一种口炎清作用靶点的筛选方法
阅读说明：本技术 一种口炎清作用靶点的筛选方法 (Method for screening stomatitis clearing action target ) 是由 谌攀 李沛波 苏薇薇 姚宏亮 于 2021-06-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种口炎清作用靶点的预测方法。该方法包括如下步骤：采用中药系统药理学平台、毒性与基因比较数据库及靶点预测平台检索预测靶点,构建口炎清活性成分靶点库,并通过软件建立成分和对应靶点的可视化网络。进而构建活性成分和口腔溃疡疾病靶点库。最后对所有成分靶点和口腔溃疡疾病靶点进行了蛋白质-蛋白质相互作用,建立可视化网络,并分析网络的拓扑特征,通过网络结点的度、中介中心性和接近中心性3个拓扑参数筛选预测核心靶点。经试验证明：本方法可以解释口炎清发挥药效的科学内涵,也可以用于其他多成分药物的作用机制研究,为口炎清制剂质量控制提供更全面科学的研究方法,且具有耗时少、成本低的优势。(The invention relates to a method for predicting stomatitis clearing action target. The method comprises the following steps: the method comprises the steps of adopting a traditional Chinese medicine system pharmacology platform, a toxicity and gene comparison database and a target prediction platform to search for predicted targets, constructing a stomatitis clearing active ingredient target library, and establishing a visual network of ingredients and corresponding targets through software. And further constructing an active ingredient and oral ulcer disease target library. And finally, performing protein-protein interaction on all component targets and the oral ulcer disease target, establishing a visual network, analyzing topological characteristics of the network, and screening and predicting the core target through 3 topological parameters of the degree, the intermediary centrality and the approach centrality of network nodes. The test proves that: the method can explain the scientific connotation of the drug effect of the Kouyanqing, can also be used for the research of the action mechanism of other multi-component drugs, provides a more comprehensive and scientific research method for the quality control of the Kouyanqing preparation, and has the advantages of less time consumption and low cost.)
技术领域
本发明涉及药物靶点研究领域，具体涉及一种口炎清作用靶点的筛选方法。
背景技术
中药复方口炎清制剂用于阴虚火旺型口腔炎症的治疗，在临床上已使用数十年，疗效确切，但由于其成分复杂，对口炎清的作用机制研究较少，其作用靶点尚不明确。中药复方一般具有多成分、多靶点的特点，单一通路研究难以诠释中药“整体观念”的治疗思想。口腔溃疡是一种复杂的免疫疾病，对口腔溃疡的治疗研究也应该是从多因素的角度出发。因些，针对于口炎清治疗口腔溃疡的作用机制和靶点的研究，应该从整体的角度出发。以往的药物作用机制研究方法多是从细胞实验和动物实验开始，耗时长、风险大，也难以满足中药复方复杂体系的药理机制研究。
因此有必要建立一种针对于口炎清快速经济准确的中药作用机制和作用靶点研究方法，为口炎清制剂生产的质量控制提供更好的技术基础。
发明内容
基于上述问题，本发明旨在提供一种口炎清作用靶点的筛选方法，克服现有方法耗时长、成本高的缺点。
本发明采用的技术方案包括如下步骤：
1.构建口炎清活性成分靶点库：采用中药系统药理学平台、毒性与基因比较数据库检索靶点，再使用靶点预测平台数据库检索得到活性成分对应的靶点，通过软件建立成分和对应靶点的可视化网络；
2.构建活性成分和口腔溃疡疾病靶点库：人类孟德尔遗传数据库、人类基因数据库、基因疾病关联数据库和药物研发数据库中检索疾病靶点，再将各数据库结果整合去重后得到口腔溃疡疾病靶点库；
3.通过网络构建和网络拓扑分析预测口炎清作用靶点：对所有成分靶点和口腔溃疡疾病靶点进行了蛋白质-蛋白质相互作用，建立可视化网络，并分析网络的拓扑特征，通过网络结点的度、中介中心性和接近中心性3个拓扑参数筛选预测核心靶点。
所述步骤3所述拓扑参数构建的网络中的度大于2倍中位值，中介中心性和接近中心性均大于中位值的结点作为预测核心靶点。
经验证试验证明：本方法建立的口炎清作用靶点预测方法可以解释口炎清发挥药效的科学内涵，也可以应用于其他多成分药物的作用机制研。且具有以下优点：本方法提供了一种从整体角度出，更符合中药复杂体系的作用机制特点；本方法是基于数据挖掘、网络拓扑分析、分子虚拟对接手段，具有耗时少、成本低的优势。
附图说明
图1为成分-预测靶点网络图；
图2为预测靶点的度和中介中心性分布图；
图3为靶点验证动物试验的结果图示。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于此。
1.研究方法
(1)活性成分靶点库构建
通过中药系统药理学平台(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)、Toxicogenomics Database(CTD,http://ctdbase.org/)和毒性与基因比较数据库(CTD,https://ctdbase.org/)检索靶点，以及使用SwissTargetPrediction(STPD,http://www.swisstargetprediction.ch/)数据库预测靶点，得到活性成分对应的靶点。通过Cytoscape 3.7.0软件建立成分和对应靶点的可视化网络。成分-预测靶点可视化网络图见图1。
(2)疾病关联靶点库构建
以“Oral ulcer”或“Mouth ulcer”为关键词，在人类孟德尔遗传数据库(OMIM,https://omim.org/)、人类基因数据库(Genecards,https://www.malacards.org/)、基因疾病关联数据库(DisGeNET,http://www.disg enet.org/)和药物研发(Integrity)数据库(https://integrity.thomson-pharma.com/integrity/xmlxsl/)中检索疾病靶点。然后，将各数据库结果整合去重后得到口腔溃疡疾病靶点库。
(3)蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析
为了寻找成分靶点和疾病靶点之间的相互联系，进而发现与成分直接和间接作用靶点间的相互关系，对所有成分靶点和疾病靶点进行了蛋白质-蛋白质相互作用研究。在STRING(https://string-db.org/)中导入活性成分靶点和口腔溃疡相关靶点，选择好种属“Homo spaiens”并提交，“minimum required interaction score”设置成0.4，获得关键药效成分靶点和口腔溃疡相关靶点的相互作用网络，以TSV格式导出结果。将导出的结果使用Cytoscape 3.7.0软件建立起可视化网络，并分析网络的拓扑特征。
(4)核心靶点的筛选
将成分靶点映射到疾病靶点网络，得到与成分和疾病共同相关的靶点。将与成分疾病共同相关的靶点以及和共同靶点直接相连的靶点取出，再使用STRING数据库进行PPI分析，然后利用Cytoscape 3.7.0软件进行可视化，并分析网络的拓扑特征。网络的拓扑分析中，将网络结点的度(degree)大于2倍中位值，中介中心性(Betweenness centrality)和接近中心性(Closeness centrality)大于中位值的节点作为核心靶点。靶点的度和中介中心性分布图见图2。
(5)成分-核心靶点网络构建及分析
将核心靶点导入STRING数据库进行PPI分析，导入TSV格式文件结果，用该结果和关键药效成分信息导入Cytoscape 3.7.0软件，利用其可视化功能构建活性成分-核心靶点网络，并分析网络的拓扑特征。
(6)GO和KEGG通路富集分析
为了推测核心靶点可能参与生物过程和信号通路，本研究利用David数据库(https://david.ncifcrf.gov/)(V6.8)对核心靶点进行GO(gene ontology)注释分析，包括生物过程(Biological process)、细胞组分(Cell component)、分子功能(Molecularfunction)。同时，在该数据进行KEGG信号通路富集分析。并根据P-Value值取GO分析前10的条目和信号通路前15的条目(P≤0.05)。同时，使用Cytoscape 3.7.0软件构建成分-靶点-通路网络图。
(7)分子对接研究
从Pubchem中下载16个口炎清活性成分的SDF文件，导入软件Discovery Studio2016中，经Prepare Ligand处理，对小分子的构象进行能量优化处理，产生三维结构，加氢，产生异构体。16个化合物处理后产生了41种用于对接的配体分子。从RCSD蛋白质数据库(https://www.rcsb.org/)下载PTGS2、MMP9、TNF、TP53、ALB、IL6、CASP3、BCL2、JUN和EGF的PDB蛋白文件。首先删除PDB结构中的水分子和原配体分子，利用Clean Protein功能，补全不完整残基、删除多余蛋白质构象、加氢和分配相关电荷等得到用于对接的PDB文件。对接的活性口袋由原始配体分子进行定义。对接参数设置之后，我们将晶体结构中原配体分子重新对接至预先定义好的活性口袋。将每个靶蛋白的原配体以上述相同的方式对接到它们相应的蛋白质受体中。通过比较药效成分和原配体的对接打分(LibDockScore)结果来评估有效成分和靶点的相互作用强度。
(8)靶点验证
将雄性Sprague-Dawley大鼠(8周龄)随机分为5组：正常组(Control)、模型组(Model)和口炎清低(KYQG-Low)、中(KYQG-Mid)、高剂量组(KYQG-High)。每组7只动物，12h昼夜自然交替下饲养，饮水和食物自由供应。口炎清低、中、高剂量组从第1天至第9天分别以0.522、1.57、4.70g/kg/d的剂量灌胃，其他组以蒸馏水灌胃处理。第4天，模型组和口炎清低、中、高剂量组大鼠的颊黏膜用苯酚进行化学损伤，在第6天在口腔颊黏膜区域形成一个几乎均匀的圆形溃疡。然后，对模型组和口炎清低、中、高剂量组的大鼠进行睡眠剥夺72h。睡眠剥夺结束后，用异氟烷将动物麻醉，腹主动脉取血。将血液在4℃下以5000rpm离心20min得到血清，然后在－80℃下保存。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测血清中环氧酶-2(COX-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。
2.研究结果
(1)药效成分-核心靶点网络构建和分析
通过对各数据库整合去重后得到口腔溃疡相关的疾病靶点97个，将成分靶点映射到疾病靶点网络得到与成分和疾病共同相关的靶点12个，将与成分疾病共同相关的靶点以及和共同靶点直接相连的靶点进行PPI分析，然后利用Cytoscape软件建立可视化网络，并分析网络的拓扑特征。网络的拓扑分析中，将网络结点的度(degree)大于2倍中位值，同时中介中心性(Betweenness centrality)和接近中心性(Closeness centrality)大于中位值的节点作为核心靶点，共47个。利用Cytoscape建立了成分-核心靶点网络图(见图1)，共63个节点，970条边。在本研究中，通过计算度和中介中心性来评价网络中节点的重要性。度代表了连接至该结点边的数量。中介中心性反映了一个节点作为桥梁连接两个其他节点之间最短路径的次数。因此，一些具有较高的度值和/或较高的中介中心性值的靶点被认为是发挥关键作用的靶点。靶点的度和中介中心性的趋势是高度相关的(图2)。中介中心性线的峰值代表了那些在度值相对较低的情况下仍然拥有高中介中心性值的节点，如，MMP2、RELA、NOS3和NOS2。这些节点连接了某些有影响力的靶点，也是相对重要的靶点。在47个核心靶点中，度值排前10的靶点为PTGS2、MMP9、TNF、TP53、ALB、IL6、CASP3、BCL2、JUN和EGF。其中绿原酸(Degree＝15)，异槲皮苷(Degree＝9)，肉桂酸(Degree＝8)和异绿原酸B(Degree＝6)Degree值较高。
(2)GO分析与KEGG通路分析
对47个核心靶点进行GO富集分析，根据P-Value值列出前10的生物过程、细胞组分和分子功能。结果表明，口炎清颗粒可能在细胞外区、小凹和细胞质核周围等细胞组分中通过酶结合、血红素结合和受体结合等分子功能调节药物反应、脂多糖调节信号通路和细胞凋亡等生物过程，进而发挥治疗作用。对核心靶点进行了KEGG分析，根据P-Value值列出了前15的通路。从CTD数据库检索到HIF-1信号通路和TNF信号通路这两条通路与口腔溃疡疾病相关。可以看出，这些关键成分均有涉及到这两条通路的相关靶点。因此，HIF-1信号通路和TNF信号通路可能是口炎清颗粒发挥药效而参与调控的关键通路。
(3)分子对接研究结果
选择HIF-1信号通路和TNF信号通路中具有蛋白原配体抑制剂的靶点进行分子对接。我们发现不同的组分对所选择的目标蛋白表现出不同的结合活性。通过活性成分和靶蛋白之间相互作用的热图可以看出，异绿原酸B和异绿原酸A、异槲皮苷和哈巴俄苷与HMOX1、NOS2、EGFR和NOS3有较强的相互作用；与MMP9、MAPK3、MAPK1、CASP3、TNF和BCL2有中等强度的相互作用；与PTGS2不能对接成功。哈巴苷、绿原酸、木犀草苷、新绿原酸、隐绿原酸和异槲皮苷与HMOX1、NOS2、EGFR、NOS3、PTGS2和MMP9有中等强度的相互作用。酪氨酸、赖氨酸、白屈菜酸、γ-氨基丁酸和肉桂酸几乎与各靶点都仅有微弱的作用或无相互作用。根据对接结果，安格洛苷对NOS2、MAPK3、CASP3、TNF、BCL2具有较强结合特异性。HIF-1信号通路中的BCL2、EGFR、HMOX1、MAPK1、MAPK3、NOS2、NOS3以及TNF信号通路中的PTGS2、CASP3、TNF、MMP9、MAPK1、MAPK3等靶点都与至少与一个药效成分具有较强的相互作用。
(4)靶点验证
我们通过网络药理学方法初步推断了口炎清颗粒治疗口腔溃疡的作用机制和靶点，但还需要进一步的实验验证。因此，我们在阴虚火旺型口腔溃疡大鼠模型上进行了动物实验验证。在成分-关键靶点网络中，PTGS2，又称为环氧酶2(COX2)、MMP9和TNF-α是度值排名前三的靶点，可能是口炎清颗粒发挥药效的重要靶点。结果表明，如图3所示，口炎清(4.7g/kg/d)能显著抑制血清中COX2、MMP9和TNF-α的升高。由此可见，口炎清的治疗效果与抑制COX2、MMP9和TNF-α的升高有关，这与网络药理学的研究结果一致。动物实验的结果证实本方法预测靶点的可靠性。
综上所述，本方法发现口炎清具有多成分、多靶点的作用特点。口炎清基于COX2、MMP9和TNF-α等47个关键靶点，通过抑制炎症、调节免疫反应、抑制氧化应激来发挥对口腔溃疡的治疗作用。其中，TNF信号通路和HIF-1信号通路可能在口炎颗粒对口腔溃疡的治疗中发挥了关键作用。