃恒温搅拌12h后，停止搅拌。
采用加一层医用脱脂棉撒一层炉甘石的方式，将1.5g撕成纤维片状的医用脱脂棉和0.2g炉甘石加入到带有聚四氟乙烯内衬的容器中，放入不锈钢反应釜中密闭，于恒温箱中加热至100℃恒温晶化反应24h。
取出反应釜，于淬冷槽内快速冷却至室温，取出反应产物，以去离子水洗涤3次，抽滤，真空干燥箱中70℃干燥12h，得到基于Y分子筛载体的炉甘石止血复合物样品。
对照例1。
本对照例采用导向剂法制备生长在棉纤维上的Y分子筛。
在容器中依次加入19.0mL去离子水，5.96g氢氧化钠，0.56g偏铝酸钠，40%硅溶胶5.93mL，置于35℃水浴锅中搅拌反应18h，得到用于制备Y分子筛的导向剂。
之后在带聚四氟乙烯内衬的容器中依次加入25.6mL去离子水，3.94g氢氧化钠，1.24g偏铝酸钠，40%硅溶胶9.7mL，逐滴加入1.44mL导向剂，搅拌2h。
采用加一层医用脱脂棉撒一层炉甘石的方式，将1.5g撕成纤维片状的医用脱脂棉和0.2g炉甘石加入到带有聚四氟乙烯内衬的容器中，放入不锈钢反应釜中密闭，于恒温箱中加热至100℃恒温晶化反应24h。
取出反应釜，于淬冷槽内快速冷却至室温，取出反应产物，以去离子水洗涤3次，抽滤，真空干燥箱中70℃干燥12h，得到导向剂法制备的在棉纤维上的生长Y分子筛的炉甘石止血复合物样品。
图1给出了上述制备样品的XRD图，其中a为实施例1制备的复合物样品，b为对照例1制备的复合物样品。
图中，a与b均在2θ=6.1º、10.0º、15.5º、18.6º、20.2º、23.5º、26.9º、30.6º、31.2º、32.3º和33.9º等处出现Y分子筛的特征衍射峰，表明加入的炉甘石和作为支撑载体存在的棉纤维没有影响样品的结晶，两种方法都成功合成了Y分子筛。
然而，a在2θ=6.1º、15.5º、18.6º和26.9º处的特征衍射峰强度高于b，半峰宽也小于b，表明采用本发明方法得到的Y分子筛结晶度高于导向剂法，可以得到更好结晶度的Y分子筛。
图2进一步给出了上述制备样品的SEM图，其中a和b为实施例1制备的复合物样品的表面形貌，b为a的局部放大图，c为对照例1制备的复合物样品的表面形貌。
图中，两个样品的Y分子筛均牢固生长在棉纤维的粗糙表面与凹槽处。其中，从a和b可以看出，实施例1制备样品的Y分子筛颗粒在棉纤维表面存在团聚现象，粒径尺寸较小，约为300～450nm左右，炉甘石的负载使棉纤维上生长的Y分子筛数量相对更多，不仅在粗糙与凹槽处，在较光滑的棉纤维表面上也有一定数量的颗粒物，而在凹槽内团聚现象有所缓解。c的对照例1采用导向剂法制备样品中Y分子筛呈球形，粒径分布均匀，粒径尺寸约为550～750nm左右。
分子筛晶体的形成分为晶体成核和生长两个步骤。本发明制备方法将原料溶液由25℃、45℃、60℃梯度升温至100℃，为晶化反应提供了温和、缓慢的形成环境，有足够时间形成数量众多的晶核，生成粒径较小的Y分子筛。本发明在晶体进行一定时间的成核生长后再添加棉纤维，为分子筛提供了更多空间的生长基材，而且棉纤维上的活性醇羟基可以实现Y分子筛的牢固生长，因此得到了粒径小且结晶度良好的复合物。
为证实炉甘石有效负载在复合物样品上，将实施例1制备的基于Y分子筛载体的炉甘石止血复合物样品进行焙烧处理后，焙烧产物的XRD图如图3。图中在2θ=5～35º处出现的尖锐衍射峰为Y分子筛的特征峰，在2θ=30.9º、34.7º、36.2º、47.1º、62.7º和68.2º处出现的衍射峰均为ZnO的特征峰，分析是炉甘石的有效成分为ZnCO3和ZnO，焙烧后ZnCO3转化为ZnO，在2θ=30.9～68.2º的特征峰表面炉甘石药品已经负载在复合物样品上。
实施例2。
在带有聚四氟乙烯内衬的容器中依次加入35mL去离子水，1.285g氢氧化钠，0.2g氯化钠，1.99g偏铝酸钠，2.33g白炭黑，室温下搅拌60min。
之后将容器置于25℃水浴锅中，恒温搅拌24h，再将水浴锅温度升至45℃，恒温搅拌24h，最后升温至60℃恒温搅拌12h后，停止搅拌。
采用加一层医用脱脂棉撒一层炉甘石的方式，将1.5g撕成纤维片状的医用脱脂棉和0.27g炉甘石加入到带有聚四氟乙烯内衬的容器中，放入不锈钢反应釜中密闭，于恒温箱中加热至100℃恒温晶化反应24h。
取出反应釜，于淬冷槽内快速冷却至室温，取出反应产物，以去离子水洗涤3次，抽滤，真空干燥箱中70℃干燥12h，制备得到基于Y分子筛载体的炉甘石止血复合物。
实施例3。
在带有聚四氟乙烯内衬的容器中依次加入32mL去离子水，1.8g氢氧化钠，0.2g氯化钠，3.41g偏铝酸钠，40%硅溶胶9.7mL，室温下搅拌60min。
之后将容器置于25℃水浴锅中，恒温搅拌24h，再将水浴锅温度升至45℃，恒温搅拌24h，最后升温至60℃恒温搅拌12h后，停止搅拌。
采用加一层医用脱脂棉撒一层炉甘石的方式，将1.0g撕成纤维片状的医用脱脂棉和0.15g炉甘石加入到带有聚四氟乙烯内衬的容器中，放入不锈钢反应釜中密闭，于恒温箱中加热至100℃恒温晶化反应24h。
取出反应釜，于淬冷槽内快速冷却至室温，取出反应产物，以去离子水洗涤3次，抽滤，真空干燥箱中70℃干燥12h，制备得到基于Y分子筛载体的炉甘石止血复合物。
应用例1：兔耳动脉创伤止血实验。
实验用家兔15只，普通级，平均体重2.5Kg。
将15只白兔单笼适应性饲养1周后，随机分为空白组、实验组和对照组3组，每组5只。其中空白组采用空白棉花止血，实验组采用实施例1制备的炉甘石止血复合物样品止血，对照组采用直接浸渍炉甘石的棉花止血。
家兔实验前禁食8h，自由饮水，用10%水合氯醛经耳缘静脉麻醉注射麻醉。麻醉后固定于手术台上，用碘伏消毒兔耳背侧面中央区，用手术刀横断耳动脉，但不切透耳朵，建立耳动脉出血模型。
实验前预先精确称量各组棉花干重。造模后立即于各组创面分别敷相同质量的不同组棉花，用100g砝码加压，并开始计时，观察时间点分别为30s、20s、10s、5s，之后每隔5s观察1次创面出血情况，并记录止血时间。以移去敷料及砝码后3min不再出血为止血成功。
止血后精确称量各组棉花的湿重，计算出血量。出血量=止血后湿棉花重量－止血前干棉花重量。
本实验所有数据均采用表示，以SPSS 24.0软件处理数据，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
实验结果表明，与空白组比较，对照组和实验组的出血量和出血时间显著降低；与对照组比较，实验组出血量和出血时间显著降低；均具有统计学差异，见表1。
应用例2：活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)测试。
于清晨空腹情况下真空抽取受检者静脉血液，采用法国STAGO公司STA-R全自动血凝仪进行APTT、PT指标检测。通过APTT、PT值来判断材料是否激活内源性或外源性的凝血途径。
以实施例1制备的样品作为测试样品，将测试样品与血浆混合后，37℃孵育3min，静置10min，上机进行检测。所有血液标本均于采集后2h内完成检测，避免延迟检测对检验结果真实性的影响。
检测结果如图4，其中A为各样品的APTT结果；B为各样品的PT结果；图中a代表炉甘石，b代表Y分子筛，c代表实施例1样品，d代表云南白药止血药物。
如图4A所示的APTT实验结果，表明炉甘石与云南白药相比APTT值明显增高，二者有显著性差异，即单独使用炉甘石对内源性凝血系统有阻碍作用；而本发明制备的止血复合物与云南白药相比，有效降低了APTT值，血浆凝血时间明显缩短，说明本发明止血复合物可以加速内源性凝血系统的启动，且相较于云南白药凝血效果更好。
如图4B所示的PT实验结果，表明炉甘石与云南白药相比PT值明显增高，有显著性差异，即单独使用炉甘石对外源性凝血系统也存在阻碍作用；而本发明制备的止血复合物与云南白药相比没有显著性差异，说明本发明止血复合物对外源性凝血途径没有影响。
APTT和PT实验表明，本发明止血复合物主要是激活内源性凝血途径来促进止血，对外源性凝血途径没有显著影响，且与云南白药相比具有更高效的凝血性能。
本发明以上实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制本发明仅为以上所述实施例。本领域普通技术人员在不脱离本发明原理和宗旨的情况下，针对这些实施例进行的各种变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。
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