具体实施方式

定义

为了方便起见，下面提供在说明书、实施例和所附权利要求书中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明或从上下文暗示，否则以下术语和短语包括下面提供的含义。提供定义以帮助描述特定实施方案，并且不旨在限制要求保护的技术，因为本技术的范围仅由权利要求限制。除非另外限定，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本技术所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。如果在本领域中术语的使用与本文提供的其定义之间存在明显差异，则以说明书内提供的定义为准。

在本申请中，除非上下文另外清楚可见，否则(i)术语“一个/种”可以理解为意指“至少一个/种”；(ii)术语“或”可以理解为意指“和/或”；并且(iii)术语“包括”和“包含”可以理解为涵盖逐项列出的组分或步骤，无论它们是单独呈现还是与一个/种或多个/种额外组分或步骤一起呈现。

如本文所用，术语“约”和“大约”是指在所描述的值以上或以下10％内的值。例如，术语“约5nM”指示4.5nM至5.5nM的范围。

如从上下文中清楚可见，在数字或系列数字之前的术语“至少”应理解为包括与术语“至少”相邻的数字，以及逻辑上可以包括的所有后续数字或整数。例如，核酸分子中核苷酸的数目必须是整数。例如，“21个核苷酸的核酸分子的至少18个核苷酸”意指18、19、20或21个核苷酸具有所指示的性质。当至少存在于一系列数字或范围之前时，应理解“至少”可以修饰所述系列或范围中的每个数字。

如本文所用，“不多于”或“小于”应理解为与短语相邻的值和逻辑上更低的值或整数，如根据上下文的逻辑，至零。例如，具有“不多于3个与靶序列的错配”的寡核苷酸具有3、2、1或0个与靶序列的错配。当“不多于”存在于一系列数字或范围之前时，应理解“不多于”可以修饰所述系列或范围中的每个数字。

如本文所用，术语“施用”是指将组合物(例如，化合物或包含如本文所述的化合物的制剂)施用到受试者或系统。向动物受试者(例如，人)的施用可以通过任何合适的途径如本文所述的途径进行。

如本文所用，“组合疗法”或“组合施用”意指将两种(或更多种)不同的剂或治疗作为特定疾病或病况的限定治疗方案的一部分施用到受试者。治疗方案定义了每种剂的剂量和施用周期，使得单独的剂对受试者的作用重叠。在一些实施方案中，两种或更多种剂的递送是同时或并行的，并且所述剂可以被共同配制。在一些实施方案中，两种或更多种剂不是共同配制的，而是作为指定方案的一部分以顺序方式施用。在一些实施方案中，两种或更多种剂或治疗的组合施用使得症状或与病症相关的其他参数的减轻大于单独递送一种剂或治疗或不存在另一种剂或治疗时将观察到的减轻。两种治疗的效果可以是部分相加的、完全相加的或大于相加的(例如，协同的)。每种治疗剂的顺序或基本上同时施用可以通过任何合适的途径实现，所述途径包括但不限于口服途径、静脉内途径、肌内途径和通过粘膜组织直接吸收。治疗剂可以通过相同途径或通过不同途径施用。例如，组合的第一治疗剂可以通过静脉内注射施用，而组合的第二治疗剂可以口服施用。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“KCNT1”是指钾钠激活的通道亚家族T成员1，其具有来自包括但不限于人、牛、鸡、啮齿动物、小鼠、大鼠、猪、羊、灵长类动物、猴和豚鼠的任何脊椎动物或哺乳动物来源的氨基酸序列。所述术语还指天然KCNT1的维持天然KCNT1的至少一种体内或体外活性的片段和变体。所述术语涵盖KCNT1的全长未加工前体形式以及由信号肽的翻译后裂解产生的成熟形式。KCNT1由KCNT1基因编码。示例性智人(人)KCNT1基因的核酸序列在NCBI参考号NG_033070.1中示出。示例性智人(人)KCNT1转录物的核酸序列在NCBI参考号NM_020822.2和NM_001272003.1中示出。术语“KCNT1”还指野生型KCNT1蛋白的天然变体，例如与野生型人KCNT1的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或更高同一性)的蛋白质。示例性小家鼠(小鼠)KCNT1转录物的核酸序列在NCBI参考号NM_175462.4和NM_001145403.2以及NM_01302351.1中示出。示例性食蟹猕猴(cyno)KCNT1转录物的核酸序列在NCBI参考号XM_015436456.1中示出。

如本文所用的术语“KCNT1”还指通过KCNT1基因的天然存在的DNA序列变异(诸如KCNT1基因中的单核苷酸多态)在细胞中表达的特定多肽。已经鉴定出在KCNT1转录物内的许多SNP(参见例如，表1)。

如本文所用，“靶序列”是指在KCNT1基因的转录期间形成的mRNA分子(包括作为初级转录产物的RNA加工的产物的mRNA)的核苷酸序列的连续部分。在一个实施方案中，序列的靶部分的长度将至少足以在KCNT1基因的转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的部分处或其附近充当寡核苷酸定向(例如，反义寡核苷酸(ASO)定向)裂解的底物。靶序列的长度可以是例如约9-36个核苷酸，例如，约15-30个核苷酸，例如，约18-22个核苷酸。例如，靶序列的长度可以是约15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个核苷酸。在上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本发明的一部分。

“G”、“C”、“A”、“T”和“U”各自通常分别代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷和尿嘧啶作为碱基的天然存在的核苷酸。然而，应理解术语“核苷酸”也可以指如下进一步详述的替代的核苷酸或替代物置换部分。本领域技术人员很清楚，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以被其他部分置换而基本上不改变包含携带这种置换部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对性质。例如但不限于，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以在本发明的特征性寡核苷酸的核苷酸序列中被含有例如肌苷的核苷酸置换。在另一实施例中，寡核苷酸中任何位置处的腺嘌呤和胞嘧啶可以分别被鸟嘌呤和尿嘧啶置换以与靶mRNA形成G-U摇摆碱基配对。含有这种置换部分的序列适于本发明的特征性组合物和方法。

术语“核碱基”和“碱基”包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文中，术语核碱基还涵盖可以不同于天然存在的核碱基，但在核酸杂交期间有功能的替代的核碱基。在此上下文中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及替代的核碱基。此类变体例如描述于Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research,第45卷,第2055页和Bergstrom(2009)CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry,增刊371.4.1中。

术语“核苷”是指具有核碱基和糖部分的寡核苷酸或多核苷酸的单体单元。核苷可以包括天然存在的核苷以及替代的核苷，诸如本文所述的那些。核苷的核碱基可以是天然存在的核碱基或替代的核碱基。类似地，核苷的糖部分可以是天然存在的糖或替代的糖。

术语“替代的核苷”或“修饰的核苷”是指具有替代的糖或替代的核碱基的核苷，诸如本文所述的那些。

在一些实施方案中，通过将嘌呤或嘧啶改变为修饰的嘌呤或嘧啶，诸如取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿苷、5-溴尿苷、5-噻唑-尿苷、2-硫代-尿苷、假尿苷、1-甲基假尿苷、5-甲氧基尿苷、2'-硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的“替代的核碱基”来修饰核碱基部分。

核碱基部分可以由每个相应核碱基的字母代码指示，例如A、T、G、C或U，其中每个字母可以任选地包括具有等同功能的替代的核碱基。在一些实施方案中，例如，例如对于缺口体(gapmer)，可以使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。

“糖”或“糖部分”包括具有呋喃糖环的天然存在的糖。糖还包括定义为能够置换核苷的呋喃糖环的结构的“替代的糖”。在某些实施方案中，替代的糖是非呋喃糖(或4'-取代的呋喃糖)环或环系统或开放系统。此类结构包括相对于诸如六元环的天然呋喃糖环的简单变化，或者可能更复杂，如在肽核酸中使用的非环系统的情况。替代的糖还可以包括其中呋喃糖环已经被诸如像吗啉代或己糖醇环系统的另一环系统置换的糖替代物。可用于制备具有基序的寡核苷酸的糖部分包括但不限于β-D-核糖、β-D-2'-脱氧核糖、取代的糖(诸如2',5'和双取代的糖)、4'-S-糖(诸如4'-S-核糖、4'-S-2'-脱氧核糖和4'-S-2'-取代的核糖)、双环替代的糖(诸如2'-O—CH₂-4'或2'-O—(CH₂)₂-4'桥接核糖衍生的双环糖)和糖替代物(诸如当核糖环已被吗啉代或己糖醇环系统置换时)。在每个位置使用的杂环碱基和核苷间键联的类型是可变的，并且不是决定基序的因素。在大多数具有替代的糖部分的核苷中，通常维持杂环核碱基以允许杂交。

如本文所用的“核苷酸”是指包含核苷和核苷间键联的寡核苷酸或多核苷酸的单体单元。核苷间键联可以包括或者可以不包括磷酸酯键联。类似地，“连接的核苷”可以或者可以不通过磷酸酯键联连接。许多“替代的核苷间键联”是本领域已知的，包括但不限于磷酸酯、硫代磷酸酯和硼代磷酸酯键联。替代的核苷包括双环核苷(BNA)(例如，锁核苷(LNA)和限制性乙基(cEt)核苷)、肽核苷(PNA)、磷酸三酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和天然核苷的磷酸酯骨架的其他变体，包括本文所述的那些。

如本文所用的“替代的核苷酸”是指具有替代的核苷或替代的糖和可以包括替代的核苷键联的核苷间键联的核苷酸。

如本文所用的术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”如技术人员通常理解的那样定义为包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。这类共价结合的核苷也可以称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常在实验室中通过固相化学合成然后纯化来制备。当提及寡核苷酸的序列时，是指共价连接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸可以是人造的，化学合成的，并且通常是纯化的或分离的。寡核苷酸还旨在包括(i)具有一个或多个呋喃糖部分的化合物，所述呋喃糖部分被呋喃糖衍生物或被可以用作碱基部分的共价连接点的任何环状或非环状结构置换，(ii)具有一个或多个磷酸二酯键联的化合物，所述磷酸二酯键联是修饰的，如在氨基磷酸酯或硫代磷酸酯键联的情况下，或完全被合适的连接部分置换，如在甲缩醛或核糖缩醛键联的情况下，和/或(iii)具有一个或多个连接的呋喃糖-磷酸二酯键联部分的化合物，所述连接的呋喃糖-磷酸二酯键联部分被可以用作碱基部分的共价连接点的任何环状或非环状结构置换。本发明的寡核苷酸可以包含一个或多个替代的核苷或核苷酸(例如，包括本文所述的那些)。还应理解，寡核苷酸包括缺乏糖部分或核碱基但仍能够与靶序列形成配对或杂交的组合物。

“寡核苷酸”是指短多核苷酸(例如，具有100个或更少连接的核苷)。

在本发明的上下文中，“嵌合”寡核苷酸或“嵌合体”是含有两个或更多个化学上不同的区域的寡核苷酸，每个区域由至少一个单体单元(即，在寡核苷酸的情况下为核苷酸或核苷)组成。嵌合寡核苷酸还包括“缺口体”。

寡核苷酸可以具有允许通过RNA酶H介导的途径特异性降解所需靶RNA的任何长度，并且长度的范围可以是约10-30个碱基对，例如，约15-30个碱基对或约18-22(例如，18-20)个碱基对，例如约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基对，诸如约15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个碱基对。在上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本发明的一部分。

如本文所用，术语“包含核碱基序列的寡核苷酸”是指包含核苷酸或核苷链的寡核苷酸，所述核苷酸或核苷链由使用标准核苷酸命名法提及的序列描述。

术语“连续核碱基区域”是指与靶核酸互补的寡核苷酸的区域。所述术语在本文中可以与术语“连续核苷酸序列”或“连续核碱基序列”互换使用。在一些实施方案中，寡核苷酸的所有核苷酸存在于连续核苷酸或核苷区域中。在一些实施方案中，寡核苷酸包含连续核苷酸区域，并且可以任选地包含一个或多个另外的核苷酸或核苷，例如可以用于将官能团连接到连续核苷酸序列的核苷酸接头区域。核苷酸接头区域可以或者可以不与靶核酸互补。在一些实施方案中，存在于连续核苷酸区域的核苷酸之间的核苷间键联全部是硫代磷酸酯核苷间键联。在一些实施方案中，连续核苷酸区域包含一个或多个糖修饰的核苷。

如本文所用的术语“缺口体”是指包含RNA酶H募集寡核苷酸的区域(缺口)的寡核苷酸，其由包含一个或多个亲和力增强的替代的核苷的区域(侧翼或侧基)5'和3'侧接。本文描述了各种缺口体设计。头体(headmer)和尾体(tailmer)是能够募集RNA酶H的寡核苷酸，其中一个侧翼缺失，例如，寡核苷酸的仅一个末端包含亲和力增强的替代的核苷。对于头体，3'侧翼缺失(例如，5'侧翼包含亲和力增强的替代的核苷)，并且对于尾体，5'侧翼缺失(例如，3'侧翼包含亲和力增强的替代的核苷)。“混合侧翼缺口体”是指其中侧翼区域包含至少一个替代的核苷的缺口体，所述替代的核苷例如至少一个DNA核苷或至少一个2'取代的替代的核苷，诸如像2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA、2'-F-ANA核苷或双环核苷(例如，锁核苷或限制性乙基(cEt)核苷)。在一些实施方案中，混合侧翼缺口体具有一个包含替代的核苷的侧翼(例如，5'或3')，并且另一个侧翼(分别为3'或5')包含2'取代的替代的核苷。

术语“接头”或“连接基团”是两个原子之间的连接，其经由一个或多个共价键将一个感兴趣化学基团或片段连接至另一个感兴趣化学基团或片段。缀合部分可以直接或通过连接部分(例如，接头或系链基团(tether))与寡核苷酸连接。接头用于将第三区域(例如，缀合部分)共价连接到寡核苷酸(例如，区域A或C的末端)。在本发明的一些实施方案中，本发明的缀合物或寡核苷酸缀合物可以任选地包含定位在寡核苷酸与缀合物部分之间的接头区域。在一些实施方案中，在缀合物与寡核苷酸之间的接头是可生物裂解的。含有磷酸二酯的可生物裂解接头在国际公开号WO 2014/076195(以引用的方式并入本文中)中更详细地描述。

如本文所用，并且除非另外指示，否则如技术人员所理解，术语“互补”在用于描述与第二核苷酸或核苷序列有关的第一核苷酸或核苷序列时，是指包含第一核苷酸或核苷序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链体结构的能力。此类条件可以例如为严格条件，其中严格条件可以包括：400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA、50℃或70℃，12-16小时，然后洗涤(参见例如，“Molecular Cloning:ALaboratory Manual”,Sambrook等人(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press)。可以应用其他条件，例如如在生物体内部可能遇到的生理相关条件。技术人员将能够根据杂交核苷酸或核苷的最终应用确定最适合于两个序列的互补性的测试的条件集合。

就满足上述关于它们杂交能力的要求而言，如本文所用的“互补”序列还可以包括非沃森-克里克(non-Watson-Crick)碱基对和/或由非天然和替代的核苷酸或核苷形成的碱基对，或完全由其形成。这类非沃森-克里克碱基对包括但不限于G:U摇摆或Hoogstein碱基配对。如本文所述的寡核苷酸与靶序列之间的互补序列包括在一个或两个核苷酸或核苷序列的整个长度上，包含第一核苷酸或核苷序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸或核苷序列的寡核苷酸或多核苷酸的碱基配对。此类序列在本文中可以称为相对于彼此“完全互补”。然而，当第一序列在本文中被称为相对于第二序列“基本上互补”时，这两个序列可以是完全互补的，或者它们在杂交至多30个碱基对的双链体时可以形成一个或多个，但通常不多于5、4、3或2个错配碱基对，同时保留了在与它们最终应用最相关的条件下杂交的能力，例如，经由RNA酶H介导的途径抑制基因表达。“基本上互补”也可以指与感兴趣mRNA(例如，编码KCNT1的mRNA)的连续部分基本上互补的多核苷酸。例如，如果序列与编码KCNT1的mRNA的非中断部分基本上互补，则多核苷酸与KCNT1 mRNA的至少一部分互补。

如本文所用，术语“互补区域”是指寡核苷酸上与基因、初级转录物、序列(例如，靶序列，例如，KCNT1 mRNA核苷酸序列或KCNT1mRNA转录物变体)或加工的mRNA的全部或一部分基本上互补以干扰内源性基因(例如，KCNT1)的表达的区域。当互补区域与靶序列不完全互补时，错配可以在分子的内部或末端区域中。通常，最容忍的错配是在末端区域中，例如，在寡核苷酸的5'末端和/或3'末端的5、4、3或2个核苷酸内。

如本文所用，“降低KCNT1的水平和/或活性的剂”是指在细胞或受试者中降低KCNT1的水平或抑制其表达的任何多核苷酸剂(例如，寡核苷酸，例如，ASO)。如本文所用的短语“抑制KCNT1的表达”包括抑制任何KCNT1基因(诸如像，小鼠KCNT1基因、大鼠KCNT1基因、猴KCNT1基因或人KCNT1基因)以及编码KCNT1蛋白的KCNT1基因的变体或突变体的表达。因此，在遗传学操作的细胞、细胞组或生物体的背景中，KCNT1基因可以是野生型KCNT1基因、突变体KCNT1基因或转基因KCNT1基因。

“降低KCNT1的活性”意指降低与KCNT1相关的活性(例如，离子通道功能)的水平。KCNT1的活性水平可以使用本领域已知的任何方法(例如，使用标准生物物理方法)测量。

“降低KCNT1的水平”意指例如通过向细胞或受试者施用寡核苷酸来降低细胞或受试者中KCNT1的量。KCNT1的水平可以使用本领域已知的任何方法(例如，通过测量细胞或受试者中KCNT1 mRNA的水平或KCNT1蛋白的水平)测量。

如本文所用，术语“抑制剂”是指降低蛋白质(例如，KCNT1)的水平和/或活性的任何剂。抑制剂的非限制性实例包括多核苷酸(例如，寡核苷酸，例如，ASO)。如本文所用的术语“抑制”可与“减少”、“沉默”、“下调”、“遏制”和其他类似术语互换使用，并且包括任何水平的抑制。

如本文所用的短语“使细胞与寡核苷酸接触”，诸如寡核苷酸，包括通过任何可能的方式接触细胞。使细胞与寡核苷酸接触包括使细胞在体外与寡核苷酸接触或使细胞在体内与寡核苷酸接触。所述接触可以直接或间接进行。因此，例如，通过个体进行所述方法，可以使寡核苷酸与细胞物理接触，或另选地，可以使寡核苷酸剂处于将允许或导致其随后与细胞接触的情况。

体外接触细胞可以例如通过将细胞与寡核苷酸一起孵育来进行。体内接触细胞可以例如通过将寡核苷酸注射到细胞所在的组织中或附近，或通过将寡核苷酸剂注射到另一区域，例如血流或皮下空间，使得剂随后将到达待接触的细胞所在的组织来进行。例如，寡核苷酸可以含有配体和/或与配体偶联，例如，GalNAc3，所述配体将寡核苷酸引导到感兴趣部位，例如，肝。体外接触方法和体内接触方法的组合也是可能的。例如，细胞也可以在体外与寡核苷酸接触，随后移植到受试者中。

在一个实施方案中，使细胞与寡核苷酸接触包括通过促进或实现摄取或吸收到细胞中来“引入”或“递送寡核苷酸到细胞中”。ASO的吸收或摄取可以通过无辅助的扩散或活性细胞过程或通过助剂或装置发生。将寡核苷酸引入细胞中可以在体外和/或体内进行。例如，对于体内引入，可以将寡核苷酸注射到组织部位或全身施用。体外引入细胞中包括本领域已知的方法，诸如电穿孔和脂质转染。另外的方法在下文中描述和/或是本领域中是已知的。

如本文所用，“脂质纳米颗粒”或“LNP”是包含脂质层的囊泡，所述脂质层包封药物活性分子，诸如核酸分子，例如，寡核苷酸。LNP是指稳定的核酸-脂质颗粒。LNP通常含有阳离子脂质、非阳离子脂质和防止颗粒聚集的脂质(例如，PEG-脂质缀合物)。LNP描述于例如美国专利号6,858,225、6,815,432、8,158,601和8,058,069中，其全部内容以引用的方式并入本文中。

如本文所用，术语“脂质体”是指由布置在至少一个双层，例如，一个双层或多个双层中的两亲性脂质组成的囊泡。脂质体包括单层囊泡和多层囊泡，其具有由亲脂性材料形成的膜和水性内部。水性部分含有寡核苷酸组合物。亲脂性材料将水性内部与水性外部隔离，所述水性外部通常不包括寡核苷酸组合物，但是在一些实施例中，其可以包括寡核苷酸组合物。脂质体还包括“空间稳定的”脂质体，如本文所用的术语，是指包含一种或多种特化脂质的脂质体，当将特化脂质掺入脂质体中时，相对于缺乏这类特化脂质的脂质体，引起循环寿命增加。

“胶束”在本文中定义为特定类型的分子组装体，其中两亲性分子以球形结构布置，使得分子的所有疏水部分向内，留下亲水部分与周围水相接触。如果环境是疏水的，则存在相反的布置。

如本文所用的术语“反义”是指包含与基因、初级转录物或加工的mRNA的全部或一部分充分互补以干扰内源性基因(例如，KCNT1)的表达的寡核苷酸或多核苷酸的核酸。“互补的”多核苷酸是能够根据标准的沃森-克里克互补原则进行碱基配对的多核苷酸。具体地，嘌呤将与嘧啶进行碱基配对，以形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G:C)和腺嘌呤与胸腺嘧啶配对(A:T)(在DNA的情况下)或腺嘌呤与尿嘧啶配对(A:U)(在RNA的情况下)的组合。应理解，两个多核苷酸可以彼此杂交，即使它们彼此不完全互补，只要每个多核苷酸具有至少一个与另一个区域基本上互补的区域即可。

如本文所用，术语本文所述的降低(例如，细胞或受试者中)KCNT1的水平和/或活性的剂的“有效量”、“治疗有效量”和“足够量”是指当向包括人的受试者施用时，足以产生包括临床结果的有益或所需结果的量，因此，“有效量”或其同义词取决于其应用的背景。例如，在治疗KCNT1相关病症的背景下，其为降低KCNT1的水平和/或活性的剂与没有施用降低KCNT1的水平和/或活性的剂所获得的反应相比足以实现治疗反应的量。本文所述的降低KCNT1的水平和/或活性的给定剂将与这种量对应的量将根据各种因素(诸如给定剂、药物制剂、施用途径、疾病或病症的类型、所治疗的受试者(例如，年龄、性别和/或体重)或宿主的身份等)而变，但可以由本领域技术人员常规地确定。此外，如本文所用，本公开的降低KCNT1的水平和/或活性的剂的“治疗有效量”是与对照相比在受试者中产生有益或所需结果的量。如本文所定义，本领域普通技术人员通过本领域已知的常规方法可以容易地确定本公开的降低KCNT1的水平和/或活性的剂的治疗有效量。可以调整给药方案以提供最佳治疗反应。

如本文所用的“预防有效量”旨在包括当向患有或倾向于患有KCNT1相关病症的受试者施用时，足以预防或改善所述疾病或所述疾病的一种或多种症状的寡核苷酸的量。改善疾病包括减缓疾病的进程或降低后来发展的疾病的严重性。“预防有效量”可以根据寡核苷酸、如何施用剂、疾病的风险程度以及待治疗受试者的病史、年龄、体重、家族史、基因构成、之前或伴随治疗的类型(如果有的话)以及其他个体特征而变化。预防有效量还指，例如，本文所述的降低(例如，细胞或受试者中)KCNT1的水平和/或活性的剂的量，是指当向包括人的受试者施用时，与预测的发作相比，足以将如本文所述的KCNT1相关病症的发作延迟至少120天，例如至少6个月、至少12个月、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少10年或更久的量。

“治疗有效量”或“预防有效量”还包括以适用于任何治疗的合理效益/风险比产生一些所需局部或全身效果的寡核苷酸的量(以单剂量或多剂量施用)。本发明的方法中所用的寡核苷酸可以以足以产生适用于这种治疗的合理的效益/风险比的量施用。

如本文所用，术语“互补区域”是指寡核苷酸上与基因、初级转录物、序列(例如，靶序列，例如，KCNT1 mRNA核苷酸序列或KCNT1mRNA转录物变体)或加工的mRNA的全部或一部分基本上互补以干扰内源性基因(例如，KCNT1)的表达的区域。当互补区域与靶序列不完全互补时，错配可以在分子的内部或末端区域中。通常，最容忍的错配是在末端区域中，例如，在寡核苷酸的5'末端和/或3'末端的5、4、3或2个核苷酸内。

如本文所用，术语“鉴定为患有KCNT1相关病症的受试者”是指鉴定为患有KCNT1相关病症的或与其相关的分子或病理状态、疾病或病况的受试者，例如鉴定KCNT1相关病症或其症状，或者是指鉴定患有或怀疑患有可以受益于特定治疗方案的KCNT1相关病症的受试者。

如本文所用，“KCNT1相关病症”是指一类以KCNT1的功能异常为特征的遗传疾病或病症。KCNT1相关病症包括，例如，婴儿癫痫伴游走性局灶性发作(EIMFS)、常染色体显性遗传夜间额叶癫痫(ADNFLE)、韦斯特综合征、婴儿痉挛、癫痫性脑病、局灶性癫痫、大田原综合征、发育性癫痫性脑病和伦诺克斯-加斯托综合征

“确定蛋白质的水平”意指通过本领域已知的方法直接或间接检测蛋白质或编码蛋白质的mRNA。“直接确定”意指进行处理(例如，对样品进行测定或测试或“分析样品”，所述术语如本文所定义)以获得物理实体或值。“间接确定”是指从另一方或来源(例如，直接获取物理实体或值的第三方实验室)接收物理实体或值。测量蛋白质水平的方法通常包括但不限于蛋白质印迹法、免疫印迹法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀、免疫荧光、表面等离子体共振、化学发光、荧光偏振、磷光、免疫组织化学分析、基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱、液相色谱(LC)-质谱、微细胞计数法、显微镜检查、荧光激活细胞分选(FACS)和流式细胞术，以及基于蛋白质性质的测定，所述蛋白质性质包括但不限于酶活性或与其他蛋白质配偶体的相互作用。测量mRNA水平的方法是本领域已知的。

关于参考多核苷酸或多肽序列的“百分比(％)序列同一性”定义为在比对序列并引入缺口(如果需要)以实现最大百分比序列同一性之后，候选序列中与参考多核苷酸或多肽序列中的核酸或氨基酸相同的核酸或氨基酸的百分比。用于确定核酸或氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术人员能力范围内的多种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2或Megalign软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括对所比较的序列的全长实现最大比对所需的任何算法。例如，百分比序列同一性值可以使用序列比较计算机程序BLAST生成。作为说明，给定核酸或氨基酸序列A与给定核酸或氨基酸序列B的百分比序列同一性(其可以另选地被表述为给定核酸或氨基酸序列A与给定核酸或氨基酸序列B具有一定的百分比序列同一性)计算如下：

100乘以(分数X/Y)

其中X是在A和B的程序比对中通过序列比对程序(例如，BLAST)评分为相同匹配的核苷酸或氨基酸的数目，并且其中Y是B中核酸的总数。应当理解，当核酸或氨基酸序列A的长度不等于核酸或氨基酸序列B的长度时，A与B的百分比序列同一性将不等于B与A的百分比序列同一性。

“水平”意指蛋白质或编码蛋白质(例如，KCNT1)的mRNA的水平或活性，任选地与参考比较。所述参考可以是如本文所定义的任何有用的参考。蛋白质的“降低的水平”或“增加的水平”意指与参考相比蛋白水平的降低或增加(例如，降低或增加约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约150％、约200％、约300％、约400％、约500％或更大；与参考相比，降低或增加多于约10％、约15％、约20％、约50％、约75％、约100％或约200％；降低或增加小于约0.01倍、约0.02倍、约0.1倍、约0.3倍、约0.5倍、约0.8倍或更低；或增加超过约1.2倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.8倍、约2.0倍、约3.0倍、约3.5倍、约4.5倍、约5.0倍、约10倍、约15倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约100倍、约1000倍或更高)。蛋白质的水平可以以质量/体积(例如，g/dL、mg/mL、μg/mL和ng/mL)或相对于样品中总蛋白质或mRNA的百分比表示。

如本文所用的术语“药物组合物”表示含有与药学上可接受的赋形剂一起配制并且优选地作为用于治疗哺乳动物的疾病的治疗方案的一部分在政府管理机构批准的情况下制造或销售的本文所述的化合物的组合物。药物组合物可以配制成例如用于以单位剂型口服施用(例如，片剂、胶囊、囊片、软胶囊或糖浆)；用于局部施用(例如，作为乳膏、凝胶、洗剂或软膏)；用于静脉内施用(例如，作为不含颗粒栓塞物并且在适于静脉内使用的溶剂系统中的无菌溶液)；用于鞘内注射；用于脑室内注射；用于脑实质内注射；或呈任何其他药学上可接受的制剂。

如本文所用的“药学上可接受的赋形剂”是指除本文所述的化合物之外并且在受试者中具有基本上无毒和非炎性的特性的任何成分(例如，能够悬浮或溶解活性化合物的媒介物)。赋形剂可包括例如：抗粘剂、抗氧化剂、粘合剂、包衣、压缩助剂、崩解剂、染料(颜料)、软化剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣、调味剂、香料、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂以及水合作用的水。示例性赋形剂包括但不限于：丁羟甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸钙(二碱式)、硬脂酸钙、交联羧甲纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶凝淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、淀粉羟基乙酸钠、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C以及木糖醇。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”意指本文所述的任何化合物的化合物的任何药学上可接受的盐。例如，本文所述的任何化合物的药学上可接受的盐包括在合理的医学判断范围内适合与人和动物的组织接触使用而没有过度毒性、刺激性、过敏反应且与合理的利益/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐是本领域中熟知的。例如，药学上可接受的盐描述于：Berge等人,J.Pharmaceutical Sciences66:1-19,1977和PharmaceuticalSalts:Properties,Selection,and Use,(P.H.Stahl和C.G.Wermuth编),Wiley-VCH,2008中。这些盐可以在本文所述的化合物的最终分离和纯化期间原位制备，或者通过使游离碱基团与合适的有机酸反应而单独制备。

本文所述的化合物可以具有可电离的基团，从而能够制备为药学上可接受的盐。这些盐可以是涉及无机或有机酸的酸加成盐，或者在酸性形式的本文所述的化合物的情况下，这些盐可以由无机或有机碱制备。通常，将化合物制备为或用作制备为药学上可接受的酸或碱的加成产物的药学上可接受的盐。合适的药学上可接受的酸和碱以及制备合适的盐的方法是本领域中熟知的。盐可以由包括无机和有机酸和碱的药学上可接受的无毒酸和碱制备。代表性酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖庚糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐和戊酸盐。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙和镁，以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺和乙胺。

“参考”意指用于比较蛋白质或mRNA水平或活性的任何有用的参考。所述参考可以是用于比较目的任何样品、标准品、标准曲线或水平。参考可以是正常参考样品或参考标准或水平。“参考样品”可以是例如对照，例如，预定的阴性对照值，诸如“正常对照”或取自同一受试者的先前样品；来自正常健康受试者的样品，例如正常细胞或正常组织；来自未患病的受试者的样品(例如，细胞或组织)；来自被诊断患有疾病但尚未用本文所述的化合物治疗的受试者的样品；来自已经用本文所述的化合物治疗的受试者的样品；或已知正常浓度的纯化蛋白(例如，本文所述的任何蛋白)的样品。“参考标准或水平”是指来源于参考样品的值或数字。“正常对照值”是指示非疾病状态的预定值，例如，在健康对照受试者中预期的值。通常，正常对照值被表示为范围(“在X与Y之间”)、高阈值(“不高于X”)或低阈值(“不低于X”)。对于特定生物标记物测量值在正常对照值内的受试者通常被称为对于所述生物标记物“在正常限度内”。正常参考标准或水平可以是来源于未患疾病或病症(例如，KCNT1相关病症)的正常受试者的值或数值；已经用本文所述的化合物治疗的受试者。在优选的实施方案中，参考样品、标准或水平通过以下标准中的至少一种与样品受试者样品匹配：年龄、体重、性别、疾病阶段和总体健康。在正常参考范围内的纯化的蛋白质(例如，本文所述的任何蛋白质)的水平的标准曲线也可以用作参考。

如本文所用，术语“受试者”是指可以例如出于实验、诊断、预防和/或治疗目的施用根据本发明的组合物的任何生物体。典型的受试者包括任何动物(例如，哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人)。受试者可寻求或需要治疗、要求治疗、正接受治疗、将来接受治疗或者是由针对特定疾病或病况受过训练的专业人员照顾的人或动物。

如本文所用，术语“治疗(treat、treated或treating)”意指治疗性治疗和预防性(prophylactic或preventative)措施两者，其中目的是防止或减慢(减轻)不期望的生理病况、病症或疾病，或获得有益或所需的临床结果。有益或所需的临床结果包括但不限于：症状的减轻；病况、病症或疾病程度的减小；病况、病症或疾病的稳定(即，不恶化)状态；病况、病症或疾病发作的延迟或进展的减慢；病况、病症或疾病状态的改善或减轻(不管部分还是全部)，不管是可检测还是不可检测的；至少一种可测量的物理参数(不必是受试者可辨别的)的改善；或者病况、病症或疾病的增强或改善。治疗包括引出临床上重要的反应而没有过量水平的副作用。治疗还包括与不接受治疗情况下的预期存活相比延长的存活。

如本文所用，术语“衍生物”是指本文所述的化合物、肽、蛋白质或其他物质的天然存在的、合成的和半合成的类似物。本文所述的化合物、肽、蛋白质或其他物质的衍生物可以保留或改善原始材料的生物活性。

本发明的一个或多个实施方案的细节在下面的描述中列出。自描述和权利要求书中将显而易见本发明的其他特征、目的和优点。

KCNT1相关病症

本发明人发现，细胞中KCNT1水平和/或活性的抑制或消耗在治疗KCNT1相关病症中是有效的。因此，本发明的特征在于治疗例如有需要的受试者的KCNT1相关病症的有用组合物和方法。本发明的特征在于单链寡核苷酸，其长度包括18-22(例如，18、19、20、21和22)个连接的核苷，具有SEQ ID NO:1-3525中任一个(例如，SEQ ID NO:1-116或1、4、5、6、8、10、12、13、15、17、28、29、62、625-649、1046、1071、1195-1224、1388、1496-1567、2591-2631或3395-3525)的至少18(例如，18、19、20、21和22)个连续核碱基的区域。特征还在于在人和小鼠，人和猴，或人、小鼠和猴KCNT1之间交叉杂交的寡核苷酸。人KCNT1 mRNA转录物的序列(NCBI NM_020822.2)作为SEQ ID NO:3526提供。小鼠KCNT1 mRNA转录物的序列作为SEQ IDNO:3533提供。食蟹猕猴(cynomolgous monkey)(食蟹猕猴(Macaca fascicularis))KCNT1mRNA转录物的序列作为SEQ ID NO:3534提供。可以将寡核苷酸(例如，化学修饰的寡核苷酸)施用到患有KCNT1相关病症(例如，癫痫)的受试者以治疗、减轻KCNT1相关病症的症状或预防KCNT相关病症。寡核苷酸与KCNT1(例如，KCNT1 mRNA，包括前体mRNA和加工的mRNA)的靶区域反义(例如，至少部分互补)。在施用后，寡核苷酸降低KCNT1(例如，KCNT1 mRNA和/或蛋白质)的水平、表达和/或活性，从而为患有KCNT1相关病症的受试者提供治疗效果。

KCNT1编码在中枢神经系统中表达的细胞内钠激活的钾通道(钾钠激活的通道亚家族T成员1)。KCNT1还称为Slack，是钾通道基因的Slo型家族的成员并且可以与其他Slo通道亚单元共组装。这些通道可以介导钠敏感性钾电流(IKNa)，其由钠通道离子通过钠通道或神经递质受体的流入而触发。延迟的外向电流可能参与调节神经元兴奋性。野生型KCNT1(UNIPROT ID Q5JUK3-3)的氨基酸序列作为SEQ ID NO:3527提供。G288S KCNT1的氨基酸序列作为SEQ ID NO:3528提供。R398Q KCNT1的氨基酸序列作为SEQ ID NO:3529提供。R428QKCNT1的氨基酸序列作为SEQ ID NO:3530提供。R928CKCNT1的氨基酸序列作为SEQ ID NO:3531提供。A934T KCNT1的氨基酸序列作为SEQ ID NO:3532提供。

KCNT1中的突变(例如，功能获得性突变)已与特定形式的癫痫相关，包括婴儿癫痫伴游走性局灶性发作(EIMFS)、常染色体显性遗传夜间额叶癫痫(ADNFLE)、韦斯特综合征、婴儿痉挛、癫痫性脑病、局灶性癫痫、大田原综合征、发育性癫痫性脑病和伦诺克斯-加斯托综合征。

EIMFS是罕见且衰弱的遗传病况，其特征在于几乎连续的异质性病灶发作的早期发作(在6月龄之前)，其中发作似乎从一个脑区和半球迁移到另一个。患有EIMFS的受试者可能是智力受损的、非言语的和卧床的。患有EIMFS的受试者可以具有KCNT1的突变(例如，功能获得性突变)，例如V271F、G288S、R428Q、R474Q、R474H、R474C、I760M、A934T和P924L。

ADNFLE比EIMFS发病晚，通常在儿童中期，并且通常是不太严重的病况。其特征在于夜间额叶发作，并且可以导致患有这种病况的受试者的精神病、行为和认知障碍。患有ADNFLE的受试者可具有KCNT1的突变(例如，功能获得性突变)，诸如M896I、R398Q、Y796H和R928C。

韦斯特综合征是严重形式的癫痫，其中受试者表现出婴儿痉挛、称为高度节律失常的发作期间脑电图(EEG)模式和智力迟钝中的一种或多种。患有韦斯特综合征的受试者可具有KCNT1的突变(例如，功能获得性突变)，诸如G652V和R474H。

本文所述的任何KCNT1相关病症可以通过施用SEQ ID NO:1-3525中任一个(例如，SEQ ID NO:1-116或1、4、5、6、8、10、12、13、15、17、28、29、62、625-649、1046、1071、1195-1224、1388、1496-1567、2591-2631或3395-3525)的寡核苷酸(例如，化学修饰的寡核苷酸)或长度为18-22个核苷且具有来自SEQ ID NO:1-3525中任一个(例如，SEQ ID NO:1-116或1、4、5、6、8、10、12、13、15、17、28、29、62、625-649、1046、1071、1195-1224、1388、1496-1567、2591-2631或3395-3525)的至少18个连续核苷、至少19个连续核苷、至少20个连续核苷、至少21个连续核苷或至少22个连续核苷的区域的寡核苷酸来治疗。在一些实施方案中，本文所述的任何KCNT1相关病症可以通过施用SEQ ID NO:4、1046、1071、1388、1551、1546或2595中任一个的寡核苷酸(例如，化学修饰的寡核苷酸)治疗。

待治疗的受试者可具有KCNT1的功能获得性突变。功能获得性突变可以是V271F、L274I、G288S、F346L、R398Q、R428Q、R474H、F502V、M516V、K629N、I760M、Y796H、E893K、M896I、M896K、P924L、R928C、F932I、A934T、A966T、H257D、R262Q、Q270E、V340M、C377S、P409S、L437F、R474C、A477T、R565H、K629E、G652V、I760F、Q906H、R933G、R950Q、R961H、R1106Q、K1154Q、R474Q、Y1903C、H469L、M896R、K946E和R950L中的一种或多种。

下表1显示KCNT1转录物的单核苷酸多态(SNP)和与KCNT1转录物(例如，SEQ IDNO:3526)相比的每个SNP的位置。短语“KCNT1转录物变体”或“KCNT1 mRNA转录物变体”是指与野生型KCNT1转录物(例如，SEQ ID NO:3526)相差至少一个核苷酸(例如，两个、三个、四个或五个核苷酸)的KCNT1转录物。

表1：KCNT1的SNP。进一步显示了由于每个SNP引起的相应氨基酸突变。如果SNP已经输入到dbSNP数据库中，则RS编号是指dbSNP ID参考号。

寡核苷酸剂

本文所述的降低细胞中KCNT1的水平和/或活性的剂可以是例如多核苷酸，例如，寡核苷酸。这些剂在细胞或受试者中降低与KCNT1相关的活性或相关的下游效应的水平，或降低KCNT1的水平。

在一些实施方案中，降低KCNT1的水平和/或活性的剂是多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸是单链寡核苷酸(例如，SEQ ID NO:1-3525(例如，SEQ ID NO:1-116或1、4、5、6、8、10、12、13、15、17、28、29、62、625-649、1046、1071、1195-1224、1388、1496-1567、2591-2631或3395-3525))，例如，其通过RNA酶H介导的途径起作用。寡核苷酸包括DNA和DNA/RNA嵌合分子，通常长度约10至30个核苷酸，其通过与靶序列(例如，KCNT1 mRNA转录物或KCNT1mRNA转录物变体)的核苷酸碱基的氢键相互作用识别多核苷酸靶序列或序列部分。寡核苷酸分子可以降低KCNT1的表达水平(例如，蛋白质水平或mRNA水平)。例如，寡核苷酸包括靶向全长KCNT1的寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸分子募集RNA酶H，导致靶mRNA降解。在各种实施方案中，寡核苷酸的长度可以是至少16个核碱基。在各种实施方案中，寡核苷酸的长度可以是17、18、19、20、21或22个核碱基。在各种实施方案中，寡核苷酸的长度可以是至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个或至少22个核碱基。在各种实施方案中，寡核苷酸的长度可以是17-22、18-21或19-20个核碱基。

在一些实施方案中，寡核苷酸降低功能正调节物的水平和/或活性。在其他实施方案中，寡核苷酸增加功能正调节物的抑制剂的水平和/或活性。在一些实施方案中，寡核苷酸增加功能负调节物的水平和/或活性。

在一些实施方案中，寡核苷酸(例如，SEQ ID NO:1-3525(例如，SEQ ID NO:1-116或1、4、5、6、8、10、12、13、15、17、28、29、62、625-649、1046、1071、1195-1224、1388、1496-1567、2591-2631或3395-3525))降低KCNT1的水平和/或活性或功能。在一些实施方案中，寡核苷酸(例如，SEQ ID NO:1-3525(例如，SEQ ID NO:1-116或1、4、5、6、8、10、12、13、15、17、28、29、62、625-649、1046、1071、1195-1224、1388、1496-1567、2591-2631或3395-3525))抑制KCNT1的表达。在其他实施方案中，寡核苷酸(例如，SEQ ID NO:1-3525(例如，SEQ ID NO:1-116或1、4、5、6、8、10、12、13、15、17、28、29、62、625-649、1046、1071、1195-1224、1388、1496-1567、2591-2631或3395-3525))增加KCNT1的降解和/或降低KCNT1的稳定性(例如，半衰期)。在一些实施方案中，寡核苷酸(例如，SEQ ID NO:1-3525(例如，SEQ ID NO:1-116或1、4、5、6、8、10、12、13、15、17、28、29、62、625-649、1046、1071、1195-1224、1388、1496-1567、2591-2631或3395-3525))可以是化学合成的。

在一些实施方案中，寡核苷酸(例如，SEQ ID NO:1-3525(例如，SEQ ID NO:1-116或1、4、5、6、8、10、12、13、15、17、28、29、62、625-649、1046、1071、1195-1224、1388、1496-1567、2591-2631或3395-3525))包括具有互补区域(例如，连续核碱基区域)的寡核苷酸，所述互补区域与KCNT1基因的表达中形成的mRNA的至少一部分互补。在一些实施方案中，互补区域的长度可以是约30个核苷酸或更短(例如，长度是约30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或18个核苷酸或更短)。在一些实施方案中，在与表达KCNT1基因的细胞接触后，寡核苷酸可以抑制KCNT1基因(例如，人、灵长类动物、非灵长类动物或鸟KCNT1基因)的表达至少约10％，如通过例如基于PCR或分支DNA(bDNA)的方法，或通过基于蛋白质的方法，诸如通过免疫荧光分析，使用例如蛋白质印迹法或流式细胞术技术所测定。

在一些实施方案中，与靶序列互补的区域的长度可以在10个连接的核苷与30个连接的核苷之间，例如，10-29、10-28、10-27、10-26、10-25、10-24、10-23、10-22、10-21、10-20、10-19、10-18、10-17、10-16、10-15、10-14、10-13、10-12、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个连接的核苷。在上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本发明的一部分。

在一些实施方案中，寡核苷酸可以通过如下面进一步讨论的本领域已知的标准方法，例如，通过使用诸如可从例如Biosearch,Applied Biosystems,Inc.商购获得的自动化DNA合成仪来合成。

在一些实施方案中，寡核苷酸化合物可以使用溶液相或固相有机合成或两者来制备。有机合成提供的优点在于可以容易地制备包含非天然或替代的核苷酸的寡核苷酸。本发明的单链寡核苷酸可以使用溶液相或固相有机合成或两者来制备。

在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包括与KCNT1转录物(例如，SEQ ID NO:3526)或KCNT1转录物变体的至少10个连续核苷酸具有至少80％(例如，至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)互补性的至少10个连续核苷酸的区域。在一个方面，本发明的寡核苷酸包括与KCNT1转录物(例如，SEQ ID NO:3526)或KCNT1转录物变体的10个连续核苷酸互补的至少10个连续核碱基的区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与KCNT1转录物(例如，SEQ ID NO:3526)或KCNT1转录物变体的至少10个连续核苷酸、11个连续核苷酸、12个连续核苷酸、13个连续核苷酸、14个连续核苷酸、15个连续核苷酸、16个连续核苷酸、17个连续核苷酸、18个连续核苷酸、19个连续核苷酸或20个连续核苷酸互补的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与19-23个连续核苷酸互补的序列，所述寡核苷酸序列可以选自SEQ ID NO:1-3525(例如，SEQ ID NO:1-116或1、4、5、6、8、10、12、13、15、17、28、29、62、625-649、1046、1071、1195-1224、1388、1496-1567、2591-2631或3395-3525)中任一个。在一些实施方案中，寡核苷酸(例如，化学修饰的寡核苷酸)选自SEQ ID NO:4、1046、1071、1388、1551、1546和2595中任一个。在这一方面，所述序列与KCNT1基因的表达中生成的mRNA的序列基本上互补。

在一些实施方案中，寡核苷酸具有与SEQ ID NO:1-3525(例如，SEQ ID NO:1-116或1、4、5、6、8、10、12、13、15、17、28、29、62、625-649、1046、1071、1195-1224、1388、1496-1567、2591-2631或3395-3525)中任一个的核酸序列具有至少50％(例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，寡核苷酸具有与SEQ ID NO:1-3525(例如，SEQ ID NO:1-116或1、4、5、6、8、10、12、13、15、17、28、29、62、625-649、1046、1071、1195-1224、1388、1496-1567、2591-2631或3395-3525)中任一个的核酸序列具有至少85％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，寡核苷酸具有SEQ ID NO:1-3525(例如，SEQ ID NO:1-116或1、4、5、6、8、10、12、13、15、17、28、29、62、625-649、1046、1071、1195-1224、1388、1496-1567、2591-2631或3395-3525)中任一个的核酸序列。

在一些实施方案中，寡核苷酸具有与SEQ ID NO:4、1046、1071、1388、1551、1546或2595中任一个的核酸序列具有至少50％(例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的核酸序列。

应理解，尽管在一些实施方案中，SEQ ID NO:1-3525(例如，SEQ ID NO:1-116或1、4、5、6、8、10、12、13、15、17、28、29、62、625-649、1046、1071、1195-1224、1388、1496-1567、2591-2631或3395-3525)中的序列被描述为未修饰的和/或未缀合的序列，但是本发明的寡核苷酸的核苷，例如，本发明的寡核苷酸，可以包含为替代的核苷和/或如下面详细描述缀合的SEQ ID NO:1-3525(例如，SEQ ID NO:1-116或1、4、5、6、8、10、12、13、15、17、28、29、62、625-649、1046、1071、1195-1224、1388、1496-1567、2591-2631或3395-3525)中任一个中示出的序列中任一个。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1-3525(例如，SEQ ID NO:1-116或1、4、5、6、8、10、12、13、15、17、28、29、62、625-649、1046、1071、1195-1224、1388、1496-1567、2591-2631或3395-3525)中所示的序列中任一个的寡核苷酸可以是未修饰的或修饰的核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或RNA和DNA的混合物。

技术人员熟知，具有约18-20个碱基对的结构的寡核苷酸在诱导RNA酶H介导的降解中可能特别有效。然而，可以理解，更短或更长的寡核苷酸也可以是有效的。在上述实施方案中，由于本文提供的寡核苷酸序列的性质，本文所述的寡核苷酸可以包括。可以合理地预期，与上述寡核苷酸相比，在一个或两个末端仅减去几个连接的核苷的较短寡核苷酸可以是类似有效的。因此，预期具有来源于本文提供的序列(例如，SEQ ID NO:1-3525(例如，SEQ ID NO:1-116或1、4、5、6、8、10、12、13、15、17、28、29、62、625-649、1046、1071、1195-1224、1388、1496-1567、2591-2631或3395-3525))中的一个的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个连续连接的核苷的序列并且抑制KCNT1基因表达的能力与包含完整序列的寡核苷酸相差不多于约5％、10％、15％、20％、25％或30％抑制的寡核苷酸在本发明的范围内。

在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸可以经由核酸酶介导的靶核酸降解而起作用，其中本发明的寡核苷酸能够募集核酸酶，特别是核酸内切酶，优选核糖核酸内切酶(RNA酶)，诸如RNA酶H。经由核酸酶介导的机制起作用的寡核苷酸设计的实例是通常包含至少5或6个DNA核苷的区域并且在一侧或两侧侧接例如缺口体、头体和尾体的亲和力增强的替代的核苷的寡核苷酸。

寡核苷酸的RNA酶H活性是指当与互补RNA分子形成双链体时，募集RNA酶H的能力。国际申请公开号WO 01/23613(以引用的方式并入本文中)提供用于确定RNA酶H活性的体外方法，其可以用于确定募集RNA酶H的能力。通常，在以下情况下，认为寡核苷酸能够募集RNA酶H，即当提供有互补靶核酸序列时，寡核苷酸的初始速率(如以pmol/l/min为单位所测量)是当使用具有与测试的修饰的寡核苷酸相同的碱基序列，但仅含有DNA单体(在寡核苷酸的所有单体之间具有硫代磷酸酯键联)且使用由WO01/23613的实施例91-95提供的方法(以引用的方式并入本文中)确定的初始速率的至少5％，例如至少10％或多于20％。

在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸(例如，SEQ ID NO:1-3525(例如，SEQ IDNO:1-116或1、4、5、6、8、10、12、13、15、17、28、29、62、625-649、1046、1071、1195-1224、1388、1496-1567、2591-2631或3395-3525))鉴定KCNT1转录物中易受RNA酶H介导的裂解的一个或多个位点。因此，本发明的特征还在于在此一个或多个位点内靶向的寡核苷酸内。如本文所用，如果寡核苷酸促进转录物在特定位点内任何位置的裂解，则称寡核苷酸在RNA转录物的特定位点内靶向。这种寡核苷酸通常将包括来自本文提供的序列中的一个的至少约5-10个连续连接的核苷，所述序列与取自与KCNT1基因中选定的序列连续的区域的额外连接核苷序列偶联。

抑制性寡核苷酸可以通过本领域熟知的方法设计。尽管靶序列的长度通常为约10-30个连接的核苷，但在此范围内的特定序列对于定向任何给定靶RNA的裂解的适用性有广泛的变化。

同源性足以提供独特降解任何RNA所需的序列特异性的寡核苷酸可以使用本领域已知的程序进行设计。

根据本文提供的教导，也可以进行用于优化抑制性寡核苷酸序列的几种设计物种的系统性测试。设计干扰寡核苷酸时的考虑包括但不限于生物物理学、热力学和结构上的考虑、具体位置的碱基优选和同源性。基于非编码寡核苷酸的抑制性治疗剂的制备和使用也是本领域已知的。

本文提出的各种软件包和指导方针提供用于鉴定任何给定基因靶标的最佳靶序列的指导，但是也可以采用经验方法，在所述方法中将给定大小(作为非限制性实例，21个核苷酸)的“窗口”或“掩模”真正地或象征性地(包括，例如，计算机)置于靶RNA序列上，以鉴定可以充当靶序列的在所述大小范围内的序列。通过将序列“窗口”逐渐移动起始靶序列位置的上游或下游一个核苷酸，可以鉴定下一个潜在的靶序列，直到针对选定的任何给定靶标大小鉴定出完整的可能序列组。此过程，与用以鉴定最佳表现的那些序列的鉴定的序列的系统性合成和测试(使用如本文所述或如本领域已知的测定)结合，可以鉴定当用寡核苷酸剂靶向时介导靶基因表达的最佳抑制的那些RNA序列。因此，尽管本文鉴定的序列代表有效的靶序列，但预期抑制效率的进一步优化可以通过逐渐“使窗口前进”给定序列的上游或下游一个核苷酸以鉴定具有等效或更好抑制特征的序列来实现。

此外，预期，对于本文鉴定的任何序列，可以通过系统性地添加或去除连接的核苷以生成更长或更短序列并测试通过使更长或更短大小的窗口从那个点沿着靶RNA向上或向下前进所生成那些序列实现进一步优化。同样，将这种产生新候选靶标的方法与如本领域已知和/或如本文所述的抑制测定中基于那些靶序列测试寡核苷酸的有效性结合，可以引起抑制效率的进一步改善。

此外，这类优化的序列可以通过以下方式调整，例如，引入如本文所述或如本领域已知的替代的核苷、替代的糖部分和/或替代的核苷间键联，包括如本领域已知和/或本文讨论的替代的核苷、替代的糖部分和/或替代的核苷间键联，以进一步优化作为表达抑制剂的分子(例如，增加血清稳定性或循环半衰期、增加热稳定性、增强跨膜递送、靶向特定位置或细胞类型、增加与沉默途径酶的相互作用、增加从内体的释放)。如本文所述的寡核苷酸剂可以含有一个或多个与靶序列的错配。在一个实施方案中，如本文所述的寡核苷酸含有不多于3个错配。如果寡核苷酸含有与靶序列的错配，则优选的是错配区域不位于互补区域的中心。如果寡核苷酸含有与靶序列的错配，则优选的是错配被限制在互补区域的5'端或3'端的最后5个核苷酸内。例如，对于30个连接的核苷寡核苷酸剂，与KCNT1转录物(例如，SEQ ID NO:3526)或KCNT1 mRNA转录物变体的区域互补的连续核碱基区域通常在中心5-10个连接的核苷内不含任何错配。本文所述的方法或本领域已知的方法可以用于确定含有与靶序列的错配的寡核苷酸是否有效抑制KCNT1基因的表达。考虑具有错配的寡核苷酸抑制KCNT1基因表达的功效是重要的，尤其是如果已知KCNT1转录物(例如，SEQ ID NO:3526)或KCNT1 mRNA转录物变体中的特定互补区域在群体内具有多态序列变化。

用于表达在本发明中使用的多核苷酸的载剂的构建可以使用不需要对本领域的普通技术人员详细解释的常规技术完成。为了产生有效的表达载剂，必须具有控制多核苷酸表达的调节序列。这些调节序列包括启动子和增强子序列，且受与这些序列相互作用的具体细胞因子影响，并且是本领域熟知的。

替代的寡核苷

在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸的连接的核苷或核苷间键联中的一个或多个是天然存在的，并且不包含例如本领域已知和本文所述的化学修饰和/或缀合。在另一个实施方案中，本发明的寡核苷酸的连接的核苷或核苷间键联中的一个或多个被化学修饰以增强稳定性或其他有益特征。不受理论束缚，据信某些修饰可以增加核酸酶抗性和/或血清稳定性或降低免疫原性。例如，本发明的寡核苷酸可以含有发现在DNA或RNA中天然存在的核苷酸(例如，腺嘌呤、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷或肌苷)，或者可以含有对核苷酸的一种或多种组分(例如，核碱基、糖或磷酸-接头部分)具有一个或多个化学修饰的替代的核苷或核苷间键联。本发明的寡核苷酸可以通过天然存在的磷酸二酯键彼此连接，或者可以含有替代的键联(例如，通过硫代磷酸酯(例如，Sp硫代磷酸酯或Rp硫代磷酸酯)、3'-亚甲基膦酸酯、5'-亚甲基膦酸酯、3'-氨基磷酸酯、2'-5'磷酸二酯、胍、S-甲基硫脲、2'-烷氧基、烷基磷酸酯或肽键共价连接)。

在本发明的某些实施方案中，本发明的寡核苷酸的基本上所有的核苷或核苷间键联都是替代的核苷。在本发明的其他实施方案中，本发明的寡核苷酸的所有核苷或核苷间键联都是替代的核苷。“基本上所有核苷都是替代的核苷”的本发明的寡核苷酸大部分但并非全部是修饰的，并且可以包括不多于五个、四个、三个、两个或一个天然存在的核苷。在本发明的再其他实施方案中，本发明的寡核苷酸可以包括不多于五个、四个、三个、两个或一个替代的核苷。

本发明的特征性核酸可以通过本领域中成熟的方法合成和/或修饰，所述方法例如在“Current protocols innucleic acidchemistry,”Beaucage,S.L.等人(编)，JohnWiley&Sons,Inc.,New York,N.Y.,USA中描述的那些方法，其以引用的方式并入本文中。

替代的核苷酸和核苷包括具有修饰的那些，所述修饰包括例如末端修饰，例如，5'端修饰(磷酸化、缀合、反向连接)或3'端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)；碱基修饰，例如，用稳定碱基、去稳定碱基或与扩大的配偶体库碱基配对的碱基置换，除去碱基(脱碱基核苷酸)或缀合的碱基；糖修饰(例如，在2'位或4'位)或糖的置换；和/或主链修饰，包括磷酸二酯键联的修饰或置换。核碱基还可以是异核苷，其中核碱基从糖部分的C1位置移动到不同的位置(例如C2、C3、C4或C5)。可用于本文所述的实施方案的寡核苷酸化合物的具体实例包括但不限于含有修饰的主链或无天然核苷间键联的替代的核苷。具有修饰的主链的核苷酸和核苷尤其包括在主链中不具有磷原子的那些。出于本说明书的目的，并且有时如本领域所参考的，在它们的核苷间主链中不具有磷原子的替代的RNA也可以被认为是寡核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸在其核苷间主链中具有磷原子。

替代的核苷间键联

替代的核苷间键联，也称为修饰的核苷间键联，包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、2'-烷氧基核苷间键联、烷基磷酸酯核苷间键联、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、吗啉代、PNA、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、烷基膦酸酯、甲基膦酸酯、二甲基膦酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、二氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、硒代磷酸酯和具有正常3'-5'键联的硼代磷酸酯、这些的2'-5'连接类似物和具有相反极性的那些，其中相邻核苷单元对将3'-5'连接至5'-3'或将2'-5'连接至5'-2'。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。

在各种实施方案中，具有修饰的核苷间键联的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷间键联以及不具有磷原子的核苷间键联。代表性含磷核苷间键联包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯。制备含磷和不含磷的键联的方法是熟知的。

教导制备上述含磷键联的代表性美国专利包括但不限于美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029和美国专利RE39464，其各自的全部内容以引用的方式并入本文中。

其中不包括磷原子的替代的核苷间键联具有由短链烷基或环烷基核苷间键联、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键联或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键联形成的主链。这些包括具有以下的那些：吗啉代键联(部分地由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰基和硫代甲酰基主链；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合的N、O、S和CH₂组成部分的其他主链。

在一些实施方案中，寡核苷酸可以通过其主链手性中心的模式来定义。例如，硫代磷酸酯核苷间键联可以是R或S对映体。因此，每个核苷间键联可以定义为Rp或Sp，使得主链的整个立体化学是手性定义的，例如，如国际公开号WO 2015/107425中所述，所述文献以引用的方式整体并入本文中。在一些实施方案中，仅寡核苷酸(例如，多个寡核苷酸)的具体核苷间键联含有手性中心。在其他实施方案中，寡核苷酸(例如，多个寡核苷酸)包括立体随机和立体特异性手性中心的混合物。

教导上述寡核苷的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,64,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437和5,677,439，其各自的全部内容以引用的方式并入本文中。

在其他实施方案中，合适的寡核苷酸包括其中核苷酸单元的糖键联和核苷间键联(即主链)两者被置换的那些寡核苷酸。维持碱基单元以与合适的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物，即已显示具有优异杂交性质的模拟物，被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，核苷的糖用含酰胺的主链，特别是氨基乙基甘氨酸主链置换。核碱基被保留并直接或间接结合到主链的酰胺部分的氮杂氮原子。教导PNA化合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082、5,714,331和5,719,262，其各自的全部内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的寡核苷酸的额外PNA化合物描述在例如Nielsen等人,Science,1991,254,1497-1500中。

本发明的一些特征性实施方案包括具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有上述参考的美国专利号5,489,677的杂原子主链，且特别是-CH₂-NH-CH₂-、-CH₂-N(CH₃)-O-CH₂-[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链]、-CH₂-O-N(CH₃)-CH₂-、-CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂-和-N(CH₃)-CH₂-CH₂-[其中天然磷酸二酯主链表示为-O-P-O-CH₂-]以及上述参考的美国专利号5,602,240的酰胺主链的寡核苷酸。在一些实施方案中，本文的特征性寡核苷酸具有上述参考的美国专利号5,034,506的吗啉代主链结构。在其他实施方案中，本文所述的寡核苷酸包括二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)，其中脱氧核糖部分被吗啉环置换，并且带电荷的磷酸二酯亚基间键联被不带电荷的二氨基磷酸酯键联置换，如Summerton等人,AntisenseNucleic Acid Drug Dev.1997,7:63-70中所述。

替代的糖部分

替代的核苷和核苷酸也可以含有一个或多个取代和/或修饰的糖部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含修饰的糖部分，例如以下中任一种：2'-O-甲基(2'OMe)部分、2'-O-甲氧基乙基部分、双环糖部分、PNA(例如，包含一个或多个通过酰胺键或羰基亚甲基键作为重复单元连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元代替糖-磷酸酯主链的寡核苷酸)、锁核苷(LNA)(例如，包含一个或多个锁核糖的寡核苷酸，并且可以是2'-脱氧核苷酸或2'OMe核苷酸的混合物)、c-ET(例如，包含一个或多个cET糖的寡核苷酸)、cMOE(例如，包含一个或多个cMOE糖的寡核苷酸)、吗啉代寡聚物(例如，包含含有一个或多个二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物的主链的寡核苷酸)、2'-脱氧-2'-氟核苷(例如，包含一个或多个2'-氟-β-D-阿拉伯核苷的寡核苷酸)、tcDNA(例如，包含一个或多个tcDNA修饰的糖的寡核苷酸)、限制性乙基2'-4'-桥接核酸(cEt)、S-cEt、亚乙基桥接核酸(ENA)(例如，包含一个或多个ENA修饰的糖的寡核苷酸)、己糖醇核酸(HNA)(例如，包含一个或多个HNA修饰的糖的寡核苷酸)或三环类似物(tcDNA)(例如，包含一个或多个tcDNA修饰的糖的寡核苷酸)。

寡核苷酸，例如，本文的特征性寡核苷酸，可以包括在2'位的以下中的一种：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C₁至C₁₀烷基或C₂至C₁₀烯基或炔基。示例性合适的修饰包括-O[(CH₂)_nO]_mCH₃、-O(CH₂)_nOCH₃、-O(CH₂)_n-NH₂、-O(CH₂)_nCH₃、-O(CH₂)_n-ONH₂和-O(CH₂)_n-ON[(CH₂)_nCH₃]₂，其中n和m是1至约10。在其他实施方案中，寡核苷酸包括在2'位的以下中的一种：C₁至C₁₀低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、报告基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团或用于改善寡核苷酸的药效学性质的基团以及具有相似性质的其他取代基。在一些实施方案中，修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH₂CH₂OCH₃，也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin等人,HeIv.Chin.Acta,1995,78:486-504)，即烷氧基-烷氧基。MOE核苷赋予寡核苷酸若干有益性质，包括但不限于与未修饰的寡核苷酸相比，核酸酶抗性增加、药代动力学性质改善、非特异性蛋白结合降低、毒性降低、免疫刺激性质减少和靶亲和力增强。

另一示例性替代物含有2'-二甲基氨基氧基乙氧基，即-O(CH₂)₂ON(CH₃)₂基团，也称为2'-DMAOE，如下文中的实施例中所述，和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(本领域中也称为2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，即2'-O-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-N(CH₃)₂。另外的示例性替代物包括：5'-Me-2'-F核苷酸、5'-Me-2'-OMe核苷酸、5'-Me-2'-脱氧核苷酸(这三个家族中的R异构体和S异构体两者)；2'-烷氧基烷基；和2'-NMA(N-甲基乙酰胺)。

其他替代物包括2'-甲氧基(2'-OCH₃)、2'-氨基丙氧基(2'-OCH₂CH₂CH₂NH₂)和2'-氟(2'-F)。也可以在寡核苷酸的核苷和核苷酸上的其他位置，特别是在3'末端核苷酸上或在2'-5'连接的寡核苷酸中的糖的3'位和5'末端核苷酸的5'位进行相似的修饰。寡核苷酸也可以具有糖模拟物诸如环丁基部分代替戊呋喃糖基糖。教导这种修饰的糖结构的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633和5,700,920，其中的某些与本申请是共同拥有的。每个上述申请的全部内容以引用的方式并入本文中。

在一些实施方案中，核苷酸中的糖部分可以是核糖分子，其任选地具有2'-O-甲基、2'-O-MOE、2'-F、2'-氨基、2'-O-丙基、2'-氨基丙基或2'-OH修饰。

本发明的寡核苷酸可以包括一个或多个双环糖部分。“双环糖”是通过两个原子的桥接修饰的呋喃糖环。“双环核苷”(“BNA”)是具有糖部分的核苷，所述糖部分包含连接糖环的两个碳原子的桥，从而形成双环系统。在某些实施方案中，桥连接糖环的4'碳和2'碳。在一些实施方案中，双环糖包含4'-CH(R)—O-2'桥，其中R独立地是H、C₁-C₁₂烷基或保护基团。在一些实施方案中，R是甲基。在一些实施方案中，R是H。

在一些实施方案中，本发明的剂可以包括一个或多个锁核苷。锁核苷是具有修饰的核糖部分的核苷，其中核糖部分包含连接2'碳和4'碳的额外的桥。换句话说，锁核苷是包含双环糖部分的核苷，所述双环糖部分包含4'-CH₂-O-2'桥。此结构有效地将核糖“锁定”为3'-内结构构象。已经显示将锁核苷添加到寡核苷酸增加血清中寡核苷酸稳定性并减少脱靶效应(Grunweller,A.等人,(2003)Nucleic Acids Research31(12):3185-3193)。用于本发明的多核苷酸中的双环核苷的实例包括但不限于在4'核糖环原子与2'核糖环原子之间包含桥的核苷。在某些实施方案中，本发明的多核苷酸剂包括一个或多个包含4'至2'桥的双环核苷。这类4'至2'桥接双环核苷的实例包括但不限于：4'-(CH₂)-O-2'(LNA)；4'-(CH₂)-S-2'；4'-(CH₂)₂-O-2'(ENA)；4'-CH(CH₃)-O-2'(也称为“限制性乙基”或“cEt”)和4'-CH(CH₂OCH₃)-O-2'(及其类似物；参见，例如，美国专利号7,399,845)；4'-C(CH₃)(CH₃)-O-2'(及其类似物；参见例如，美国专利号8,278,283)；4'-CH₂-N(OCH₃)-2'(及其类似物；参见例如，美国专利号8,278,425)；4'-CH₂-O-N(CH₃)₂-2'(参见，例如，美国专利公开号2004/0171570)；4'-CH₂-N(R)-O-2'，其中R是H、C₁-C₁₂烷基或保护基团(参见，例如，美国专利号7,427,672)；4'-CH₂-C(H)(CH₃)-2'(参见，例如，Chattopadhyaya等人,J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；和4'-CH₂-C(＝CH₂)-2'(及其类似物；参见，例如，美国专利号8,278,426)。每个上述申请的全部内容以引用的方式并入本文中。

教导锁核酸核苷酸的制备的额外代表性美国专利和美国专利公开包括但不限于以下：美国专利号6,268,490；6,525,191；6,670,461；6,770,748；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,034,133；7,084,125；7,399,845；7,427,672；7,569,686；7,741,457；8,022,193；8,030,467；8,278,425；8,278,426；8,278,283；US 2008/0039618；和US2009/0012281，其各自的全部内容以引用的方式并入本文中。

任何前述双环核苷都可以制备成具有一种或多种立体化学糖构型，所述构型包括例如α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(参见国际公开号WO99/14226，其内容以引用的方式并入本文中)。

本发明的寡核苷酸还可以被修饰成包括一个或多个限制性乙基核苷。如本文所用，“限制性乙基核苷”或“cEt”是包含双环糖部分的锁核苷，所述双环糖部分包含4'-CH(CH₃)-O-2'桥。在一个实施方案中，限制性乙基核苷呈S构象，本文称为“S-cEt”。

本发明的寡核苷酸还可以包括一个或多个“构象限制性核苷”(“CRN”)。CRN是具有连接核糖的C2'和C4'碳或核糖的C3和--C5'碳的接头的核苷类似物。CRN将核糖环锁定为稳定构象并增加与mRNA的杂交亲和力。接头具有足够的长度以将氧置于稳定性和亲和性的最佳位置，导致较少的核糖环折叠。

教导某些上述CRN的制备的代表性公开包括但不限于美国专利公开号2013/0190383；以及PCT公开WO 2013/036868，其各自的全部内容以引用的方式并入本文中。

在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含一个或多个为UNA(非锁核苷)核苷的单体。UNA是非锁无环核苷，其中糖的任何键已经被除去，形成非锁“糖”残基。在一个实施例中，UNA还涵盖在C1'-C4'之间的键(即，C1'碳与C4'碳之间的共价碳-氧-碳键)已被除去的单体。在另一个实施例中，糖的C2'-C3'键(即，C2'碳与C3'碳之间的共价碳-碳键)已被除去(参见Nuc.Acids Symp.Series,52,133-134(2008)和Fluiter等人,Mol.Biosyst.,2009,10,1039，其以引用的方式并入本文中)。

教导UNA的制备的代表性美国公开包括但不限于美国专利号8,314,227；和美国专利公开号2013/0096289；2013/0011922；和2011/0313020，其各自的全部内容以引用的方式并入本文中。

核糖分子也可以用环丙烷环修饰，产生三环脱氧核酸(三环DNA)。核糖部分可以被另一种糖取代，如1,5-脱水己糖醇、苏糖(以产生苏糖核苷(TNA))或阿拉伯糖(以产生阿拉伯糖核苷)。核糖分子也可以用非糖置换，如环己烯(以产生环己烯核苷)或二醇(以产生二醇核苷)。

对核苷分子末端的潜在稳定修饰可以包括N-(乙酰氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己酰基-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6)、N-(乙酰基-4-羟基脯氨醇(Hyp-NHAc)、胸苷-2'-O-脱氧胸苷(醚)、N-(氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-氨基)、2-二十二烷酰基-尿苷-3"-磷酸酯、反向碱基dT(idT)等。这种修饰的公开内容可以在PCT公开号WO2011/005861中见到。

本发明的寡核苷酸的其他替代的化学品包括5'磷酸酯或5'磷酸酯模拟物，例如，寡核苷酸的5'末端磷酸酯或磷酸酯模拟物。合适的磷酸酯模拟物公开于例如美国专利公开号2012/0157511中，其全部内容以引用的方式并入本文中。

替代的核碱基

本发明的寡核苷酸还可以包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)替代物(例如，修饰或取代)。未修饰的或天然的核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。替代的核碱基，也称为修饰的核碱基，包括其他合成的和天然的核碱基，例如5-甲基胞嘧啶；假尿苷；5-甲氧基尿苷；5-甲基胞苷；5-羟甲基胞苷；5-甲酰基胞苷；5-羧基胞苷；吡咯并胞苷；二脱氧胞苷；尿苷；5-甲氧基尿苷；5-羟基脱氧尿苷；二氢尿苷；4-硫代尿苷；假尿苷；1-甲基-假尿苷；脱氧尿苷；5-羟基丁炔基-2'-脱氧尿苷；黄嘌呤；次黄嘌呤；7-脱氮-黄嘌呤；噻吩并鸟嘌呤；8-氮杂-7-脱氮鸟苷；7-甲基鸟苷；7-脱氮鸟苷；6-氨基甲基-7-脱氮鸟苷；8-氨基鸟嘌呤；2,2,7-三甲基鸟苷；8-甲基腺嘌呤；8-叠氮腺嘌呤；7-甲基腺嘌呤；7-脱氮腺嘌呤；3-脱氮腺嘌呤；2,6-二氨基嘌呤；2-氨基嘌呤；7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤；8-氨基-嘌呤；胸腺嘧啶；双脱氧胸腺嘧啶；5-硝基吲哚；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物；2-硫代尿苷；2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶；5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶；5-丙炔基尿苷和胞苷；6-偶氮尿苷、胞苷和胸腺嘧啶；4-硫代尿苷；8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤代，特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿苷和胞苷；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；以及3-脱氮鸟嘌呤。另外的核碱基包括美国专利号3,687,808中公开的那些；Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.编,Wiley-VCH,2008中公开的那些；TheConcise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,第858-859页,Kroschwitz,J.L编,John Wiley&Sons,1990中公开的那些；Englisch等人,(1991)Angewandte Chemie,国际版,30:613公开的那些；和Sanghvi,Y S.,第15章,AntisenseResearch and Applications,第289-302页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编,CRC Press,1993公开的那些。这些核碱基中的某些特别适用于增加本发明的特征性寡聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经显示5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编,Antisense Research andApplications,CRC Press,Boca Raton,1993,第276-278页)并且是示例性碱基取代，甚至更特别地当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。5-甲基胞嘧啶取代的实例包括5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶(5-甲基-dC)或5-甲基-2'-胞嘧啶(5-甲基-C)。

教导某些上述替代的核碱基以及其他替代的核碱基的制备的代表性美国专利包括但不限于上述美国专利号3,687,808、4,845,205、5,130,30、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617、5,681,941、5,750,692、6,015,886、6,147,200、6,166,197、6,222,025、6,235,887、6,380,368、6,528,640、6,639,062、6,617,438、7,045,610、7,427,672和7,495,088，其各自的全部内容以引用的方式并入本文中。

示例性寡核苷酸实施方案

本发明的示例性寡核苷酸包含具有替代的糖部分的核苷，并且还可以包含DNA或RNA核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸包含含有替代的糖部分的核苷和DNA核苷。将替代的核苷掺入本发明的寡核苷酸中可以增强寡核苷酸对靶核酸的亲和力。在这种情况下，替代的核苷可以被称为亲和力增强替代核苷酸。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个替代的核苷，诸如至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个替代的核苷。在其他实施方案中，寡核苷酸包含一至十个替代的核苷、二至九个替代的核苷、三至八个替代的核苷、四至七个替代的核苷(例如，6或7个替代的核苷)。在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸可以包含替代物，其独立地选自这三种类型的替代物(替代的糖部分、替代的核碱基和替代的核苷间键联)或其组合。在一些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个包含替代的糖部分的核苷，例如，2'糖替代的核苷。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含独立地选自由2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-氨基-DNA、2'-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2'-氟-ANA和BNA(例如，LNA)核苷组成的组的一个或多个2'糖替代的核苷。在一些实施方案中，所述一个或多个替代的核苷是BNA。

在一些实施方案中，所述替代的核苷中的至少一个是BNA(例如，LNA)，诸如所述替代的核苷中的至少两个，诸如至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或至少八个是BNA。在再一个实施方案中，所有替代的核苷都是BNA。

在另一个实施方案中，寡核苷酸包含至少一个替代的核苷间键联。在一些实施方案中，连续核苷酸序列内的核苷间键联是硫代磷酸酯或硼代磷酸酯核苷间键联。在一些实施方案中，寡核苷酸的连续序列中的所有核苷间键联都是硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，硫代磷酸酯键联是立体化学纯的硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，硫代磷酸酯键联是Sp硫代磷酸酯键联。在其他实施方案中，硫代磷酸酯键联是Rp硫代磷酸酯键联。

在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含至少一个作为2'-MOE-RNA的替代的核苷，诸如2、3、4、5、6、7、8、9或10个2'-MOE-RNA核苷单元。在一些实施方案中，2'-MOE-RNA核苷单元通过硫代磷酸酯键联连接。在一些实施方案中，所述替代的核苷中的至少一个是2'-氟DNA，诸如2、3、4、5、6、7、8、9或10个2'-氟-DNA核苷单元。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含至少一个BNA单元和至少一个2'取代的修饰核苷。在本发明的一些实施方案中，寡核苷酸包含2'糖修饰的核苷和DNA单元两者。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸或其连续核苷酸区域是缺口体寡核苷酸。

额外的缺口体寡核苷酸实施方案

在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸或其连续核苷酸区域具有缺口体设计或结构，在本文中也仅称为“缺口体”。在缺口体结构中，寡核苷酸沿‘5->3’取向包含至少三个不同结构区域，5'侧翼、缺口和3'侧翼。在这种设计中，5'侧翼区域和3'侧翼区域(也称为侧接区域)包含至少一个与缺口区域相邻的替代的核苷，并且在一些实施方案中，可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个替代的核苷的连续延伸段，或替代的核苷和DNA核苷的连续延伸段(包含替代的核苷和DNA核苷两者的混合侧翼)。5'侧翼区域的长度可以是至少两个核苷(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或更多个核苷)。3'侧翼区域的长度可以是至少两个核苷(例如，至少2个、至少3个、至少至少4个、至少5个或更多个核苷)。5'侧翼区域和3'侧翼区域可以相对于它们包含的核苷的数目是对称的或不对称的。在一些实施方案中，缺口区域包含侧接5'侧翼区域和3'侧翼区域的约10个核苷，每个侧翼区域包含约5个核苷，也称为5-10-5缺口体。

因此，与缺口区域相邻的5'侧翼区域和3'侧翼区域的核苷是替代的核苷，诸如2'替代的核苷。当寡核苷酸与KCNT1靶核酸形成双链体时，缺口区域包含能够募集RNA酶H的核苷酸的连续延伸段。在一些实施方案中，缺口区段包含连接的脱氧核糖核苷、2'-氟阿拉伯糖核酸(FANA)和氟环己烯基核酸(F-CeNA)中的一种或多种。在一些实施方案中，缺口区域包含5-16个DNA核苷的连续延伸段。在一些实施方案中，缺口区域包含6-15、7-14、8-13或9-11个DNA核苷的连续延伸段。在一些实施方案中，缺口区域包含至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个DNA核苷的连续延伸段。在一些实施方案中，缺口区域包含与KCNT1转录物(例如，SEQ ID NO:3526)或KCNT1转录物变体具有至少80％(例如，至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)互补性的至少至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基的区域。在一些实施方案中，缺口体包含与KCNT1转录物(例如，SEQ ID NO:3526)或KCNT1转录物变体的至少17个连续核苷酸、19-23个连续核苷酸或19个连续核苷酸互补的区域。缺口体与KCNT1靶核酸(KCNT1转录物(例如，SEQ ID NO:3526)或KCNT1转录物变体)互补，并且因此可以是寡核苷酸的连续核苷区域。在一些实施方案中，缺口区域包含与SEQ ID NO:1-3525中任一个的等长部分具有至少80％(例如，至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基的区域。

侧接缺口区域的5'端和3'端的5'侧翼区域和3'侧翼区域可以包含一个或多个亲和力增强替代核苷。在一些实施方案中，5'侧翼和/或3'侧翼包含至少一个2'-O-甲氧基乙基(MOE)核苷，例如至少两个MOE核苷。在一些实施方案中，5'侧翼包含至少一个MOE核苷。在一些实施方案中，5'侧翼区域和3'侧翼区域两者都包含MOE核苷。在一些实施方案中，侧翼区域中的所有核苷都是MOE核苷。在其他实施方案中，侧翼区域可以包含MOE核苷和其他核苷(混合侧翼)，诸如DNA核苷和/或非MOE替代核苷，诸如双环核苷(BNA)(例如，LNA核苷或cET核苷)，或其他2'取代的核苷。在这种情况下，缺口被定义为至少5个RNA酶H募集核苷(诸如5-16个DNA核苷)的连续序列，其5'端和3'端侧接亲和力增强替代核苷，诸如MOE核苷。

在其他实施方案中，5'侧翼和/或3'侧翼包含至少一个BNA(例如，至少一个LNA核苷或cET核苷)，例如至少2个双环核苷。在一些实施方案中，5'侧翼包含至少一个BNA。在一些实施方案中，5'侧翼区域和3'侧翼区域两者都包含BNA。在一些实施方案中，侧翼区域中的所有核苷都是BNA。在其他实施方案中，侧翼区域可以包含BNA和其他核苷(混合侧翼)，诸如DNA核苷和/或非BNA替代核苷，诸如2'取代的核苷。在这种情况下，缺口被定义为至少五个RNA酶H募集核苷(诸如5-16个DNA核苷)的连续序列，其5'端和3'端侧接亲和力增强替代核苷，诸如BNA，诸如LNA，诸如β-D-氧基-LNA。

连接到缺口区域5'端的5'侧基或5'侧翼包含、含有至少一个替代的糖部分(例如，至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或更多个替代的糖部分)或由其组成。在一些实施方案中，侧翼区域包含1至7个替代的核碱基，诸如二至六个替代的核碱基，二至五个替代的核碱基，二至四个替代的核碱基，或一至三个替代的核碱基(例如，一个、两个、三个或四个替代的核碱基)或由其组成。在一些实施方案中，侧翼区域包含至少一个替代的核苷间键联(例如，至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或更多个替代的核苷间键联)或由其组成。

在一些实施方案中，连接到缺口区域的3'端的3'侧基或3'侧翼包含、含有至少一个替代的糖部分(例如，至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或更多个替代的糖部分)或由其组成。在一些实施方案中，侧翼区域包含一至七个替代的核碱基，诸如二至六个替代的核碱基，二至五个替代的核碱基，二至四个替代的核碱基，或一至三个替代的核碱基(例如，两个、三个或四个替代的核碱基)或由其组成。在一些实施方案中，侧翼区域包含至少一个替代的核苷间键联(例如，至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或更多个替代的核苷间键联)或由其组成。

在一个实施方案中，侧翼区域中的一个或多个或所有替代的糖部分是2'替代的糖部分。

在另一个实施方案中，侧翼区域中的2'替代的糖部分中的一个或多个选自2'-O-烷基-糖部分、2'-O-甲基-糖部分、2'-氨基-糖部分、2'-氟-糖部分、2'-烷氧基-糖部分、MOE糖部分、LNA糖部分、阿拉伯糖核酸(ANA)糖部分和2'-氟-ANA糖部分。

在本发明的一个实施方案中，侧翼区域中的所有替代的核苷都是双环核苷。在另一个实施方案中，侧翼区域中的双环核苷独立地选自由β-D构型或α-L构型或其组合的氧基-LNA、硫代-LNA、氨基-LNA、cET和/或ENA组成的组。

在一些实施方案中，侧翼区域中的一个或多个替代的核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。在一些实施方案中，硫代磷酸酯键联是立体化学纯的硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，硫代磷酸酯键联是Sp硫代磷酸酯键联。在其他实施方案中，硫代磷酸酯键联是Rp硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，硫代磷酸酯键联是混合的富立体异构(例如，Sp-Rp-Sp或Rp-Sp-Rp)硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，替代的核苷间键联是2'-烷氧基核苷间键联。在其他实施方案中，替代的核苷间键联是烷基磷酸酯核苷间键联。

缺口区域可以包含、含有至少5-16个连续的能够募集RNA酶H的DNA核苷或由其组成。在一些实施方案中，缺口区域的所有核苷都是DNA单元。在另外的实施方案中，缺口区域可以由DNA和其他能够介导RNA酶H裂解的核苷的混合物组成。在一些实施方案中，缺口区域的至少50％的核苷是DNA，诸如至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的DNA。

本发明的寡核苷酸包含与靶核酸互补的连续区域。在一些实施方案中，寡核苷酸还可以包含位于5'侧翼区域和3'侧翼区域的5'和/或3'的额外的连接的核苷。这些额外的连接的核苷可以分别连接至5'侧翼区域的5'端或3'侧翼区域的3'端。在一些实施方案中，额外的核苷可以形成与靶核酸互补的连续序列的一部分，或在其他实施方案中，可以与靶核酸不互补。

在5'侧翼区域和3'侧翼区域中任一个或两个处包含额外的核苷可以独立地包含一个、两个、三个、四个或五个额外的核苷酸，其可以与靶核酸互补或不互补。在这方面，在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸可以包含能够调节靶标的连续序列，其在5'端和/或3'端侧接额外的核苷酸。这类额外核苷可以充当核酸酶敏感的生物可裂解的接头并且因此可以用于将官能团如缀合部分连接至本发明的寡核苷酸。在一些实施方案中，额外的5'和/或3'端核苷用磷酸二酯键联连接，并且可以是DNA或RNA。在另一个实施方案中，额外的5'和/或3'端核苷是替代的核苷，其可以例如被包括在内以增强核酸酶稳定性或便于合成。

在其他实施方案中，本发明的寡核苷酸利用“交替聚体(altimer)”设计，并且包含每三个核苷交替的交替2'-氟-ANA和DNA区域。交替聚体寡核苷酸在Min等人,Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2002,12(18):2651-2654和Kalota等人,Nuc.AcidRes.2006,34(2):451-61(以引用的方式并入本文中)中更详细地论述。

在其他实施方案中，本发明的寡核苷酸利用“半聚体”设计，并且包含与缺口区域相邻(在其5'侧或3'侧中的任一侧)的单个2'-修饰的侧翼区段。半聚体寡核苷酸在Geary等人,2001,J.Pharm.Exp.Therap.,296:898-904(以引用的方式并入本文中)中更详细地论述。

在各种实施方案中，寡核苷酸包含5'侧翼区域、3'侧翼区域和在5'侧翼区域与3'侧翼区域之间的缺口区域。在一些实施方案中，缺口区域包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个DNA核苷的连续延伸段。在一些实施方案中，缺口区域包含8、10或12个DNA核苷的连续延伸段。在各种实施方案中，5'侧翼区域和3'侧翼区域包含一个或多个亲和力增强替代核苷，诸如一个或多个2'-O-甲氧基乙基(MOE)核苷。在一些实施方案中，5'侧翼区域包含一个、两个、三个、四个、五个或六个2'-O-MOE核苷。在特定的实施方案中，5'侧翼区域包含两个或五个2'-O-MOE核苷。在一些实施方案中，5'侧翼区域包含一个、两个、三个、四个、五个或六个锁核苷(LNA)。在特定的实施方案中，5'侧翼区域包含两个LNA。在一些实施方案中，5'侧翼区域包含两个2'-O-MOE核苷和两个LNA。

在一些实施方案中，3'侧翼区域包含一个、两个、三个、四个、五个或六个2'-O-MOE核苷。在特定的实施方案中，3'侧翼区域包含三个或五个MOE核苷。在一些实施方案中，3'侧翼区域包含一个、两个、三个、四个、五个或六个锁核苷(LNA)。在特定的实施方案中，3'侧翼区域包含两个LNA。在一些实施方案中，3'侧翼区域包含三个MOE核苷和两个LNA。

在各种实施方案中，寡核苷酸的一个或多个核苷间键联是天然存在的键联(例如，磷酸二酯键)。在一些实施方案中，寡核苷酸的所有核苷间键联都是天然存在的键联(例如，磷酸二酯键)。在各种实施方案中，寡核苷酸的一个或多个核苷间键联是替代的键联(例如，硫代磷酸酯键联)。在一些实施方案中，至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个核苷间键联是硫代磷酸酯键联。在各种实施方案中，寡核苷酸包括磷酸二酯键和硫代磷酸酯键联两者。在一些实施方案中，寡核苷酸的缺口区域包含磷酸二酯键，并且5'侧翼区域和3'侧翼区域各自包含一个或多个硫代磷酸酯键联。

在各种实施方案中，寡核苷酸包括一个或多个未修饰的胞嘧啶。在一些实施方案中，寡核苷酸中的所有胞嘧啶都是未修饰的。在各种实施方案中，寡核苷酸包括一个或多个修饰的胞嘧啶。修饰的胞嘧啶的实例是5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶(5-甲基-dC)或5-甲基-2'-胞嘧啶(5-甲基-C)。在一些实施方案中，寡核苷酸的所有胞嘧啶是5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。在一些实施方案中，寡核苷酸的缺口区域中的所有胞嘧啶都是5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶，并且5'侧翼区域和3'侧翼区域中的所有胞嘧啶都是5-甲基-C。

在一个实施方案中，寡核苷酸具有化学修饰的核碱基序列eeeee-d10-eeeee(其中“e”表示2'-O-MOE修饰的核苷，并且其中“d10”表示连续10DNA核碱基序列)。在这个实施方案中，5'侧翼区域包括五个2'-O-MOE修饰的核苷，缺口区域包括10个连续DNA核碱基，并且3'侧翼区域包括五个2'-O-MOE修饰的核苷。连接核碱基的核苷间键联可以是磷酸二酯键。在一个实施方案中，寡核苷酸包括未修饰的胞苷。在另一个实施方案中，寡核苷酸包括修饰的胞苷(例如，5-甲基-dC和/或5-甲基-C)。

在一个实施方案中，寡核苷酸具有化学修饰的核碱基序列eeeee-d12-eeeee。在这个实施方案中，5'侧翼区域包括五个2'-O-MOE修饰的核苷，缺口区域包括12个连续DNA核碱基，并且3'侧翼区域包括五个2'-O-MOE修饰的核苷。连接核碱基的核苷间键联可以是磷酸二酯键。寡核苷酸包括未修饰的胞苷。

在一个实施方案中，寡核苷酸具有化学修饰的核碱基序列eeeee-d8-eeeee。在这个实施方案中，5'侧翼区域包括五个2'-O-MOE修饰的核苷，缺口区域包括8个连续DNA核碱基，并且3'侧翼区域包括五个2'-O-MOE修饰的核苷。连接核碱基的核苷间键联可以如下：sooosssssssssooss(其中“s”是指硫代磷酸酯键且“o”是指磷酸二酯键)。寡核苷酸包括未修饰的胞苷。

在一个实施方案中，寡核苷酸具有化学修饰的核碱基序列eekk-d8-kkeee(其中“e”表示2'-O-MOE修饰的核苷，“d8”表示连续8个DNA核碱基的序列，且“k”表示锁核酸(LNA)、限制性甲氧基乙基(cMOE)核苷、限制性乙基(cET)核苷或肽核酸(PNA)。在这个实施方案中，5'侧翼区域包括两个2'-O-MOE修饰的核苷和两个LNA，缺口区域包括8个连续DNA核碱基，并且3'侧翼区域包括两个LNA和三个2'-O-MOE修饰的核苷。连接核碱基的核苷间键联可以如下：soosssssssssooss(其中“s”是指硫代磷酸酯键且“o”是指磷酸二酯键)。寡核苷酸包括未修饰的胞苷。

与配体缀合的寡核苷酸

本发明的寡核苷酸可以化学连接至增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或多个配体、部分或缀合物。这类部分包括但不限于脂质部分，诸如胆固醇部分(Letsinger等人,(1989)Proc.Natl.Acid.Sci.USA,86:6553-6556)；胆酸(Manoharan等人,(1994)Biorg.Med.Chem.Let.,4:1053-1060)；硫醚，例如，beryl-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人,(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.,660:306-309；Manoharan等人,(1993)Biorg.Med.Chem.Let.,3:2765-2770)；巯基胆固醇(Oberhauser等人,(1992)Nucl.AcidsRes.,20:533-538)；脂族链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人,(1991)EMBO J,10:1111-1118；Kabanov等人,(1990)FEBS Lett.,259:327-330；Svinarchuk等人,(1993)Biochimie,75:49-54)；磷脂，例如，二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-铵-1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-磷酸酯(Manoharan等人,(1995)Tetrahedron Lett.,36:3651-3654；Shea等人,(1990)Nucl.Acids Res.,18:3777-3783)；聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,(1995)Nucleosides&Nucleotides,14:969-973)；或金刚烷乙酸(Manoharan等人,(1995)Tetrahedron Lett.,36:3651-3654)；棕榈基部分(Mishra等人,(1995)Biochim.Biophys.Acta,1264:229-237)或十八烷基胺或己基氨基-羰基氧基胆固醇部分(Crooke等人,(1996)J.Pharmacol.Exp.Ther.,277:923-937)。

在一个实施方案中，配体改变其所掺入的寡核苷酸剂的分布、靶向或寿命。在一些实施方案中，配体提供对选定的靶标(例如，分子、细胞或细胞类型)、区室(例如，细胞或器官区室)、组织、器官或身体的区域的增强的亲和力，例如与不存在这种配体的物种相比。

配体可以包括天然存在的物质，诸如蛋白质(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚糖、支链淀粉、壳多糖、脱乙酰壳多糖、菊粉、环糊精、N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基半乳糖胺或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组或合成分子，诸如合成聚合物，例如，合成聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括聚氨基酸为聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚膦嗪。聚胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、多胺、伪肽-多胺、肽模拟物多胺、树枝状多胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、多胺的季盐或α螺旋肽。

配体还可以包括靶向基团，例如，细胞或组织靶向剂，例如，凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如，抗体，其结合至指定的细胞类型，诸如肾细胞。靶向基团可以是促甲状腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、二膦酸酯、聚谷氨酸酯、聚天冬氨酸酯、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸酯、维生素B12、维生素A、生物素或RGD肽或RGD肽模拟物。

配体的其他实例包括染料、嵌入剂(例如，吖啶)、交联剂(例如，补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、德克萨卟啉、噻啉(Spphyrin))、多环芳烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工内切核酸酶(例如，EDTA)、亲脂性分子(例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)和肽缀合物(例如，触角肽、Tat肽)、烷化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]₂、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记物、酶、半抗原(例如，生物素)、转运/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+复合物)、二硝基苯基、HRP或AP。

配体可以是蛋白质，例如，糖蛋白，或肽，例如，对共配体具有特异性亲和力的分子，或抗体，例如，结合诸如肝细胞的指定细胞类型的抗体。配体还可以包括激素和激素受体。它们还可以包括非肽物质，诸如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖或多价岩藻糖。

配体可以是以下物质，例如，药物，其可以例如通过破坏细胞的细胞骨架，例如，通过破坏细胞的微管、微丝和/或中间丝状体增加寡核苷酸剂到细胞的摄取。药物可以是，例如，紫杉烷、长春新碱、长春花碱、细胞松弛素、诺考达唑、促微丝聚合剂(japlakinolide)、红海海绵素A、鬼笔环肽、海洋苔藓素(swinholide)A、茚满诺星(indanocine)或myoservin。

在一些实施方案中，连接至如本文所述的寡核苷酸的配体充当药代动力学调节剂(PK调节剂)。PK调节剂包括亲脂体、胆酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、PEG、维生素等。示例性PK调节剂包括但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、维生素E、生物素等。还已知包含许多硫代磷酸酯键联的寡核苷酸结合血清蛋白，因此在主链中包含多个硫代磷酸酯键联的短寡核苷酸，例如，约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸，作为配体(例如，作为PK调节配体)也适用于本发明。另外，结合血清组分(例如，血清蛋白)的适体也适合用作本文所述的实施方案中的PK调节配体。

本发明的配体缀合的寡核苷酸可以通过使用带有侧反应性官能团的寡核苷酸来合成，诸如衍生自连接分子在寡核苷酸上的连接的官能团(如下所述)。这种反应性寡核苷酸可以与市售配体、带有各种保护基中任一种的合成配体或具有连接到其的连接部分的配体直接反应。

本发明的缀合物中使用的寡核苷酸可以通过熟知的固相合成技术方便地且常规地制备。用于这种合成的设备由包括例如Applied Biosystems(Foster City,Calif.)的多个供应商出售。可以另外或另选地使用本领域已知的用于这种合成的任何其他方法。还已知使用相似的技术来制备其他寡核苷酸，诸如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。

在本发明的配体-缀合的寡核苷酸中，诸如在本发明的带有序列特异性连接的核苷的配体-分子中，寡核苷酸和寡核苷可以在合适的DNA合成仪上利用标准的核苷酸或核苷前体，或已经带有连接部分的核苷酸或核苷缀合物前体，已经带有配体分子的配体-核苷酸或核苷缀合物前体或带有非核苷配体的结构基元(building block)组装。

当使用已经带有连接部分的缀合物前体时，通常完成序列特异性连接核苷的合成，然后使配体分子与连接部分反应以形成配体缀合的寡核苷酸。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸或连接的核苷通过自动合成仪，除了可商购获得且在寡核苷酸合成中常规使用的标准亚磷酰胺和非标准亚磷酰胺之外，还使用衍生自配体-核苷缀合物的亚磷酰胺来合成。

脂质缀合物

在一个实施方案中，配体或缀合物是脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子可以结合血清蛋白，例如，人血清白蛋白(HSA)。HSA结合配体允许缀合物分布到靶组织，例如，身体的非肾靶组织。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加对缀合物降解的抗性，(b)增加向靶细胞或细胞膜中的靶向或向其中的转运，和/或(c)可以用于调节与血清蛋白例如HSA的结合。

在另一个方面，配体是被靶细胞，例如，增殖细胞摄取的部分，例如，维生素。示例性维生素包括维生素A、E和K。

细胞渗透剂

在另一个方面，配体是细胞渗透剂，例如螺旋细胞渗透剂。在一些实施方案中，细胞渗透剂是两亲性的。示例性剂是肽，诸如tat或触角足蛋白(antennopedia)。如果所述剂是肽，则其可以是修饰的，包括肽酰基模拟物、反转异构体、非肽或假肽键联和D-氨基酸的使用。在一些实施方案中，螺旋剂是α-螺旋剂，其可以具有亲脂相和疏脂相。

配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(在本文中也称为寡肽模拟物)是能够折叠成与天然肽相似的限定的三维结构的分子。肽和肽模拟物连接至寡核苷酸剂可以诸如通过增强细胞识别和吸收而影响寡核苷酸的药代动力学分布。肽或肽模拟物部分的长度可以是约5-50个氨基酸，例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。

肽或肽模拟物可以是例如细胞渗透肽、阳离子肽、两亲性肽或疏水肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树枝状肽、限制性肽或交联肽。在另一个替代的方案中，肽部分可以包括疏水膜易位序列(MTS)。示例性含疏水性MTS的肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO:3535)的RFGF。含有疏水性MTS的RFGF类似物(例如，氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO:3536)也可以是靶向部分。肽部分可以为“递送”肽，其可以携带大的极性分子，包括肽、寡核苷酸和跨细胞膜蛋白。例如，已经发现来自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ)(SEQ ID NO:3537)和果蝇触角足蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK)(SEQ ID NO:3538)的序列能够起递送肽的作用。肽或肽模拟物可以由DNA的随机序列编码，诸如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库(Lam等人,Nature,354:82-84，1991)鉴定的肽。出于细胞靶向目的，经由掺入的单体单元栓系到寡核苷酸剂的肽或肽模拟物的实例是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽或RGD模拟物。肽部分的长度范围可以是约5个氨基酸至约40个氨基酸。肽部分可以具有结构修饰，诸如增加稳定性或导向构象性质。可以利用下面描述的任何结构修饰。

用于本发明的组合物和方法中的RGD肽可以是线性的或环状的，并且可以是修饰的，例如，糖基化或甲基化的，以促进对一种或多种具体组织的靶向。含RGD的肽和肽模拟物可以包括D-氨基酸以及合成的RGD模拟物。除了RGD之外，还可以使用靶向整合素配体的其他部分。这种配体的一些缀合物靶向PECAM-1或VEGF。

细胞渗透肽能够渗透细胞，例如，微生物细胞，诸如细菌或真菌细胞，或哺乳动物细胞，诸如人细胞。微生物细胞渗透肽可以是例如α-螺旋线性肽(例如，LL-37或CeropinP1)、含二硫键的肽(例如，α-防御素、β-防御素或抗菌肽)或仅含一种或两种主要氨基酸的肽(例如，PR-39或吲哚力西丁(indolicidin))。细胞渗透肽还可以包括核定位信号(NLS)。例如，细胞渗透肽可以是二分两亲性肽(bipartite amphipathic peptide)，诸如MPG，其来源于HIV-1gp41的融合肽结构域和SV40大T抗原的NLS(Simeoni等人,Nucl.Acids Res.31:2717-2724,2003)。

碳水化合物缀合物

在本发明的组合物和方法的一些实施方案中，寡核苷酸还包含碳水化合物。如本文所述，碳水化合物缀合的寡核苷酸有利于体内递送核酸以及适于体内治疗用途的组合物。如本文所用，“碳水化合物”是指这样的化合物，其本身是由一个或多个具有至少6个碳原子的单糖单元(其可以是直链、支链或环状的)组成的碳水化合物，每个碳原子键合有氧、氮或硫原子；或这样的化合物，其具有由一个或多个各自具有至少六个碳原子的单糖单元(其可以是直链、支链或环状的)组成的碳水化合物部分作为其部分，每个碳原子键合有氧、氮或硫原子。代表性的碳水化合物包括糖(含有约4、5、6、7、8或9个单糖单元的单糖、二糖、三糖和寡糖)和多糖，诸如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。具体的单糖包括C5和更多碳数(例如，C5、C6、C7或C8)糖；二糖和三糖包括具有两个或三个单糖单元(例如，C5、C6、C7或C8)的糖。

在一个实施方案中，用于本发明的组合物和方法的碳水化合物缀合物是单糖。

在一些实施方案中，碳水化合物缀合物还包含一种或多种如上所述的额外配体，诸如但不限于PK调节剂和/或细胞渗透肽。

适用于本发明的额外碳水化合物缀合物(和接头)包括PCT公开号WO 2014/179620和WO 2014/179627中描述的那些，其各自的全部内容以引用的方式并入本文中。

接头

在一些实施方案中，本文所述的缀合物或配体可以用各种接头连接至寡核苷酸，所述接头可以是可裂解的或不可裂解的。

接头通常包括：直接键或原子，诸如氧或硫；单元，诸如NR⁸、C(O)、C(O)NH、SO、SO₂、SO₂NH或原子链，诸如但不限于取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂环炔基、芳基、杂芳基、杂环基、杂烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环烷基、烷基杂环烯基、烷基杂环炔基、烯基杂环烷基、烯基杂环烯基、烯基杂环炔基、炔基杂环烷基、炔基杂环烯基、炔基杂环炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其一个或多个亚甲基可以被O、S、S(O)、SO₂、N(R⁸)、C(O)、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环中断或封端；其中R⁸是氢、酰基、脂族或取代的脂族。在一个实施方案中，接头为约1-24个原子、2-24个原子、3-24个原子、4-24个原子、5-24个原子、6-24个原子、6-18个原子、7-18个原子、8-18个原子、7-17个原子、8-17个原子、6-16个原子、7-17个原子或8-16个原子。

可裂解的连接基团是在细胞外足够稳定的基团，但其在进入靶细胞时被裂解以释放接头保持在一起的两个部分。在一个优选的实施方案中，可裂解的连接基团在靶细胞中或在第一参考条件(其可以例如被选择为模拟或代表细胞内条件)下比在受试者的血液中或在第二参考条件(其可以例如被选择为模拟或代表血液或血清中见到的条件)下裂解快至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多倍，或至少约100倍。

可裂解的连接基团易受裂解剂，例如，pH、氧化还原电位或降解分子的存在影响。通常，裂解剂更普遍或在细胞内比在血清或血液中以更高的水平或活性见到。这类降解剂的实例包括：对特定底物具有选择性或不具有底物特异性的氧化还原剂，包括例如存在于细胞中的氧化或还原酶或还原剂如硫醇，其可以通过还原降解氧化还原可裂解的连接基团；酯酶；可以产生酸性环境的内体或剂，例如导致pH为五或更低的内体或剂；可以通过充当一般酸而水解或降解酸可裂解的连接基团的酶，肽酶(其可以为底物特异性的)和磷酸酶。

诸如二硫键的可裂解的连接基团可能对pH敏感。人血清的pH为7.4，而平均细胞内pH略低，范围为约7.1-7.3。内体具有更酸性的pH，在5.5-6.0的范围内，并且溶酶体具有甚至更酸性的pH，约5.0。一些接头将具有可裂解连接基团，其在优选的pH下裂解，从而从细胞内的配体释放阳离子脂质或释放到细胞的所需区室中。

接头可以包括可被特定酶裂解的可裂解连接基团。掺入接头中的可裂解连接基团的类型可以取决于待靶向的细胞。例如，肝靶向配体可以通过包括酯基的接头连接至阳离子脂质。肝细胞富含酯酶，并且因此接头在肝细胞中的裂解比在非富含酯酶的细胞类型中更有效。富含酯酶的其他细胞类型包括肺、肾皮质和睾丸的细胞。

当靶向富含肽酶的细胞类型，诸如肝细胞和滑膜细胞时，可以使用含有肽键的接头。

通常，候选可裂解连接基团的合适性可以通过测试降解剂(或条件)裂解候选连接基团的能力来评价。还期望还测试候选可裂解连接基团在血液中或当与其他非靶组织接触时抵抗裂解的能力。因此，可以确定在第一条件和与第二条件之间对裂解的相对敏感性，其中第一条件被选择为指示靶细胞中的裂解，并且第二条件被选择为指示其他组织或生物流体例如血液或血清中的裂解。可以在无细胞系统、细胞、细胞培养物、器官或组织培养物或整个动物中进行评价。在无细胞或培养条件下进行初始评价并通过在整个动物中的进一步评价证实可以是有用的。在优选的实施方案中，有用的候选化合物在细胞中(或在选择为模拟细胞内条件的体外条件下)比在血液或血清中(或在选择为模拟细胞外条件的体外条件下)裂解快至少约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或约100倍。

氧化还原可裂解的连接基团

在一个实施方案中，可裂解的连接基团是在还原或氧化时裂解的氧化还原可裂解的连接基团。还原可裂解的连接基团的一个实例是二硫连接基团(--S--S--)。为了确定候选可裂解的连接基团是否是合适的“还原可裂解的连接基团”，或例如是否适合与特定的寡核苷酸部分和特定的靶向剂一起使用，可以参见本文所述的方法。例如，候选物可以通过与二硫苏糖醇(DTT)或其他还原剂一起使用本领域已知的试剂孵育来评价，其模拟将在细胞例如靶细胞中观察到的裂解速率。候选物也可以在选择为模拟血液或血清条件的条件下进行评价。在一个实施方案中，候选化合物在血液中裂解至多约10％。在其他实施方案中，有用的候选化合物在细胞中(或在选择为模拟细胞内条件的体外条件下)比在血液中(或在选择模拟细胞外条件的体外条件下)降解快至少约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或约100倍。候选化合物的裂解速率可以在选择为模拟细胞内介质的条件下使用标准酶动力学测定来确定，并与选择为模拟细胞外介质的条件进行比较。

基于磷酸酯的可裂解连接基团

在另一个实施方案中，可裂解接头包含基于磷酸酯的可裂解连接基团。基于磷酸酯的可裂解连接基团被降解或水解磷酸酯基团的剂裂解。裂解细胞中的磷酸酯基团的剂的实例是酶，诸如细胞中的磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例是-O-P(O)(OR^k)-O-、

-O-P(S)(OR^k)-O-、-O-P(S)(SR^k)-O-、-S-P(O)(OR^k)-O-、-O-P(O)(OR^k)-S-、-S-P(O)(OR^k)-S-、

-O-P(S)(OR^k)-S-、-S-P(S)(OR^k)-O-、-O-P(O)(R^k)-O-、-O-P(S)(R^k)-O-、-S-P(O)(R^k)-O-、-S-P(S)(R^k)-O-、

-S-P(O)(R^k)-S-、-O-P(S)(R^k)-S-。这些候选物可以使用类似于上述那些的方法进行评价。

酸可裂解的连接基团

在另一个实施方案中，可裂解接头包含酸可裂解的连接基团。酸可裂解的连接基团是在酸性条件下裂解的连接基团。在优选的实施方案中，酸可裂解的连接基团在pH为约6.5或更低(例如，约6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)的酸性环境中，或通过诸如可以充当广义酸的酶的剂裂解。在细胞中，具体的低pH细胞器，诸如内体和溶酶体，可以为酸可裂解的连接基团提供裂解环境。酸可裂解的连接基团的实例包括但不限于腙、酯和氨基酸的酯。酸可裂解的基团可以具有通式-C＝NN--、C(O)O或--OC(O)。优选的实施方案是连接至酯的氧(烷氧基)的碳是芳基、取代的烷基或叔烷基，诸如二甲基戊基或叔丁基。这些候选物可以使用类似于上述那些的方法进行评价。

基于酯的连接基团

在另一个实施方案中，可裂解的接头包含基于酯的可裂解的连接基团。基于酯的可裂解的连接基团被细胞中的诸如酯酶和酰胺酶的酶裂解。基于酯的可裂解的连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。酯可裂解的连接基团具有通式--C(O)O--或--OC(O)--。这些候选物可以使用类似于上述那些的方法进行评价。

基于肽的裂解基团

在另一个实施方案中，可裂解的接头包含基于肽的可裂解的连接基团。基于肽的可裂解的连接基团被细胞中的诸如肽酶和蛋白酶的酶裂解。基于肽的可裂解的连接基团是在氨基酸之间形成以产生寡肽(例如，二肽、三肽等)和多肽的肽键。基于肽的可裂解的基团不包括酰胺基(-C(O)NH-)。酰胺基可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形成以产生肽和蛋白质的特殊类型的酰胺键。基于肽的裂解基团通常限于在氨基酸之间形成以产生肽和蛋白质的肽键(即，酰胺键)，并且不包括整个酰胺官能团。基于肽的可裂解的连接基团具有以下通式

-NHCHR^AC(O)NHCHR^BC(O)--，其中R^A和R^B是两个相邻氨基酸的R基团。这些候选物可以使用类似于上述那些的方法进行评价。

在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸通过接头缀合至碳水化合物。接头包括二价和三价分支接头基团。用于寡核苷酸碳水化合物缀合物的接头包括但不限于PCT公开号WO 2018/195165的式24-35中描述的那些。

教导寡核苷酸缀合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,828,979、4,948,882、5,218,105、5,525,465、5,541,313、5,545,730、5,552,538、5,578,717、5,580,731、5,591,584、5,109,124、5,118,802、5,138,045、5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、4,667,025、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、4,958,013、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、5,371,241、5,391,723、5,416,203、5,451,463、5,510,475、5,512,667、5,514,785、5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,595,726、5,597,696、5,599,923、5,599,928和5,688,941、6,294,664、6,320,017、6,576,752、6,783,931、6,900,297、7,037,646、8,106,022，其各自的全部内容以引用的方式并入本文中。

给定化合物中的所有位置不必被均匀地修饰，并且实际上可以将多于一种前述修饰并入单个化合物中或甚至并入寡核苷酸内的单个核苷中。本发明还包括为嵌合化合物的寡核苷酸化合物。嵌合寡核苷酸通常含有至少一个此类区域，在所述区域中RNA被修饰，以赋予寡核苷酸增加的对核酸酶降解的抗性、增加的细胞摄取和/或增加的对靶核酸的结合亲和力。寡核苷酸的额外区域可以充当能够裂解RNA:DNA的酶的底物。例如，RNA酶H是裂解RNA:DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶。因此，激活RNA酶H导致RNA靶标的裂解，从而大大增强寡核苷酸抑制基因表达的效率。因此，与杂交到相同靶区域的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸相比，当使用嵌合寡核苷酸时，用较短的寡核苷酸通常可以获得相当的结果。RNA靶标的裂解可以通过凝胶电泳和(必要时)本领域已知的相关核酸杂交技术常规地检测。

在某些情况下，寡核苷酸的核苷酸可以由非配体基团修饰。许多非配体分子已经与寡核苷酸缀合，以增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取，并且用于进行这类缀合的程序可在科学文献中获得。这类非配体部分包括：脂质部分，诸如胆固醇(Kubo，T等人,Biochem.Biophys.Res.Comm,2007,365(1):54-61；Letsinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86:6553)、胆酸(Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4:1053)、硫醚(例如，己基-S-三苯甲基硫醇)(Manoharan等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660:306；Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3:2765)、巯基胆固醇(Oberhauser等人,Nucl.Acids Res.,1992,20:533)、脂族链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)(Saison-Behmoaras等人,EMBO J.,1991,10:111；Kabanov等人,FEBS Lett.,1990,259:327；Svinarchuk等人,Biochimie,1993,75:49)、磷脂(例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-铵-1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-磷酸酯)(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,1995,36:3651；Shea等人,Nucl.Acids Res.,1990,18:3777)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,Nucleosides&Nucleotides,1995,14:969)或金刚烷乙酸(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,1995,36:3651)；棕榈基部分(Mishra等人,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264:229)；或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分(Crooke等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277:923)。教导这类寡核苷酸缀合物的制备的代表性美国专利已经在上面列出。典型的缀合方案包括合成在序列的一个或多个位置带有氨基接头的寡核苷酸。然后使用合适的偶联或活化剂使氨基与被缀合的分子反应。缀合反应可以在寡核苷酸仍结合在固体支撑物上的情况下或在寡核苷酸裂解之后在溶液相中进行。通过HPLC纯化寡核苷酸缀合物通常提供纯的缀合物。

药物用途

本文所述的寡核苷酸组合物可用于本发明的方法中，并且尽管不受理论束缚，但据信它们通过它们调节KCNT1的水平、状态和/或活性的能力，例如通过抑制哺乳动物细胞中KCNT1蛋白的活性或水平来发挥它们的期望效果。

本发明的一个方面涉及治疗有需要的受试者的与KCNT1相关的病症(例如，癫痫)的方法。本发明的另一方面包括降低鉴定为患有KCNT1相关病症的受试者的细胞中KCNT1的水平。再一方面包括一种抑制受试者的细胞中KCNT1的表达的方法。所述方法可以包括使细胞与以有效抑制细胞中KCNT1的表达的量的寡核苷酸接触，从而抑制细胞中KCNT1的表达。

基于上述方法，本发明的其他方面包括本发明的寡核苷酸或包含这种寡核苷酸的组合物，其用于治疗，或用作药物，或用于治疗有需要的受试者的KCNT1相关病症，或用于降低被鉴定为患有KCNT1相关病症的受试者的细胞中KCNT1的水平，或用于抑制受试者的细胞中KCNT1的表达。所述用途包括使细胞与以有效抑制细胞中KCNT1的表达的量的寡核苷酸接触，从而抑制细胞中KCNT1的表达。下面描述的与本发明的方法相关的实施方案也可适用于这些另外的方面。

细胞与寡核苷酸的接触可以在体外或体内进行。细胞在体内与寡核苷酸接触包括受试者如人受试者内的细胞或细胞组与寡核苷酸接触。体外和体内接触细胞的方法的组合也是可能的。如上所论述，接触细胞可以是直接或间接的。此外，接触细胞可以经由靶向配体，包括本文所述或本领域已知的任何配体完成。在一些实施方案中，靶向配体是碳水化合物部分，例如，GalNAc₃配体或将寡核苷酸导向目标位点的任何其他配体。细胞可以包括中枢神经系统的那些细胞或肌肉细胞。

抑制KCNT1基因的表达包括KCNT1基因的任何抑制水平，例如，至少部分遏制KCNT1基因的表达，诸如抑制至少约20％。在某些实施方案中，抑制为至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。

KCNT1基因的表达可以基于与KCNT1基因表达相关的任何变量的水平，例如，KCNT1mRNA水平或KCNT1蛋白水平来评估。

抑制可以通过与对照水平相比这些变量中的一个或多个的绝对或相对水平的降低来评估。对照水平可以是本领域使用的任何类型的对照水平，例如，给药前基线水平，或从未治疗或用对照(诸如像，仅缓冲液对照或非活性剂对照)治疗的相似受试者、细胞或样品确定的水平。

在某些实施方案中，可以使用替代标记物检测KCNT1的抑制。例如，如通过使用降低KCNT1表达的剂的可接受的诊断和监测标准所表明，KCNT1相关病症的有效治疗可以理解为表明KCNT1的临床相关降低。

在本发明方法的一些实施方案中，KCNT1基因的表达被抑制至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或低于测定的检测水平。在某些实施方案中，所述方法包括KCNT1表达的临床相关的抑制，例如，如用降低KCNT1表达的剂治疗受试者后的临床相关结果所表明。

KCNT1基因表达的抑制可以通过第一细胞或细胞组(这种细胞可以存在于例如来源于受试者的样品中)表达的mRNA量的减少来表明，在所述第一细胞或细胞组中，KCNT1基因被转录并且已经被处理(例如，通过使细胞与本发明的寡核苷酸接触，或通过将本发明的寡核苷酸施用到其中存在所述细胞的受试者)，使得与第二细胞或细胞组相比，KCNT1基因的表达被抑制，所述第二细胞或细胞群与所述第一细胞或细胞群基本相同，但还没有或尚未如此处理(对照细胞未用寡核苷酸处理或未用靶向目标基因的寡核苷酸处理)。抑制程度可以根据以下表示：

在其他实施方案中，KCNT1基因表达的抑制可以根据与KCNT1基因表达功能性连接的参数例如，KCNT1蛋白表达或KCNT1活性的降低来评估。KCNT1基因沉默可以在表达KCNT1的任何细胞中自表达构建体内源或异源确定，并且通过本领域已知的任何测定确定。

KCNT1蛋白表达的抑制可以通过由细胞或细胞组表达的KCNT1蛋白的水平(例如，在来源于受试者的样品中表达的蛋白水平)的降低来表明。如上所解释，为了评估mRNA遏制，在处理的细胞或细胞组中蛋白质表达水平的抑制可以相似地表示为对照细胞或细胞组中蛋白水平的百分比。

可以用于评估KCNT1基因表达的抑制的对照细胞或细胞组包括尚未与本发明的寡核苷酸接触的细胞或细胞组。例如，对照细胞或细胞组可以在用寡核苷酸治疗个体受试者(例如，人或动物受试者)之前来源于所述受试者。

由细胞或细胞组表达的KCNT1 mRNA的水平可以使用本领域已知的评估mRNA表达的任何方法确定。在一个实施方案中，样品中KCNT1的表达水平通过检测转录的多核苷酸或其部分例如KCNT1基因的mRNA来确定。可以使用RNA提取技术从细胞中提取RNA，所述技术包括例如使用酸性酚/异硫氰酸胍提取(RNAzol B；Biogenesis)、RNEASY^TM RNA制备试剂盒(Qiagen)或PAXgene(PreAnalytix,Switzerland)。利用核糖核酸杂交的典型测定形式包括核运行测定(nuclear run-on assay)、RT-PCR、RNA酶保护测定、RNA印迹法、原位杂交和微阵列分析。循环KCNT1 mRNA可以使用PCT公开WO 2012/177906中描述的方法检测，其全部内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，KCNT1的表达水平使用核酸探针确定。如本文所用的术语“探针”是指能够选择性结合特异性KCNT1序列例如mRNA或多肽的任何分子。探针可以由本领域技术人员合成，或来源于合适的生物制剂。探针可以被具体设计以被标记。可以用作探针的分子的实例包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。

分离的mRNA可以用于杂交或扩增测定，所述测定包括但不限于DNA印迹或RNA印迹分析、聚合酶链反应(PCR)分析和探针阵列。确定mRNA水平的一种方法涉及使分离的mRNA与可以与KCNT1mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。在一个实施方案中，mRNA被固定在固体表面上并与探针接触，例如通过在琼脂糖凝胶上运行分离的mRNA并将mRNA从凝胶转移到诸如硝酸纤维素的膜上来实现。在一个替代的实施方案中，一个或多个探针被固定在固体表面上，并且例如在AFFYMETRIX基因芯片阵列中使mRNA与所述探针接触。熟练技术人员可以容易地修改已知mRNA检测方法以用于确定KCNT1 mRNA的水平。

确定样品中KCNT1的表达水平的另一种方法包括样品中例如m RNA的核酸扩增和/或逆转录酶(制备cDNA)的过程，例如，通过RT-PCR(Mullis,1987,美国专利号4,683,202中阐述的实验实施方案)、连接酶链反应(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:189-193)、自持序列复制(self-sustained sequence replication)(Guatelli等人,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等人,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等人,(1988)Bio/Technology 6:1197)、滚环复制(Liza rdi等人,美国专利号5,854,033)或任何其他核酸扩增方法，然后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增的分子。如果核酸分子以非常少的数量存在，则这些检测方案对于检测这类分子特别有用。在本发明的特定方面，KCNT1的表达水平通过定量荧光RT-PCR(即，TAQM ANTM^TM系统)或荧光素酶确定。

KCNT1 mRNA的表达水平可使用膜印迹(membrane blot)(诸如用于杂交分析，诸如RNA印迹、DNA印迹、dot等)或微孔、样品管、凝胶、珠或纤维(或任何包含结合核酸的固体支撑体)监测。参见美国专利号5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195和5,445,934，其以引用的方式并入本文中。KCNT1表达水平的确定也可以包括使用溶液中的核酸探针。

在一些实施方案中，使用分支DNA(bDNA)测定或实时PCR(qPCR)评估mRNA表达的水平。在本文呈现的实施例中描述和例证了这种PCR方法的使用。这类方法也可以用于检测KCNT1核酸。

KCNT1蛋白表达的水平可以使用本领域已知的测量蛋白水平的任何方法来确定。这类方法包括例如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、超扩散色谱、流体或凝胶沉淀反应、吸收光谱、比色测定、分光光度测定、流式细胞术、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、蛋白质印迹法、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、电化学发光测定等。这类测定也可以用于检测指示KCNT1蛋白存在或复制的蛋白。

在本发明方法的一些实施方案中，将寡核苷酸施用到受试者，使得寡核苷酸被递送至受试者内的具体部位。KCNT1表达的抑制可以使用来源于受试者内具体部位的样品中KCNT1 mRNA或KCNT1蛋白的水平或水平变化的测量来评估。在某些实施方案中，所述方法包括KCNT1表达的临床相关的抑制，例如，如用降低KCNT1表达的剂治疗受试者后的临床相关结果所表明。

在其他实施方案中，寡核苷酸以有效引起KCNT1病症的一种或多种症状减轻(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)的量和时间施用。这类症状包括但不限于发作延长、发作频繁、行为和发育延迟、运动和平衡问题、矫形状况、语言和说话延迟问题、生长和营养问题、睡眠困难、慢性感染、感觉统合失调、自主神经系统破坏和出汗。

治疗KCNT1相关病症可以引起与未治疗的受试者群体相比，根据本发明治疗的个体或受试者群体的平均存活时间增加。例如，个体的存活时间或群体的平均存活时间增加多于30天(多于60天、90天或120天)。个体的存活时间的增加或群体的平均存活时间的增加可以通过任何可再现的方法测量。个体的存活时间的增加可以例如通过计算个体在用本文所述的化合物开始治疗后的存活时间长度来测量。群体的平均存活时间的增加可以例如通过计算用本文所述的化合物开始治疗后的平均存活时间长度来测量。个体的存活时间的增加也可以例如通过计算用本文所述化合物或化合物的药学上可接受的盐完成第一轮治疗后个体的存活时间长度来测量。群体的平均存活时间的增加也可以例如通过计算用本文所述的化合物或化合物的药学上可接受的盐完成第一轮治疗后群体的平均存活时间长度来测量。

治疗KCNT1相关病症也可以引起与未治疗的群体相比，受治疗的受试者群体的死亡率降低。例如，死亡率降低多于2％(例如，多于5％、10％或25％)。受治疗的受试者群体死亡率的降低可以通过任何可再现的手段测量，例如，通过计算用本文所述的化合物或化合物的药学上可接受的盐开始治疗后每单位时间的疾病相关死亡的平均数测量。群体死亡率的降低也可以例如通过计算群体在用本文所述化合物或化合物的药学上可接受的盐完成第一轮治疗后每单位时间疾病相关死亡的平均数来测量。

寡核苷酸的递送

可以以多种不同的方式实现将本发明的寡核苷酸递送至细胞，例如受试者，如人受试者，例如有需要的受试者，如患有KCNT1相关病症的受试者内的细胞。例如，递送可以通过使细胞与本发明的寡核苷酸在体外或体内接触来进行。体内递送还可以通过向受试者施用包含寡核苷酸的组合物直接进行。这些替代的方案将在下面进一步讨论。

通常，任何递送核酸分子的方法(体外或体内)都可以适用于本发明的寡核苷酸(参见，例如，Akhtar S和Julian R L.,(1992)Trends Cell.Biol.2(5):139-144和WO 94/02595，其以引用的方式整体并入本文中。对于体内递送，为了递送寡核苷酸分子而要考虑的因素包括，例如，递送的分子的生物稳定性、非特异性效应的预防和递送的分子在靶组织中的积聚。寡核苷酸的非特异性效应可以通过局部施用，例如通过直接注射或植入组织或局部施用制剂而最小化。向治疗部位的局部施用使剂的局部浓度最大化，限制剂对全身组织的暴露(否则全身组织可能被所述剂损害或者可能降解所述剂)并且允许待施用的寡核苷酸分子的总剂量更低。

为了全身施用寡核苷酸以治疗疾病，寡核苷酸可以包括替代的核碱基、替代的糖部分和/或替代的核苷间键联，或另选地使用药物递送系统递送；两种方法都用以防止寡核苷酸在体内被内切核酸酶和外切核酸酶快速降解。寡核苷酸或药物载剂的修饰还可以允许寡核苷酸组合物靶向靶组织并避免不希望的脱靶效应。寡核苷酸分子可以通过与诸如胆固醇的亲脂性基团化学缀合来修饰，以增强细胞摄取并防止降解。在一个替代的实施方案中，寡核苷酸可以使用药物递送系统递送，所述药物递送系统例如纳米颗粒、脂质纳米颗粒、多聚复合物纳米颗粒、脂质复合物纳米颗粒、树枝状体、聚合物、脂质体或阳离子递送系统。带正电荷的阳离子递送系统促进寡核苷酸分子(带负电荷)的结合，并且还增强在带负电荷的细胞膜处的相互作用，以允许寡核苷酸被细胞有效摄取。阳离子脂质、树枝状体或聚合物可以结合到寡核苷酸，或被诱导以形成包裹寡核苷酸的囊泡或胶束。囊泡或胶束的形成进一步防止寡核苷酸在全身性施用时降解。通常，本领域已知的任何核酸递送方法都可以适用于递送本发明的寡核苷酸。用于制备和施用阳离子寡核苷酸复合物的方法完全在本领域技术人员的能力范围内(参见例如，Sorensen,D R.等人,(2003)J.Mol.Biol 327:761-766；Verma,U N.等人,(2003)Clin.Cancer Res.9:1291-1300；Arnold,A S等人,(2007)J.Hypertens.25:197-205，其以引用的方式整体并入本文中)。可用于全身递送寡核苷酸的药物递送系统的一些非限制性实例包括DOTAP(Sorensen,D R.等人,(2003)，上述；Verma,UN.等人,(2003)，上述)、Oligofectamine“固体核酸脂质颗粒”(Zimmermann,T S.等人,(2006)Nature 441:111-114)、心磷脂(Chien,P Y.等人,(2005)Cancer Gene Ther.12:321-328；Pal,A.等人,(2005)Int J.Oncol.26:1087-1091)、聚乙烯亚胺(Bonnet M E.等人,(2008)Pharm.Res.8月16日线上发表；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3:472-487)和聚酰胺胺(Tomalia,D A.等人,(2007)Biochem.Soc.Trans.35:61-67；Yoo,H.等人,(1999)Pharm.Res.16:1799-1804)。在一些实施方案中，寡核苷酸与环糊精形成复合物用于全身施用。寡核苷酸和环糊精的施用方法和药物组合物可以见于美国专利号7,427,605，其以引用的方式整体并入本文中。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸通过多聚复合物或脂质复合物纳米颗粒递送。寡核苷酸和多聚复合物纳米颗粒和脂质复合物纳米颗粒的施用方法和药物组合物可以见于美国专利

申请号2017/0121454、2016/0369269、2016/0279256、2016/0251478、2016/0230189、2015/0335764、2015/0307554、2015/0174549、2014/0342003、2014/0135376和2013/0317086，其以引用的方式整体并入本文中。

在一些实施方案中，本文所述的化合物可以与额外的治疗剂组合施用。额外治疗剂的实例包括保健性抗癫痫药物的标准品，诸如奎尼丁和/或钠通道阻滞剂。另外，本文所述的化合物可以与推荐的生活方式改变如生酮饮食组合施用。

膜分子组装递送方法

本发明的寡核苷酸也可以使用各种膜分子组装递送方法递送，所述膜分子组装递送方法包括本领域已知的聚合物、生物可降解微粒或微胶囊递送装置。例如，胶态分散系统可以用于本文所述的寡核苷酸剂的靶向递送。胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。脂质体是可用作体外和体内递送媒介物的人工膜囊泡。已经显示大小在0.2-4.0μm范围内的大单层囊泡(LUV)可以包封相当大百分比的含有大分子的水性缓冲液。脂质体可用于将活性成分转移和递送至作用部位。因为脂质体膜在结构上与生物膜相似，所以当将脂质体应用于组织时，脂质体双层与细胞膜的双层融合。随着脂质体和细胞的融合进行，包括寡核苷酸的内部水性内容物被递送至细胞中，其中寡核苷酸可以特异性地结合至靶RNA并且可以介导RNA酶H介导的基因沉默。在一些情况下，脂质体也被特异性靶向，例如，以将寡核苷酸导向特定细胞类型。脂质体的组成通常是磷脂的组合，通常与类固醇，尤其是胆固醇组合。也可以使用其他磷脂或其他脂质。脂质体的物理特征取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。

含有寡核苷酸的脂质体可以通过多种方法制备。在一个实施例中，将脂质体的脂质组分溶解在洗涤剂中，使得与脂质组分形成胶束。例如，脂质组分可以是两亲性阳离子脂质或脂质缀合物。洗涤剂可以具有高临界胶束浓度，并且可以是非离子的。示例性洗涤剂包括胆酸盐、CHAPS、辛基葡糖苷、脱氧胆酸盐和月桂酰肌氨酸。然后将寡核苷酸制剂添加到包括脂质组分的胶束中。脂质上的阳离子基团与寡核苷酸相互作用，并且在寡核苷酸周围缩合以形成脂质体。在缩合后，洗涤剂例如通过透析除去，以产生寡核苷酸的脂质体制剂。

如果需要，可以在缩合反应期间例如通过控制添加来添加有助于缩合的载剂化合物。例如，载剂化合物可以是除核酸外的聚合物(例如，精胺或亚精胺)。也可以调节pH以有利于缩合。

用于产生稳定的多核苷酸递送媒介物的方法进一步描述于例如WO 96/37194中，其全部内容以引用的方式并入本文中，所述多核苷酸递送媒介物作为递送媒介物的结构组分掺入多核苷酸/阳离子脂质复合物。脂质体形成也可以包括以下文献中描述的示例性方法的一个或多个方面：Feigner,P.L.等人,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8:7413-7417；美国专利号4,897,355；美国专利号5,171,678；Bangham等人,(1965)M.Mol.Biol.23:238；Olson等人,(1979)Biochim.Biophys.Acta 557:9；Szoka等人,(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.75:4194；Mayhew等人,(1984)Biochim.Biophys.Acta 775:169；Kim等人,(1983)Biochim.Biophys.Acta 728:339；以及Fukunaga等人,(1984)Endocrinol.115:757。制备用作递送媒介物的适当大小的脂质聚集体的常用技术包括超声处理和冻融加挤压(参见，例如,Mayer等人,(1986)Biochim.Biophys.Acta 858:161)。当需要一致小(50-200nm)且相对均匀的聚集体时，可以使用微流体化(Mayhew等人,(1984)Biochim.Biophys.Acta 775:169)。这些方法容易适用于将寡核苷酸制剂包装到脂质体中。

脂质体分为两大类。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其与带负电荷的核酸分子相互作用形成稳定的复合物。带正电荷的核酸/脂质体复合物结合到带负电荷的细胞表面上，并且在内体中内化。由于内体内的酸性pH，脂质体破裂，将其内容物释放到细胞质中(Wang等人,(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.,147:980-985)。

pH敏感或带负电荷的脂质体捕获核酸而不是与其复合。由于核酸和脂质两者带有相似的电荷，因此会发生排斥而不是复合物形成。然而，一些核酸被捕获在这些脂质体的水性内部。pH敏感性脂质体已经用于将编码胸苷激酶基因的核酸递送至培养物中的细胞单层中。在靶细胞中检测到外源基因的表达(Zhou等人,(1992)Journal of ControlledRelease,19:269-274)。

一种主要类型的脂质体组合物包括除天然衍生的磷脂酰胆碱外的磷脂。例如，中性脂质体组合物可以由二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)形成。阴离子脂质体组合物通常由二肉豆蔻酰磷脂酰甘油形成，而阴离子融合脂质体主要由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。另一种脂质体组合物由磷脂酰胆碱(PC)如大豆PC和卵PC形成。另一种类型由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。

将脂质体体外和体内引入细胞中的其他方法的实例包括美国专利号5,283,185；美国专利号5,171,678；WO 94/00569；WO 93/24640；WO 91/16024；Feigner,(1994)J.Biol.Chem.269:2550；Nabel,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90:11307；Nabel,(1992)Human Gene Ther.3:649；Gershon,(1993)Biochem.32:7143；以及Strauss,(1992)EMBOJ.11:417。

还检查了非离子脂质体系统，特别是包含非离子表面活性剂和胆固醇的系统，以确定它们在将药物递送至皮肤中的效用。使用包含NOVASOME^TM I(甘油二月桂酸酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)和NOVASOME^TM II(甘油二硬脂酸酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非离子脂质体制剂将环孢菌素A递送至小鼠皮肤的真皮中。结果指示，这种非离子脂质体系统有效促进环孢菌素A沉积到皮肤的不同层中(Hu等人,(1994)S.T.P.Pharma.Sci.,4(6):466)。

脂质体也可以是空间稳定的脂质体，其包含一种或多种特化脂质，相对于缺乏这类特化脂质的脂质体，所述特化脂质导致循环寿命延长。空间稳定的脂质体的实例是其中脂质体的囊泡形成脂质部分的一部分(A)包含一种或多种糖脂，诸如单唾液酸神经节苷脂G_M1，或(B)用一种或多种亲水聚合物诸如聚乙二醇(PEG)部分衍生。虽然不希望受任何特定理论的束缚，但在本领域中认为，至少对于含有神经节苷脂、鞘磷脂或PEG衍生的脂质的空间稳定的脂质体，这些空间稳定的脂质体的增强的循环半衰期来源于网状内皮系统(RES)的细胞中减少的摄取(Allen等人,(1987)FEBS Letters,223:42；Wu等人,(1993)CancerResearch,53:3765)。

包含一种或多种糖脂的各种脂质体是本领域已知的。Papahadjoulos等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.,(1987),507:64)报道了单唾液酸神经节苷脂G^M1、半乳糖脑苷脂硫酸酯和磷脂酰肌醇改善脂质体的血液半衰期的能力。这些发现由Gabizon等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,(1988),85:6949)阐明。Allen等人的美国专利号4,837,028和WO 88/04924公开了包含(1)鞘磷脂和(2)神经节苷脂G_M1或半乳糖脑苷脂硫酸酯的脂质体。美国专利号5,543,152(Webb等人)公开了包含鞘磷脂的脂质体。包含1,2-sn-二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的脂质体公开在WO 97/13499(Lim等人)中。

在一个实施方案中，使用阳离子脂质体。阳离子脂质体具有能够与细胞膜融合的优点。非阳离子脂质体，尽管不能与质膜有效地融合，但在体内被巨噬细胞摄取，并且可以用于递送寡核苷酸至巨噬细胞。

脂质体的另外优点包括：从天然磷脂获得的脂质体是生物相容的且生物可降解的；脂质体可以结合宽范围的水溶性和脂溶性药物；脂质体可以保护在它们的内部区室中的包封的寡核苷酸免于代谢和降解(Rosoff,在“Pharmaceutical Dosage Forms,”Lieberman,Rieger和Banker(编),1988,第1卷,第245页中)。在脂质体制剂的制备中，重要的考虑是脂质表面电荷、囊泡大小和脂质体的水体积。

带正电荷的合成阳离子脂质N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)可以用于形成小脂质体，其自发地与核酸相互作用以形成脂质-核酸复合物，所述复合物能够与组织培养细胞的细胞膜的带负电荷的脂质融合，导致寡核苷酸的递送(参见，例如，Feigner,P.L.等人,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8:7413-7417和美国专利号4,897,355，关于DOTMA及其与DNA一起的使用的描述)。

DOTMA类似物1,2-双(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)可以与磷脂组合使用，形成DNA-复合囊泡。LIPOFECTIN^TM(Bethesda Research Laboratories,Gaithersburg,Md.)是一种将高度阴离子性核酸递送至活组织培养细胞中的有效剂，所述活组织培养细胞包含带正电荷的DOTMA脂质体，所述脂质体自发地与带负电荷的多核苷酸相互作用形成复合物。当使用足够的带正电荷的脂质体时，所得复合物上的净电荷也是正的。以这种方式制备的带正电荷的复合物自发地连接至带负电荷的细胞表面，与质膜融合，并有效地将功能性核酸递送至例如组织培养细胞中。另一种可商购获得的阳离子脂质1,2-双(油酰氧基)-3,3-(三甲氨)丙烷(“DOTAP”)(Boehringer Mannheim，Indianapolis，Indian)与DOTMA的不同之处在于油酰基部分通过酯而不是醚键联连接。

其他报道的阳离子脂质化合物包括已经与多种部分缀合的那些，所述部分包括例如已经与两种类型的脂质之一缀合的羧基精胺，并且包括化合物，诸如5-羧基精胺基甘氨酸二八油酰基酰胺(“DOGS”)(TRANSFECTAM^TM,Promega,Madison,Wis.)和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺基-酰胺(“DPPES”)(参见，例如，美国专利号5,171,678)。

另一种阳离子脂质缀合物包括用胆固醇(“DC-Chol”)使脂质衍生化，其已被配制成脂质体与DOPE的组合(参见，Gao,X.和Huang,L.,(1991)Biochim.Biophys.Res.Commun.179:280)。已经报道通过将聚赖氨酸缀合到DOPE制备的脂质聚赖氨酸在血清存在下对于转染是有效的(Zhou,X.等人,(1991)Biochim.Biophys.Acta1065:8)。对于某些细胞系，据称这些含有缀合的阳离子脂质的脂质体与含有DOTMA的组合物相比表现出更低的毒性并提供更有效的转染。其他可商购获得的阳离子脂质产品包括DMRIE和DMRIE-HP(Vical,La Jolla,Calif.)和Lipofectamine(DOSPA)(Life Technology,Inc.,Gaithersburg,Md.)。其他适于递送寡核苷酸的阳离子脂质描述在WO 98/39359和WO96/37194中。

脂质体制剂特别适合于局部施用，脂质体呈现出优于其他制剂的若干优势。这类优势包括与施用的药物的高度全身吸收有关的副作用减少、施用的药物在所需靶标处的累积增加以及将寡核苷酸施用到皮肤中的能力。在一些具体实施中，脂质体用于将寡核苷酸递送至表皮细胞，并且还增强寡核苷酸渗透向真皮组织例如皮肤中的渗透。例如，脂质体可以局部施用。已经记载将配制成脂质体的药物局部递送至皮肤(参见，例如，Weiner等人,(1992)Journal of Drug Targeting,第2卷,405-410以及du Plessis等人,(1992)Antiviral Research,18:259-265；Mannino,R.J.和Fould-Fogerite,S.,(1998)Biotechniques 6:682-690；Itani,T.等人,(1987)Gene 56:267-276；Nicolau,C.等人,(1987)Meth.Enzymol.149:157-176；Straubinger,R.M.和Papahadjopoulos,D.(1983)Meth.Enzymol.101:512-527；Wang,C.Y.和Huang,L.,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7851-7855)。

还检查了非离子脂质体系统，特别是包含非离子表面活性剂和胆固醇的系统，以确定它们在将药物递送至皮肤中的效用。使用包含NOVASOME I(甘油二月桂酸酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)和NOVASOME II(甘油二硬脂酸酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非离子脂质体制剂将药物递送至小鼠皮肤的真皮中。这类具有寡核苷酸的制剂可用于治疗皮肤病。

脂质体的靶向也可以基于例如器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性，并且是本领域已知的。在脂质体靶向递送系统的情况下，脂质基团可以掺入脂质体的脂质双层中，以维持靶向配体与脂质体双层的稳定结合。各种连接基团可以用于将脂质链连接至靶向配体。额外的方法是本领域已知的，并且描述于例如美国专利申请公开号20060058255中，其连接基团以引用的方式并入本文中。

包括寡核苷酸的脂质体可以被制成高度可变形的。这种可变形性可以使脂质体能够渗透通过小于脂质体的平均半径的孔。例如，传递体是又一类型的脂质体，并且是高度可变形的脂质聚集体，其是药物递送媒介物的有吸引力的候选物。传递体可以被描述为脂质小滴，其高度可变形以致于它们能够容易地渗透穿过比小滴小的孔。传递体可以通过向标准脂质体组合物中添加通常是表面活性剂的表面边缘活化剂来制备。包括寡核苷酸的传递体可以例如通过感染来皮下递送，以便将寡核苷酸递送至皮肤中的角质形成细胞。为了穿过完整的哺乳动物皮肤，脂质囊泡必须在合适的透皮梯度的影响下通过一系列细孔，每个细孔的直径小于50nm。另外，由于脂质性质，这些传递体可以是自优化的(适应例如皮肤中的孔的形状)、自修复性的并且可以经常到达它们的靶标而不片段化，并且经常是自负载性的。转铁蛋白已经用于将血清白蛋白递送至皮肤。已经显示转铁蛋白介导的血清白蛋白的递送与皮下注射含有血清白蛋白的溶液一样有效。

其他可用于本发明的制剂描述于PCT公开号WO 2009/088891、WO 2009/132131和WO 2008/042973中，其以引用的方式整体并入本文中。

表面活性剂在诸如乳剂(包括微乳剂)和脂质体的制剂中具有广泛的应用。对许多不同类型的天然和合成表面活性剂的性质进行分类和分级的最常见方式是通过使用亲水/亲油平衡(HLB)。亲水基团(也称为“头部”)的性质提供了对制剂中所用的不同表面活性剂进行分类的最有用的手段(Rieger,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,第285页)。

如果表面活性剂分子未被离子化，则其被分类为非离子表面活性剂。非离子表面活性剂在药物和化妆品中具有广泛的应用，并且可在宽的pH值范围内使用。通常，它们的HLB值范围为2至约18，这取决于它们的结构。非离子表面活性剂包括非离子酯，诸如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脱水山梨糖醇酯、蔗糖酯和乙氧基化酯。非离子烷醇酰胺和醚，诸如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物，也包括在这种类别中。聚氧乙烯表面活性剂是非离子表面活性剂类别中最流行的成员。

如果表面活性剂分子在溶解或分散于水中时带有负电荷，则表面活性剂被分类为阴离子型。阴离子表面活性剂包括羧酸盐如皂、酰基乳酸盐、氨基酸的酰基酰胺、硫酸酯如烷基硫酸盐和乙氧基化烷基硫酸盐、磺酸盐如烷基苯磺酸盐、酰基羟乙基磺酸盐、酰基牛磺酸盐和磺基琥珀酸盐，以及磷酸盐。阴离子表面活性剂类别中最重要的成员是烷基硫酸盐和皂。

如果表面活性剂分子在溶解或分散于水中时带有正电荷，则表面活性剂被分类为阳离子型。阳离子表面活性剂包括季铵盐和乙氧基化胺。季铵盐是这类中最常用的成员。

如果表面活性剂分子具有携带正电荷或负电荷的能力，则表面活性剂被分类为两性的。两性表面活性剂包括丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱和磷脂。

表面活性剂在药品、制剂和乳剂中的应用已有综述(Rieger,PharmaceuticalDosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,第285页)。

用于本发明方法的寡核苷酸也可以以胶束制剂的形式提供。胶束为特定类型的分子组装体，其中两亲性分子以球形结构布置，使得分子的所有疏水部分向内，留下亲水部分与周围水相接触。如果环境是疏水的，则存在相反的布置。

基于脂质纳米颗粒的递送方法

本发明的寡核苷酸可以完全包封在脂质制剂例如脂质纳米颗粒(LNP)或其他核酸-脂质颗粒中。LNP对于全身应用是非常有用的，因为它们在静脉内(i.v.)注射后表现出延长的循环寿命，并且在远端部位(例如，与施用部位物理上分开的部位)累积。LNP包括“pSPLP”，其包括如PCT公开号WO 00/03683中所述的包封的缩合剂-核酸复合物。本发明的颗粒的平均直径通常是约50nm至约150nm，更通常约60nm至约130nm，更通常约70nm至约110nm，最通常约70nm至约90nm，并且基本上是无毒的。另外，当存在于本发明的核酸-脂质颗粒中时，核酸在水溶液中抗核酸酶降解。核酸-脂质颗粒及其制备方法公开于例如美国专利号5,976,567、5,981,501、6,534,484、6,586,410、6,815,432、美国公开号2010/0324120和PCT公开号WO96/40964中。

在一个实施方案中，脂质与药物的比率(质量/质量比)(例如，脂质与寡核苷酸的比率)将在约1:1至约50:1、约1:1至约25:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1或约6:1至约9:1的范围内。还预期在上述范围的中间范围是本发明的一部分。

阳离子脂质的非限制性实例包括N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N--(I-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N--(I-(2,3-二油烯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油烯氧基)丙胺(DODMA)、1,2-二亚油烯氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻烯氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二亚油烯基氨基甲酰氧基-3-二甲氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油烯氧基-3-(二甲氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油烯氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油烯基硫基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油烯氧基-3-二甲氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油烯氧基-3-三甲氨基丙烷氯化盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油烯氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)或3-(N,N-二亚油烯基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油烯基氧代-3-(2-N),N-二甲氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1,2-二亚麻烯氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLinDMA)、2,2-二亚油烯基-4-二甲氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基四氢--3aH-环戊[d][1,3]二氧戊环-5-胺(ALN100)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲氨基)丁酸酯(MC3)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基乙基氮烷二基二-十二烷-2-醇(Tech G1)或其混合物。阳离子脂质可以占颗粒中存在的总脂质的例如约20摩尔％至约50摩尔％或约40摩尔％。

可电离的/非阳离子脂质可以是阴离子脂质或中性脂质，包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰磷脂酰乙醇胺(SOPE)、胆固醇或其混合物。如果包括胆固醇的话，非阳离子脂质可以是例如颗粒中存在的总脂质的约5摩尔％至约90摩尔％、约10摩尔％或约60摩尔％。

抑制颗粒聚集的缀合脂质可以是例如聚乙二醇(PEG)-脂质，包括但不限于PEG-二酰基甘油(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)或其混合物。PEG-DAA缀合物可以是例如PEG-二月桂基氧基丙基(C₁₂)、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(C₁₄)、PEG-二棕榈基氧基丙基(C₁₆)或PEG-二硬脂基氧基丙基(C₁₈)。防止颗粒聚集的缀合脂质可以是例如颗粒中存在的总脂质的0摩尔％至约20摩尔％或约2摩尔％。

在一些实施方案中，核酸-脂质颗粒还包含颗粒中存在的总脂质的例如约10摩尔％至约60摩尔％或约50摩尔％的胆固醇。

组合疗法

本发明的方法可以单独使用或与额外治疗剂例如治疗KCNT1相关病症或与其相关症状的其他剂组合，或与其他类型的治疗KCNT1相关病症的治疗剂组合使用。在组合治疗中，一种或多种治疗化合物的剂量可以比单独施用时的标准剂量降低。例如，剂量可以根据经验由药物组合和排列来确定，或者可以通过等效分析推断(例如，Black等人,Neurology65:S3-S6(2005))。在这种情况下，当组合时，化合物的剂量应当提供治疗效果。

在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸剂可以与治疗KCNT1相关病症的额外治疗剂组合使用。在一些实施方案中，额外治疗剂可以是与KCNT1相关病症相关的基因的mRNA杂交的寡核苷酸(例如，ASO)。

在一些实施方案中，第二治疗剂是化疗剂(例如，细胞毒性剂或其他可用于治疗KCNT1相关病症的化合物)。

第二剂可以是作为非药物治疗的治疗剂。例如，第二治疗剂是物理疗法。

在本文所述的任何组合实施方案中，第一治疗剂和第二治疗剂可以同时或以任一顺序依次施用。第一治疗剂可以在第二治疗剂之前或之后立即、至多1小时、至多2小时、至多3小时、至多4小时、至多5小时、至多6小时、至多7小时、至多8小时、至多9小时、至多10小时、至多11小时、至多12小时、至多13小时、14小时、至多16小时、至多17小时、至多18小时、至多19小时、至多20小时、至多21小时、至多22小时、至多23小时、至多24小时或至多1-7天、1-14天、1-21天或1-30天施用。

药物组合物

在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸被配制成药物组合物，以适于体内施用的生物相容形式施用到人受试者。

本文所述的化合物可以以游离碱的形式，以盐、溶剂化物的形式，以及作为前药使用。所有形式均在本文所述的方法内。根据本发明的方法，如本领域技术人员所理解的，所述化合物或其盐、溶剂化物或前药可以根据选定的施用途径以多种形式施用到受试者。本文所述的化合物可以例如通过口服、胃肠外、鞘内、脑室内、脑实质内、经颊、舌下、鼻、直肠、贴剂、泵或透皮施用来施用，并且药物组合物相应地配制。胃肠外施用包括静脉内、腹膜内、皮下、肌内、经上皮、经鼻、肺内、鞘内、脑室内、脑实质内、直肠和局部施用模式。胃肠外施用可以是在选定的时间内连续输注。

本文所述的化合物可以例如与惰性稀释剂或与可同化的食用载剂一起口服施用，或者可以将其包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者可以将其压制成片剂，或者可以将其直接与饮食的食物合并。对于口服治疗性施用，本文所述的化合物可以与赋形剂合并，并且以可摄取片剂、经颊片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆剂和糯米纸囊剂的形式使用。本文所述的化合物还可以胃肠外施用。本文所述的化合物的溶液可以在适当地混合有诸如羟丙基纤维素的表面活性剂的水中制备。分散体还可以在甘油、液体聚乙二醇、DMSO及其混合物中在有或没有醇的情况下以及在油中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制剂可以含有防腐剂以防止微生物的生长。选择和制备合适制剂的常规程序和成分描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences(2012,第22版)和2018年出版的The UnitedStates Pharmacopeia:The National Formulary(USP 41NF 36)中。适于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉剂。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，并且必须是以可以容易地经由注射器施用的程度流动的流体。用于经鼻施用的组合物可以方便地配制成气溶胶、滴剂、凝胶剂和粉剂。气溶胶制剂通常包括活性物质在生理学上可接受的水性或非水性溶剂中的溶液或细混悬液，并且通常以无菌形式在密封容器中以单剂量或多剂量提供，所述密封容器可以采用药筒的形式或者重新填充以与雾化装置一起使用。另选地，密封容器可以是一体式分配装置，诸如单剂量鼻吸入器或装配有计量阀的气溶胶分配器，其意欲在使用后处理掉。当剂型包括气溶胶分配器时，其将含有推进剂，所述推进剂可以是压缩气体(诸如压缩空气)或有机推进剂(诸如氟氯烃)。气溶胶剂型也可以采用泵式雾化器的形式。适于经颊或舌下施用的组合物包括片剂、糖锭剂和软锭剂，其中活性成分与诸如糖、阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶和甘油的载剂一起配制。用于直肠施用的组合物常规上是以含有诸如可可脂的常规栓剂基质的栓剂形式。

本文所述的化合物可以单独或与如本文提到的药学上可接受的载剂组合施用到动物，例如，人，其比例由化合物的溶解度和化学性质、选定的施用途径和标准药学实践确定。

剂量

本文所述的组合物(例如，包括寡核苷酸的组合物)的剂量可以根据许多因素而变化，所述因素诸如化合物的药效学性质；施用模式；接受者的年龄、健康和体重；症状的性质和程度；治疗的频率，以及并行治疗(如果有的话)的类型；以及化合物在待治疗动物中的清除率。本文所述的组合物可以最初以合适的剂量施用，所述剂量可以根据临床反应根据需要调整。在一些实施方案中，组合物(例如，包括寡核苷酸的组合物)的剂量是预防或治疗有效量。

药盒

本发明的特征还在于药盒，其包括(a)包含本文所述的降低细胞或受试者中KCNT1的水平和/或活性的寡核苷酸剂的药物组合物，和(b)具有进行本文所述的任何方法的说明书的包装插页。在一些实施方案中，所述药盒包括(a)包含本文所述的降低细胞或受试者中KCNT1的水平和/或活性的寡核苷酸剂的药物组合物，(b)额外的治疗剂，和(c)具有进行本文所述的任何方法的说明书的包装插页。

选择ASO的方法

适用于ASO治疗的寡核苷酸可以使用生物信息学方法选择。寡核苷酸的长度可以是18-22个核苷酸。寡核苷酸的GC含量可以是约40％至约70％(例如，45％、50％、55％、60％、65％或70％)。寡核苷酸可以包括3个或更少(例如，2、1或0个)与人KCNT1的错配。在一些实施方案中，寡核苷酸可以包括与小鼠KCNT1的等长靶标至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，寡核苷酸可以包括与小鼠KCNT1的等长靶标具有100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸可以包括与食蟹猕猴KCNT1的等长靶标至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，寡核苷酸可以包括与食蟹猕猴KCNT1的等长靶标具有100％序列同一性的序列。寡核苷酸可以包括与小鼠KCNT1和食蟹猕猴KCNT1的等长靶标具有85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，寡核苷酸可以包括与小鼠KCNT1和食蟹猕猴KCNT1的等长靶标具有100％序列同一性的序列。寡核苷酸可以包括至少3个(例如，4、5、6、7、8、9、10个或更多个)与非KCNT1转录物的错配。寡核苷酸可以不形成二聚体。寡核苷酸可以不形成发夹。寡核苷酸可以缺少polyG运行，诸如GGGG。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含SED ID NO:3526的1-4770位中任一个的10个核碱基范围内的核碱基的等长部分至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的至少10个连续核碱基。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SED ID NO:3526的1-4770位中任一个的核碱基范围内的核碱基的等长度部分至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的至少11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:3526的374、661、655-680、765、837、1347、1340-1370、1629、1760、1752、1795、1775、1740-1815、2879、3008、3168或3110-3171位中任一个的10个核碱基范围内的核碱基的等长部分至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的至少10个连续核碱基。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:3526的374、661、655-680、765、837、1347、1340-1370、1629、1760、1752、1795、1775、1740-1815、2879、3008、3168或3110-3171位中任一个的核碱基的等长部分至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的至少11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:3526的655-680、1340-137、1740-1815或3110-3175位中任一个内的核碱基的等长部分至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的至少10个连续核碱基。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:3526的655-680、1340-137、1740-1815或3110-3175位中任一个内的核碱基的等长部分至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的至少11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:3526的655-665、660-670、665-675、670-680、1340-1350、1345-1355、1350-1360、1355-1365、1360-1370、1740-1750、1745-1755、1750-1760、1755-1765、1760-1770、1765-1775、1770-1780、1775-1785、1780-1790、1785-1795、1790-1800、1795-1805、1800-1810、1805-1815、3110-3120、3115-3125、3120-3130、3125-3135、3130-3140、3135-3145、3140-3150、3145-3155、3150-3160、3155-3165、3160-3170、3165-3175或3170-3180位中任一个内的核碱基的等长部分互补的至少10个连续核碱基。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:3526的655-665、660-670、665-675、670-680、1340-1350、1345-1355、1350-1360、1355-1365、1360-1370、1740-1750、1745-1755、1750-1760、1755-1765、1760-1770、1765-1775、1770-1780、1775-1785、1780-1790、1785-1795、1790-1800、1795-1805、1800-1810、1805-1815、3110-3120、3115-3125、3120-3130、3125-3135、3130-3140、3135-3145、3140-3150、3145-3155、3150-3160、3155-3165、3160-3170、3165-3175或3170-3180位中任一个内的核碱基的等长部分互补的至少11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基。

SEQ ID NO:3526的位置是指KCNT1转录物的核苷酸位置。例如，KCNT1转录物(SEQID NO:3526)的1261位的核苷酸是腺嘌呤。本文所述的任何反义寡核苷酸可以结合KCNT1转录物或KCNT1转录物变体的任何位置的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续核碱基。寡核苷酸可以包含与KCNT1转录物或KCNT1转录物变体的任何位置的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个核碱基范围内的核碱基的等长部分至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的至少10个连续核碱基。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少10个连续核碱基、至少11个连续核碱基、至少12个连续核碱基、至少13个连续核碱基、至少14个连续核碱基、至少15个连续核碱基、至少16个连续核碱基、至少17个连续核碱基、至少18个连续核碱基、至少19个连续核碱基或至少20个连续核碱基，它们与KCNT1转录物或KCNT1转录物变体的任何位置的10个核碱基范围内的核碱基的等长部分至少90％互补。例如，与KCNT1转录物或转录物变体的220-230位的10个核碱基至少90％互补的20个核碱基的寡核苷酸在KCNT1转录物或KCNT1转录物变体的211-239位的10个核碱基的范围内。在一些实施方案中，寡核苷酸结合与KCNT1转录物或KCNT1转录物变体核碱基位置重叠。例如，与KCNT1转录物或KCNT1转录物变体的500位互补的20个核碱基的寡核苷酸可以与KCNT1转录物或KCNT1转录物变体核苷酸位置的核碱基481-500、483-503、490-510、497-517或500-519或其中的任何范围杂交。

ASO的评估

本公开的反义寡核苷酸的活性可以使用本领域已知的各种技术来评估和证实。例如，可以在体外测定中评估反义寡核苷酸抑制KCNT1表达和/或全细胞电流的能力，以证实反义寡核苷酸适用于治疗与KCNT1的功能获得性突变和/或过度神经元兴奋性相关的疾病或病况。小鼠模型不仅可以用于评估反义寡核苷酸抑制KCNT1表达或全细胞电流的能力，而且可以用于改善与KCNT1的功能获得性突变和/或过度神经元兴奋性相关的症状。

在一个实施例中，用KCNT1转染并表达此基因的诸如哺乳动物细胞(例如CHO细胞)的细胞也用本公开的反义寡核苷酸转染。通常，KCNT1含有功能获得性突变。在另一个实施例中，使用天然表达天然野生型KCNT1的人神经元细胞系(例如SH-SY5Y)。任选地，编辑这种细胞的基因组以含有功能获得性突变，使得所得KCNT1是致病变体。KCNT1 mRNA的水平可以使用如本领域已知的qRT-PCR或RNA印迹来评估。KCNT1的蛋白质的表达水平可以通过如Rizzo等人(Mol Cell Neurosci.72:54-63,2016)中所述的对总细胞裂解物或级分的蛋白质印迹法来评估。KCNT1编码的通道的残余功能也可以使用电生理学或离子流测定来评估。

在一个特定的实施例中，本公开的反义寡核苷酸的活性使用干细胞建模来评估和证实(对于综述，参见例如Tidball和Parent Stem Cells34:27-33,2016；Parent和Anderson Nature Neuroscience 18:360-366,2015)。例如，人诱导的多能干细胞(iPSC)可以由体细胞(例如，真皮成纤维细胞或血液源性造血细胞)产生，所述体细胞来源于具有KCNT1功能获得性突变并呈现相关疾病或病况(例如，EIMFS、ADNFLE或韦斯特综合征)的患者。任选地，基因组编辑可以用于将功能获得性突变回复为野生型以产生等基因对照细胞系(Gaj等人,Trends Biotechnol 31,397-405,2013)，这也可以用于确定所需的野生型活性水平，随后评估和比较寡核苷酸。另选地，可以使用基因组编辑将功能获得性突变引入野生型对照iPSC(例如，参考iPSC系)的KCNT1基因中。含有功能获得性突变和任选地同基因对照的iPSC然后可以使用已知技术(参见例如Kim等人,Front Cell Neurosci 8:109,2014；Zhang等人,2013,Chambers等人,Nat Biotechnol 27,275-280,2009)分化成神经元，包括兴奋性神经元。然后，在将iPSC暴露于本发明的反义寡核苷酸之后，可以评估本发明的反义寡核苷酸对KCNT1表达(如通过KCNT1 mRNA或蛋白水平所评估)和/或活性(如通过离子流测定和/或电生理学，例如使用全细胞膜片钳技术、单电极电压钳技术或双电极电压钳(TEVC)技术所评估)的影响。

将当表达KCNT1的细胞暴露于本公开的反义寡核苷酸时观察到的KCNT1表达(mRNA或蛋白质)或全细胞电流的水平与当表达KCNT1的细胞暴露于阴性对照反义寡核苷酸时观察到的相应水平进行比较，以确定由本公开的反义寡核苷酸导致的抑制水平。通常，KCNT1的表达水平或全细胞电流水平降低至少或约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多。因此，本公开的反义寡核苷酸可以用于治疗与KCNT1的功能获得性突变相关的疾病或病况。

也可以使用小鼠模型评估和证实本公开的反义寡核苷酸的活性。例如，敲入或转基因小鼠模型可以使用含有功能获得性突变的KCNT1基因以与针对SCN1A和SCN2A敲入和转基因小鼠模型所述相似的方式产生(参见例如Kearney等人,Neuroscience 102,307–317,2001；Ogiwara等人,J Neurosci 27:5903-5914,2007；Yu等人,Nat Neurosci 9:1142-1149,2006)。在特定的实施例中，使用与特定反义寡核苷酸(例如，等位基因特异性寡核苷酸)匹配的KCNT1基因以产生敲入或转基因小鼠。功能获得性KCNT1敲入或转基因小鼠可以呈现与EIMFS、ADNFLE和/或韦斯特综合征相似的表型，包括例如神经元活动增加、自发性发作和脑电图(EEG)异质性局灶性发作活动。在其他实施例中，SCN1A和SCN2A敲入和转基因小鼠模型可以用于表现出过度神经元兴奋性的模型。然后可以评估本发明的反义寡核苷酸抑制这些小鼠中KCNT1的表达和改善小鼠中与功能获得性KCNT1突变和/或过度神经元兴奋性相关的任何症状的能力。

例如，KCNT1 mRNA和/或蛋白质的水平可以在向小鼠施用本公开的反义寡核苷酸或阴性对照反义寡核苷酸后评估。在一个特定的实施例中，评估脑中且特别是神经元中的KCNT1 mRNA和/或蛋白水平。将施用本公开的反义寡核苷酸之后KCNT1表达的水平与施用阴性对照反义寡核苷酸时观察到的相应水平进行比较，以确定由本公开的反义寡核苷酸产生的抑制水平。通常，小鼠中(例如，小鼠的脑中)KCNT1的表达水平降低至少或约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多。

在另一个实施例中，评估施用本公开的反义寡核苷酸的功能效果。例如，发作的次数、严重性和/或类型可以视觉和/或通过EEG评估。还可以诸如通过从施用本公开的反义寡核苷酸或阴性对照反义寡核苷酸的小鼠切除脑切片并评估全细胞电流(例如，使用全细胞膜片钳技术)评估神经元兴奋性。可以使用从小鼠分离然后培养的神经元进行相似的神经元兴奋性分析。额外地，可以评估包括步态特征的小鼠行为，以确定施用本公开的反义寡核苷酸的功能效果。

额外的实施方案

本文公开了一种长度为18-22个连接的核苷的单链寡核苷酸，其包含40％至70％的GC含量且与智人KCNT1和小家鼠KCNT1的等长部分具有至少85％的序列同一性。

本文另外公开了一种长度为18-22个连接的核苷的单链寡核苷酸，其包含40％至70％的GC含量且与智人KCNT1和食蟹猕猴KCNT1的等长部分具有至少85％的序列同一性。

本文另外公开了一种长度为18-22个连接的核苷的单链寡核苷酸，其包含40％至70％的GC含量且与智人KCNT1、小家鼠KCNT1和食蟹猕猴KCNT1的等长部分具有至少85％的序列同一性。

在一个方面，寡核苷酸包含不多于2个与智人KCNT1的错配。在一个方面，寡核苷酸包含至少3个与任何非KCNT1转录物的错配。在一个方面，寡核苷酸缺乏GGGG四联体。

本文另外公开了一种长度为18-22个连接的核苷的单链寡核苷酸，其包含SEQ IDNO:1-3409中任一个的至少18个连续核苷酸的区域。在一个方面，至少10个核碱基的区域与SEQ ID NO:1-3409中任一个的等长部分至少90％互补。在一个方面，至少10个核碱基的区域与SEQ ID NO:1-3409中任一个的等长部分至少95％互补。在一个方面，寡核苷酸包含SEQID NO:1-3409中任一个的核碱基序列。在一个方面，寡核苷酸的核碱基序列由SEQ ID NO:1-3409中任一个组成。

在一个方面，寡核苷酸包含：(a)缺口区段，其包含连接的脱氧核糖核苷；(b)5'侧翼区段，其包含连接的核苷；和(c)3'侧翼区段，其包含连接的核苷；其中所述缺口区段包含定位在所述5'侧翼区段与所述3'侧翼区段之间的与SEQ ID NO:1-3409中任一个的等长部分具有至少80％互补性的至少10个连续核碱基的区域；其中所述5'侧翼区段和所述3'侧翼区段各自包含至少两个连接的核苷；并且其中每个侧翼区段的至少一个核苷包含替代的核苷。

在一个方面，寡核苷酸包含至少一个替代的核苷间键联。在一个方面，所述至少一个替代的核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。在一个方面，所述至少一个替代的核苷间键联是2'-烷氧基核苷间键联。在一个方面，所述至少一个替代的核苷间键联是烷基磷酸酯核苷间键联。在一个方面，寡核苷酸包含至少一个替代的核碱基。在一个方面，替代的核碱基是5'-甲基胞嘧啶、假尿苷或5-甲氧基尿苷。在一个方面，寡核苷酸包含至少一个替代的糖部分。在一个方面，替代的糖部分是2'-OMe或双环核酸。在一个方面，寡核苷酸还包含通过单价或分支的二价或三价接头缀合至寡核苷酸的5'端或3'端的配体。

在一个方面，寡核苷酸包含与KCNT1基因的至少17个连续核苷酸互补的区域。在一个方面，寡核苷酸包含与KCNT1基因的至少19个连续核苷酸互补的区域。在一个方面，寡核苷酸包含SEQ ID NO:1-17和19-50中任一个的至少18个连续核碱基的区域。在一个方面，寡核苷酸包含SEQ ID NO:18的至少18个连续核碱基的区域。在一个方面，寡核苷酸包含SEQID NO:51-81、83-86和88-96中任一个的至少18个连续核碱基的区域。在一个方面，寡核苷酸包含SEQ ID NO:82和87中任一个的至少18个连续核碱基的区域。在一个方面，寡核苷酸包含SEQ ID NO:97-116中任一个的至少18个连续核碱基的区域。

本文另外公开了一种药物组合物，其包含寡核苷酸和药学上可接受的载剂或赋形剂。本文另外公开了一种组合物，其包含如权利要求1-28中任一项所述的寡核苷酸和脂质纳米颗粒、多聚复合物纳米颗粒、脂质复合物纳米颗粒或脂质体。本文另外公开了一种治疗、预防有需要的受试者的KCNT1相关病症或延迟其进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用寡核苷酸、药物组合物或组合物，其量和持续时间足以治疗、预防所述KCNT1相关病症或延迟其进展。

本文另外公开了一种治疗、预防受试者的KCNT1相关病症或延迟其进展的方法，其包括：(a)选择长度为18-22个连接的核苷的单链寡核苷酸，其包含40％至70％的GC含量，其中所述寡核苷酸：(i)与智人KCNT1和小家鼠KCNT1的等长部分具有至少85％序列同一性；(ii)与智人KCNT1和食蟹猕猴KCNT1的等长部分具有至少85％序列同一性；或(iii)与智人KCNT1、小家鼠KCNT1和食蟹猕猴KCNT1的等长部分具有至少85％序列同一性；和(b)向所述受试者施用寡核苷酸，其量和持续时间足以治疗、预防所述KCNT1相关病症或延迟其进展。

在一个方面，寡核苷酸包含不多于2个与智人KCNT1的错配。在一个方面，寡核苷酸包含至少3个与任何非KCNT1转录物的错配。在一个方面，寡核苷酸缺乏GGGG四联体。

本文另外公开了一种抑制细胞中KCNT1的转录的方法，所述方法包括使细胞与寡核苷酸、药物组合物或组合物接触，其量和持续时间足以获得KCNT1基因的mRNA转录物的降解，其中寡核苷酸抑制细胞中KCNT1基因的表达。

本文另外公开了一种降低患有KCNT1相关病症的受试者的细胞中KCNT1的水平和/或活性的方法，所述方法包括使所述细胞与寡核苷酸、药物组合物或组合物接触，其量和持续时间足以降低所述细胞中KCNT1的水平和/或活性。在一个方面，受试者是人。在一个方面，细胞是中枢神经系统的细胞。在一个方面，KCNT1相关病症选自由以下组成的组：婴儿癫痫伴游走性局灶性发作、常染色体显性遗传夜间额叶癫痫、韦斯特综合征、婴儿痉挛、癫痫性脑病、局灶性癫痫、大田原综合征、发育性癫痫性脑病和伦诺克斯-加斯托综合征。在一个方面，受试者具有KCNT1的功能获得性突变。在一个方面，功能获得性突变选自由以下组成的组：V271F、L274I、G288S、F346L、R398Q、R428Q、R474H、F502V、M516V、K629N、I760M、Y796H、E893K、M896I、M896K、P924L、R928C、F932I、A934T、A966T、H257D、R262Q、Q270E、V340M、C377S、P409S、L437F、R474C、A477T、R565H、K629E、G652V、I760F、Q906H、R933G、R950Q、R961H、R1106Q、K1154Q、R474Q、Y1903C、H469L、M896R、K946E和R950L。在一个方面，所述方法减轻KCNT1相关病症的一种或多种症状。在一个方面，KCNT1相关病症的一种或多种症状选自由以下组成的组：发作延长、发作频繁、行为和发育延迟、运动和平衡问题、矫形状况、语言和说话延迟问题、生长和营养问题、睡眠困难、慢性感染、感觉统合失调、自主神经系统破坏和出汗。

本文另外公开了一种长度为18-22个连接的核苷的单链寡核苷酸，其包含40％至70％的GC含量且与智人KCNT1和小家鼠KCNT1的等长部分具有至少85％的序列同一性。本文另外公开了一种长度为18-22个连接的核苷的单链寡核苷酸，其包含40％至70％的GC含量且与智人KCNT1和食蟹猕猴KCNT1的等长部分具有至少85％的序列同一性。本文另外公开了一种长度为18-22个连接的核苷的单链寡核苷酸，其包含40％至70％的GC含量且与智人KCNT1、小家鼠KCNT1和食蟹猕猴KCNT1的等长部分具有至少85％的序列同一性。

本文另外公开了一种长度为18-22个连接的核苷的单链寡核苷酸，其包含40％至70％的GC含量且与智人KCNT1和小家鼠KCNT1的等长部分具有至少85％的序列同一性。本文另外公开了一种长度为18-22个连接的核苷的单链寡核苷酸，其包含40％至70％的GC含量且与智人KCNT1和食蟹猕猴KCNT1的等长部分具有至少85％的序列同一性。本文另外公开了一种长度为18-22个连接的核苷的单链寡核苷酸，其包含40％至70％的GC含量且与智人KCNT1、小家鼠KCNT1和食蟹猕猴KCNT1的等长部分具有至少85％的序列同一性。

在一个方面，本发明的特征在于一种长度为18-22个连接的核苷的单链寡核苷酸，其包括40％至70％的GC含量且与智人KCNT1和小家鼠KCNT1的等长部分具有至少85％的序列同一性。

在另一个方面，本发明的特征在于一种长度为18-22个连接的核苷的单链寡核苷酸，其包括40％至70％的GC含量且与智人KCNT1和小家鼠KCNT1的等长部分具有至少85％的序列同一性。

在另一个方面，本发明的特征在于一种长度为18-22个连接的核苷的单链寡核苷酸，其包括40％至70％的GC含量且与智人KCNT1、小家鼠KCNT1和食蟹猕猴KCNT1的等长部分具有至少85％的序列同一性。

在一些实施方案中，寡核苷酸包括不多于2个与智人KCNT1转录物的错配。

在一些实施方案中，寡核苷酸包括至少3个与任何非KCNT1转录物的错配。

在一些实施方案中，寡核苷酸缺乏GGGG四联体。

在另一个方面，本发明的特征在于一种长度为18-22个连接的核苷的单链寡核苷酸，其包括SEQ ID NO:1-3409(例如，SEQ ID NO:1-116或1-3384)中任一个的至少18个连续核碱基的区域。

在一些实施方案中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:1-3409(例如，SEQ ID NO:1-116或1-3384)中任一个的至少18个连续核碱基具有至少85％、90％或95％序列同一性的区域。

在一些实施方案中，寡核苷酸包括：缺口区段，其包括连接的脱氧核糖核苷；5'侧翼区段，其包括连接的核苷；和3'侧翼区段，其包括连接的核苷。所述缺口区段可以包括定位在5'侧翼区段与3'侧翼区段之间的与SEQ ID NO:1-3409(例如，SEQ ID NO:1-116或1-3384)中任一个的等长部分具有至少80％互补性的至少10个连续核碱基的区域。5'侧翼区段和3'侧翼区段可以各自包括至少两个连接的核苷，并且每个侧翼区段的至少一个核苷可以包括替代的核苷。

在一些实施方案中，至少10个核碱基的区域与SEQ ID NO:1-3409(例如，SEQ IDNO:1-116或1-3384)中任一个的等长部分具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)互补性。

在一些实施方案中，寡核苷酸包括SEQ ID NO:1-3409(例如，SEQ ID NO:1-116或1-3384)中任一个的核碱基序列。

在一些实施方案中，寡核苷酸的核碱基序列由SEQ ID NO:1-3409(例如，SEQ IDNO:1-116或1-3384)中任一个组成。

在一些实施方案中，寡核苷酸包括至少一个替代的核苷间键联。

在一些实施方案中，所述至少一个替代的核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。

在一些实施方案中，所述至少一个替代的核苷间键联是2'-烷氧基核苷间键联。

在一些实施方案中，所述至少一个替代的核苷间键联是烷基磷酸酯核苷间键联。

在一些实施方案中，寡核苷酸包括至少一个替代的核碱基。

在一些实施方案中，替代的核碱基是5'-甲基胞嘧啶、假尿苷或5-甲氧基尿苷。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个替代的糖部分。

在一些实施方案中，所述替代的糖部分是2'-OMe或双环核酸。

在一些实施方案中，寡核苷酸还包括通过单价或分支的二价或三价接头缀合至寡核苷酸的5'端或3'端的配体。

在一些实施方案中，寡核苷酸包括与KCNT1基因的至少17个连续核苷酸互补的区域。

在一些实施方案中，寡核苷酸包括与KCNT1基因的至少19个连续核苷酸互补的区域。

在一些实施方案中，寡核苷酸包括SEQ ID NO:1-116中任一个的至少18个连续核碱基的区域。

在一些实施方案中，寡核苷酸包括SEQ ID NO:1-17和19-50中任一个的至少18个连续核碱基的区域。

在一些实施方案中，寡核苷酸包括SEQ ID NO:18的至少18个连续核碱基的区域。

在一些实施方案中，寡核苷酸包括SEQ ID NO:51-81、83-86和88-96中任一个的至少18个连续核碱基的区域。

在一些实施方案中，寡核苷酸包括SEQ ID NO:82和87中任一个的至少18个连续核碱基的区域。

在一些实施方案中，寡核苷酸包括SEQ ID NO:97-116中任一个的至少18个连续核碱基的区域。

在另一个方面，本发明的特征在于一种药物组合物，其包含上述实施方案中任一项的寡核苷酸和药学上可接受的载剂或赋形剂。

在另一个方面，本发明的特征在于一种组合物，其包含上述方面中任一个的寡核苷酸和脂质纳米颗粒、多聚复合物纳米颗粒、脂质复合物纳米颗粒或脂质体。

在另一个方面，本发明的特征在于治疗、预防有需要的受试者的KCNT1相关病症或延迟其进展的方法，所述方法通过向所述受试者施用上述方面中任一个的寡核苷酸、药物组合物或组合物实现，其量和持续时间足以治疗、预防所述KCNT1相关病症或延迟其进展。

在另一个方面，本发明的特征在于通过以下来治疗、预防受试者的KCNT1相关病症或延迟其进展的方法：

(a)选择长度为18-22个连接的核苷的单链寡核苷酸，所述单链寡核苷酸包括40％至70％的GC含量，其中所述寡核苷酸：

(i)与智人KCNT1和小家鼠KCNT1的等长部分具有至少85％的序列同一性；

(ii)与智人KCNT1和食蟹猕猴KCNT1的等长部分具有至少85％的序列一致性；或

(iii)与智人KCNT1、小家鼠KCNT1和食蟹猕猴KCNT1的等长部分具有至少85％的序列同一性；以及

(b)向所述受试者施用所述寡核苷酸，其量和持续时间足以治疗、预防所述KCNT1相关病症或延迟其进展。

在一些实施方案中，寡核苷酸包括不多于2个与智人KCNT1的错配。

在一些实施方案中，寡核苷酸包括至少3个与任何非KCNT1转录物的错配。

在一些实施方案中，寡核苷酸缺乏GGGG四联体。

在另一个方面，本发明的特征在于一种抑制细胞中KCNT1的转录的方法，其通过使所述细胞与上述方面中任一个的寡核苷酸、药物组合物或组合物接触实现，其量和持续时间足以实现KCNT1基因的mRNA转录物的降解，其中所述寡核苷酸抑制所述细胞中KCNT1基因的表达。

在另一个方面，本文的特征在于一种降低患有KCNT1相关病症的受试者的细胞中KCNT1的水平和/或活性的方法，所述方法通过使所述细胞与上述方面中任一个的寡核苷酸、药物组合物或组合物接触来实现，其量和持续时间足以降低所述细胞中KCNT1的水平和/或活性。

在一些实施方案中，受试者是人。

在一些实施方案中，细胞是中枢神经系统的细胞。

在一些实施方案中，KCNT1相关病症选自由以下组成的组：婴儿癫痫伴游走性局灶性发作、常染色体显性遗传夜间额叶癫痫、韦斯特综合征、婴儿痉挛、癫痫性脑病、局灶性癫痫、大田原综合征、发育性癫痫性脑病和伦诺克斯-加斯托综合征。

在一些实施方案中，受试者具有KCNT1的功能获得性突变。

在一些实施方案中，功能获得性突变选自由以下组成的组：V271F、L274I、G288S、F346L、R398Q、R428Q、R474H、F502V、M516V、K629N、I760M、Y796H、E893K、M896I、M896K、P924L、R928C、F932I、A934T、A966T、H257D、R262Q、Q270E、V340M、C377S、P409S、L437F、R474C、A477T、R565H、K629E、G652V、I760F、Q906H、R933G、R950Q、R961H、R1106Q、K1154Q、R474Q、Y1903C、H469L、M896R、K946E和R950L。

在一些实施方案中，所述方法减轻KCNT1相关病症的一种或多种症状。

在一些实施方案中，KCNT1相关病症的一种或多种症状选自由以下组成的组：发作延长、发作频繁、行为和发育延迟、运动和平衡问题、矫形状况、语言和说话延迟问题、生长和营养问题、睡眠困难、慢性感染、感觉统合失调、自主神经系统破坏和出汗。

实施例

实施例1.反义寡核苷酸的设计、选择和测试

进行生物信息学分析以鉴定人、小鼠和猴KCNT1基因的具有20碱基对区域的区域，所述碱基对区域具有成对同源性。例如，鉴定了在人KCNT1与猴KCNT1，人KCNT1与小鼠KCNT1，或人KCNT1、猴KCNT1与小鼠KCNT1之间具有至少17bp重叠的20bp区域。还鉴定了仅结合人KCNT1的靶序列。ASO序列、在指定人转录物中的位置和错配数目示于2018年12月20日提交的美国临时申请62/782,877的表1中，其以引用的方式整体并入本文中。此外，鉴定了人KCNT1基因中的内含子靶序列。这些ASO序列在美国临时申请62/782,877的表2中。对于外显子定向ASO或内含子定向ASO，MM分别指示与NM_020822.2或NG_033070.1的错配的数目。

对于ASO序列，还使用NCBI RefSeq R92(2019年1月)和Ensemble R94(2018年10月)数据库确定了与非KCNT1剪接的(次级)mRNA转录物的同源性。2019年6月17日提交的美国临时申请62/862,328(其以引用的方式整体并入本文)的表3列出了随着错配(MM)数目从0MM增加至4MM而鉴定的非KCNT1转录物的数目。

对于ASO序列，还使用Ensemble R94(2018年10月)数据库确定了与非KCNT1非剪接(初级)前体mRNA转录物的同源性。2019年6月17日提交的美国临时申请62/862,328的表4列出了随着错配(MM)数目从0MM增加至4MM而鉴定的非KCNT1转录物的数目。

对于ASO序列，还使用NCBI dbSNP Build 151(2017年10月，2019年1月下载)确定了ASO序列内报道的单核苷酸多态(SNP)的位置。2019年6月17日提交的美国临时申请62/862,328的表5列出了每个SNP的位置和相关的SNP ID。

表2显示ASO序列的SEQ ID NO、那些ASO序列在指定人转录物中的位置和错配(MM)的数目。值得注意的是，与NM_020822.2(SEQ ID NO:3526)比较，确定了SEQ ID NOs:1-96和117-3525的错配的数目。与NG_033070.1比较，确定了SEQ ID NO:97-116的错配的数目。

对于选择ASO，使用taqman定量聚合酶链反应(qPCR测定)确定了KCNT1 mRNA敲减的程度。使人(BE(2)-M17)或小鼠(Neuro2a)神经元细胞系在96孔板中生长，并使用RNAiMAX转染试剂(ThermoFisher Scientific)用30nM或300nM ASO转染。在37℃下孵育48小时后，使用Cell-to-Ct试剂盒(ThermoFisher Scientific)从每个孔中制备cDNA。KCNT1的表达水平使用针对KCNT1(人Hs01063050_m1或小鼠Mm01330638_g1)或持家基因HPRT1(人Hs02800695_m1或小鼠Mm00446968_m1)的Taqman qPCR测定来确定。所有taqman测定均由ThermoFisher Scientific预先设计。人KCNT1和HPRT1检测在单个孔中多重进行。小鼠KCNT1和HPRT1检测在配对孔中单重进行。KCNT1的倍数变化使用ΔΔCp方法计算，其中首先将KCNT1的表达归一化至在同一孔中的HPRT1(2^{-(Cp_KCNT1-Cp_HPRT1)})，然后二次归一化至媒介物，非转染对照(2^{-(Cp_ASO-Cp_媒介物)})。测定以生物一式两份地进行并以技术一式三份地进行。表3列出在人(BE(2)-M17)或小鼠(Neuro2a)细胞中表达的KCNT1的敲减百分比。

鉴定了与人KCNT1具有高度同源性而与食蟹猕猴KCNT1和小鼠KCNT1具有较低同源性的序列。ASO序列、在指定的人转录物中的位置和错配数目示于美国临时申请62/862,328的表7和2019年8月8日提交的美国临时申请62/884,567的表11中，其以引用的方式整体并入本文。MM指示错配的数目。

对于ASO序列，还使用NCBI RefSeq R92(2019年1月)和Ensemble R94(2018年10月)数据库确定与非KCNT1剪接的(次级)mRNA转录物的同源性。美国临时申请62/862,328的表8和美国临时申请62/884,567的表12列出随着错配数目从0MM增加至4MM而鉴定的非KCNT1转录物的数目。

对于ASO序列，还使用Ensemble R94(2018年10月)数据库确定与非KCNT1非剪接(初级)前体mRNA转录物的同源性。美国临时申请62/862,328的表9和美国临时申请62/884,567的表13列出随着错配数目从0MM增加至4MM而鉴定的非KCNT1转录物的数目。

对于ASO序列，还使用NCBI dbSNP Build 151(2017年10月，2019年1月下载)确定了ASO序列内报道的单核苷酸多态(SNP)的位置。美国临时申请62/862,328的表10和美国临时申请62/884,567的表14列出每个SNP的位置和相关的SNP ID。

对于ASO序列，还使用人(BE(2)-M17)或小鼠(Neuro2a)神经元细胞系确定了KCNT1敲减的水平。表4列出以敲减百分比表示的数据。

表3：示例性ASO-在人(BE(2)-M17)或小鼠(Neuro2a)细胞中表达的KCNT1的敲减百分比

实施例2.KCNT1的反义抑制

可以使用基于细胞的测定来表明KCNT1的抑制或敲减。例如，可以遵循制造商的说明书使用诸如lipofectamine 2000(Invitrogen)的转染试剂使用至少五种不同的剂量水平的上文在实施例1中鉴定的靶向KCNT1的寡核苷酸测试来源于iPSC、SH-SY5Y细胞或另一可得到的哺乳动物细胞系(例如，CHO细胞)的神经元。在多个时间点直至转染后7天收集细胞以用于mRNA或蛋白质分析。mRNA和蛋白质的敲减分别通过RT-qPCR或蛋白质印迹法分析使用如前所述的标准分子生物学技术(参见，例如，如Drouet等人,2014,PLOS One 9(6):e99341中所述)来确定。将在不同寡核苷酸水平下的KCNT1 mRNA和蛋白质的相对水平与模拟寡核苷酸对照进行比较。选择最有效的寡核苷酸(例如，当与对照比较时，能够使蛋白水平降低至少90％，例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)用于后续研究。

实施例3.具有修饰化学品的反义寡核苷酸的设计、选择和测试

实施例1中测试的选定的ASO用如表4和表5中所示的糖和键联化学品合成。

对于选择ASO，使用taqman定量聚合酶链反应(qPCR测定)确定了KCNT1 mRNA敲减的程度。使人(BE(2)-M17)神经元细胞系在96孔板中生长，并使用RNAiMAX转染试剂(ThermoFisher Scientific)用100nM ASO转染。在37℃下孵育48小时后，使用Cell-to-Ct试剂盒(ThermoFisher Scientific)从每个孔中制备cDNA。KCNT1的表达水平使用针对KCNT1(人Hs01063050_m1或小鼠Mm01330638_g1)或持家基因HPRT1(人Hs02800695_m1或小鼠Mm00446968_m1)的Taqman qPCR测定来确定。所有taqman测定均由ThermoFisherScientific预先设计。KCNT1和HPRT1检测在单个孔中多重进行。KCNT1的倍数变化使用ΔΔCp方法计算，其中首先将KCNT1的表达归一化至在同一孔中的HPRT1(2^{-(Cp_KCNT1-Cp_HPRT1)})(多重反应)，然后二次归一化至媒介物，非转染对照(2^{-(Cp_ASO-Cp_媒介物)})。测定以生物一式两份地进行并以技术一式三份地进行。

表5提供了寡核苷酸ASO序列、在KCNT1转录物(NCBI NM_020822.2(SEQ ID NO:3526))中的位置和用于修饰ASO的化学品。在ASO缺口列中，“d”是DNA，“e”指示包含2'-修饰的(例如，2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'MOE)修饰的)核糖的核糖核苷，并且“k”指示双环糖(例如，锁核苷(LNA)或cET)。在ASO键联列中，“s”指示硫代磷酸酯键联且“o”指示磷酸二酯键联。在“ASO胞嘧啶”列中，“无”指示所有胞嘧啶均未被修饰，而“修饰的”指示所有胞嘧啶均为5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶(5-甲基-dC)。为了产生ASO特异性阴性对照，选择的ASO(SEQ IDNO:3512-3525)使用在5、9、13、17位的工程化错配(MM)或加扰(SC)策略合成，其中原始序列在5个区块中重新排序。这些阴性对照由在NM_020822.2上的原始结合位置组织。

表5：序列的缺口设计、键联化学品和胞嘧啶修饰。

表6提供寡核苷酸ASO序列、在KCNT1转录物(NCBI NM_020822.2)中的位置、用于修饰ASO的化学品以及用指示的ASO处理后BE(2)-M17细胞中KCNT1的敲减百分比。在此，如第一列中所示，对应于不同ASO序列的数据根据KCNT位置组织。在ASO缺口列中，“e”指示2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'MOE)修饰的核苷，并且“k”指示锁核苷(LNA)。在ASO键联列中，“s”指示硫代磷酸酯键联且“o”指示磷酸二酯键联。在“ASO胞嘧啶”列中，“无”指示所有胞嘧啶均未被修饰，而“修饰的”指示所有胞嘧啶均为5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶(5-甲基-dC)。

与匹配的靶向ASO相比，所有ASO特异性阴性对照(SEQ ID NO:3512-3525)在BE(2)-M17细胞中产生较少的KCNT1敲减。这些数据证实测定的特异性，并突出敲减对序列同源性的依赖性。以各种化学品获得的敲减之间通常具有良好的一致性。然而，一些ASO序列根据所使用的化学品表明显著不同的活性(1354位：SEQ ID NO:1208具有21％的敲减相对于SEQ ID NO:3457具有59％的敲减)。另外，胞嘧啶修饰的ASO对大多数测试的ASO始终更有效。尽管在测试的整体热点中的每一个(NM_020822.2(SEQ ID NO:3526)：655至680、1340至1370、1740至1815和3110至3171)中都观察到了活性，但某些ASO具有更高的活性，这是序列同源性无法预测的。

表6：在人(BE(2)-M17)神经元细胞中表达的KCNT1的敲减百分比。序列根据KCNT1位置组织。

下表7显示在用具有相应SEQ ID NO的序列的ASO处理后BE(2)-M17细胞中KCNT1的敲减百分比。

表7：在根据SEQ ID NO组织的人BE(2)-M17细胞中表达的KCNT1的敲减百分比。

实施例4.选择反义寡核苷酸的评价

对于选择ASO，使用taqman定量聚合酶链反应(qPCR测定)确定了KCNT1 mRNA敲减的程度。使用Amaxa核转染(方案CA137)，用500nM至10,000nM ASO转染人(SH-Sy5Y)神经元细胞系。在37℃下孵育48小时后，使用Cell-to-Ct试剂盒(ThermoFisher Scientific)从每个孔中制备cDNA。KCNT1的表达水平使用针对KCNT1(人Hs.PT.58.19442766)或持家基因HPRT1(人Hs.PT.58v.45621572)的taqman qPCR测定来确定。所有taqman测定都通过整合DNA技术预先设计。KCNT1和HPRT1检测在单个孔中多重进行。KCNT1的倍数变化使用ΔΔCp方法计算，其中首先将KCNT1的表达归一化至在同一孔中的HPRT1(2^{-(Cp_KCNT1-Cp_HPRT1)})(多重反应)，然后二次归一化至媒介物，非转染对照(2^{-(Cp_ASO-Cp_媒介物)})。测定以生物一式两份地进行并以技术一式三份地进行。

图1是表明响应于不同反义寡核苷酸处理(具体地，对应于SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:751、SEQ ID NO:759、SEQ ID NO:1206和SEQ ID NO:1546的反义寡核苷酸)的hKCNT1的敲减百分比的图。敲减值的数值百分数示于下表8中。阳性对照是SEQ ID NO:7。阴性对照是具有相同化学性质但具有在人基因组中未发现的序列的ASO。

表8：表示为平均敲减百分比的敲减百分比数据。

所有测试的ASO都表现出KCNT1表达的剂量依赖性敲减。如SEQ ID NO.4和1546中所示的ASO表现出最有效的KCNT1基因敲减，当用5μM ASO寡核苷酸处理时，基因表达降低大于80％。每个ASO的IC50示于表9中。

表9.选择的ASO在SH-SY5Y神经元细胞中的IC50

其他实施方案

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都以引用的方式整体并入本文，就如同特定地和个别地指示将每个个别出版物、专利或专利申请以引用的方式整体并入本文一般。当发现本申请中的术语在以引用的方式并入本文的文献中被不同地定义时，本文提供的定义将用作所述术语的定义。

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