具体实施方式

概要

在整个说明书中，除非另有特别说明或上下文另有要求，引用单个步骤、特征、物质组成、步骤组特征组、或物质组成组应被认为包括一个和多个(即一个或更多个)那些步骤、特征、物质组成、步骤组、特征组、或物质组成组。

本领域技术人员将理解，除了具体描述的那些之外，本发明易于变化和修改。应当理解，本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还包括本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何两个或更多个的任何和所有组合。

本发明不限于本文描述的特定实施例的范围，这些实施例仅用于示例性目的。功能上等同的产物、组合物和方法清楚地在本发明的范围内。

除非另外具体说明，否则应对其加以必要的变更后适用于本发明的任何其他实例。

除非另有明确定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均应被视为具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学中)普通技术人员通常理解的相同含义。

除非另有说明，本发明中使用的重组DNA、重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员熟知的标准方法。这些技术在以下来源文献中都有描述和解释，例如，J.Perbal，《分子克隆实用指南》(A Practical Guide to Molecular Cloning)，JohnWiley and Sons(1984)，Sambrook等人，《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(编)，《基本分子生物学：一种实用的方法》(Essential Molecular Biology:A PracticalApproach)，第1卷和第2卷，IRL Press(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(编)，《DNA克隆：一种实用的方法》(DNA Cloning:A Practical Approach)，1-4卷,IRL Press(1995和1996)，以及F.M.Ausubel等人，(编)，《分子生物学现行实验指南》(Current Protocols inMolecular Biology)，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括目前为止的所有更新)，Ed Harlow和David Lane(编)，《抗体：实验室手册》(Antibodies：ALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，(1988)，以及J.E.Coligan等人，(编)，《免疫学现行实验指南》(Current Protocols in Immunology)，John Wiley&Sons(包括目前为止的所有更新)。

在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括(comprise)”或诸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”的变体应理解为暗示包括所述的步骤或元件或整数，或步骤或元件或整数组，但不排除任何其他步骤或元件或整数或元素或整数组。

术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并且应理解为提供对两种含义或任一含义的明确支持。

选定的定义

“RNA”是指包括至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖部分的2'位具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及通过一个或多个核苷酸的添加、缺失、替代和/或改变而不同于天然存在的RNA的改变的RNA。这样的改变可以包括添加非核苷酸物质，例如添加到siRNA的末端或内部，例如在RNA的一个或多个核苷酸处。本发明的RNA分子中的核苷酸还可以包括非标准核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以被称为类似物或天然存在的RNA的类似物。

术语“RNA干扰”或“RNAi”通常是指由细胞的细胞质中的双链RNA(dsRNA)分子引发的基因表达的RNA依赖性沉默。dsRNA分子减少或抑制靶核酸序列的转录产物，从而使基因沉默或减少该基因的表达。

如本文所用，术语“双链RNA”或“dsRNA”是指具有双链体结构并包括彼此长度相似的效应子序列和效应子互补序列的RNA分子。效应子序列和效应子互补序列可以是单一RNA链或分开的RNA链。“效应子序列”(通常称为“引导链”)与靶序列基本上互补，靶序列在本发明中是PABPN1 mRNA转录物的区域。“效应子序列”也可称为“反义序列”。“效应子互补序列”将与效应子序列充分互补，使得其可与效应子序列退火以形成双链体。在这点上，效应子互补序列将与靶序列的区域基本上同源。对于本领域技术人员显而易见的是，术语“效应子互补序列”也可称为“效应子序列的补体”或有义序列。

如本文所用，术语“双链体”是指在单链核酸(例如RNA)的两个互补或基本上互补的核酸(例如RNA)中的区域，或在彼此形成碱基对的单链核酸(例如RNA)的两个互补或基本上互补的区域中的区域，通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对或允许互补或基本上互补的核苷酸序列之间的稳定双链体的任何其他方式。本领域技术人员将理解，在双链体区域内，不需要100％互补性；实质互补性是允许的。实质互补性包括可包括79％或更大互补性。例如，由19个碱基对组成的双链体区域中的单一错配(即，共同配对，18个碱基对和一个错配)导致94.7％的互补性，使得双链体区域基本上互补。在另一个实例中，在由19个碱基对组成的双链体区域中的两个错配(即，17个碱基对和两个错配)导致89.5％的互补性，使得双链体区域基本上互补。在另一个实例中，由19个碱基对组成的双链区的3个错配(即，16个碱基对和3个错配)导致84.2％的互补性，使得双链区基本上互补，等等。

dsRNA可以作为发夹或茎环结构提供，其具有由效应子序列和效应子互补序列构成的双链体区域，效应子序列和效应子互补序列通过称为茎环的至少2个核苷酸序列连接。当dsRNA以发夹或茎环结构提供时，其可以被称为“发夹RNA”或“短发夹RNAi剂”或“shRNA”。在发夹结构或茎环结构中提供的或产生发夹结构或茎环结构的其他dsRNA分子包括初级miRNA转录物(pri-miRNA)和前体微小RNA(pre-miRNA)。pre-miRNA shRNA可以通过Drosha和Pasha酶的作用从pri-miRNA天然产生，Drosha和Pasha酶识别并释放形成茎-环结构的初级miRNA转录物的区域。或者，pri-miRNA转录物可被工程化以用人工/重组茎-环结构替代天然茎-环结构。即，可以将人工/重组茎-环结构插入或克隆到缺乏其天然茎-环结构的pri-miRNA骨架序列中。在设计为表达pri-miRNA分子的茎环序列的情况下，Drosha和Pasha识别并释放人工shRNA。使用该方法产生的dsRNA分子称为“shmiRNA”、“shmiR”或“微小RNA框架shRNA”。

如本文所用，关于序列的术语“互补”是指与通过沃森-克里克碱基配对的序列的互补，由此鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对，并且腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)配对。一个序列可以与另一个序列的全长互补，或者它可以与另一个序列的特定部分或长度互补。本领域技术人员将认识到，U可存在于RNA中，并且T可存在于DNA中。因此，RNA或DNA序列中的任一个内的A可与RNA序列中的U或DNA序列中的T配对。本领域技术人员还将认识到RNA中存在的G可以与RNA中的C或U配对。

如本文所用，术语“基本上互补”用于指示足够程度的互补性或精确配对，使得稳定和特异性结合发生在核酸序列之间，例如发生在效应子序列和效应子互补序列之间，或发生在效应子序列和靶序列之间。应理解核酸序列不必与其靶序列或互补序列100％互补。该术语涵盖与除突出端之外的另一序列互补的序列。在一些情况下，除1-2个错配外，该序列与另一个序列互补。在一些情况下，除1个错配外，序列是互补的。在一些情况下，除2个错配外，序列是互补的。在其他情况下，除3个错配外，序列是互补的。在还有的其他情况下，除4个错配外，序列是互补的。

在本发明的shRNA或shmiR的上下文中使用的术语“编码的”应理解为意指能够从DNA模板转录的shRNA或shmiR。因此，编码或为本发明的shRNA或shmiR编码的核酸将包括用作转录相应shRNA或shmiR的模板的DNA序列。

术语“DNA指导的RNAi构建体”或“ddRNAi构建体”是指包括DNA序列的核酸，DNA序列在转录时产生引起RNAi的shRNA或shmiR分子(优选shmiR)。ddRNAi构建体可以包括转录为能够自退火成发夹结构的单个RNA的核酸，发夹结构具有通过至少2个核苷酸的茎环连接的双链体区域，即shRNA或shmiR，或转录为具有多个shRNA或shmiR的单个RNA，或转录为各自能够分别折叠为单个shRNA或shmiR的多个RNA转录物。可以在包括一种或多种另外的DNA序列的较大“DNA构建体”内提供ddRNAi构建体。例如，可以在包括编码功能性PABPN1蛋白的另外的DNA序列的DNA构建体中提供ddRNAi构建体，功能性PABPN1蛋白已经被密码子优化，使得其mRNA转录物不被ddRNAi构建体的shmiR靶向。ddRNAi构建体和/或包括该构建体的DNA构建体可在与启动子可操作连接的表达载体(vector)(例如质粒)内。

如本文所用，术语“可操作连接的”或“可操作连接”(或类似)意指编码核酸序列以促进编码序列表达的方式连接至调节序列(例如启动子)或与调节序列(例如启动子)缔合。调节序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件，它们是本领域公知的并被选择用于指导编码序列的表达。

如本文所用，术语“反向末端重复序列”或“ITR”以复数或单数形式是指位于载体(vector)一端的序列，当与位于载体(vector)相对端的互补序列组合使用时，其可形成发夹结构。该对反向末端重复序列参与AAV DNA的拯救，在宿主基因组中的复制和包装。ITR还用于AAV DNA的有效衣壳化和完全装配的AAV颗粒的产生。

“载体(vector)”应理解为是指将核酸引入细胞的载体(vehicle)。载体(vector)包括但不限于衍生自病毒或细菌来源的质粒、噬菌粒、病毒、细菌和载体(vehicle)。“质粒”是环状双链DNA分子。根据本发明使用的有用类型的载体(vector)是病毒载体(vector)，其中将异源DNA序列插入到可以被修饰以缺失一个或多个病毒基因或其部分的病毒基因组中。某些载体(vector)能够在宿主细胞中自主复制(例如，具有在宿主细胞中起作用的复制起点的载体(vector))。其他载体(vector)可以稳定地整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。如本文所用，术语“表达载体(vector)”应理解为意指能够表达本发明的RNA分子的载体(vector)。

“功能性PABPN1蛋白”应理解为是指具有野生型PABPN1蛋白的功能特性的PABPN1蛋白，例如，在哺乳动物细胞中控制mRNA聚腺苷酸化和/或内含子剪接位点的能力。因此，“功能性PABPN1蛋白”应理解为当在受试对象中表达或存在时不会引起OPMD的PABPN1蛋白。在一个实例中，本文提及的“功能性PABPN1蛋白”是指人野生型PABPN1蛋白。人野生型PABPN1蛋白的序列在NCBI RefSeq NP_004634中给出。因此，功能性人PABPN1蛋白可具有NCBI RefSeq NP_004634中列出的人PABPN1蛋白的体内功能特性。

如本文所用，术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”及其变化形式是指设计用于在临床病理过程期间改变所治疗个体或细胞的自然过程的临床干预。治疗的期望效果包括降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。因此，OPMD的治疗包括降低或抑制受试对象中引起OPMD的PABPN1蛋白的表达和/或在受试对象中表达具有正常长度的聚丙氨酸残基的PABPN1蛋白。优选地，OPMD的治疗包括降低或抑制受试对象中引起OPMD的PABPN1蛋白的表达和/或在受试对象中表达具有正常长度的聚丙氨酸残基的PABPN1蛋白。例如，如果实现上述治疗结果中的一个或多个，则成功地“治疗”个体。

“治疗有效剂量”至少是使OPMD病情有明显改善所需的最低浓度或量，例如OPMD的一个或多个症状(包括但不限于受试对象的上睑下垂、吞咽困难和肌肉无力)的明显改善。本文的治疗效应量可以根据诸如患者的疾病状态、年龄、性别和体重，以及shmiR、编码shmiR的核酸、ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体(vector)或包括其的组合物的能力，以在个体中引起期望的反应和/或表达载体(vector)在受试对象中表达功能性PABPN1蛋白的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中shmiR、编码shmiR的核酸、ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体(vector)或包括其的组合物的任何毒性或有害作用超过shmiR、编码shmiR的核酸、ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体(vector)或包括其的组合物的治疗有益作用的量，以在受试对象中抑制、压制或减少引起OPMD的PABPN1蛋白的表达(单独考虑或与功能性PABPN1蛋白的表达组合考虑)。

如本文所用，“受试对象”或“患者”可以是患有OPMD或在遗传上倾向于OPMD的人或非人动物，即，具有引起OPMD的PABPN1基因变体的人或非人动物。“非人类动物”可以是灵长类动物、家畜(例如羊、马、牛、猪、驴)、同伴动物(例如狗和猫等宠物)、实验室实验动物(例如小鼠、兔子、大鼠、豚鼠、果蝇、秀丽隐杆线虫、斑马鱼)、性能动物(例如赛马、骆驼、灰狗)或圈养野生动物。在一个实例中，受试对象或患者是哺乳动物。在一个实例中，受试对象或患者是人。

术语“表达降低”、“降低表达”或类似术语是指靶基因(例如，PABPN1基因)的蛋白和/或mRNA产物的水平不存在或可观察到降低。降低不必是绝对的，但可以是部分降低，足以导致由shmiR、编码shmiR的核酸、ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体(vector)或包括本发明的这些的组合物引起的RNAi的可检测或可观察到的变化。降低可以通过测定来自靶核酸的mRNA和/或蛋白产物的水平相对于缺乏shmiR、编码shmiR的核酸、ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体(vector)或包括其的组合物的细胞的降低来测量，并且可以低至1％、5％或10％，或可以是绝对的，即100％抑制。降低的效果可以通过检查细胞或生物体的外向特性(即，细胞或生物体的定量和/或定性表型)来测定，并且还可以包括在本发明的shmiR、编码shmiR的核酸，ddRNAi构建体，DNA构建体，表达载体(vector)或包括其的组合物给药之后，检测细胞或生物体中expPABPN1的核聚集体的存在或核聚集体的量的变化。

如本文所用，“递送系统”是指用于包装外来遗传物质如DNA或RNA的载体(vector)，并且其可被引入细胞中。递送系统可以包括病毒载体(vector)，例如，腺病毒相关病毒(AAV)载体(vector)、逆转录病毒载体(vector)、腺病毒载体(vector)(AdV)和慢病毒(LV)载体(vector)。如本文所述，病毒载体(vector)可用于在细胞中递送和表达外源遗传物质。因此，本文所述的病毒表达载体(vector)可用作递送系统。

如本文所用，术语“腺相关病毒”或“AAV”涉及细小病毒科(Parvoviridae)内的一组病毒，其含有短(约4.7kb)单链DNA基因组并且取决于辅助病毒(例如用于其复制的腺病毒)的存在。本发明还涉及衍生自AAV的载体(vector)，例如用作基因转移载体(vehicle)。

如本文所用，在AAV的上下文中使用的术语“血清型”是用于指具有与其它AAV血清型在血清学上不同的衣壳的AAV的区别。在与另一种AAV相比，针对一种AAV的抗体之间缺乏交叉反应性的基础上测定血清学特异性。这种交叉反应性差异通常是由于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的差异(例如，由于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)。

如本文所用，在AAV的上下文中，术语“病毒衣壳蛋白”、“衣壳蛋白”、“衣壳多肽”或类似物涉及AAV的多肽，其具有自组装活性以产生AAV颗粒的蛋白质壳，也称为外壳蛋白或VP蛋白。其由三个亚单位VP1、VP2和VP3组成，通常由单个核酸分子表达，并且相互作用形成二十面体对称的衣壳。AAV的衣壳结构描述于BERNARD N.FIELDS等人，《病毒学》(VIROLOGY)第2卷，第69&70章(第4版，Lippincott-Raven出版社)。

如本文所用，术语“启动子”通常是指参与DNA依赖性RNA聚合酶和其它蛋白质(反式作用转录因子)的识别和结合以起始和控制一个或多个编码序列的转录的DNA序列，并且相对于转录方向通常位于编码序列的上游。

如在本发明的包括经修饰的衣壳蛋白或VP1序列的AAV的上下文中使用的术语“改善的功能”或类似术语应理解为意指包括经修饰的衣壳蛋白或VP1序列的AAV相对于相同血清型的野生型AAV具有改善的内体逃逸活性，该野生型AAV尚未被修饰并且在昆虫细胞中产生。如本文所用，术语“内体逃逸活性(endosomal escape activity)”、“内体逃逸活性(endosome escape activity)”或类似术语应理解为是指AAV在细胞内在化后从内体区室逃逸的能力。在AAV功能方面，应当理解，在细胞内在化后不能从内体逃逸的AAV是不起作用的，特别是在基因治疗方面。

如本文所用的“咽肌”是指形成咽的一组或多组肌肉。咽肌可以包括下缩肌、中缩肌、上缩肌、腭咽肌、咽喉肌和/或茎突咽肌中的一个或多个。

用于治疗OPMD的经修饰的AAV递送载体(vector)

腺相关病毒(AAV)是依赖性细小病毒，其通常需要与另一种病毒(通常是腺病毒或疱疹病毒)共同感染以引发和维持生产性感染循环。在没有这种辅助病毒的情况下，AAV仍然能够通过受体介导的结合和内化感染或转导靶细胞，穿透非分裂细胞和分裂细胞中的细胞核。因为子代病毒不是在缺乏辅助病毒的情况下由AAV感染产生的，所以转导的程度仅限于用病毒感染的初始细胞。这是AAV成为用于基因治疗的理想载体(vector)的特征。此外，与逆转录病毒、腺病毒和单纯疱疹病毒不同，AAV似乎缺乏人的致病性和毒性(Kay等人,Nature.424:251(2003))。由于基因组通常仅编码两个基因，因此AAV作为递送载体(vehicle)受到4.5千碱基(kb/s)的包装容量的限制并不奇怪。然而，尽管该大小限制可能限制可递送用于替代基因治疗的基因，但其不会不利地影响较短序列如shmiR和shRNA的包装和表达。由于这些原因，本发明考虑了AAV作为递送PABPN1‘沉默和替换’构建体的载体(vector)或系统用于治疗OPMD的用途。通常，用于基因治疗应用的AAV优选选自能够感染人的那些血清型，例如选自AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13(或其变体)组成的组的AAV。

在一个实例中，本发明提供了AAV，其包括：

(a)病毒衣壳蛋白，其包括包括修饰的VP1序列，其中磷脂酶A2(PLA2)结构域内的特定氨基酸和亚单位1(VP1)的侧翼序列相对于相应的野生型序列被修饰为更“AAV2样”；以及

(b)多核苷酸序列，其包括(i)包括核酸的DNA指导的RNAi(ddRNAi)构建体，核酸包括编码短发夹微小RNA(shmiR)的序列；以及(ii)包括核酸的PABPN1构建体，核酸包括编码功能性PABPN1蛋白的序列，功能性PABPN1蛋白具有不被ddRNAi构建体编码的shmiR靶向的mRNA转录物；

在这点上，本发明人已经表明，由昆虫细胞中的杆状病毒表达系统产生的来自血清型2之外的血清型的代表性AAV的内体逃逸活性可以通过在PLA2结构域及其侧翼序列内的特定位点进行氨基酸替代来恢复或改善。例如，本发明人已经表明，通过用AAV血清型2PLA2结构域和侧翼序列内相应位置的氨基酸替代PLA2结构域和侧翼序列内多达6个不同位置的氨基酸，可以恢复或改善血清型2以外的代表性血清型的AAV的内体逃逸活性。在这点上，由于目前采用的策略是改善昆虫细胞中产生的AAV的功能，本发明人已经表明不必将整个PLA2结构域和侧翼序列与AAV2的结构域和侧翼序列交换以产生嵌合AAV，也不必产生表达包括野生型VP1/PLA2序列和AAV2例如AAV2/WT VP1的嵌合衣壳的AAV。

可用于生产具有本文所述经修饰VP1序列的AAV的AAV序列可衍生自任何AAV血清型的基因组。通常，AAV血清型在氨基酸和核酸水平上具有显著同源性的基因组序列，提供相同的遗传功能组，产生物理上和功能上相似的病毒体，并通过实际上相同的机制(具有本文所述的PLA2结构域的活性的特异性豁免)复制和装配。用于设计和生产本发明的经修饰的AAV的合适的AAV核酸和蛋白质序列是可公开获得的。已知感染人的野生型AAV的VP1序列(且其在本文中涵盖)描述于Chen等人，(2013)J.Vir.87(11):6391-6405。人或猿腺相关病毒(AAV)血清型是用于本发明内容的优选AAV核苷酸序列来源，更优选通常感染人的AAV血清型(例如，血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13)。AAV血清型1-13的衣壳多肽序列是本领域已知的，例如AAV1(基因库登录号：AAD27757.1，GI:4689097)、AAV2(基因库登录号：AAC03780.1，GP.2906023)、AAV3(基因库登录号：AAC55049.1，GI:1408469)、AAV4(基因库登录号：AAC58045.1，GL2337940)、AAV5(基因库登录号：AAD13756.1，GI-4249658)、AAV10(基因库登录号：AAT46337.1，GL48728343)、AAV11(基因库登录号：AAT46339.1，GI:48728346)、AAV12(基因库登录号：ΑΒI16639.1，GI:112379656)或AAV13(基因库登录号：ABZ10812.1，GI:167047087)。血清型1-13的AAV衣壳蛋白的多肽序列也在本文的SEQ ID NO：27-39中示出。此外，来自血清型1-13的AAV的完整基因组是本领域已知的，例如AAV1(NCBI参考序列：NC_002077.1)、AAV2(基因库登录号：J01901.1)、AAV3(基因库登录号：AF028705.1)、AAV4(NCBI参考序列：NC_001829.1)、AAV5(NCBI参考序列：NC_006152.1)、AAV6(基因库：AF028704.1)、AAV7(NCBI参考序列：NC_006260.1)、AAV8(NCBI参考序列：NC_006261.1)、AAV9(基因库登录号：AY530579.1)、AAV10(基因库登录号：AY631965.1)、AAV11(基因库登录号：AY631966.1)或AAV12(基因库登录号：DQ813647.1)。在特定实例中，本发明提供来自血清型8和9的AAV递送载体(vector)。

在一个实例中，本发明的AAV包括来自AAV9的病毒衣壳蛋白，其包括经修饰的VP1序列，其中相对于SEQ ID NO：87中所示的相应野生型AAV9 VP1序列，位置1、26、40、43和44处中的一个或多个氨基酸被修饰。例如，本发明的AAV可包括来自AAV9的病毒衣壳蛋白，病毒衣壳蛋白包括经修饰的VP1序列，该VP1序列包括位置1的丝氨酸、位置26的谷氨酸、位置40的精氨酸、位置43的天冬氨酸、位置44的丝氨酸和位置64的赖氨酸的序列，其中氨基酸位置是相对于在SEQ ID NO：87中示出的野生型AAV9 VP1序列定义的，其中在位置1、26、40、43和44的任何一个或多个的氨基酸是相对于相应的野生型AAV9 VP1序列修饰的。在一些实例中，相对于相应的野生型AAV9 VP1序列，除了在所述任何一个或多个位置1、26、40、43和44处的那些氨基酸之外没有其他氨基酸被修饰。

在一个实例中，本文所述的AAV可包括来自具有经修饰的VP1序列的AAV9的病毒衣壳蛋白，其中相对于SEQ ID NO：87中所示的相应野生型AAV9 VP1序列，位置1、26、40、43和44中任两个、三个、四个或五个处的氨基酸被修饰。

在一个实例中，本文所述的AAV可包括来自具有经修饰的VP1序列的AAV9的病毒衣壳蛋白，其中相对于SEQ ID NO：87中所示的相应野生型AAV9 VP1序列，位置1、26、40、43和44中的任何两个或更多个位置处的氨基酸被修饰。例如，相对于SEQ ID NO：87所示序列，经修饰的VP1序列可以包括选自A1S、A26E、Q40R、K43D和A44S的两个或多个修饰。

在一个实例中，本文所述的AAV可包括来自具有经修饰的VP1序列的AAV9的病毒衣壳蛋白，其中相对于SEQ ID NO：87中所示的相应野生型AAV9 VP1位置1、26、40、43和44中任三个或更多个处的氨基酸被修饰。例如，相对于SEQ ID NO：87所示的序列，经修饰的VP1序列可以包括选自A1S、A26E、Q40R、K43D和A44S的三个或更多个修饰。

在一个实例中，本文所述的AAV可包括来自具有经修饰的VP1序列的AAV9的病毒衣壳蛋白，其中相对于SEQ ID NO：87中所示的相应野生型AAV9 VP1序列，位置1、26、40、43和44中的任何四个或更多个位置处的氨基酸被修饰。例如，相对于SEQ ID NO：87所示序列，经修饰的VP1序列可以包括选自A1S、A26E、Q40R、K43D和A44S的四个或多个修饰。

在一个实例中，本文所述的AAV可包括来自具有经修饰的VP1序列的AAV9的病毒衣壳蛋白，其中相对于SEQ ID NO：87中所示的相应野生型AAV9 VP1位置1、26、40、43和44处的氨基酸被修饰。例如，相对于SEQ ID NO：87所示序列，经修饰的VP1序列可包括以下修饰：A1S、A26E、Q40R、K43D和A44S。例如，经修饰的AAV9 VP1序列可包括SEQ ID NO：88中所示的氨基酸序列。例如，相对于SEQ ID NO：89所示的相应全长野生型AAV9衣壳VP1序列，位置42、67、81、84和85处的残基被修饰(例如，相对于SEQ ID NO：89所示的序列，修饰A42S、A67E、Q81R、K84D和A85S)。根据本实例，本发明的AAV可以包括来自AAV9的病毒衣壳蛋白，该病毒衣壳蛋白包括在SEQ ID NO：90中示出的经修饰的VP1序列。

在一个实例中，本发明的AAV包括来自AAV8的病毒衣壳蛋白，其包括经修饰的VP1序列，其中相对于SEQ ID NO：91中所示的相应野生型AAV8 VP1序列，位置1、26、40、43、44和64处中的一个或多个氨基酸被修饰。例如，本发明的AAV可包括来自AAV8的病毒衣壳蛋白，病毒衣壳蛋白包括经修饰的VP1序列，该VP1序列包括位置1的丝氨酸、位置26的谷氨酸、位置40的精氨酸、位置43的天冬氨酸、位置44的丝氨酸和位置64的赖氨酸的序列，其中氨基酸位置是相对于在SEQ ID NO：91中列出的野生型AAV8VP1序列定义的，其中在位置1、26、40、43、44和64的任何一个或多个的氨基酸是相对于相应的野生型AAV8 VP1序列修饰的。在一些实例中，相对于相应的野生型AAV8 VP1序列，除了在所述任何一个或多个位置1、26、40、43、44和64处的那些氨基酸之外没有其他氨基酸被修饰。

在一个实例中，本文所述的AAV可包括来自具有经修饰的VP1序列的AAV8的病毒衣壳蛋白，其中相对于SEQ ID NO：91中所示的相应野生型AAV8 VP1序列，位置1、26、40、43、44和64中任两个、三个、四个或五个处的氨基酸被修饰。

在一个实例中，本文所述的AAV可包括来自具有经修饰的VP1序列的AAV8的病毒衣壳蛋白，其中相对于SEQ ID NO：91中所示的相应野生型AAV8 VP1序列，位置1、26、40、43、44和64中的任何两个或更多个位置处的氨基酸被修饰。例如，相对于SEQ ID NO：91所示序列，经修饰的VP1序列可以包括选自A1S、A26E、Q40R、K43D、A44S和Q64K的两个或多个修饰。

在一个实例中，本文所述的AAV可包括来自具有经修饰的VP1序列的AAV8的病毒衣壳蛋白，其中相对于SEQ ID NO：91中所示的相应野生型AAV8 VP1位置1、26、40、43、44和64中任三个或多个处的氨基酸被修饰。例如，相对于SEQ ID NO：91所示的序列，经修饰的VP1序列可以包括选自A1S、A26E、Q40R、K43D、A44S和Q64K的三个或更多个修饰。

在一个实例中，本文所述的AAV可包括来自具有经修饰的VP1序列的AAV8的病毒衣壳蛋白，其中相对于SEQ ID NO：91中所示的相应野生型AAV8 VP1序列，位置1、26、40、43、44和64中的任何四个或更多个位置处的氨基酸被修饰。例如，相对于SEQ ID NO：91所示序列，经修饰的VP1序列可以包括选自A1S、A26E、Q40R、K43D、A44S和Q64K的四个或多个修饰。

在一个实例中，本文所述的AAV可包括来自具有经修饰的VP1序列的AAV8的病毒衣壳蛋白，其中相对于SEQ ID NO：91中所示的相应野生型AAV8 VP1位置1、26、40、43、44和64中任五个或多个处的氨基酸被修饰。例如，相对于SEQ ID NO：91所示的序列，经修饰的VP1序列可以包括选自A1S、A26E、Q40R、K43D、A44S和Q64K的五个或更多个修饰。

在一个实例中，本文所述的AAV可包括来自具有经修饰的VP1序列的AAV8的病毒衣壳蛋白，其中相对于SEQ ID NO：91中所示的相应野生型AAV8 VP1位置1、26、40、43、44和64处的氨基酸被修饰。例如，相对于SEQ ID NO：91所示序列，经修饰的VP1序列可包括以下修饰：A1S、A26E、Q40R、K43D、A44S和Q64K。例如，经修饰的AAV8 VP1序列可包括SEQ ID NO：92中所示的氨基酸序列。例如，相对于SEQ ID NO：93所示的相应全长野生型AAV8衣壳VP1序列，位置42、67、81、84、85和105处的残基被修饰(例如，相对于SEQ ID NO：93所示的序列，修饰A42S、A67E、Q81R、K84D、A85S和Q105K)。根据本实例，本发明的AAV可以包括来自AAV8的病毒衣壳蛋白，该病毒衣壳蛋白包括在SEQ ID NO：94中示出的经修饰的VP1序列。

在上述实施例的每一个中，病毒衣壳蛋白可包括来自与修饰的VP1相同的AAV血清型的亚单位2(VP2)和亚单位3(VP3)序列。优选VP1，VP1和VP3由同一ORF表达。

AAV基因组包括复制(Rep)基因，该基因是由病毒编码的蛋白质，其在病毒基因组的复制中起作用。因此，在一个实例中，本文所述的AAV包括至少一种选自Rep78和Rep68的大AAV Rep蛋白和至少一种选自Rep52和Rep40的小AAV Rep蛋白。在一个实例中，本文所述的AAV包括Rep78和Rep52。在一个实例中，本文所述的AAV包括Rep78和Rep40。在一个实例中，本文所述的AAV包括Rep68和Rep52。在一个实例中，本文所述的AAV包括Rep68和Rep40。在一个实例中，本文描述的AAV包括Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。在上述实例的每一个中，相应的小和大Rep蛋白可以来自与病毒衣壳蛋白相同的AAV血清型。或者，各个小Rep蛋白和大Rep蛋白可以来自不同于病毒衣壳蛋白的AAV血清型，例如，Rep蛋白可以来自AAV2。

如本文所述，AAV可用作基因治疗中的递送系统。例如，AAV可以包括包括编码目的蛋白或RNA的多核苷酸。如本文所述，本发明的AAV包括包括包括ddRNAi构建体和PABPN1构建体的多核苷酸序列。编码ddRNAi构建体和PABPN1构建体的多核苷酸可以侧接AAV反向末端重复(ITR)序列。在一个实例中，AAV ITR序列来自与病毒衣壳蛋白相同的血清型。在另一个实例中，AAV ITR序列来自不同于病毒衣壳蛋白的血清型。在一个特定实例中，ITR序列来自AAV血清型2。在另一特定实例中，ITR序列来自AAV血清型2并且包括SEQ ID NO：91和/或SEQ ID NO：92中示出的序列。

如上所述，编码目的蛋白或RNA的多核苷酸，包括侧翼ITR，通常长度为5,000个核苷酸(nt)或更短。然而，也可以考虑编码尺寸过大的DNA，即长度超过5,000nt的多核苷酸。尺寸过大的DNA在本文中被理解为超过5kbp的最大AAV包装限制的DNA。因此，本发明的AAV能够表达通常由大于5.0kb的基因组编码的蛋白质或RNA也是可行的。

如本文所述，本发明的AAV还包括并入其基因组中的多核苷酸序列，该多核苷酸序列包括用于在哺乳动物细胞中表达的ddRNAi构建体和PABPN1构建体。示例性ddRNAi构建体和PABPN1构建体在本文中描述(例如，在副标题“ddRNAi构建体”下)，并且应被视为加以必要的变更后适用于描述本发明的AAV的实例，除非另有具体说明。在这点上，本发明的AAV可以包括多核苷酸，该多核苷酸包括编码本文所述的命名为shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17的shmiR中的任一种或多种的ddRNAi构建体。然而，在特定实例中，本发明的AAV可包括包括编码shmiR13和/或shmiR17的ddRNAi构建体的多核苷酸，和包括编码功能性PABPN1蛋白的序列的多核苷酸构建体，功能性PABPN1蛋白是密码子优化的，使得其mRNA转录物不被ddRNAi构建体的shmiR靶向(例如，SEQ ID NO：73中所示的序列)。本文描述并考虑了编码shmiR13和shmiR17的示例性ddRNAi构建体。

在一个具体实例中，AAV包括：(a)来自AAV9的病毒衣壳蛋白，其包括相对于SEQ IDNO：87中所示的相应野生型序列具有修饰A1S、A26E、Q40R、K43D和A44S的经修饰的VP1序列(例如，包括SEQ ID NO：88中所示的序列的经修饰的VP1序列)；和(b)多核苷酸序列，其包括(i)包括核酸的ddRNAi构建体，核酸包括编码如本文所述的shmiR13和如本文所述的shmiR17的序列；以及(ii)包括核酸的PABPN1构建体，核酸包括编码功能性PABPN1蛋白的序列，功能性PABPN1蛋白具有不被ddRNAi构建体编码的shmiR靶向的mRNA转录物(例如，SEQID NO：73所示的密码子优化序列)。(b)的多核苷酸可侧接来自AAV2的AAV反向末端重复(ITR)序列，如SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：96所示。在一些实施方案中，ddRNAi构建体包括包括编码包括SEQ ID NO：31所示的效应子序列的shmiR的DNA序列和与SEQ ID NO：31所示的序列基本互补的效应子互补序列的核酸，例如，SEQ ID NO：30(shmiR13)所示的效应子互补序列或由其组成的核酸，以及包括编码shmiR的DNA序列的核酸，shmiR包括SEQ ID NO：39所示的效应子序列和与SEQ ID NO：39所示的序列基本互补的效应子互补序列，例如SEQ IDNO：38(shmiR17)所示的效应子互补序列或由其组成的核酸。例如，根据该实例的ddRNAi构建体可包括包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列组成的核酸，以及包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列组成的核酸。

在另一个具体实例中，AAV包括：(a)来自AAV8的病毒衣壳蛋白，其包括相对于SEQID NO：91中所示的相应野生型序列具有修饰A1S、A26E、Q40R、K43D、A44S和Q64K的经修饰的VP1序列(例如，包括SEQ ID NO：92中所示的序列的经修饰的VP1序列)；和(b)多核苷酸序列，其包括(i)包括核酸的ddRNAi构建体，核酸包括编码如本文所述的shmiR13和如本文所述的shmiR17的序列；以及(ii)包括核酸的PABPN1构建体，核酸包括编码功能性PABPN1蛋白的序列，功能性PABPN1蛋白具有不被ddRNAi构建体编码的shmiR靶向的mRNA转录物(例如，SEQ ID NO：73所示的密码子优化序列)。(b)的多核苷酸可侧接来自AAV2的AAV反向末端重复(ITR)序列，如SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：96所示。(b)的多核苷酸可侧接来自AAV2的AAV反向末端重复(ITR)序列，如SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：96所示。在一些实施方案中，ddRNAi构建体包括包括编码包括SEQ ID NO：31所示的效应子序列的shmiR的DNA序列和与SEQ ID NO：31所示的序列基本互补的效应子互补序列的核酸，例如，SEQ ID NO：30(shmiR13)所示的效应子互补序列或由其组成的核酸，以及包括编码shmiR的DNA序列的核酸，shmiR包括SEQ ID NO：39所示的效应子序列和与SEQ ID NO：39所示的序列基本互补的效应子互补序列，例如SEQ ID NO：38(shmiR17)所示的效应子互补序列或由其组成的核酸。例如，根据该实例的ddRNAi构建体可包括包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列组成的核酸，以及包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列组成的核酸。

在每个前述实例中，将编码ddRNAi构建体和PABPN1构建体的多核苷酸可操作地连接至适于在哺乳动物细胞中表达shmiR和PABPN1蛋白的一个或多个启动子。在一个实例中，启动子可以是肌肉特异性启动子。本文描述了合适的肌肉特异性启动子。

本发明的AAV可以包括一个选自Rep78和Rep68的大AAV Rep蛋白和至少一个选自Rep52和Rep40的小AAV Rep蛋白。

在这点上，AAV基因组包括Rep基因(即Rep78和Rep52)，在病毒基因组复制中起作用的蛋白。Rep ORF中的剪接事件导致4种Rep蛋白(即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)的表达。然而，已经显示编码Rep78和Rep52蛋白的未剪接mRNA在昆虫细胞中足以产生AAV载体(vector)。因此，在一个实例中，AAV包括一个选自Rep78和Rep68的大AAV复制Rep蛋白和至少一个选自Rep52和Rep40的小AAV Rep蛋白。在一个实例中，AAV包括Rep78和Rep52。在一个实例中，AAV包括Rep78和Rep40。在一个实例中，AAV包括Rep68和Rep52。在一个实例中，AAV包括Rep68和Rep40。在一个实例中，AAV包括Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。在上述实例的每一个中，相应的小和大Rep蛋白可以来自与病毒衣壳蛋白相同的AAV血清型。或者，各个小Rep蛋白和大Rep蛋白可以来自不同于病毒衣壳蛋白的AAV血清型，例如，Rep蛋白可以来自AAV血清型2。在这点上，Rep序列在大多数血清型中特别保守，并且已经报道Rep序列在昆虫细胞中有效地交叉补体。

可掺入任何核苷酸序列用于随后在用本发明的AAV转染的哺乳动物细胞中表达，只要构建体保持在AAV病毒体的包装容量内。

如本文所述，与包括相应野生型VP1序列的AAV相比，本文所述AAV在昆虫细胞中产生时可具有改善的功能。

用修饰的VP1制备AAV的方法和试剂

生产AAV的方法是本领域已知的。如所述，与包括相应野生型VP1序列的AAV相比，本发明的AAV在昆虫细胞中产生时具有改善的功能(例如，改善的内体逃逸活性)。因此，考虑了用于在昆虫细胞中产生AAV的方法和试剂。在一些实例中，可以使用昆虫细胞相容性载体(vector)，即杆状病毒载体(vector)，或产生本发明的AAV。

在一个实例中，本发明提供了用于在昆虫细胞中产生本发明的AAV的多种杆状病毒载体(vector)。多种杆状病毒载体(vector)可以包括：

(i)第一杆状病毒载体(vector)，其包括编码具有如本文所述的修饰的VP1序列的AAV病毒衣壳蛋白的核酸分子；以及

(ii)第二杆状病毒载体(vector)，其包括编码如本文所述的ddRNAi构建体和PABPN1构建体的多核苷酸，侧接为AAV反向末端重复(ITR)序列。

在一个实例中，AAV ITR序列来自与由第一杆状病毒载体(vector)内的核酸分子编码的病毒衣壳蛋白相同的血清型。在另一个实例中，AAV ITR序列来自另一种AAV血清型，例如AAV2。在一些实例中，ITR序列来自AAV血清型2并且包括SEQ ID NO：95和/或SEQ IDNO：96中示出的序列。

在一些实例中，AAV包括来自AAV9的衣壳蛋白，该AAV9包括如本文所述的经修饰的VP1。在其他实例中，AAV包括来自AAV8的衣壳蛋白，该AAV8包括如本文所述的经修饰的VP1。因此，第一杆状病毒载体(vector)可包括编码具有修饰VP1序列的AAV8或AAV9病毒衣壳蛋白的核酸分子。本文已经描述了包括来自AAV9或AAV8的衣壳蛋白的AAV的经修饰的VP1序列，并且除非另外特别说明，否则应被理解为加以必要的变更后适用于描述用于产生本发明的AAV的杆状病毒载体(vector)的本发明的实例。

如本文所述，第二杆状病毒载体(vector)包括编码一种或多种靶向PABPN1的shmiR的ddRNAi构建体。本文描述了靶向PABPN1的编码shmiR(包括shmiR的组合)的示例性ddRNAi构建体，并且除非另有具体说明，否则应被视为加以必要的变更后适用于描述用于产生本发明的AAV的杆状病毒载体(vector)的本发明的实例。在一个特定实例中，第二杆状病毒载体(vector)可以包括编码shmiR13和shmiR17的ddRNAi构建体，和包括编码功能性PABPN1蛋白的序列的多核苷酸构建体，功能性PABPN1蛋白是密码子优化的，使得其mRNA转录物不被ddRNAi构建体的shmiR靶向(例如，SEQ ID NO：73中所示的序列)。例如，第二杆状病毒载体(vector)可以包括ddRNAi构建体包括包括编码包括SEQ ID NO：31所示的效应子序列的shmiR的DNA序列和与SEQ ID NO：31所示的序列基本互补的效应子互补序列例如，SEQ ID NO：30(shmiR13)所示的效应子互补序列或由其组成的ddRNAi构建体，以及包括编码shmiR的DNA序列的核酸，shmiR包括SEQ ID NO：39所示的效应子序列和与SEQ ID NO：39所示的序列基本互补的效应子互补序列，例如SEQ ID NO：38(shmiR17)所示的效应子互补序列或由其组成的核酸。例如，第二杆状病毒载体(vector)可以包括ddRNAi构建体，该ddRNAi构建体包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列组成的核酸，以及包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由SEQ IDNO：68(shmiR17)所示的DNA序列组成的核酸。

在每个前述实例中，编码ddRNAi构建体和PABPN1构建体的多核苷酸可以可操作地连接至启动子。在一个实例中，启动子可以是肌肉特异性启动子。

类似地，编码AAV病毒衣壳蛋白的核酸分子可以可操作地连接至适于在昆虫细胞中表达衣壳蛋白的启动子。用于在昆虫细胞中表达的合适启动子是本领域已知的并且考虑用于本文。在这点上，先前已经描述了在昆虫细胞中分子工程和多肽表达的方法，例如，在Summers和Smith的《杆状病毒载体(vector)和昆虫培养方法手册》(A Manual of Methodsfor Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures)，Texas AgriculturalExperimental Station Bull.No.7555，College Station，Tex.(1986)；Luckow.，InProkop等人，《杆状病毒载体重组DNA技术在昆虫细胞中的克隆、表达及应用》(Cloning andExpression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors'Recombinant DNA Technology and Applications)，97-152(1991)；King,L.A和R.D.Possee，《杆状病毒表达系统》(The baculovirus expression system，Chapman andHall)，United Kingdom(1992)；O'Reilly，D.R.，L.K.Miller，V.A Luckow，《杆状病毒表达载体:实验室手册》(Baculovirus Expression Vectors:A Laboratory Manual)，New York(1992)；W.H.Freeman和Richardson，C.D.，《分子生物学中的杆状病毒表达方案，方法》(Baculovirus Expression Protocols，Methods in Molecular Biology)，第39卷(1992)；美国专利4,745,051；US2003148506；WO2003/074714号；Kotin RM(2011)《人类分子遗传学》(Hum.Mol.Genet.)，20(R1):R2-R6；Aucoin等人，(2006)《生物技术与生物工程》(Biotechnol.Bioeng.)95(6):1081-1092；以及van Oers等人，(2015)《普通病毒学杂志》(J.Gen.Virol.)96:6-23。清楚地考虑将本领域已知的启动子和其它此类调节元件用于本发明的核酸中。在一些实施方案中，启动子是多面体启动子(polyhedron promoter)或p10启动子。

根据其中第一杆状病毒载体(vector)不编码AAV Rep蛋白的实例，多种杆状病毒载体(vector)进一步包括：

(iii)第三杆状病毒载体(vector)，其包括编码选自Rep78和Rep68的至少一种大AAV Rep蛋白和选自Rep52和Rep40的至少一种小AAV Rep蛋白的多核苷酸序列。

在这点上，AAV基因组包括Rep基因(即Rep78和Rep52)，在病毒基因组复制中起作用的蛋白。Rep ORF中的剪接事件导致4种Rep蛋白(即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)的表达。然而，已经显示编码Rep78和Rep52蛋白的未剪接mRNA在昆虫细胞中足以产生AAV载体(vector)。因此，在一个实例中，第三杆状病毒载体(vector)，其包括编码选自Rep78和Rep68的至少一种大AAV复制Rep蛋白和选自Rep52和Rep40的至少一种小AAV Rep蛋白的多核苷酸序列。在一个实例中，第三杆状病毒载体(vector)包括编码Rep78和Rep52的多核苷酸序列。在一个实例中，第三杆状病毒载体(vector)包括编码Rep78和Rep40的多核苷酸序列。在一个实例中，第三杆状病毒载体(vector)包括编码Rep68和Rep52的多核苷酸序列。在一个实例中，第三杆状病毒载体(vector)包括编码Rep68和Rep40的多核苷酸序列。在一个实例中，第三杆状病毒载体(vector)包括编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40的多核苷酸序列。在上述实例的每一个中，相应的小和大Rep蛋白可以来自与病毒衣壳蛋白相同的AAV血清型。或者，各个小Rep蛋白和大Rep蛋白可以来自不同于病毒衣壳蛋白的AAV血清型，例如，Rep蛋白可以来自AAV血清型2。在这点上，Rep序列在大多数血清型中特别保守，并且已经报道Rep序列在昆虫细胞中有效地交叉补体。

在描述多种杆状病毒载体(vector)的前述实施例的每一个中，编码第三杆状病毒载体(vector)内的Rep蛋白的多核苷酸序列可以可操作地连接到用于在昆虫细胞中表达Rep蛋白的启动子上。用于在昆虫细胞中表达的合适启动子是本领域已知的并且考虑用于本文。在一个具体实例中，启动子可以是例如多面体启动子或p10启动子。编码各Rep蛋白的核苷酸序列可以与同一启动子可操作地连接。或者，编码Rep蛋白的每个序列可与它自己的启动子可操作地连接。

多种杆状病毒载体(vector)中的至少一个将包括编码AAV衣壳装配所需的装配-活化蛋白(AAP)的多核苷酸。在一个实例中，编码衣壳蛋白的杆状病毒载体(vector)包括编码AAP的多核苷酸。在替代实例中，编码Rep蛋白的杆状病毒和/或编码ddRNAi构建体和PABPN1构建体的杆状病毒包括编码AAP的多核苷酸。

生产适用于基因治疗的AAV的方法(例如，不能复制AAV)是本领域熟知的并且在本文中考虑。例如，AAV可以使用杆状病毒系统在昆虫细胞中产生，例如，如US20120028357 A1、WO2007046703、US20030148506 A1,WO2017184879、US20040197895 A1和WO2007148971中描述，其内容通过引用并入本文。重组AAV也可以在哺乳动物细胞(粘附细胞和悬浮细胞)中产生，其方法描述于WO2015031686、WO2009097129、WO2007127264、WO1997009441和WO2001049829中，其内容通过引用并入本文。生产用于基因治疗的重组AAV的方法也描述于以下文献，Berns KI和Giraud C(1996)腺相关病毒生物学(Biology of adeno-associatedvirus.)Curr Top Microbiol Immunol 218:1-23，Snyder和Flotte(2002)Curr.Opin.Biotechnol.，13:418–423，以及Synder RO和Moullier P,《腺相关病毒：方法和实验指南》(Adeno-associated virus；methods and protocols).New York:Humana Press(2011)，其内容通过引用并入本文。

ddRNAi构建体

如本文所述，本发明的AAV包括DNA指导的RNAi(ddRNAi)构建体，其包括编码短发夹微小RNA(shmiR)的DNA序列。由ddRNAi构建体编码的shmiR包括：

长度至少17个核苷酸的效应子序列；

效应子互补序列；

茎环序列；以及

初级微小RNA(pri-miRNA)骨架。

在一个实例中，效应子序列与SEQ ID NO：1-13中任一个所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。优选地，效应子序列的长度小于30个核苷酸。例如，合适的效应子序列的长度可以在17-29个核苷酸的范围内。在特别优选的实例中，效应子序列长度为21个核苷酸。更优选效应子序列长度为21个核苷酸，效应子互补序列长度为20个核苷酸。

在某些实施方案中，由ddRNAi构建体编码的shmiR包括与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补的效应子序列，RNA转录物包括SEQ ID NO：1-13(即SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13)中任一个所示的序列或由其中任一个所示的序列组成。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列或由SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含4个错配碱基。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列或由SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含3个错配碱基。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列或由SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含2个错配碱基。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列或由SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含1个错配碱基。例如，效应子序列可以与包括SEQ ID NO：1-13任一个所示序列或由SEQ ID NO：1-13任一个所示序列组成的RNA转录物中的相应长度的区域100％互补。

在一个实例中，由ddRNAi构建体编码的shmiR包括与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补的效应子序列，RNA转录物包括SEQ ID NO：9所示的序列或由SEQ ID NO：9所示的序列组成。根据本实例的shmiR在本文中也称为“shmiR13”。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：9所示的序列或由SEQ ID NO：9所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含4个错配碱基。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：9所示的序列或由SEQ ID NO：9所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含3个错配碱基。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：9所示的序列或由SEQ ID NO：9所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含2个错配碱基。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：9所示的序列或由SEQ ID NO：9所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含1个错配碱基。例如，效应子序列可以与包括SEQ ID NO：9所示序列或由SEQ ID NO：9所示序列组成的RNA转录物中的相应长度的区域100％互补。

在一个实例中，由ddRNAi构建体编码的shmiR包括与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补的效应子序列，RNA转录物包括SEQ ID NO：13所示的序列或由SEQ ID NO：13所示的序列组成。根据本实例的shmiR在本文中也称为“shmiR17”。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：13所示的序列或由SEQ ID NO：13所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含4个错配碱基。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：13所示的序列或由SEQ ID NO：13所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含3个错配碱基。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：13所示的序列或由SEQ ID NO：13所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含2个错配碱基。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：13所示的序列或由SEQ ID NO：13所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含1个错配碱基。例如，效应子序列可以与包括SEQ ID NO：13所示序列或由SEQ ID NO：13所示序列组成的RNA转录物中的相应长度的区域100％互补。

根据一个实例，其中shmiR的效应子序列与本文所述的PABPN1 miRNA转录物中的相应长度的区域基本上互补并且相对于其包括1、2、3或4个错配碱基，优选错配不位于对应于shmiR种子区，即效应子序列的第2-8位核苷酸的区域内。

在一些实例中，ddRNAi构建体可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：14所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：14所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由ddRNAi构建体编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：15所示的效应子序列和与SEQ ID NO：15所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：15所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：14所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR2”。

在一个实例中，ddRNAi构建体可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：16所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：16所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由ddRNAi构建体编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：17所示的效应子序列和与SEQ ID NO：17所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：17所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：16所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR3”。

在一个实例中，ddRNAi构建体可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：18所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：18所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由ddRNAi构建体编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：19所示的效应子序列和与SEQ ID NO：19所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：19所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：18所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR4”。

在一个实例中，ddRNAi构建体可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：20所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：20所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由ddRNAi构建体编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：21所示的效应子序列和与SEQ ID NO：21所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：21所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：20所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR5”。

在一个实例中，ddRNAi构建体可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：22所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：22所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由ddRNAi构建体编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：23所示的效应子序列和与SEQ ID NO：23所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：23所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：22所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR6”。

在一个实例中，ddRNAi构建体可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：24所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：24所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由ddRNAi构建体编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：25所示的效应子序列和与SEQ ID NO：25所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：25所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：24所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR7”。

在一个实例中，ddRNAi构建体可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：26所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：26所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由ddRNAi构建体编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：27所示的效应子序列和与SEQ ID NO：27所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：27所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：26所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR9”。

在一个实例中，ddRNAi构建体可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：28所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：28所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由ddRNAi构建体编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：29所示的效应子序列和与SEQ ID NO：29所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：29所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：28所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR11”。

在一个实例中，ddRNAi构建体可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：30所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：30所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由ddRNAi构建体编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：31所示的效应子序列和与SEQ ID NO：31所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：31所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：30所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR13”。

在一个实例中，ddRNAi构建体可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：32所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：32所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由ddRNAi构建体编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：33所示的效应子序列和与SEQ ID NO：33所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：33所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：32所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR14”。

在一个实例中，ddRNAi构建体可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：34所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：34所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由ddRNAi构建体编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：35所示的效应子序列和与SEQ ID NO：35所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：35所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：34所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR15”。

在一个实例中，ddRNAi构建体可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：36所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：36所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由ddRNAi构建体编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：37所示的效应子序列和与SEQ ID NO：37所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：37所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：36所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR16”。

在一个实例中，ddRNAi构建体可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：38所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：38所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由ddRNAi构建体编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：39所示的效应子序列和与SEQ ID NO：39所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：39所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：38所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR17”。

在本文所述的任何实例中，由本发明的ddRNAi构建体编码的shmiR可以在5'至3'方向包括：

pri-miRNA骨架的5'侧翼序列；

效应子互补序列；

茎环序列；

效应子序列；以及

pri-miRNA骨架的3'侧翼序列。

在本文所述的任何实例中，由本发明的ddRNAi构建体编码的shmiR可以在5'至3'方向包括：

pri-miRNA骨架的5'侧翼序列；

效应子序列；

茎环序列；

效应子互补序列；以及

pri-miRNA骨架的3'侧翼序列。

合适的环序列可以选自本领域已知的那些。然而，示例性茎环序列在SEQ ID NO：40中示出。

用于本发明的核酸的合适的初级微小RNA(pri-miRNA或pri-R)骨架可选自本领域已知的那些。例如，pri-miRNA骨架可选自pri-miR-30a骨架、pri-miR-155骨架、pri-miR-21骨架和pri-miR-136骨架。然而优选pri-miRNA骨架为pri-miR-30a骨架。根据pri-miRNA骨架是pri-miR-30a骨架的实例，pri-miRNA骨架的5'侧翼序列在SEQ ID NO：41中示出，pri-miRNA骨架的3'侧翼序列在SEQ ID NO：42中示出。因此，编码本发明的shmiR(例如，本文所述的shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11和shmiR13-shmiR17的一种或多种)的ddRNAi构建体可包括编码SEQ ID NO：41所示序列的DNA序列和编码SEQ ID NO：42所示序列的DNA序列。

在一个实例中，ddRNAi构建体可包括选自SEQ ID NO：56-68中任一个所示序列的DNA序列。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括SEQ ID NO：56所示的DNA序列或由SEQ ID NO：56所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：43所示的序列或由SEQ ID NO：43所示的序列组成的shmiR(shmiR2)。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括SEQ ID NO：57所示的DNA序列或由SEQ ID NO：57所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：44所示的序列或由SEQ ID NO：44所示的序列组成的shmiR(shmiR3)。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括SEQ ID NO：58所示的DNA序列或由SEQ ID NO：58所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：45所示的序列或由SEQ ID NO：45所示的序列组成的shmiR(shmiR4)。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括SEQ ID NO：59所示的DNA序列或由SEQ ID NO：59所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：46所示的序列或由SEQ ID NO：46所示的序列组成的shmiR(shmiR5)。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括SEQ ID NO：60所示的DNA序列或由SEQ ID NO：60所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：47所示的序列或由SEQ ID NO：47所示的序列组成的shmiR(shmiR6)。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括SEQ ID NO：61所示的DNA序列或由SEQ ID NO：61所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：48所示的序列或由SEQ ID NO：48所示的序列组成的shmiR(shmiR7)。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括SEQ ID NO：62所示的DNA序列或由SEQ ID NO：62所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：49所示的序列或由SEQ ID NO：49所示的序列组成的shmiR(shmiR9)。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括SEQ ID NO：63所示的DNA序列或由SEQ ID NO：63所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：50所示的序列或由SEQ ID NO：50所示的序列组成的shmiR(shmiR11)。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括SEQ ID NO：64所示的DNA序列或由SEQ ID NO：64所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：51所示的序列或由SEQ ID NO：51所示的序列组成的shmiR(shmiR13)。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括SEQ ID NO：65所示的DNA序列或由SEQ ID NO：65所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：52所示的序列或由SEQ ID NO：52所示的序列组成的shmiR(shmiR14)。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括SEQ ID NO：66所示的DNA序列或由SEQ ID NO：66所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：53所示的序列或由SEQ ID NO：53所示的序列组成的shmiR(shmiR15)。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括SEQ ID NO：67所示的DNA序列或由SEQ ID NO：67所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：54所示的序列或由SEQ ID NO：54所示的序列组成的shmiR(shmiR16)。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括SEQ ID NO：68所示的DNA序列或由SEQ ID NO：68所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：55所示的序列或由SEQ ID NO：55所示的序列组成的shmiR(shmiR17)。

本发明的示例性ddRNAi构建体编码选自本文所述的shmiR2、shmiR3、shmiR5、shmiR9、shmiR13、shmiR14和shmiR17的一种或多种shmiR。特别优选编码本文所述的选自shmiR3、shmiR13、shmiR14和shmiR17的一种或多种shmiR的ddRNAi构建体。例如，ddRNAi构建体可以编码如本文所述的shmiR13。例如，ddRNAi构建体可以编码如本文所述的shmiR17。

本领域技术人员应理解，本文所述的ddRNAi构建体可编码靶向对应于导致OPMD的PABPN1蛋白的RNA转录物的多个shmiR。

因此，在一个实例中，ddRNAi构建体包括两种或更多种编码本文所述的shmiR的核酸，例如两种、或三种、或四种、或五种、或六种、或七种、或八种、或九种、或十种编码本文所述shmiR的核酸。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括含有编码shmiR2的DNA序列或由编码shmiR2的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR2的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：56所示的DNA序列或由SEQ ID NO：56所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ IDNO：43所示的序列或由SEQ ID NO：43所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR。例如，ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ IDNO：56(shmiR2)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：56(shmiR2)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR3-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR3-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一的DNA序列组成的核酸。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括含有编码shmiR3的DNA序列或由编码shmiR3的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR3的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：57所示的DNA序列或由SEQ ID NO：57所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ IDNO：44所示的序列或由SEQ ID NO：44所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR。例如，ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ IDNO：57(shmiR3)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2、shmiR4-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2、shmiR4-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一的DNA序列组成的核酸。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括含有编码shmiR4的DNA序列或由编码shmiR4的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR4的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：58所示的DNA序列或由SEQ ID NO：58所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ IDNO：45所示的序列或由SEQ ID NO：45所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR。例如，ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ IDNO：58(shmiR4)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：58(shmiR4)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2、shmiR3、shmiR5-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2、shmiR3、shmiR5-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一的DNA序列组成的核酸。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括含有编码shmiR5的DNA序列或由编码shmiR5的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR5的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：59所示的DNA序列或由SEQ ID NO：59所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ IDNO：46所示的序列或由SEQ ID NO：46所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR。例如，ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ IDNO：59(shmiR5)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：59(shmiR5)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR4、shmiR6-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR4、shmiR6-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一的DNA序列组成的核酸。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括含有编码shmiR6的DNA序列或由编码shmiR6的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR6的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：60所示的DNA序列或由SEQ ID NO：60所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ IDNO：47所示的序列或由SEQ ID NO：47所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR。例如，ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ IDNO：60(shmiR6)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：60(shmiR6)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2、shmiR5-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2、shmiR5-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一的DNA序列组成的核酸。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括含有编码shmiR7的DNA序列或由编码shmiR7的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR7的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：61所示的DNA序列或由SEQ ID NO：61所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ IDNO：48所示的序列或由SEQ ID NO：48所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR。例如，ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ IDNO：61(shmiR7)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：61(shmiR7)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR6、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR6、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一的DNA序列组成的核酸。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括含有编码shmiR9的DNA序列或由编码shmiR9的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR9的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：62所示的DNA序列或由SEQ ID NO：62所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ IDNO：49所示的序列或由SEQ ID NO：49所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR。例如，ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ IDNO：62(shmiR9)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：62(shmiR9)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一的DNA序列组成的核酸。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括含有编码shmiR11的DNA序列或由编码shmiR11的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR11的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：63所示的DNA序列或由SEQ ID NO：63所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ IDNO：50所示的序列或由SEQ ID NO：50所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR。例如，ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ IDNO：63(shmiR11)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：63(shmiR11)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9或shmiR13-shmiR17之一的DNA序列组成的核酸。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括含有编码shmiR13的DNA序列或由编码shmiR13的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR13的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：64所示的DNA序列或由SEQ ID NO：64所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ IDNO：51所示的序列或由SEQ ID NO：51所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR。例如，ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ IDNO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR14-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR14-shmiR17之一的DNA序列组成的核酸。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括含有编码shmiR14的DNA序列或由编码shmiR14的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR14的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：65所示的DNA序列或由SEQ ID NO：65所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ IDNO：52所示的序列或由SEQ ID NO：52所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR。例如，ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ IDNO：65(shmiR14)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13、shmiR15-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13、shmiR15-shmiR17之一的DNA序列组成的核酸。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括含有编码shmiR15的DNA序列或由编码shmiR15的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR15的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：66所示的DNA序列或由SEQ ID NO：66所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ IDNO：53所示的序列或由SEQ ID NO：53所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR。例如，ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ IDNO：66(shmiR15)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：66(shmiR15)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR14或shmiR16-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR14或shmiR16-shmiR17之一的DNA序列组成的核酸。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括含有编码shmiR16的DNA序列或由编码shmiR16的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR16的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：67所示的DNA序列或由SEQ ID NO：67所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ IDNO：54所示的序列或由SEQ ID NO：54所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR。例如，ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ IDNO：67(shmiR16)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：67(shmiR16)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR15、或shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR15、或shmiR17之一的DNA序列组成的核酸。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括含有编码shmiR17的DNA序列或由编码shmiR17的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR17的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：68所示的DNA序列或由SEQ ID NO：68所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ IDNO：55所示的序列或由SEQ ID NO：55所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR。例如，ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ IDNO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR16之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR16之一的DNA序列组成的核酸。

根据其中ddRNAi构建体编码多个shmiR的一个实例，shmiR中的至少一个包括与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补的效应子序列，RNA转录物包括SEQ ID NO：1所示的序列或由SEQ ID NO：1所示的序列组成。本文针对shmiR2描述了编码具有效应子序列的shmiR的合适核酸，效应子序列与包括SEQ ID NO：1所示序列或由SEQ ID NO：1所示序列组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。

根据其中ddRNAi构建体编码多个shmiR的一个实例，shmiR中的至少一个包括与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补的效应子序列，RNA转录物包括SEQ ID NO：2所示的序列或由SEQ ID NO：2所示的序列组成。本文针对shmiR3描述了编码具有效应子序列的shmiR的合适核酸，效应子序列与包括SEQ ID NO：2所示序列或由SEQ ID NO：2所示序列组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。

根据其中ddRNAi构建体编码多个shmiR的一个实例，shmiR中的至少一个包括与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补的效应子序列，RNA转录物包括SEQ ID NO：4所示的序列或由SEQ ID NO：4所示的序列组成。本文针对shmiR5描述了编码具有效应子序列的shmiR的合适核酸，效应子序列与包括SEQ ID NO：4所示序列或由SEQ ID NO：4所示序列组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。

根据其中ddRNAi构建体编码多个shmiR的一个实例，shmiR中的至少一个包括与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补的效应子序列，RNA转录物包括SEQ ID NO：7所示的序列或由SEQ ID NO：7所示的序列组成。本文针对shmiR9描述了编码具有效应子序列的shmiR的合适核酸，效应子序列与包括SEQ ID NO：7所示序列或由SEQ ID NO：7所示序列组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。

根据其中ddRNAi构建体编码多个shmiR的一个实例，shmiR中的至少一个包括与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补的效应子序列，RNA转录物包括SEQ ID NO：9所示的序列或由SEQ ID NO：9所示的序列组成。本文针对shmiR13描述了编码具有效应子序列的shmiR的合适核酸，效应子序列与包括SEQ ID NO：9所示序列或由SEQ ID NO：9所示序列组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。

根据其中ddRNAi构建体编码多个shmiR的一个实例，shmiR中的至少一个包括与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补的效应子序列，RNA转录物包括SEQ ID NO：10所示的序列或由SEQ ID NO：10所示的序列组成。本文针对shmiR14描述了编码具有效应子序列的shmiR的合适核酸，效应子序列与包括SEQ ID NO：10所示序列或由SEQ ID NO：10所示序列组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。

根据其中ddRNAi构建体编码多个shmiR的一个实例，shmiR中的至少一个包括与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补的效应子序列，RNA转录物包括SEQ ID NO：13所示的序列或由SEQ ID NO：13所示的序列组成。本文针对shmiR17描述了编码具有效应子序列的shmiR的合适核酸，效应子序列与包括SEQ ID NO：13所示序列或由SEQ ID NO：13所示序列组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。

本发明的多个shmiR的示例性ddRNAi构建体包括至少两种核酸，每种核酸包括编码本发明的shmiR的DNA序列，其中每种shmiR包括不同的效应子序列。

在一个实例中，至少两种核酸中编码包括与SEQ ID NO：1、2、4、7、9、10和13之一所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列的shmiR。本文描述了编码包括效应子序列的shmiR的本发明的示例性核酸，效应子序列与SEQ ID NO：1、2、4、7、9、10和13所示的RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括选自以下组成的组的至少两种核酸：

包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：15所示的效应子序列和SEQ ID NO：14所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：56(shmiR2)所示的DNA序列或由其组成的核酸；

包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：17所示的效应子序列和SEQ ID NO：16所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列或由其组成的核酸；

包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：21所示的效应子序列和SEQ ID NO：20所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：59(shmiR5)所示的DNA序列或由其组成的核酸；

包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：27所示的效应子序列和SEQ ID NO：26所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：62(shmiR9)所示的DNA序列或由其组成的核酸；

包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：31所示的效应子序列和SEQ ID NO：30所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由其组成的核酸；

包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：33所示的效应子序列和SEQ ID NO：32所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列或由其组成的核酸；以及

包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：39所示的效应子序列和SEQ ID NO：38所示的效应子互补序列，例如，包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由其组成的核酸。

在一个实例中，ddRNAi构建体中至少两种核酸中的每一种均编码包括与SEQ IDNO：2、9、10和13之一所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列的shmiR。本文描述了编码包括效应子序列的shmiR的示例性核酸，效应子序列与SEQ ID NO：2、9、10和13所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括选自以下组成的组的至少两种核酸：

包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：17所示的效应子序列和SEQ ID NO：16所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列或由其组成的核酸；

包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：31所示的效应子序列和SEQ ID NO：30所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由其组成的核酸；

包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：33所示的效应子序列和SEQ ID NO：32所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列或由其组成的核酸；以及

包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：39所示的效应子序列和SEQ ID NO：38所示的效应子互补序列，例如，包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由其组成的核酸。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括编码shmiR的核酸，该shmiR包括与SEQ ID NO：9所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列，和编码shmiR的核酸，该shmiR包括与SEQ ID NO：13所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。例如，ddRNAi构建体可包括：

(a)包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：31所示的效应子序列和SEQ ID NO：30所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由其组成的核酸；以及

(b)包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：39所示的效应子序列和SEQ ID NO：38所示的效应子互补序列，例如，包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由其组成的核酸。

本发明的示例性ddRNAi构建体包括包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列组成的核酸和包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列组成的核酸。

在一个实例中，ddRNAi构建体包括编码shmiR的核酸，该shmiR包括与SEQ ID NO：2所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列，和编码shmiR的核酸，该shmiR包括与SEQ ID NO：10所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。例如，ddRNAi构建体可包括：

(a)包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：17所示的效应子序列和SEQ ID NO：16所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列或由其组成的核酸；以及

(b)包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：33所示的效应子序列和SEQ ID NO：32所示的效应子互补序列，例如，包括SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的序列或由其组成的核酸。

本发明的示例性ddRNAi构建体包括包括SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列组成的核酸和包括SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列组成的核酸。

根据本发明的ddRNAi构建体编码两种或更多种shmiR的实例，编码shmiR的核酸中的两种或更多种可形成ddRNAi构建体中相同多核苷酸的单独部分。

在一些实例中，编码shmiR的核酸或每种编码shmiR的核酸可包括另外的元件，或与另外的元件可操作地连接，例如，以促进shmiR的转录。例如，ddRNAi构建体可包括可操作地连接至编码本文所述shmiR的序列的一个或多个启动子。其他元件，例如转录终止子和起始子，是本领域已知的和/或本文描述的。

在描述本发明内容的ddRNAi构建体的每种前述实例中，编码shmiR的核酸或每种核酸可操作地连接至启动子。例如，如本文所述的ddRNAi构建体可包括单一启动子，其可操作地连接至包括于其中的编码shmiR的核酸或每种核酸，例如，以驱动来自ddRNAi构建体的一种或多种shmiR的表达。在另一个实例中，包括在ddRNAi构建体中的编码shmiR的每种核酸与单独的启动子可操作地连接。

根据存在多个启动子的实例，启动子可以相同或不同。例如，构建体可以包括相同启动子的多个拷贝，每种拷贝与本发明的不同核酸可操作地连接。在另一个实例中，与本发明的编码shmiR的核酸可操作地连接的每个启动子是不同的。例如，在编码两种shmiR的ddRNAi构建体中，编码shmiR的两种核酸各自与不同的启动子可操作地连接。

在一个实例中，启动子是组成型启动子。当涉及启动子时，术语“组成型”意指启动子能够在不存在特定刺激(例如热休克、化学品、光等)的情况下指导可操作连接的核酸序列的转录。通常，组成型启动子能够指导编码序列在基本上任何细胞和任何组织中的表达。用于转录shmiR的启动子包括泛素、CMV、β-肌动蛋白、组蛋白H4、EF-1α或由RNA聚合酶II控制的pgk基因的启动子、或由RNA聚合酶I控制的启动子元件。

在一个实例中，使用Pol II启动子如CMV、SV40、U1、β-肌动蛋白或杂交Pol II启动子。其他合适的Pol II启动子是本领域已知的并且可根据本发明的该实例使用。例如，在表达pri-miRNA的本发明的ddRNAi构建体中，Pol II启动子系统可以是优选的，pri-miRNA在酶Drosha和Pasha的作用下被加工成一种或多种shmiR。在包括编码在单一启动子控制下的多种shmiR的序列的本发明的ddRNAi构建体中，Pol II启动子系统也可以是优选的。在需要组织特异性的情况下，Pol II启动子系统也可以是期望的。

在另一个实例中，使用由RNA聚合酶III控制的启动子，例如U6启动子(U6-1、U6-8、U6-9)、H1启动子、7SL启动子、人Y启动子(hY1,hY3,hY4(参见Maraia等人，《核酸研究》(Nucleic Acids Res)22(15)：3045-52(1994))和hY5(参见Maraia等人，《核酸研究》(Nucleic Acids Res)24(18)：3552-59(1994))、人MRP-7-2启动子、腺病毒VA1启动子、人tRNA启动子、或5s核糖体RNA启动子。

美国专利8,008,468号和美国专利8,129,510号中描述了用于本发明的ddRNAi构建体的适合的启动子。

在一个实例中，启动子是RNA Pol III启动子。例如，启动子是U6启动子(例如，U6-1、U6-8或U6-9启动子)。在另一个实例中，启动子是H1启动子。

在编码多种shmiR的本发明的ddRNAi构建体的情况下，ddRNAi构建体中的每种核酸可操作地连接至U6启动子，例如单独的U6启动子。

在一个实例中，ddRNAi构建体中的启动子是U6启动子。例如，启动子可以是U6-1启动子。例如，启动子可以是U6-8启动子。例如，启动子可以是U6-9启动子。

在一些实例中，使用具有可变强度的启动子。例如，使用两种或更多种强启动子(例如Pol III型启动子)可通过，例如去除转录所需的可用核苷酸或其他细胞组分的汇集而使细胞死亡。此外，或可替代地，使用几种强启动子可以引起细胞中shmiR的表达的毒性水平。因此，在一些实例中，多启动子ddRNAi构建体中的一个或多个启动子弱于构建体中的其他启动子，或者构建体中的所有启动子可以以小于最大速率的速率表达shmiR。还可以使用各种分子技术修饰启动子，或者通过修饰各种调节元件修饰启动子，以获得较弱水平或较强水平的转录。实现降低的转录的一种方法是修饰已知控制启动子活性的启动子内的序列元件。例如，已知近端序列元件(PSE)影响人U6启动子的活性(参见Domitrovich等人，《核酸研究》(Nucleic Acids Res)，31：2344-2352(2003))。用来自弱启动子如人U6-7启动子的元件替代存在于强启动子如人U6-1、U6-8或U6-9启动子中的PSE元件，降低了杂合U6-1、U6-8或U6-9启动子的活性。在本申请中描述的示例中使用了该方法，但是实现该结果的其他手段在本领域中是已知的。

可用于本发明的ddRNAi构建体的启动子也可以是组织特异性的或细胞特异性的。当应用于启动子时，术语“组织特异性的”是指在不同类型的组织(例如，肝)中相对缺乏目的相同核苷酸序列的表达时，能够引导目的核酸在特定类型的组织(例如，眼睛或肌肉的组织)中选择性转录的启动子。应用于启动子时，术语“细胞特异性的”是指在相同组织内不同类型细胞中相对缺乏相同目的核苷酸序列表达时，能够指导目的核酸在特定类型细胞中选择性转录的启动子。根据一个实例，使用肌肉特异性启动子，例如Spc512或CK8。然而，其他肌肉特异性启动子是本领域已知的并且预期与本发明的ddRNAi构建体结合使用。

在一个实例中，本发明的ddRNAi构建体可另外包括一种或多种增强子以增加由本文所述的shmiR的表达。适用于本发明的实例的增强子包括Apo E HCR增强子，CMV增强子(Xia等人，《核酸研究》(Nucleic Acids Res)，31-17(2003))和本领域技术人员已知的其他增强子。美国专利8,008,468号中描述了用于本发明的ddRNAi构建体中的适合的增强子。

在另一个实例中，本发明的ddRNAi构建体可包括与编码本发明的shmiR的核酸连接的转录终止子。在包括本文所述的多种核酸(即编码多种shmiR)的ddRNAi构建体的情况下，连接至每种核酸的终止子可以相同或不同。例如，在使用RNA pol III启动子的本发明的ddRNAi构建体中，终止子可以是4个或更多个或5个或更多个或6个或更多个T残基的连续片段。然而，当使用不同的启动子时，终止子可以不同并且与来自产生终止子的基因的启动子匹配。这些终止子包括，但不限于SV40聚腺苷酸、AdV VA1基因、5S核糖体RNA基因和人t-RNA的终止子。其他启动子和终止子组合是本领域已知的并且预期用于本发明的ddRNAi构建体中。

此外，启动子和终止子可以混合并匹配，如通常使用RNA pol II启动子和终止子所进行的。

在一个实例中，用于包括多种核酸的ddRNAi构建体中的每种核酸的启动子和终止子组合是不同的，以降低组分之间的DNA重组事件的可能性。

本发明的一个示例性ddRNAi构建体包括包括与启动子可操作连接的由本文所述的编码shmiR13的DNA序列的核酸或由其组成的核酸和包括与启动子可操作连接的由本文所述的编码shmiR17的DNA序列的核酸或由其组成的核酸。例如，本发明的示例性ddRNAi构建体包括包括与启动子可操作连接的SEQ ID NO：64所示的DNA序列的核酸或由其组成的核酸和包括与启动子可操作连接的SEQ ID NO：68所示的DNA序列的核酸或由其组成的核酸。在一个实例中，编码shmiR的ddRNAi构建体中的每种核酸与单独的启动子可操作地连接。在另一个实例中，编码shmiR的ddRNAi构建体中的每种核酸与相同的启动子可操作地连接。例如，启动子或每个启动子可以是U6启动子，例如，U6-1、U6-8或U6-9启动子。例如，启动子或每个启动子可以是肌肉特异性启动子，例如，Spc512或CK8启动子。

根据其中编码shmiR13和shmiR17的ddRNAi构建体中的核酸可操作地连接至相同Spc512启动子的一个实例，ddRNAi构建体包括SEQ ID NO：72所示的DNA序列或由SEQ IDNO：72所示的DNA序列组成。根据其中编码shmiR13和shmiR17的ddRNAi构建体中的核酸可操作地连接至相同CK8启动子的实例，ddRNAi构建体包括SEQ ID NO：70所示的DNA序列或由SEQ ID NO：70所示的DNA序列组成。

本发明的另一个示例性ddRNAi构建体包括包括与启动子可操作连接的由本文所述的编码shmiR3的DNA序列或由其组成的核酸和包括与启动子可操作连接的由本文所述的编码shmiR14的DNA序列或由其组成的核酸。例如，本发明的示例性ddRNAi构建体包括包括与启动子可操作连接的SEQ ID NO：57所示的DNA序列的核酸或由其组成的核酸和包括与启动子可操作连接的SEQ ID NO：65所示的DNA序列的核酸或由其组成的核酸。在一个实例中，编码shmiR的ddRNAi构建体中的每种核酸与单独的启动子可操作地连接。在另一个实例中，编码shmiR的ddRNAi构建体中的每种核酸与相同的启动子可操作地连接。例如，启动子或每个启动子可以是U6启动子，例如，U6-1、U6-8或U6-9启动子。例如，启动子或每个启动子可以是肌肉特异性启动子，例如，Spc512或CK8启动子。

根据其中编码shmiR3和shmiR14的ddRNAi构建体中的核酸可操作地连接至相同Spc512启动子的实例，ddRNAi构建体包括SEQ ID NO：71所示的DNA序列或由SEQ ID NO：71所示的DNA序列组成。根据其中编码shmiR3和shmiR14的ddRNAi构建体中的核酸可操作地连接至相同CK8启动子的实例，ddRNAi构建体包括SEQ ID NO：69所示的DNA序列或由SEQ IDNO：69所示的DNA序列组成。

此外，ddRNAi构建体可包括一个或多个多克隆位点和/或位于策略上的独特限制性位点，使得启动子、编码shmiR的核酸和/或其他调控元件易于移除或替代。该ddRNAi构建体可以使用策略性定位的限制性位点和/或互补粘性末端从较小的寡核苷酸组分组装。用于根据本发明的一种方法的基础载体(vector)包括具有多链接体的质粒，其中所有位点是独特的(尽管这不是绝对要求)。依次地，将每个启动子插入其指定的独特位点之间，产生具有一个或多个启动子的碱基盒，所有这些可以具有可变的方向。依次地，再次将退火的引物对插入每种单独启动子下游的独特位点，产生单、双或多表达盒构建体。可以使用在单、双或多表达盒插入物侧翼的两个独特的限制性酶切位点(相同的或不同的酶切位点)将插入物移入AAV骨架中。

可以使用本领域已知的任何合适的基因工程技术，包括但不限于PCR、寡核苷酸合成、限制性核酸内切酶酶切、连接、转化、质粒纯化和DNA测序的标准技术，完成ddRNAi构建体的产生。ddRNAi构建体(或包括其的多核苷酸)还可以包括将ddRNAi构建体包装到病毒颗粒中所必需的序列和/或允许ddRNAi构建体整合到靶细胞基因组中的序列。在一些实例中，病毒构建体或每一病毒构建体另外含有允许病毒复制和增殖的基因，然而此类基因将以反式提供。另外，或每种病毒构建体可以含有来自以天然形式掺入或修饰的任何已知生物体的基因组的基因或遗传序列。例如，病毒构建体可包括用于在细菌中复制构建体的序列。

测试本发明的shmiR或ddRNAi构建体

细胞培养模型

用作OPMD细胞培养模型的细胞系的实例是HEK293T细胞系(HEK293T，ATCC，Manassas，USA)，其已经用表达正常Ala10-人PABPN1-FLAG(Ala10)或突变体Ala17-人PABPN1-FLAG(Ala17)的载体(vector)转染，后者是OPMD的标志。

可用作OPMD细胞培养模型的细胞系的其他实例为C2C12小鼠肌肉细胞和ARPE-19人视网膜细胞。

用作OPMD细胞培养模型的细胞系的另一个实例是稳定转染以表达正常Ala10-人PABPN1-FLAG(Ala10)或突变体Ala17-人PABPN1-FLAG(Ala17)的原代小鼠成肌细胞(IM2)细胞系。稳定表达突变体Ala17-人PABPN1-FLAG(Ala17)的示例性IM2衍生细胞系是H2kB-D7e细胞系。H2kB-D7e细胞系也描述于Raz等人，(2011)美国病理学杂志(American Journal ofPathology)，179(4)：1988-2000。

适用于OPMD的细胞培养模型的其他细胞系是本领域已知的，例如描述于Fan等人(2001)人类分子遗传学(Human Molecular Genetics)，10：2341-2351，Bao等人(2002)生物化学杂志(The Journal of Biological Chemistry)，277：12263-12269和Abu-Baker等人(2003)人类分子遗传学(Human Molecular Genetics)，12：2609-2623。

如本文所例示，通过将编码shmiR的核酸或包括其的ddRNAi构建体或表达载体(vector)施用至细胞并随后测量由PABPN1基因编码的RNA或蛋白的表达水平来测定本发明的shmiR的活性。例如，可以通过RT-PCR、定量PCR、半定量PCR或在严格条件下的原位杂交中的任何一种或多种，使用对PABPN1特异的一种或多种探针或引物来测定细胞内PABPN1基因表达。PABPN1 mRNA或DNA也可通过使用一种或多种对PABPN1具有特异性的探针或引物的PCR、蛋白印迹(Western blot)或ELISA来检测PABPN1蛋白。

用于检测PABPN1表达的可用于RT-PCR、定量PCR或半定量PCR技术的多核苷酸是已知的并且是可商购的(Thermo Fisher)。然而，可使用本领域已知的方法和/或软件基于PABPN1可获得的序列信息设计可用于基于PCR的检测方法的多核苷酸。在一个实例中，可以使用本领域已知的标准方法使用RT-PCR检测PABPN1 mRNA的存在或不存在。在一个实例中，可以使用蛋白印迹、ELISA或本领域可用的其他标准定量或半定量技术中的任何一种或多种，或这些技术的组合来检测PABPN1多肽或蛋白的存在或不存在或相对量。考虑并描述了依赖于PABPN1的抗体识别的技术。在一个实例中，可以使用包括PABPN1多肽的抗体捕获以及捕获的PABPN1多肽的电泳拆分的技术检测PABPN1多肽的存在或不存在或相对丰度，例如使用Isonostic^TMAssay(Target Discovery,公司)。可购得PABPN1蛋白的抗体。

将转染或转导效率和样本回收率的差异归一化的各种方法是本领域已知的。

本发明的核酸、ddRNAi构建体或表达载体(vector)相对于由PABPN1编码的mRNA表达或蛋白的水平或在没有本发明的RNA的情况下PABPN1蛋白的核聚集的水平，减少PABPN1编码的mRNA或蛋白的表达，或减少PABPN1蛋白的核聚集的存在，被认为对于治疗应用是有用的，例如，通过减少内源性PABPN1的表达并替代一些或全部具有本文所述的引起OPMD的PABPN1蛋白的内源性PABPN1来治疗OPMD。

动物模型

有几种小动物模型可用于研究OPMD，其实例描述于Uyama等人，(2005)ActaMyologica,24(2):84-88和Chartier和Simonelig(2013)Drug Discovery Today:technologies,10:e103-107。示例性动物模型是A17.1转基因小鼠模型，先前已描述于Davies等人(2005)自然医学(Nature Medicine)，11：672-677和Trollet等人(2010)人类分子遗传学(Human Molecular Genetics)，19(11)：2191-2207。

任何前述动物模型可用于测定本发明的shmiR或ddRNAi构建体敲低、降低或抑制由PABPN1基因编码的RNA或蛋白的表达的功效。

本文已经就细胞模型描述了用于测定PABPN1基因表达的方法，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。

PABPN1构建体

如本文所述，本发明的AAV包括包括PABPN1构建体的多核苷酸序列。在这点上，本发明的AAV提供了用于将功能性PABPN1蛋白替代为例如，细胞或动物的试剂。功能性PABPN1蛋白不会是OPMD的病因，也不会由mRNA转录物编码，该mRNA转录物被同样包括在AAV内的如本文所述的ddRNAi构建体编码的shmiR靶向。

在一个实例中，PABPN1构建体包括编码功能性PABPN1蛋白的核酸，例如DNA或cDNA。例如，编码功能性PABPN1蛋白的核酸可以是密码子优化的，例如，含相对于野生型PABPN1核酸但编码相同氨基酸的一个或多个简并或摆动碱基，使得编码功能性PABPN1蛋白的相应mRNA序列不被从ddRNAi构建体编码和表达的shmiR识别。例如，编码功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸可在由ddRNAi构建体编码和表达的一种或多种shmiR靶向的区域内包括相对于野生型PABPN1核酸的一个或多个简并或摆动碱基。在一个实例中，一个或多个简并或摆动碱基位于由ddRNAi构建体编码和表达的shmiR的效应子序列的种子区内。

在一个实例中，具有编码功能性PABPN1蛋白的PABPN1构建体的核酸被密码子优化，使得其相应的mRNA序列不被从ddRNAi构建体编码和表达的shmiR识别。优选地，由密码子优化的核酸序列编码的功能性PABPN1蛋白包括SEQ ID NO：74所示的氨基酸序列，即，野生型人PABPN1蛋白的氨基酸序列。技术人员将理解存在许多可用于编码功能性PABPN1蛋白的核苷酸序列组合，并且核苷酸序列的选择将最终取决于由ddRNAi构建体编码和表达的shmiR的效应子序列，即，使得密码子优化的核酸不被shmiR识别。在一个实例中，PABPN1构建体包括含有SEQ ID NO：73所示序列的核酸。在一个实例中，编码功能性PABPN1蛋白的核酸还可以包括Kozak序列。

在一个实例中，编码功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸与适于表达功能性PABPN1蛋白的启动子可操作地连接。适于在肌肉中表达功能性PABPN1蛋白的启动子可能是特别合适的。适用于编码功能性PABPN1蛋白的核酸的一个示例性启动子是Spc512启动子。适用于编码功能性PABPN1蛋白的核酸的另一个示例性启动子是CK8启动子。然而，可以使用本领域已知的任何合适的启动子。例如，在US 20110212529A1中描述了与编码功能性PABPN1蛋白的核酸一起使用的其他合适的启动子。

在一个实例中，PABPN1构建体和ddRNAi构建体与同一多核苷酸内的同一启动子可操作地连接，例如，它们都与Spc512启动子可操作地连接。根据该实例，单一启动子驱动功能性PABPN1蛋白和shmiR的表达。

如本文所述，可用于本发明的一些实例中的启动子可以是组织特异性的或细胞特异性的。

在一个实例中，编码本发明的功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸可以另外包括一种或多种增强子以增加该功能性PABPN1蛋白及其对应的mRNA转录物的表达。适用于本发明的该实例的增强子将是本领域技术人员已知的。

测试功能性PABPN1

动物模型

已经描述了用于研究OPMD的示例性动物模型。

前述动物模型中的任一种可用于测定PABPN1构建体或包括其的AAV在存在由本发明的ddRNAi表达的一种或多种shmiR的情况下在体内替代功能性PABPN1蛋白的功效。

本文已经就细胞模型描述了用于测定PABPN1表达的方法，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。

在一个实例中，组织学和形态学分析可用于测定在存在由本发明的ddRNAi表达的一种或多种shmiR的情况下，本发明的试剂在体内替代功能性PABPN1蛋白的功效。可用于确定本发明的药剂在体内替代功能性PABPN1蛋白的功效的其他测定描述于Trollet等人，(2010)人类分子遗传学(Human Molecular Genetics)，19(11)：2191-2207。

PABPN1‘沉默和替代’DNA构建体

如本文所述，本发明的AAV包括单个多核苷酸，该单个多核苷酸包括如本文所述的ddRNAi构建体和PABPN1构建体。即，ddRNAi构建体和PABPN1构建体可作为组合的DNA构建体(本文也称为‘沉默和替代’构建体或SR构建体)提供，其包装在如本文所述的经修饰的AAV中以递送至患者。实施例2中描述了包括编码功能性PABPN1蛋白的核酸和本发明的ddRNAi构建体的示例性DNA构建体。

包括ddRNAi构建体和PABPN1构建体的单一DNA构建体可包括例如一个或多个启动子以驱动由ddRNAi构建体编码的功能性PABPN1蛋白和/或shmiR的表达。可用于本发明的一些实例中的启动子可以是组织特异性的或细胞特异性的。示例性启动子是肌肉-特异性启动子，例如Spc512和CK8。然而，本领域已知的任何合适的启动子都被考虑用于本文所述的DNA构建体，例如在US 20110212529A1中描述的那些。

将包括ddRNAi构建体和PABPN1构建体的DNA构建体包装在如本文所述的经修饰的AAV中以递送至患者。

在一个实例中，DNA构建体在5'至3'方向包括肌肉特异性启动子，例如Spc512启动子，本文所述的PABPN1构建体和本文所述的ddRNAi构建体，例如，其中ddRNAi构建体位于编码功能性PABPN1蛋白的核酸的3'非翻译区(UTR)中。根据本实施例的DNA构建体示于图1A。

根据本实施例的示例性DNA构建体在5'至3'方向包括：

(a)肌肉特异性启动子，例如，Spc512；

(b)包括编码功能性PABPN1蛋白的DNA序列的本文所述的PABPN1构建体，功能性PABPN1蛋白具有不被ddRNAi构建体编码的shmiR靶向的mRNA转录物；以及

(c)包括包括编码本文所述的shmiR17的DNA序列的核酸和包括编码本文所述的shmiR13的DNA序列的核酸的本发明的ddRNAi构建体。

根据该实施例，DNA构建体可以包括SEQ ID NO：72所示的DNA序列或由SEQ ID NO：72所示的DNA序列组成。

包括在本发明的DNA构建体中的编码shmiR13和shmiR17的示例性ddRNAi构建体包括包括编码包括SEQ ID NO：31所示的效应子序列的shmiR的DNA序列和与SEQ ID NO：31所示的序列基本互补的效应子互补序列例如，SEQ ID NO：30(shmiR13)所示的效应子互补序列或由其组成的核酸，以及包括编码shmiR的DNA序列的核酸，shmiR包括SEQ ID NO：39所示的效应子序列和与SEQ ID NO：39所示的序列基本互补的效应子互补序列，例如SEQ ID NO：38(shmiR17)所述的效应子互补序列或由其组成的核酸。例如，根据DNA构建体的该实例的ddRNAi构建体可包括包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列组成的核酸，以及包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列组成的核酸。

包括在本发明的DNA构建体中的示例性PABPN1构建体包括SEQ ID NO：73所示的密码子优化的序列，并编码SEQ ID NO：74所示的功能性PABPN1蛋白。

虽然已经描述了某些实例，但是应当理解，根据本发明的DNA构建体可包括本文所述的编码靶向PABPN1的RNA转录物的一种或多种shmiR的任何ddRNAi构建体。然而，编码本文实施例1至5中描述的shmiR的ddRNAi构建体可特别适于包括在本发明的DNA构建体中。类似地，应理解，根据本发明的DNA构建体可包括编码功能性PABPN1蛋白的任何PABPN1构建体，其转录物不被从ddRNAi构建体表达的shmiR靶向。

组合物和载体(carrier)

在一些实例中，本发明的AAV可以在配制用于递送至患者例如人类患者的药物组合物中提供。

本发明的组合物还可包括一种或多种药学上可接受的载体(carrier)或稀释剂。例如，该组合物可以包括适于在给药之后将本发明的AAV递送到受试对象肌肉的载体(carrier)。适用于配制和递送AAV的载体(carrier)是本领域已知的并且在本文中涵盖。

组合物将合意地包括增加本发明的AAV的生物稳定性的材料和/或增加AAV选择性地定位至肌细胞和/或穿透肌细胞的能力的材料。本发明的治疗组合物可以以在药学上可接受的载体(carrier)(例如，生理盐水)中施用，其基于给药的模式和途径以及标准药学实践来选择。本领域普通技术人员可以容易地配制包括本发明的一种或多种AAV的药物组合物。在一些情况下，使用等渗制剂。通常，用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在一些情况下，优选等渗溶液如磷酸盐缓冲盐水。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实例中，将血管收缩剂加入到制剂中。提供无菌且无热原的根据本发明的组合物。在本领域的标准参考书，雷明顿：药物科学和实践(Remington:The Science andPractice of Pharmacy)(以前为雷明顿药学科学(Remington's PharmaceuticalSciences)，Mack出版公司，和在USP/NF中描述了用于药物制剂的合适的药物载体(carrier)以及药物需要。

药物组合物的体积、浓度和制剂以及给药方案可以特别定制以使细胞递送最大化，同时使毒性如炎性反应最小化，例如，如果需要可以使用具有相应低浓度活性成分的相对大体积(5、10、20、50ml或更多)，以及包括抗炎化合物如皮质类固醇。

本发明的组合物可以被配制用于通过任何合适的途径(例如，适合于递送至受试对象的咽肌的途径)给药。例如，给药途径包括但不限于肌内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和口服以及经皮或通过吸入或栓剂。示例性给药途径包括静脉内(IV)注射、肌内(IM)注射、口服、腹膜内、皮内、动脉内和皮下注射。在一个实例中，本发明的组合物被配制成用于肌内注射给药(例如，配制成用于咽肌给药)。在一个优选的实施方案中，直接给药到受试对象的咽肌。例如，咽肌可以包括下缩肌、中缩肌、上缩肌、腭咽肌、咽鼓管咽肌、茎突咽肌或其任何组合中的一个或多个。在另一个优选的实施方案中，给药是直接给药至受试对象的舌肌。此类组合物可用于药物应用，并且可容易地在合适的无菌、无热原的载体(vehicle)(例如，用于注射的缓冲盐水)中配制，用于肠胃外给药，例如，肌内注射(例如，直接用于咽肌)、静脉内注射(包括静脉内输注)、皮下注射和腹膜内给药。在一个优选的实施方案中，给药途径例如肌内注射(例如，直接施用至咽肌)实现了向肌肉组织的有效递送和编码本发明的PABPN1的ddRNAi构建体和密码子优化的核酸的转染，以及shmiR和密码子优化的核酸在其中的表达。

治疗方法

本发明的某些方面涉及向有需要的人类受试对象施用AAV或包括与本文所述相同AAV的组合物，其用于治疗受试对象和/或抑制内源性PABPN1蛋白(包括引起OPMD的PABPN1蛋白)的表达，在受试对象中，其中通过直接注射到受试对象的咽肌施用组合物。

在一些实施方案中，AAV或包括本文所述AAV的组合物可用于治疗患有OPMD的受试对象的OPMD。类似地，如本文所述的AAV或包括其的组合物可用于在患有或易患OPMD的受试对象中预防OPMD的一种或多种症状的发展或进展。

在一些实施方案中，在通过直接注射至受试对象的咽肌来施用AAV或包括AAV的组合物之后，受试对象具有改善的吞咽功能。

如本文所述，本发明的AAV和/或组合物包括本发明的ddRNAi构建体和本发明的PABPN1构建体，该PABPN1构建体包括编码本发明的功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸。因此，AAV或组合物的给药可以有效地(i)抑制、降低或敲除内源PABPN1的表达，包括包括引起OPMD的扩增的聚丙氨酸束的PABPN1蛋白，和(ii)提供功能性PABPN1蛋白的表达，功能性PABPN1蛋白不被抑制、降低或敲除内源PABPN1表达的shmiR靶向。因此，AAV或本发明的组合物可以在施用其的细胞或动物中恢复PABPN1蛋白功能，例如RNA的转录后加工。

在某些实施方案中，OPMD的治疗可以包括通过直接注射至受试对象的咽肌来施用AAV或包括如本文所述的AAV的组合物

在一些实施方案中，给药途径是IM(例如，直接注射至受试对象的咽肌)并且实现有效递送至肌肉组织和包括编码PABPN1的密码子优化的核酸和靶向野生型PABPN1 mRNA转录物的shmiR的表达以及密码子优化的核酸在其中的表达的本发明的ddRNAi构建体和PABPN1构建体转导。

用于任何特定患者的治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括：采用的组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间；给药途径；AAV或包括如本文所述AAV的组合物的结合率，治疗持续时间以及其它相关因素。

AAV或包括其的组合物减少或抑制引起OPMD的PABPN1蛋白的表达并表达不引起OPMD的功能性PABPN1蛋白的量足以恢复PABPN1功能的功效可以通过评估治疗受试对象的肌肉收缩特性和/或吞咽困难来测定。用于测试吞咽能力和肌肉收缩特性的方法是本领域已知的。例如，吞咽困难可以使用电视透视检查、UGI内窥镜或食道测压和阻抗测试来评估。用于评估OPMD的临床特征的其他方法描述于Rüegg等人，(2005)《瑞士医学周刊》(SwissMedical Weekly)，135：574-586。

表1-PABPN1中的靶向区域

表2-shmiR效应子和效应子互补序列

表3-shmiR序列

表4-shmiR编码盒

实施例1——靶向PABPN1的shmiR的设计

使用公众可获得的siRNA设计算法(包括Ambion、Promega、Invitrogen、Origene和MWG)从PABPN1mRNA序列中鉴定出代表用于siRNA构建体设计的潜在靶点的序列：选择的序列在人、非人灵长类、牛和小鼠物种中是保守的。将编码候选siRNA的序列掺入pre-miR30a支架以产生编码短发夹微小RNA(shmiR)的序列，短发夹微小RNA(shmiR)包括5'侧翼区(SEQID NO：41)、siRNA有义链序列(效应子互补序列)、茎/环连接序列(SEQ ID NO：40)、siRNA反义链(效应子序列)和3'侧翼区(SEQ ID NO：42)。代表性shmiR的预测二级结构示于图1C中。所设计的shmiR的PABPN1 mRNA转录物的靶区域示于表1中，相应的shmiR效应子序列(反义链)示于表2中。

实施例2——产生用于同时发生内源PABPN1的基因沉默和用密码子优化的PABPN1替代的单一“沉默和替代构建体”。

创建了表达shmiR17和shmiR13(例如，如在表3和4中描述的)以及optPABPN1序列的单链腺相关病毒2型(ssAAV2)质粒。

沉默和替代构建体(下文称为“SR-构建体”)通过将编码shmiR17和shmiR13的DNA序列(如表4中)亚克隆到pAAV2载体(vector)骨架(pAAV-shmiR病毒质粒)中的optPABPN1转录物的3'非翻译区中而产生。optPABPN1和两种shmiR在单一转录物中的表达由肌肉特异性启动子Spc512驱动。图1(A)、图1(B)和图2中提供了SR构建体的示意图。

然后产生重组假型AAV载体(vector)原种。简言之，HEK293T细胞在Dulbecco‘s改良的Eagle’s培养基中的细胞工厂中培养，添加10％的FBS，在37℃和5％CO₂的条件下孵育。根据制造商的说明书将pAAV-shmiR病毒质粒(SR-构建体)和pAAV辅助病毒和pAAV repcap8质粒或pAAV repcap9或pAAV辅助病毒和pAAVRH74质粒与磷酸钙进行复合。然后用pAAV-shmiR质粒(SR-构建体)结合pAAV辅助病毒和以下衣壳之一进行三重转染；在HEK293T细胞中的pAAVrepcap8、pAAVrepcap9或pAAVRH74。然后将HEK293T细胞在37℃和5％CO₂下培养72小时，此后将细胞裂解并通过碘克沙醇(Sigma-Aldrich)分级-梯度超速离心然后氯化铯超速离心来纯化表达SR构建体的颗粒。用定量聚合酶链反应(Q-PCR)对载体(vector)基因组进行定量。

实施例3——使用单一载体(vector)“沉默和替代”方法的体内研究。

为了测试实施例2中描述的SR-构建体在OPMD相关疾病模型中的体内功效，将SR-构建体以一定剂量范围单独施用，通过肌内注射到10-12周龄的A17小鼠的胫骨前肌(TA)中。给药剂量分别为每块肌肉7.5x10¹¹、2.5x10¹¹、5x10¹⁰、1x10¹⁰、2x10⁹和4x10⁸个载体(vector)基因组(vg)。给年龄匹配的A17小鼠注射盐水作为未处理组。在处理后14或20周处死小鼠。

实施例4——SR-构建体处理的A17小鼠中shmiR产生、PABPN1沉默和密码子优化的PABPN1表达的定量测量。

SR-构建体处理14周后，收获实施例3的A17小鼠的TA肌并提取RNA。对TA肌肉中shmiR的SR-构建体依赖的表达进行了定量(图3A)。shmiR的定量表达水平依赖于SR-构建体剂量，PABPN1(包括expPABPN1)(图3B)的沉默和正常PABPN1水平(图3C)的恢复也是如此。

实施例5——SR-构建体处理的A17小鼠中的核内内含物(INI)的减少。

在实施例3的第14周A17小鼠中测试SR-构建体对核内内含物(INI)的持久性的影响。还包括FvB野生型小鼠作为健康对照。AAV注射后14周，收集肌肉并安置用于组织学研究。切片用1M KCl预处理以优先从组织中洗脱所有可溶PABPN1。PABPN1(绿色)和层粘连蛋白(一种在肌肉细胞外基质中丰富的蛋白质)(红色)的免疫荧光在处理的肌肉的部分中被检测到，并且显示在SR-构建体处理的肌肉中PABPN1阳性的核内内含物(INI)的数量显著减少，并且具有剂量效应(图4A)。对肌肉切片中含有INI的细胞核百分比的量化表明，与未经处理的A17肌肉相比，使用SR-构建体的治疗显著减少了INI的数量(采用Bonferroni事后检验的单因素方差检验(One-way Anova test)，***p<0.001，ns：不显著)(图4B)。

实施例6——用SR-构建体治疗改善了所治疗肌肉的生理特性和功能。

在实施例3的第14周的A17小鼠中，测量了处理过的肌肉的生理特性和功能。还包括FvB野生型小鼠作为健康对照。通过原位肌肉生理学测量TA肌肉产生的最大力(图5A)。SR-构建体以剂量依赖性方式显著增加由TA肌肉产生的最大力。还在SR-构建体给药后14周测量相对于体重(BW)归一化的肌肉重量(图5B)。当每TA注射剂量超过1e10 vg时，归一化至体重的SR处理组的肌重与对照组FvB小鼠的相当(平均值±SEM，n＝10，使用Bonferroni事后检验进行单因素方差检验，*p<0.05，**p<0.001，*p<0.01，ns：不显著)。

实施例7——肌肉功能随时间恢复

SR-构建体处理的A17小鼠和FvB野生型小鼠的TA肌肉产生的最大力通过SR-构建体给药后14周(图6A)和SR-构建体给药后20周(图6B)的原位肌肉生理学来测量。对于中等剂量(每TA 1e10 vg和6e10vg)，与注射后14周相比，在20周时对肌肉力量的有益效果更加显著(平均值±SEM，n＝10，使用Bonferroni事后检验进行单因素方差检验，***p<0.001，**p<0.01)。

实施例8——直接给药至绵羊咽肌

将SR-构建体直接注射到绵羊的咽肌中，PABPN1在绵羊和人类之间高度保守，包括第95位的一个氨基酸残基以外的所有氨基酸残基。

将SR-构建体直接注射到绵羊的咽肌中(图7A)。分别向绵羊研究中的两只动物的环咽肌(CP)注射1.5e13 vg SR-构建体，并向咽肌(咽部))注射1.0e13 vg SR-构建体。用SR-构建体(1.0e10 vg至1.0e13vg)处理的剩余10只动物仅接受CP注射。CP注射总量1.5ml(每次3次，每次0.5ml)。咽部注射总量为6ml(左右各注射2次，每次1.5ml)。

使用放射性标记乳膏剂的放射成像显示，人类OPMD患者存在严重的吞咽困难，存在“误入”的风险(图7B)。

实施例9——经修饰的AAV VP1序列的设计、生产和测试

在该实例中，设计并制备了具有病毒衣壳蛋白亚单位1(VP1)的AAV，在其中，将特异性序列修饰即氨基酸替代引入磷脂酶A2(PLA2)结构域和侧翼序列，以在昆虫细胞中产生时恢复AAVs的磷脂酶活性和AAV的病毒功能。此外，基于对包括各种代表性AAV血清型的PLA2结构域和侧翼序列的VP1亚序列进行的多序列比对，制备包括PLA2结构域和侧翼序列的共有VP1亚序列，包括设计用于恢复磷脂酶活性的序列修饰。野生型AAV9 VP1子序列示于SEQ ID NO：87。

9.1修饰的AAV9 VP1序列的设计

使用BLASTp比对工具对AAV9(SEQ ID NO：89)、AAV8(SEQ ID NO：93)和AAV2(SEQID NO：97)的VP1蛋白的N端180个氨基酸进行序列比对。基于这些比对，来自AAV8和AAV9的PLA2结构域和侧翼序列显示与AAV2中的相应序列高度保守。基于这些序列比对，计算机模拟设计了修饰的AAV9 VP1和AAV8VP1序列。通过用存在于SEQ ID NO：97所示AAV2 VP1序列的相应位置的氨基酸替换SEQ ID NO：89所示序列的位置42、67、81、84和85的氨基酸，即，SEQ ID NO：89序列内的A42S、A67E、Q81R、K84D和A85S，来设计修饰的AAV9 VP1序列。修饰的AAV9 VP1序列中替代的位置之一在PLA2结构域侧翼的区域中(但被认为可能参与PLA2结构域的折叠和/或活性)，并且修饰的残基位置中的四个位于PLA2结构域自身内。同样地，过用存在于SEQ ID NO：97所示AAV2 VP1序列的相应位置的氨基酸替换SEQ ID NO：93所示序列的位置42、67、81、84、85和105的氨基酸，即，SEQ ID NO：93序列内的A42S、A67E、Q81R、K84D、A85S和Q105K，来设计修饰的AAV8 VP1序列。

9.2生产表达结构和非结构AAV9蛋白的杆状病毒载体(vector)

制备编码包括VP1、VP2和VP3亚单位和AAV9非结构蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40的AAV9衣壳蛋白的杆状病毒载体(vector)(BacAAV9-Rep-VPmod，图8)。简单地说，在GenScript(AAV9-VPmod，图9)合成编码AAV9衣壳蛋白的DNA构建体，AAV9衣壳蛋白具有由SEQ ID NO：90所示序列编码的修饰的AAV9 VP1亚单位，并具有侧翼NotI和ApaI限制性位点。编码非结构蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40以及衣壳蛋白VP1、VP2和VP3和装配激活蛋白(AAP)的wtAAV9-Rep质粒(Virovek，Hayward，CA)用作接受AAV9-VPmod DNA构建体的骨架。用NotI和ApaI酶切AAV9-VPmod DNA构建体和wtAAV9-Rep质粒，然后将AAV9-VPmod DNA构建体连接到wtAAV9-Rep质粒骨架中代替wt衣壳蛋白编码序列以产生AAV9-Rep-VPmod(图10)。然后将AAV9-Rep-VPmod中间体克隆到pOET1杆状病毒转移载体(vector)中(OxfordExpression Technologies)。为了促进这一点，使用Quickchange技术将EcoRV位点插入AAV9-Rep-VPmod中间体中以产生AAV9-Rep-VPmod-EcoRV中间体。然后用NotI和EcoRV酶切AAV9-Rep-VPmod-EcoRV中间体和pOET1(Oxford Expression Technologie)，然后将插入物连接到pOET1骨架中，产生最终的AAV9-Rep-VPmod克隆(BacAAV9-Rep-CapPL，图8)。

9.3生产表达结构和非结构AAV8蛋白的杆状病毒载体(vector)

制备编码包括VP1、VP2和VP3亚单位和修饰的AAV8非结构蛋白Rep78和Rep52的AAV8衣壳蛋白的杆状病毒载体(vector)(BacAAV8-Rep-VPmod，图11)。简单地说，在GenScript(AAV8-VPmod，图12)合成编码AAV8衣壳蛋白(VP1、VP2和Vp3)的DNA构建体，AAV8衣壳蛋白具有包括SEQ ID NO：94所示序列的修饰的VP1亚单位，并具有侧翼NotI和ApaI限制性位点。编码非结构蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40以及衣壳蛋白VP1、VP2和VP3和装配激活蛋白(AAP)的wtAAV8-Rep/Cap质粒(Virovek，Hayward，CA)用作接受AAV8-VPmod DNA构建体的骨架。用NotI和ApaI酶切AAV8-VPmod DNA构建体和wtAAV8-Rep/Cap质粒，然后将AAV8-VPmod DNA构建体连接到wtAAV8-Rep/Cap质粒骨架中代替wt衣壳蛋白编码序列以产生AAV8-Rep-VPmod(图13)。然后将AAV8-Rep-VPmod中间体克隆到pOET1杆状病毒转移载体(vector)中(Oxford Expression Technologies)。为了促进这一点，使用QuickChange技术将EcoRV位点插入AAV8-Rep-VPmod中间体中以产生AAV8-Rep-VPmod-EcoRV中间体。然后用NotI和EcoRV酶切AAV8-Rep-VPmod-EcoRV中间体和pOET1，然后将插入物连接到pOET1骨架(Oxford Expression Technologie)中，产生最终的AAV8-Rep-VPmod克隆(BacAAV8-Rep-VPmod，图11)。

9.4生产表达目的基因(GOI)的杆状病毒载体(vector)

制备编码侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的目的基因(GOI)的杆状病毒载体(vector)。简单地说，在一种情况下，通过用NotI消化AAV2-GOI构建体(图14)和pOET1(Oxford Expression Technologies)，将编码两个靶向侧接AAV2 ITR的人PABPN1转录物的shmiR的DNA构建体克隆到pOET1杆状病毒转移载体(vector)(Oxford ExpressionTechnologies)中，并将AAV2-GOI构建体连接到pOET1骨架中以产生最终克隆(BacAAV2-GOI，图15)。第二种GOI也以与上述相同的方式制备，虽然其编码靶向HBV聚合酶基因转录物的不同区域的三种shmiR。

9.5P0杆状病毒原种的产生

使用Oxford Expression Technologies baculoCOMPLETE系统(根据制造商的说明书)产生杆状病毒P0原种。简单地说，在转染前1小时将1百万Sf9细胞接种于6孔板中并使其粘附于该板。在1ml的TC100培养基中，将500ng的Bac-AAV2-GOI质粒、BacAAV8-Rep-CapPL或BacAAV9-Rep-CapPL与500ng的闪光BAC DNA和baculoFECTIN转染试剂(根据制造商的方案)混合。在室温下孵育30分钟后，将转染混合物加入到接种的Sf9细胞中。在28℃下孵育6孔板。转染后24小时，向细胞中加入1ml的Sf9培养基。转染后5天，收集含有P0杆状病毒原种的培养基并保存在4℃中。因此为BacAAV8-Rep-CapPL、BacAAV9-Rep-CapPL和Bac-AAV2-GOI产生了P0杆状病毒。

9.6在哺乳动物细胞中制备AAV

将在哺乳动物细胞中制备的AAV的功能与如上所述在昆虫细胞中制备的AAV的功能性进行比较。为了比较在哺乳动物和昆虫细胞中制备的重组AAV的生物活性(功能)，用各种滴度的病毒体外感染哺乳动物细胞，并且使用qRT PCR测定定量经处理的shmiR的表达。

对于这些实验，商业供应商(Vector Biolabs；https://www.vectorbiolabs.com)在哺乳动物细胞中制备了表达3种靶向HBV聚合酶基因转录物的shmiR的重组AAV8颗粒。此外，表达靶向人PABPN1的2种shmiR的重组AAV9颗粒由哺乳动物细胞的第二个供应商Nationwide Children's Hospital vector core制备，(https:// www.nationwidechildrens.org/research/resources-infrastructure/core- facilities/viralvector-core-clinical-manufacturing-facility)。

对(i)在哺乳动物细胞中产生的具有未修饰VP1的AAV8(载体(vector)Biolabs)，(ii)在昆虫细胞中通过杆状病毒产生的具有修饰VP1的AAV8(如本文所述使用BacAAV8-Rep-VPmod)，和(iii)使用wtAAV8-Rep/Cap，在昆虫细胞中通过杆状病毒产生的具有未修饰wt VP1的AAV8(Ben10,Virovek,Hayward,CA)进行生物活性评估，各自编码靶向HBV聚合酶基因的3种shmiR(HBV shmiR命名为all-4_m3、shRNA8v2_p1和All-9_p1)。简单地说，用上述修饰的或非修饰的重组病毒制备物以4x10e9、8x10e9和1.6x10e10的MOI感染JHU67细胞，并且在感染后72小时对三种shmiR中的每一种的shmiR表达进行定量。为了定量shmiR的表达，使用Qiagen RNA迷你试剂盒(Qiagen)从受感染细胞中提取RNA。使用Qiagen miScript试剂盒(Qiagen)逆转录RNA。然后将cDNA与设计用于扩增shmiR靶的特异性引物一起用于qPCR反应以测定样本中存在的拷贝总数。

如图16A-16C所示，用在哺乳动物细胞中制备的具有未修饰wt VP1的AAV8感染的细胞产生可容易检测水平的shmiR，而在昆虫细胞中由杆状病毒产生的具有未修饰wt VP1的AAV8产生很少的shmiR(如果有的话)。相反，具有由昆虫细胞中的杆状病毒产生的修饰的VP1的AAV8产生相对高水平的shmiR，表明与具有由昆虫细胞中的杆状病毒产生的未修饰的wt VP1的AAV8相比，这些AAV的功能增加。

还评价了(i)在哺乳动物细胞(Nafionwide)中产生的具有未修饰衣壳蛋白的AAV9和(ii)使用在昆虫细胞中由杆状病毒产生的BACAAV9-Rep-VPmod(如本文所述)的具有修饰衣壳蛋白的AAV9的生物活性，每个编码人PABPN1的2种shmiR靶向转录物(命名为sh13和sh17)。简单地说，用4x10e9、8x10e9和1.6x10e10载体(vector)基因组感染表达AAV内化受体的C2C12细胞。孵育72小时后，收获细胞，提取RNA并根据上述qPCR方法对两种shmiR的shmiR表达进行定量。

如图17所示，两种制剂显示非常相似的shmiR表达水平，表明非常相似的病毒功能。

尽管在来自血清型8和9的AAV的上下文中进行了证明，但是预期当在昆虫细胞中从杆状病毒表达系统产生时，根据本文所述的方法修饰其它AAV血清型(除了血清型2)的VP1亚单位序列将恢复AAV的功能。

本领域技术人员应当理解，在不脱离本公开的广义范围的情况下，可以对上述实施方案行多种变化和/或修改。因此，本实施方案在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。

序列表

<110> Benitec生物制药有限公司

<120> 用于治疗眼咽肌营养不良（OPMD）的组合物和方法

<130> 186752PCT

<150> US 62/812,187

<151> 2019-02-28

<160> 98

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 28

<212> RNA

<213> 智人

<400> 1

gagaagcaga ugaauaugag uccaccuc 28

<210> 2

<211> 28

<212> RNA

<213> 智人

<400> 2

gaacgaggua gagaagcaga ugaauaug 28

<210> 3

<211> 28

<212> RNA

<213> 智人

<400> 3

gaagcugaga agcuaaagga gcuacaga 28

<210> 4

<211> 28

<212> RNA

<213> 智人

<400> 4

gggcuagagc gacaucaugg uauucccc 28

<210> 5

<211> 28

<212> RNA

<213> 智人

<400> 5

cugugugaca aauuuagugg ccauccca 28

<210> 6

<211> 28

<212> RNA

<213> 智人

<400> 6

gacuauggug caacagcaga agagcugg 28

<210> 7

<211> 28

<212> RNA

<213> 智人

<400> 7

cgagguagag aagcagauga auaugagu 28

<210> 8

<211> 28

<212> RNA

<213> 智人

<400> 8

cagugguuuu aacagcaggc cccggggu 28

<210> 9

<211> 28

<212> RNA

<213> 智人

<400> 9

agagcgacau caugguauuc cccuuacu 28

<210> 10

<211> 28

<212> RNA

<213> 智人

<400> 10

gguagagaag cagaugaaua ugagucca 28

<210> 11

<211> 28

<212> RNA

<213> 智人

<400> 11

auugaggaga agauggaggc ugaugccc 28

<210> 12

<211> 28

<212> RNA

<213> 智人

<400> 12

ggaggaagaa gcugagaagc uaaaggag 28

<210> 13

<211> 28

<212> RNA

<213> 智人

<400> 13

aacgagguag agaagcagau gaauauga 28

<210> 14

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR2的效应子序列

<400> 14

agcagaugaa uaugagucca 20

<210> 15

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR2的效应子互补序列

<400> 15

uggacucaua uucaucugcu u 21

<210> 16

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR3的效应子序列

<400> 16

gagguagaga agcagaugaa 20

<210> 17

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR3的效应子互补序列

<400> 17

uucaucugcu ucucuaccuc g 21

<210> 18

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR4的效应子序列

<400> 18

cugagaagcu aaaggagcua 20

<210> 19

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR4的效应子互补序列

<400> 19

uagcuccuuu agcuucucag c 21

<210> 20

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR5的效应子序列

<400> 20

uagagcgaca ucaugguauu 20

<210> 21

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR5的效应子互补序列

<400> 21

aauaccauga ugucgcucua g 21

<210> 22

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR6的效应子序列

<400> 22

gugacaaauu uaguggccau 20

<210> 23

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR6的效应子互补序列

<400> 23

auggccacua aauuugucac a 21

<210> 24

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR7的效应子序列

<400> 24

auggugcaac agcagaagag 20

<210> 25

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR7的效应子互补序列

<400> 25

cucuucugcu guugcaccau a 21

<210> 26

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR9的效应子序列

<400> 26

guagagaagc agaugaauau 20

<210> 27

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR9的效应子互补序列

<400> 27

auauucaucu gcuucucuac c 21

<210> 28

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR11的效应子序列

<400> 28

gguuuuaaca gcaggccccg 20

<210> 29

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR11的效应子互补序列

<400> 29

cggggccugc uguuaaaacc a 21

<210> 30

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR13的效应子序列

<400> 30

cgacaucaug guauuccccu 20

<210> 31

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR13的效应子互补序列

<400> 31

aggggaauac caugaugucg c 21

<210> 32

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR14的效应子序列

<400> 32

gagaagcaga ugaauaugag 20

<210> 33

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR14的效应子互补序列

<400> 33

cucauauuca ucugcuucuc u 21

<210> 34

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR15的效应子序列

<400> 34

aggagaagau ggaggcugau 20

<210> 35

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR15的效应子互补序列

<400> 35

aucagccucc aucuucuccu c 21

<210> 36

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR16的效应子序列

<400> 36

gaagaagcug agaagcuaaa 20

<210> 37

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR16的效应子互补序列

<400> 37

uuuagcuucu cagcuucuuc c 21

<210> 38

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR17的效应子序列

<400> 38

agguagagaa gcagaugaau 20

<210> 39

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR17的效应子互补序列

<400> 39

auucaucugc uucucuaccu c 21

<210> 40

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 茎环

<400> 40

acugugaagc agaugggu 18

<210> 41

<211> 26

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pri-miRNA骨架的5'侧翼序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> n is u or a

<400> 41

gguauauugc uguugacagu gagcgn 26

<210> 42

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pri-miRNA骨架的3'侧翼序列

<400> 42

cgccuacugc cucggacuuc aa 22

<210> 43

<211> 107

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR2的RNA序列

<400> 43

gguauauugc uguugacagu gagcguagca gaugaauaug aguccaacug ugaagcagau 60

ggguuggacu cauauucauc ugcuucgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 44

<211> 107

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR3的RNA序列

<400> 44

gguauauugc uguugacagu gagcgagagg uagagaagca gaugaaacug ugaagcagau 60

ggguuucauc ugcuucucua ccucgcgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 45

<211> 107

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR4的RNA序列

<400> 45

gguauauugc uguugacagu gagcgacuga gaagcuaaag gagcuaacug ugaagcagau 60

ggguuagcuc cuuuagcuuc ucagccgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 46

<211> 107

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR5的RNA序列

<400> 46

gguauauugc uguugacagu gagcgauaga gcgacaucau gguauuacug ugaagcagau 60

ggguaauacc augaugucgc ucuagcgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 47

<211> 107

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR6的RNA序列

<400> 47

gguauauugc uguugacagu gagcgaguga caaauuuagu ggccauacug ugaagcagau 60

ggguauggcc acuaaauuug ucacacgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 48

<211> 107

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR7的RNA序列

<400> 48

gguauauugc uguugacagu gagcgaaugg ugcaacagca gaagagacug ugaagcagau 60

gggucucuuc ugcuguugca ccauacgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 49

<211> 107

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR9的RNA序列

<400> 49

gguauauugc uguugacagu gagcgaguag agaagcagau gaauauacug ugaagcagau 60

ggguauauuc aucugcuucu cuacccgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 50

<211> 107

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR11的RNA序列

<400> 50

gguauauugc uguugacagu gagcgagguu uuaacagcag gccccgacug ugaagcagau 60

gggucggggc cugcuguuaa aaccacgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 51

<211> 107

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR13的RNA序列

<400> 51

gguauauugc uguugacagu gagcgacgac aucaugguau uccccuacug ugaagcagau 60

ggguagggga auaccaugau gucgccgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 52

<211> 107

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR14的RNA序列

<400> 52

gguauauugc uguugacagu gagcgugaga agcagaugaa uaugagacug ugaagcagau 60

gggucucaua uucaucugcu ucucucgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 53

<211> 107

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR15的RNA序列

<400> 53

gguauauugc uguugacagu gagcgaagga gaagauggag gcugauacug ugaagcagau 60

ggguaucagc cuccaucuuc uccuccgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 54

<211> 107

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR16的RNA序列

<400> 54

gguauauugc uguugacagu gagcgagaag aagcugagaa gcuaaaacug ugaagcagau 60

ggguuuuagc uucucagcuu cuucccgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 55

<211> 107

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR17的RNA序列

<400> 55

gguauauugc uguugacagu gagcgaaggu agagaagcag augaauacug ugaagcagau 60

ggguauucau cugcuucucu accuccgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 56

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR2的DNA序列

<400> 56

ggtatattgc tgttgacagt gagcgtagca gatgaatatg agtccaactg tgaagcagat 60

gggttggact catattcatc tgcttcgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 57

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR3的DNA序列

<400> 57

ggtatattgc tgttgacagt gagcgagagg tagagaagca gatgaaactg tgaagcagat 60

gggtttcatc tgcttctcta cctcgcgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 58

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR4的DNA序列

<400> 58

ggtatattgc tgttgacagt gagcgactga gaagctaaag gagctaactg tgaagcagat 60

gggttagctc ctttagcttc tcagccgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 59

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR5的DNA序列

<400> 59

ggtatattgc tgttgacagt gagcgataga gcgacatcat ggtattactg tgaagcagat 60

gggtaatacc atgatgtcgc tctagcgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 60

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR6的DNA序列

<400> 60

ggtatattgc tgttgacagt gagcgagtga caaatttagt ggccatactg tgaagcagat 60

gggtatggcc actaaatttg tcacacgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 61

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR7的DNA序列

<400> 61

ggtatattgc tgttgacagt gagcgaatgg tgcaacagca gaagagactg tgaagcagat 60

gggtctcttc tgctgttgca ccatacgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 62

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR9的DNA序列

<400> 62

ggtatattgc tgttgacagt gagcgagtag agaagcagat gaatatactg tgaagcagat 60

gggtatattc atctgcttct ctacccgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 63

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR11的DNA序列

<400> 63

ggtatattgc tgttgacagt gagcgaggtt ttaacagcag gccccgactg tgaagcagat 60

gggtcggggc ctgctgttaa aaccacgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 64

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR13的DNA序列

<400> 64

ggtatattgc tgttgacagt gagcgacgac atcatggtat tcccctactg tgaagcagat 60

gggtagggga ataccatgat gtcgccgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 65

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR14的DNA序列

<400> 65

ggtatattgc tgttgacagt gagcgtgaga agcagatgaa tatgagactg tgaagcagat 60

gggtctcata ttcatctgct tctctcgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 66

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR15的DNA序列

<400> 66

ggtatattgc tgttgacagt gagcgaagga gaagatggag gctgatactg tgaagcagat 60

gggtatcagc ctccatcttc tcctccgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 67

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR16的DNA序列

<400> 67

ggtatattgc tgttgacagt gagcgagaag aagctgagaa gctaaaactg tgaagcagat 60

gggttttagc ttctcagctt cttcccgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 68

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR17的DNA序列

<400> 68

ggtatattgc tgttgacagt gagcgaaggt agagaagcag atgaatactg tgaagcagat 60

gggtattcat ctgcttctct acctccgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 69

<211> 2532

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR3、shmiR14和密码子优化的PABPN1的双表达构建体版本1

<400> 69

cgatcgcgcg cagatctgtc atgatgatcc tagcatgctg cccatgtaag gaggcaaggc 60

ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taacccagac atgtggctgc cccccccccc 120

ccaacacctg ctgcctctaa aaataaccct gcatgccatg ttcccggcga agggccagct 180

gtcccccgcc agctagactc agcacttagt ttaggaacca gtgagcaagt cagcccttgg 240

ggcagcccat acaaggccat ggggctgggc aagctgcacg cctgggtccg gggtgggcac 300

ggtgcccggg caacgagctg aaagctcatc tgctctcagg ggcccctccc tggggacagc 360

ccctcctggc tagtcacacc ctgtaggctc ctctatataa cccaggggca caggggctgc 420

cctcattcta ccaccacctc cacagcacag acagacactc aggagccagc cagcgtcgat 480

cattgaagtt actattccga agttcctatt ctctagaatt cgccaccacg cgtggtatat 540

tgctgttgac agtgagcgag aggtagagaa gcagatgaaa ctgtgaagca gatgggtttc 600

atctgcttct ctacctcgcg cctactgcct cggacttcaa atcatctact ccatggccct 660

ctgcgtttgc tgaagacaga accgcaaagc aggacccgac aggattctcc ccgcctcttc 720

agagactatg tttacaagat atcggtatat tgctgttgac agtgagcgtg agaagcagat 780

gaatatgaga ctgtgaagca gatgggtctc atattcatct gcttctctcg cctactgcct 840

cggacttcaa gtcgacgcta gcaataaagg atcctttatt ttcattggat ccgtgtgttg 900

gttttttgtg tgcggttaat taaggtaccc gagctccacc gcggtggcgg ccgtccgccc 960

tcggcaccat cctcacgaca cccaaatatg gcgacgggtg aggaatggtg gggagttatt 1020

tttagagcgg tgaggaaggt gggcaggcag caggtgttgg cgctctaaaa ataactcccg 1080

ggagttattt ttagagcgga ggaatggtgg acacccaaat atggcgacgg ttcctcaccc 1140

gtcgccatat ttgggtgtcc gccctcggcc ggggccgcat tcctgggggc cgggcggtgc 1200

tcccgcccgc ctcgataaaa ggctccgggg ccggcggcgg cccacgagct acccggagga 1260

gcgggaggcg ccaagctcta gaactagtgg atcccccggg ctgcaggaat tcgatgccac 1320

catggccgct gccgccgctg ctgctgccgc agccggcgct gccggcggaa gaggcagcgg 1380

ccctggcaga cggcggcatc tggtccctgg cgccggaggg gaggccggcg aaggcgcccc 1440

tggcggagcc ggcgactacg gcaacggcct ggaaagcgag gaactggaac ccgaggaact 1500

gctgctggaa cctgagcccg agccagagcc cgaggaagag ccccctaggc caagagcccc 1560

ccctggcgcc ccaggaccag gaccaggctc tggggcacca ggctctcagg aagaggaaga 1620

agagcccggc ctcgtcgagg gagacccagg cgatggcgct atcgaagatc ccgagctgga 1680

agccatcaag gccagagtgc gggagatgga agaggaggcc gaaaaattga aagagctgca 1740

gaacgaagtc gaaaaacaaa tgaacatgtc cccccctcct ggaaatgctg gccctgtgat 1800

catgagcatc gaggaaaaga tggaagccga cgcccggtct atctacgtgg gcaacgtgga 1860

ctacggcgcc accgccgaag aactggaagc ccactttcac ggctgtggca gcgtgaaccg 1920

ggtgaccatc ctgtgcgaca agttcagcgg ccaccccaag ggcttcgcct acatcgagtt 1980

cagcgacaaa gaaagcgtgc ggacctctct ggctctcgac gagtctctgt tcaggggaag 2040

gcagatcaag gtcatcccca agcggaccaa caggcccggc atcagcacca ccgacagagg 2100

cttccctagg gctaggtaca gagcccggac caccaactac aacagcagca gaagccggtt 2160

ctacagcggc ttcaattctc ggcctagagg cagagtgtac cggggcaggg ccagggccac 2220

ctcctggtac agcccctacg aacagaagct gatcagcgag gaagatctgt gatgagatat 2280

ctgatgacat atgacgcgtt taattaactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 2340

gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 2400

aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 2460

tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg 2520

tgggctctat gg 2532

<210> 70

<211> 2532

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR17、shmiR13和密码子优化的PABPN1的双表达构建体版本1

<400> 70

cgatcgcgcg cagatctgtc atgatgatcc tagcatgctg cccatgtaag gaggcaaggc 60

ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taacccagac atgtggctgc cccccccccc 120

ccaacacctg ctgcctctaa aaataaccct gcatgccatg ttcccggcga agggccagct 180

gtcccccgcc agctagactc agcacttagt ttaggaacca gtgagcaagt cagcccttgg 240

ggcagcccat acaaggccat ggggctgggc aagctgcacg cctgggtccg gggtgggcac 300

ggtgcccggg caacgagctg aaagctcatc tgctctcagg ggcccctccc tggggacagc 360

ccctcctggc tagtcacacc ctgtaggctc ctctatataa cccaggggca caggggctgc 420

cctcattcta ccaccacctc cacagcacag acagacactc aggagccagc cagcgtcgat 480

cattgaagtt actattccga agttcctatt ctctagaatt cgccaccacg cgtggtatat 540

tgctgttgac agtgagcgaa ggtagagaag cagatgaata ctgtgaagca gatgggtatt 600

catctgcttc tctacctccg cctactgcct cggacttcaa atcatctact ccatggccct 660

ctgcgtttgc tgaagacaga accgcaaagc aggacccgac aggattctcc ccgcctcttc 720

agagactatg tttacaagat atcggtatat tgctgttgac agtgagcgac gacatcatgg 780

tattccccta ctgtgaagca gatgggtagg ggaataccat gatgtcgccg cctactgcct 840

cggacttcaa gtcgacgcta gcaataaagg atcctttatt ttcattggat ccgtgtgttg 900

gttttttgtg tgcggttaat taaggtaccc gagctccacc gcggtggcgg ccgtccgccc 960

tcggcaccat cctcacgaca cccaaatatg gcgacgggtg aggaatggtg gggagttatt 1020

tttagagcgg tgaggaaggt gggcaggcag caggtgttgg cgctctaaaa ataactcccg 1080

ggagttattt ttagagcgga ggaatggtgg acacccaaat atggcgacgg ttcctcaccc 1140

gtcgccatat ttgggtgtcc gccctcggcc ggggccgcat tcctgggggc cgggcggtgc 1200

tcccgcccgc ctcgataaaa ggctccgggg ccggcggcgg cccacgagct acccggagga 1260

gcgggaggcg ccaagctcta gaactagtgg atcccccggg ctgcaggaat tcgatgccac 1320

catggccgct gccgccgctg ctgctgccgc agccggcgct gccggcggaa gaggcagcgg 1380

ccctggcaga cggcggcatc tggtccctgg cgccggaggg gaggccggcg aaggcgcccc 1440

tggcggagcc ggcgactacg gcaacggcct ggaaagcgag gaactggaac ccgaggaact 1500

gctgctggaa cctgagcccg agccagagcc cgaggaagag ccccctaggc caagagcccc 1560

ccctggcgcc ccaggaccag gaccaggctc tggggcacca ggctctcagg aagaggaaga 1620

agagcccggc ctcgtcgagg gagacccagg cgatggcgct atcgaagatc ccgagctgga 1680

agccatcaag gccagagtgc gggagatgga agaggaggcc gaaaaattga aagagctgca 1740

gaacgaagtc gaaaaacaaa tgaacatgtc cccccctcct ggaaatgctg gccctgtgat 1800

catgagcatc gaggaaaaga tggaagccga cgcccggtct atctacgtgg gcaacgtgga 1860

ctacggcgcc accgccgaag aactggaagc ccactttcac ggctgtggca gcgtgaaccg 1920

ggtgaccatc ctgtgcgaca agttcagcgg ccaccccaag ggcttcgcct acatcgagtt 1980

cagcgacaaa gaaagcgtgc ggacctctct ggctctcgac gagtctctgt tcaggggaag 2040

gcagatcaag gtcatcccca agcggaccaa caggcccggc atcagcacca ccgacagagg 2100

cttccctagg gctaggtaca gagcccggac caccaactac aacagcagca gaagccggtt 2160

ctacagcggc ttcaattctc ggcctagagg cagagtgtac cggggcaggg ccagggccac 2220

ctcctggtac agcccctacg aacagaagct gatcagcgag gaagatctgt gatgagatat 2280

ctgatgacat atgacgcgtt taattaactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 2340

gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 2400

aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 2460

tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg 2520

tgggctctat gg 2532

<210> 71

<211> 1943

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR3、shmiR14和密码子优化的PABPN1的双表达构建体版本2

<400> 71

cgagctccac cgcggtggcg gccgtccgcc ctcggcacca tcctcacgac acccaaatat 60

ggcgacgggt gaggaatggt ggggagttat ttttagagcg gtgaggaagg tgggcaggca 120

gcaggtgttg gcgctctaaa aataactccc gggagttatt tttagagcgg aggaatggtg 180

gacacccaaa tatggcgacg gttcctcacc cgtcgccata tttgggtgtc cgccctcggc 240

cggggccgca ttcctggggg ccgggcggtg ctcccgcccg cctcgataaa aggctccggg 300

gccggcggcg gcccacgagc tacccggagg agcgggaggc gccaagctct agaactagtg 360

gatcccccgg gctgcaggaa ttcgatgcca ccatggccgc tgccgccgct gctgctgccg 420

cagccggcgc tgccggcgga agaggcagcg gccctggcag acggcggcat ctggtccctg 480

gcgccggagg ggaggccggc gaaggcgccc ctggcggagc cggcgactac ggcaacggcc 540

tggaaagcga ggaactggaa cccgaggaac tgctgctgga acctgagccc gagccagagc 600

ccgaggaaga gccccctagg ccaagagccc cccctggcgc cccaggacca ggaccaggct 660

ctggggcacc aggctctcag gaagaggaag aagagcccgg cctcgtcgag ggagacccag 720

gcgatggcgc tatcgaagat cccgagctgg aagccatcaa ggccagagtg cgggagatgg 780

aagaggaggc cgaaaaattg aaagagctgc agaacgaagt cgaaaaacaa atgaacatgt 840

ccccccctcc tggaaatgct ggccctgtga tcatgagcat cgaggaaaag atggaagccg 900

acgcccggtc tatctacgtg ggcaacgtgg actacggcgc caccgccgaa gaactggaag 960

cccactttca cggctgtggc agcgtgaacc gggtgaccat cctgtgcgac aagttcagcg 1020

gccaccccaa gggcttcgcc tacatcgagt tcagcgacaa agaaagcgtg cggacctctc 1080

tggctctcga cgagtctctg ttcaggggaa ggcagatcaa ggtcatcccc aagcggacca 1140

acaggcccgg catcagcacc accgacagag gcttccctag ggctaggtac agagcccgga 1200

ccaccaacta caacagcagc agaagccggt tctacagcgg cttcaattct cggcctagag 1260

gcagagtgta ccggggcagg gccagggcca cctcctggta cagcccctac tgatgacata 1320

tgacgcgtgg tatattgctg ttgacagtga gcgagaggta gagaagcaga tgaaactgtg 1380

aagcagatgg gtttcatctg cttctctacc tcgcgcctac tgcctcggac ttcaaatcat 1440

ctactccatg gccctctgcg tttgctgaag acagaaccgc aaagcaggac ccgacaggat 1500

tctccccgcc tcttcagaga ctatgtttac aagatatcgg tatattgctg ttgacagtga 1560

gcgtgagaag cagatgaata tgagactgtg aagcagatgg gtctcatatt catctgcttc 1620

tctcgcctac tgcctcggac ttcaagtcga cgctagcaat aaaggatcct ttattttcat 1680

tggatccgtg tgttggtttt ttgtgtgcgg ttaattaact gtgccttcta gttgccagcc 1740

atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt 1800

cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct 1860

ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc 1920

tggggatgcg gtgggctcta tgg 1943

<210> 72

<211> 1943

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码shmiR17、shmiR13和密码子优化的PABPN1的双构建体版本2

<400> 72

cgagctccac cgcggtggcg gccgtccgcc ctcggcacca tcctcacgac acccaaatat 60

ggcgacgggt gaggaatggt ggggagttat ttttagagcg gtgaggaagg tgggcaggca 120

gcaggtgttg gcgctctaaa aataactccc gggagttatt tttagagcgg aggaatggtg 180

gacacccaaa tatggcgacg gttcctcacc cgtcgccata tttgggtgtc cgccctcggc 240

cggggccgca ttcctggggg ccgggcggtg ctcccgcccg cctcgataaa aggctccggg 300

gccggcggcg gcccacgagc tacccggagg agcgggaggc gccaagctct agaactagtg 360

gatcccccgg gctgcaggaa ttcgatgcca ccatggccgc tgccgccgct gctgctgccg 420

cagccggcgc tgccggcgga agaggcagcg gccctggcag acggcggcat ctggtccctg 480

gcgccggagg ggaggccggc gaaggcgccc ctggcggagc cggcgactac ggcaacggcc 540

tggaaagcga ggaactggaa cccgaggaac tgctgctgga acctgagccc gagccagagc 600

ccgaggaaga gccccctagg ccaagagccc cccctggcgc cccaggacca ggaccaggct 660

ctggggcacc aggctctcag gaagaggaag aagagcccgg cctcgtcgag ggagacccag 720

gcgatggcgc tatcgaagat cccgagctgg aagccatcaa ggccagagtg cgggagatgg 780

aagaggaggc cgaaaaattg aaagagctgc agaacgaagt cgaaaaacaa atgaacatgt 840

ccccccctcc tggaaatgct ggccctgtga tcatgagcat cgaggaaaag atggaagccg 900

acgcccggtc tatctacgtg ggcaacgtgg actacggcgc caccgccgaa gaactggaag 960

cccactttca cggctgtggc agcgtgaacc gggtgaccat cctgtgcgac aagttcagcg 1020

gccaccccaa gggcttcgcc tacatcgagt tcagcgacaa agaaagcgtg cggacctctc 1080

tggctctcga cgagtctctg ttcaggggaa ggcagatcaa ggtcatcccc aagcggacca 1140

acaggcccgg catcagcacc accgacagag gcttccctag ggctaggtac agagcccgga 1200

ccaccaacta caacagcagc agaagccggt tctacagcgg cttcaattct cggcctagag 1260

gcagagtgta ccggggcagg gccagggcca cctcctggta cagcccctac tgatgacata 1320

tgacgcgtgg tatattgctg ttgacagtga gcgaaggtag agaagcagat gaatactgtg 1380

aagcagatgg gtattcatct gcttctctac ctccgcctac tgcctcggac ttcaaatcat 1440

ctactccatg gccctctgcg tttgctgaag acagaaccgc aaagcaggac ccgacaggat 1500

tctccccgcc tcttcagaga ctatgtttac aagatatcgg tatattgctg ttgacagtga 1560

gcgacgacat catggtattc ccctactgtg aagcagatgg gtaggggaat accatgatgt 1620

cgccgcctac tgcctcggac ttcaagtcga cgctagcaat aaaggatcct ttattttcat 1680

tggatccgtg tgttggtttt ttgtgtgcgg ttaattaact gtgccttcta gttgccagcc 1740

atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt 1800

cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct 1860

ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc 1920

tggggatgcg gtgggctcta tgg 1943

<210> 73

<211> 921

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人密码子优化的PABPN1 cDNA序列

<400> 73

atggccgctg ccgccgctgc tgctgccgca gccggcgctg ccggcggaag aggcagcggc 60

cctggcagac ggcggcatct ggtccctggc gccggagggg aggccggcga aggcgcccct 120

ggcggagccg gcgactacgg caacggcctg gaaagcgagg aactggaacc cgaggaactg 180

ctgctggaac ctgagcccga gccagagccc gaggaagagc cccctaggcc aagagccccc 240

cctggcgccc caggaccagg accaggctct ggggcaccag gctctcagga agaggaagaa 300

gagcccggcc tcgtcgaggg agacccaggc gatggcgcta tcgaagatcc cgagctggaa 360

gccatcaagg ccagagtgcg ggagatggaa gaggaggccg aaaaattgaa agagctgcag 420

aacgaagtcg aaaaacaaat gaacatgtcc ccccctcctg gaaatgctgg ccctgtgatc 480

atgagcatcg aggaaaagat ggaagccgac gcccggtcta tctacgtggg caacgtggac 540

tacggcgcca ccgccgaaga actggaagcc cactttcacg gctgtggcag cgtgaaccgg 600

gtgaccatcc tgtgcgacaa gttcagcggc caccccaagg gcttcgccta catcgagttc 660

agcgacaaag aaagcgtgcg gacctctctg gctctcgacg agtctctgtt caggggaagg 720

cagatcaagg tcatccccaa gcggaccaac aggcccggca tcagcaccac cgacagaggc 780

ttccctaggg ctaggtacag agcccggacc accaactaca acagcagcag aagccggttc 840

tacagcggct tcaattctcg gcctagaggc agagtgtacc ggggcagggc cagggccacc 900

tcctggtaca gcccctactg a 921

<210> 74

<211> 306

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人野生型PABPN1氨基酸序列

<400> 74

Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly

1 5 10 15

Arg Gly Ser Gly Pro Gly Arg Arg Arg His Leu Val Pro Gly Ala Gly

20 25 30

Gly Glu Ala Gly Glu Gly Ala Pro Gly Gly Ala Gly Asp Tyr Gly Asn

35 40 45

Gly Leu Glu Ser Glu Glu Leu Glu Pro Glu Glu Leu Leu Leu Glu Pro

50 55 60

Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Glu Glu Pro Pro Arg Pro Arg Ala Pro

65 70 75 80

Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ser Gly Ala Pro Gly Ser Gln

85 90 95

Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gly Leu Val Glu Gly Asp Pro Gly Asp Gly

100 105 110

Ala Ile Glu Asp Pro Glu Leu Glu Ala Ile Lys Ala Arg Val Arg Glu

115 120 125

Met Glu Glu Glu Ala Glu Lys Leu Lys Glu Leu Gln Asn Glu Val Glu

130 135 140

Lys Gln Met Asn Met Ser Pro Pro Pro Gly Asn Ala Gly Pro Val Ile

145 150 155 160

Met Ser Ile Glu Glu Lys Met Glu Ala Asp Ala Arg Ser Ile Tyr Val

165 170 175

Gly Asn Val Asp Tyr Gly Ala Thr Ala Glu Glu Leu Glu Ala His Phe

180 185 190

His Gly Cys Gly Ser Val Asn Arg Val Thr Ile Leu Cys Asp Lys Phe

195 200 205

Ser Gly His Pro Lys Gly Phe Ala Tyr Ile Glu Phe Ser Asp Lys Glu

210 215 220

Ser Val Arg Thr Ser Leu Ala Leu Asp Glu Ser Leu Phe Arg Gly Arg

225 230 235 240

Gln Ile Lys Val Ile Pro Lys Arg Thr Asn Arg Pro Gly Ile Ser Thr

245 250 255

Thr Asp Arg Gly Phe Pro Arg Ala Arg Tyr Arg Ala Arg Thr Thr Asn

260 265 270

Tyr Asn Ser Ser Arg Ser Arg Phe Tyr Ser Gly Phe Asn Ser Arg Pro

275 280 285

Arg Gly Arg Val Tyr Arg Gly Arg Ala Arg Ala Thr Ser Trp Tyr Ser

290 295 300

Pro Tyr

305

<210> 75

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人野生型PABPN1氨基酸序列（带FLAG标签）

<400> 75

Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly

1 5 10 15

Arg Gly Ser Gly Pro Gly Arg Arg Arg His Leu Val Pro Gly Ala Gly

20 25 30

Gly Glu Ala Gly Glu Gly Ala Pro Gly Gly Ala Gly Asp Tyr Gly Asn

35 40 45

Gly Leu Glu Ser Glu Glu Leu Glu Pro Glu Glu Leu Leu Leu Glu Pro

50 55 60

Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Glu Glu Pro Pro Arg Pro Arg Ala Pro

65 70 75 80

Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ser Gly Ala Pro Gly Ser Gln

85 90 95

Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gly Leu Val Glu Gly Asp Pro Gly Asp Gly

100 105 110

Ala Ile Glu Asp Pro Glu Leu Glu Ala Ile Lys Ala Arg Val Arg Glu

115 120 125

Met Glu Glu Glu Ala Glu Lys Leu Lys Glu Leu Gln Asn Glu Val Glu

130 135 140

Lys Gln Met Asn Met Ser Pro Pro Pro Gly Asn Ala Gly Pro Val Ile

145 150 155 160

Met Ser Ile Glu Glu Lys Met Glu Ala Asp Ala Arg Ser Ile Tyr Val

165 170 175

Gly Asn Val Asp Tyr Gly Ala Thr Ala Glu Glu Leu Glu Ala His Phe

180 185 190

His Gly Cys Gly Ser Val Asn Arg Val Thr Ile Leu Cys Asp Lys Phe

195 200 205

Ser Gly His Pro Lys Gly Phe Ala Tyr Ile Glu Phe Ser Asp Lys Glu

210 215 220

Ser Val Arg Thr Ser Leu Ala Leu Asp Glu Ser Leu Phe Arg Gly Arg

225 230 235 240

Gln Ile Lys Val Ile Pro Lys Arg Thr Asn Arg Pro Gly Ile Ser Thr

245 250 255

Thr Asp Arg Gly Phe Pro Arg Ala Arg Tyr Arg Ala Arg Thr Thr Asn

260 265 270

Tyr Asn Ser Ser Arg Ser Arg Phe Tyr Ser Gly Phe Asn Ser Arg Pro

275 280 285

Arg Gly Arg Val Tyr Arg Gly Arg Ala Arg Ala Thr Ser Trp Tyr Ser

290 295 300

Pro Tyr Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

305 310

<210> 76

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人密码子优化的PABPN1氨基酸序列（带FLAG-标签）

<400> 76

Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly

1 5 10 15

Arg Gly Ser Gly Pro Gly Arg Arg Arg His Leu Val Pro Gly Ala Gly

20 25 30

Gly Glu Ala Gly Glu Gly Ala Pro Gly Gly Ala Gly Asp Tyr Gly Asn

35 40 45

Gly Leu Glu Ser Glu Glu Leu Glu Pro Glu Glu Leu Leu Leu Glu Pro

50 55 60

Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Glu Glu Pro Pro Arg Pro Arg Ala Pro

65 70 75 80

Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ser Gly Ala Pro Gly Ser Gln

85 90 95

Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gly Leu Val Glu Gly Asp Pro Gly Asp Gly

100 105 110

Ala Ile Glu Asp Pro Glu Leu Glu Ala Ile Lys Ala Arg Val Arg Glu

115 120 125

Met Glu Glu Glu Ala Glu Lys Leu Lys Glu Leu Gln Asn Glu Val Glu

130 135 140

Lys Gln Met Asn Met Ser Pro Pro Pro Gly Asn Ala Gly Pro Val Ile

145 150 155 160

Met Ser Ile Glu Glu Lys Met Glu Ala Asp Ala Arg Ser Ile Tyr Val

165 170 175

Gly Asn Val Asp Tyr Gly Ala Thr Ala Glu Glu Leu Glu Ala His Phe

180 185 190

His Gly Cys Gly Ser Val Asn Arg Val Thr Ile Leu Cys Asp Lys Phe

195 200 205

Ser Gly His Pro Lys Gly Phe Ala Tyr Ile Glu Phe Ser Asp Lys Glu

210 215 220

Ser Val Arg Thr Ser Leu Ala Leu Asp Glu Ser Leu Phe Arg Gly Arg

225 230 235 240

Gln Ile Lys Val Ile Pro Lys Arg Thr Asn Arg Pro Gly Ile Ser Thr

245 250 255

Thr Asp Arg Gly Phe Pro Arg Ala Arg Tyr Arg Ala Arg Thr Thr Asn

260 265 270

Tyr Asn Ser Ser Arg Ser Arg Phe Tyr Ser Gly Phe Asn Ser Arg Pro

275 280 285

Arg Gly Arg Val Tyr Arg Gly Arg Ala Arg Ala Thr Ser Trp Tyr Ser

290 295 300

Pro Tyr Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

305 310

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> wtPABPN1-Fwd引物

<400> 77

atggtgcaac agcagaagag 20

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> wtPABPN1-Rev引物

<400> 78

ctttgggatg gccactaaat 20

<210> 79

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> wtPABPN1-探针

<400> 79

cggttgactg aaccacagcc atg 23

<210> 80

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> optPABPN1-For引物

<400> 80

accgacagag gcttcccta 19

<210> 81

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> optPABPN1-Rev引物

<400> 81

ttctgctgct gttgtagttg g 21

<210> 82

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> optPABPN1-探针

<400> 82

tggtccgggc tctgtaccta gcc 23

<210> 83

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR3-Fwd引物

<400> 83

ttcatctgct tctctacctc g 21

<210> 84

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR13-Fwd引物

<400> 84

aggggaatac catgatgtcg c 21

<210> 85

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR14-Fwd引物

<400> 85

ctcatattca tctgcttctc t 21

<210> 86

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shmiR17-Fwd引物

<400> 86

attcatctgc ttctctacct c 21

<210> 87

<211> 64

<212> PRT

<213> 腺相关病毒血清型9

<400> 87

Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn

1 5 10 15

Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu

20 25 30

Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro

35 40 45

Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys

50 55 60

<210> 88

<211> 64

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV9的修饰的VP1 PL子序列

<400> 88

Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn

1 5 10 15

Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu

20 25 30

Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro

35 40 45

Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys

50 55 60

<210> 89

<211> 736

<212> PRT

<213> 腺相关病毒血清型9

<400> 89

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

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260 265 270

Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg

275 280 285

Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn

290 295 300

Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile

305 310 315 320

Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn

325 330 335

Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu

340 345 350

Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro

355 360 365

Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp

370 375 380

Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe

385 390 395 400

Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu

405 410 415

Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu

420 425 430

Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser

435 440 445

Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser

450 455 460

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Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn

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500 505 510

Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly

530 535 540

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595 600 605

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690 695 700

Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val

705 710 715 720

Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<210> 90

<211> 736

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的AAV9衣壳VP1（全长）

<400> 90

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

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Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn

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Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val

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Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

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<210> 91

<211> 64

<212> PRT

<213> 腺相关病毒血清型8

<400> 91

Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn

1 5 10 15

Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu

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Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro

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Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln

50 55 60

<210> 92

<211> 64

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV8的修饰的VP1 PL子序列

<400> 92

Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn

1 5 10 15

Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu

20 25 30

Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro

35 40 45

Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys

50 55 60

<210> 93

<211> 738

<212> PRT

<213> 腺相关病毒血清型8

<400> 93

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

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Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

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Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

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Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

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Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln

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325 330 335

Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln

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Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe

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Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn

370 375 380

Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr

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Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr

405 410 415

Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser

420 425 430

Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu

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705 710 715 720

Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg

725 730 735

Asn Leu

<210> 94

<211> 738

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰AAV8衣壳VP1（全长）

<400> 94

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile

145 150 155 160

Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln

165 170 175

Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro

180 185 190

Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly

195 200 205

Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser

210 215 220

Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val

225 230 235 240

Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His

245 250 255

Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ala Thr Asn Asp

260 265 270

Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn

275 280 285

Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn

290 295 300

Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn

305 310 315 320

Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala

325 330 335

Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln

340 345 350

Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe

355 360 365

Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn

370 375 380

Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr

385 390 395 400

Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr

405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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465 470 475 480

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485 490 495

Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Ala Gly Thr Lys Tyr His

500 505 510

Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Ala Asn Pro Gly Ile Ala Met Ala Thr

515 520 525

His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Asn Gly Ile Leu Ile

530 535 540

Phe Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn Ala Asp Tyr Ser Asp Val

545 550 555 560

Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr

565 570 575

Glu Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala

580 585 590

Pro Gln Ile Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val

595 600 605

Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile

610 615 620

Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe

625 630 635 640

Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val

645 650 655

Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe

660 665 670

Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu

675 680 685

Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr

690 695 700

Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu

705 710 715 720

Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg

725 730 735

Asn Leu

<210> 95

<211> 145

<212> DNA

<213> 腺相关病毒2

<400> 95

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120

gccaactcca tcactagggg ttcct 145

<210> 96

<211> 145

<212> DNA

<213> 腺相关病毒2

<400> 96

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

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gagcgcgcag agagggagtg gccaa 145

<210> 97

<211> 735

<212> PRT

<213> 腺相关病毒2

<400> 97

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro

20 25 30

Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly

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Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

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Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro

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Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly

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Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

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Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr

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Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp

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Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val

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Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu

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Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr

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Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp

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Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr

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Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn

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