具体实施方式

为使本发明的目的、优点和特征更加清楚，以下结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明实施例所提供的冷冻保存液套件用于对卵母细胞或胚胎进行冷冻保存。所述冷冻保存液套件包括玻璃化液，所述玻璃化液包括重组人血清白蛋白(RecombinantHuman Serum Albumin，rHSA)溶液、渗透性抗冻剂、非渗透性保护剂及缓冲体系。其中，所述重组人血清白蛋白溶液优选为植物源重组人血清白蛋白溶液，其可以由市售的植物源重组人血清白蛋白冻干粉溶解于蒸馏水中制备而成，例如所述植物源重组人血清白蛋白冻干粉可为sciencell公司生产的rHSA。所述渗透性抗冻剂可选自二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇、甘油中的任两种，例如二甲基亚砜和乙二醇。所述非渗透性保护剂可选自蔗糖、果糖、棉子糖、乳糖、海藻糖中的至少一种，所述缓冲体系可以是常规缓冲体系，例如TCM99 HEPES、输卵管液(如人类输卵管液，HTF)中的任一种。

本实施例中，所述玻璃化液的各种成分均可由人工手段合成并提纯，使得所述玻璃化液的成分稳定可控，并避免存在潜在威胁，从而确保各批次的冷冻保护液均具有良好的保存效果。

优选地，所述玻璃化液的各组分的含量如下：所述非渗透性保护剂的浓度为0.5mol/L-2mol/L。以体积分数计，所述缓冲体系的含量为40％-80％。所述渗透性抗冻剂的含量为20％-40％，且优选每一种所述渗透性抗冻剂的含量分别为10％-20％。所述重组人血清白蛋白溶液的含量为5％-20％，且所述重组人血清白蛋白溶液的质量分数为5％-10％。在配制所述玻璃化液时，首先将重组人血清白蛋白冻干粉溶于蒸馏水中并配制为质量分数介于5％-10％之间的重组人血清白蛋白溶液，然后采用该重组人血清白蛋白溶液与非渗透性保护剂、渗透性抗冻剂及缓冲体系一起配制得到所述玻璃化液。

进一步地，所述冷冻保存液套件还包括平衡液，所述平衡液的主要成分及配制方法与所述玻璃化液基本相同，两者仅各组分的浓度存在差异。具体地，所述平衡液中，所述非渗透性保护剂的浓度为0.2mol/L-1mol/L，以体积分数计，所述渗透性抗冻剂的含量为10％-20％，且优选每一种所述渗透性抗冻剂的含量分别为5％-10％，所述缓冲体系的含量为60％-75％，所述重组人血清白蛋白溶液的含量为5％-20％，且所述重组人血清白蛋白溶液的质量分数为5％-10％。

所述平衡液和所述玻璃化液用于对待冷冻保存的细胞进行冷冻前的前处理，使细胞脱水的同时部分渗透性抗冻剂进入细胞内部，在冷冻降温过程中，细胞内部不会形成胞内冰，防止胞内冰对细胞的损害，并且细胞外部的保护剂能防止细胞外的冰晶形成而损伤细胞。所述待冷冻保存的细胞可以是卵母细胞或胚胎。

进一步地，所述冷冻保存液套件还可以包括解冻液、稀释液和洗涤液。其中，所述解冻液包括如下组分：缓冲体系、重组人血清白蛋白溶液和非渗透性保护剂；其中，所述缓冲体系的体积分数为80％-95％，所述非渗透性保护剂的浓度为0.5mol/L-2mol/L，所述重组人血清白蛋白溶液的体积分数为5％-20％，且所述重组人血清白蛋白溶液的质量分数为5％-10％。所述稀释液包括如下组分：缓冲体系、重组人血清白蛋白溶液和非渗透性保护剂；其中，所述缓冲体系的体积分数为80％-95％，所述非渗透性保护剂的浓度为0.2mol/L-1mol/L，所述重组人血清白蛋白溶液的体积分数为5％-20％，且所述重组人血清白蛋白溶液的质量分数为5％-10％。所述清洗液包括如下组分：缓冲体系、重组人血清白蛋白溶液和非渗透性保护剂；其中，所述缓冲体系的体积分数为80％-95％，所述非渗透性保护剂的浓度为0-0.5mol/L，所述重组人血清白蛋白溶液的体积分数为5％-20％，且所述重组人血清白蛋白溶液的质量分数为5％-10％。

在所述解冻液、所述稀释液及所述清洗液中，所述非渗透性保护液可包括蔗糖、果糖、棉子糖、乳糖、海藻糖中的至少一种；所述缓冲体系包括TCM99 HEPES、HTF中的任一种。另外，类似于所述玻璃化液的配制，在配制所述解冻液、所述稀释液及所述清洗液时，均是先将重组白蛋白冻干粉溶解于蒸馏水中以配制质量分数介于5％-10％的重组白蛋白溶液，然后再采用所述重组白蛋白溶液与其他成分共同配制得到相应的操作液(即解冻液、稀释液或清洗液)。

本发明实施例所提供的冷冻保存液套件中，所述平衡液和所述玻璃化液用于对待冷冻保存的细胞进行前处理，以置换出细胞中的游离水，使细胞内的溶液达到玻璃化的水平，并降低低温对细胞所造成的伤害。所述解冻液、稀释液及洗涤液用于已冷冻细胞的复苏。所述冷冻保存液套件的各组分均可人工合成或提纯，使得所述冷冻保存液套件的性能可控，具有较高的可靠性。

基于前述的冷冻保存液套件，本发明实施例还提供了一种细胞保存方法，包括：将细胞加入到所述玻璃化液中进行玻璃化处理，之后将已玻璃化处理过的细胞置于液氮罐中进行冷冻保存。

进一步地，在对所述细胞进行玻璃化处理之前，还可先将所述细胞置于所述平衡液中平衡一段时间，然后再使用玻璃化液脱水处理。通过平衡之后再进行玻璃化处理，可使细胞渐进地脱水，防止脱水过程过于急促，造成细胞死亡。

再进一步地，本发明实施例还提供了一种细胞复苏方法，其用于对通过前述细胞保存方法进行冷冻保存的细胞进行复苏处理。

所述细胞复苏方法包括：将冷冻的细胞置于所述解冻液中进行解冻。之后，还可将解冻后的细胞置于所述稀释液中稀释，通过稀释降低细胞外的渗透压，让渗透性抗冻剂从细胞中脱出。之后，还可采用所述清洗液清洗所述细胞，清洗次数为1-2次，优选清洗2次，每次清洗时所采用的清洗液可相同，也可不相同。由于清洗液的渗透压更低，可进一步脱除细胞内部的渗透性抗冻剂；通过两次清洗，能够更彻底地洗脱对细胞有毒的渗透性抗冻剂。

下面，本文结合具体的实施例说明利用所述冷冻保存液套件对细胞的保存效果。应理解，以下实施例仅以列举的方式对本发明作说明，其并不应对本发明构成限制，另外，下文中出现的百分数，除非特别说明，否则一律是指体积百分数。

实施例一

本实施例中采用小鼠的胚胎作为实验对象，具体的实验方案如下：

小鼠促排卵后，雌雄同笼过夜。第二天取胚胎，并将该胚胎在体外继续培养84h，收集发育后的胚胎。

接着冷冻胚胎。

首先，配置所述平衡液及所述玻璃化液。其中，所述平衡液包括：0.2mol/L的蔗糖、7.5％的二甲基亚砜、7.5％的乙二醇、70％的TCM99 HEPES及15％的rHSA溶液，且rHSA溶液的质量分数为10％。所述玻璃化液包括0.5mol/L的蔗糖、15％的二甲基亚砜、15％的乙二醇、55％的TCM99 HEPES、15％的rHSA溶液，且rHSA溶液的质量分数为10％。

之后，将所述平衡液滴加在1号培养皿中，将所述玻璃化液滴加在2号培养皿中，平衡至室温。用吸管将胚胎转移至1号培养皿并静置10min，之后，再将胚胎转移至2号培养皿静置50s进行玻璃化处理，最后将玻璃化处理后的胚胎装载于冷冻载体中，例如Cryotop冷冻载体，并投入液氮罐进行冷冻保存。

一段时间后对胚胎进行复苏处理。

首先，配置解冻液、稀释液及清洗液，其中，所述解冻液的温度控制在37℃左右，所述解冻液包括2mol/L的蔗糖、85％的TCM99 HEPES及15％的rHSA溶液，且rHSA溶液的质量分数为10％。所述稀释液包括1mol/L的蔗糖、85％的TCM99 HEPES及15％的rHSA溶液，且rHSA溶液的质量分数为10％。所述清洗液包括清洗液一和清洗液二，所述清洗液一包括0.2mol/L的蔗糖、85％的TCM99 HEPES及15％的rHSA溶液，且rHSA溶液的质量分数为10％，所述清洗液二包括85％的TCM99 HEPES及15％的rHSA溶液，且rHSA溶液的质量分数为10％。

之后，将冷冻的胚胎置于所述解冻液中，并静置1min解冻。之后，将胚胎转移至稀释液中浸泡3min。之后采用所述清洗液一对稀释后的胚胎进行第一次清洗，清洗时间为5min，再采用所述清洗液进行第二次清洗，清洗时间为5min。

接着，将胚胎置于培养液中培养24h。

最后，统计囊胚存活率和发育率，其中存活囊胚的数量包括已孵化的胚胎。

本实施例共进行三组实验，其中图1所示为一组实验中部分胚胎发育的显微照片，图中1、3、4、6、7、9、10、11、12为存活囊胚，且7为已孵化的胚胎。2、5、8、13为萎缩凋亡胚胎。本实施例三组实验的结果如表1所示。

对比例一

本对比例一与实施例一的区别之处仅在于采用天然人类血清白蛋白替代所述重组人类血清白蛋白。对比例一亦进行三组实验，实验结果见表一所示。

表一

带“*”表示该组实验结果与其他组别有显著差异p<0.01。

通过表一可清楚地看到本发明实施例提供的冷冻保存液套件可有效提高卵母细胞或胚胎的保存效果。此外，由于天然人类血清白蛋白无法通过高温等方式灭菌，可能含有人类病毒，因此发明实施例采用植物源重组人血清白蛋白的冷冻保存液套件在安全性和保存效果上均更为出色。

实施例二

本实施例与实施例一的区别之处在于：

所述平衡液包括0.2mol/L的蔗糖、7.5％的二甲基亚砜、7.5％的乙二醇、80％的TCM99 HEPES及5％的rHSA溶液，且rHSA溶液的质量分数为5％。

所述玻璃化液包括0.5mol/L的蔗糖、15％的二甲基亚砜、15％的乙二醇、65％的TCM99 HEPES及5％的rHSA溶液，且rHSA溶液的质量分数为5％。

所述解冻液包括2mol/L的蔗糖、95％的TCM99 HEPES及5％的rHSA溶液，且rHSA溶液的质量分数为5％。

所述稀释液包括1mol/L的蔗糖、95％的TCM99 HEPES及5％的rHSA溶液，且rHSA溶液的质量分数为5％。

所述清洗液一包括0.2mol/L的蔗糖、80％的TCM99 HEPES及5％的rHSA溶液；所述清洗液二包括95％的TCM99 HEPES及5％的rHSA溶液，rHSA溶液的质量分数为5％。

以及，胚胎在所述平衡液中的处理时间为10min，在所述玻璃化液中的处理时间为60s。

本实施例共进行三组，实验结果见表二。

实施例三

本实施例与实施例一的区别之处在于，所述冷冻保存液套件的各操作溶液(平衡液、玻璃化液、解冻液、稀释液及清洗液)中，rHSA溶液的质量分数均为5％，以及胚胎在所述平衡液中的处理时间为10min，在所述玻璃化液中的处理时间为60s。

本实施例共进行三组，实验结果见表二。

实施例四

本实施例与实施例一的区别之处在于：

所述平衡液包括0.2mol/L的蔗糖、7.5％的二甲基亚砜、7.5％的乙二醇、65％的TCM99 HEPES及20％的rHSA溶液，且rHSA溶液的质量分数为5％。

所述玻璃化液包括0.5mol/L的蔗糖、15％的二甲基亚砜、15％的乙二醇、50％的TCM99 HEPES及20％的rHSA溶液，且rHSA溶液的质量分数为5％。

所述解冻液包括2mol/L的蔗糖、80％的TCM99 HEPES及20％的rHSA溶液，且rHSA溶液的质量分数为5％。

所述稀释液包括1mol/L的蔗糖、80％的TCM99 HEPES及20％的rHSA溶液，且rHSA溶液的质量分数为5％。

所述清洗液一包括0.2mol/L的蔗糖、80％的TCM99 HEPES及20％的rHSA溶液，所述清洗液二包括80％的TCM99 HEPES及20％的rHSA溶液。rHSA溶液的质量分数为5％。

以及，胚胎在所述平衡液中的处理时间为10min，在所述玻璃化液中的处理时间为60s。

本实施例共进行三组，实验结果见表二。

表二

带“*”表示该组实验结果与其他组别有显著差异p<0.01。

通过实施例二至实施例四对比可知，在rHSA溶液的质量分数相同的情况下，随所述冷冻保存液套件各操作溶液(即平衡液、玻璃化液、解冻液、稀释液及清洗液)中rHSA的体积分数的增大，经所述冷冻保存液套件保存的卵母细胞或胚胎囊胚率先增大后减小。这是因为，rHSA对细胞膜具有保护作用，若rHSA的含量较少，其不能对细胞起到有效的保护，而当rHSA的含量过多时，缓冲体系的含量就相对较少，使得所述冷冻保护液套件的PH不能得到有效控制，而细胞对PH很敏感，不合适的PH极易导致细胞死亡。

实施例五

本实施例与实施例一的区别之处在于：

本实施例中采用小鼠的卵母细胞作为实验对象。

所述平衡液包括1mol/L的果糖、10％的丙二醇、5％的甘油、65％的HTF及20％的rHSA溶液，且rHSA溶液的质量分数为8％。

所述玻璃化液包括2mol/L的果糖、10％的丙二醇、5％的甘油、65％的HTF及20％的rHSA溶液，且rHSA溶液的质量分数为8％。

所述解冻液包括0.5mol/L的果糖、80％的HTF及20％的rHSA溶液，且rHSA溶液的质量分数为8％。

所述稀释液包括0.2mol/L的果糖、80％的HTF及20％的rHSA溶液，且rHSA溶液的质量分数为8％。

所述清洗液一包括0.5mol/L的果糖、80％的HTF及20％的rHSA溶液，所述清洗液二包括0.1mol/L的果糖、80％的HTF及20％的rHSA溶液。rHSA溶液的质量分数为8％。

以及，卵母细胞在所述平衡液中的处理时间为20min，在所述玻璃化液中的处理时间为45s。

实施例六

本实施例与实施例一的区别之处在于：

本实施例中采用小鼠的卵母细胞作为实验对象。

所述平衡液包括1mol/L的棉子糖、10％的丙二醇、10％的甘油、60％的HTF及20％的rHSA溶液，且rHSA溶液的质量分数为8％。

所述玻璃化液包括2mol/L的棉子糖、10％的丙二醇、10％的甘油、60％的HTF及20％的rHSA溶液，且rHSA溶液的质量分数为8％。

所述解冻液包括0.5mol/L的棉子糖、85％的HTF及15％的rHSA溶液，且rHSA溶液的质量分数为8％。

所述稀释液包括0.2mol/L的棉子糖、85％的HTF及15％的rHSA溶液，且rHSA溶液的质量分数为8％。

所述清洗液一包括0.5mol/L的棉子糖、85％的HTF及15％的rHSA溶液，所述清洗液二包括0.1mol/L的棉子糖、85％的HTF及15％的rHSA溶液。rHSA溶液的质量分数为8％。

以及，卵母细胞在所述平衡液中的处理时间为20min，在所述玻璃化液中的处理时间为45s。

实施例七

本实施例与实施例一的区别之处在于：所述非渗透性保护剂为棉子糖，所述渗透性抗冻剂为丙二醇和乙二醇。

实施例八

本实施例与实施例一的区别之处在于：所述非渗透性保护剂为海藻糖，所述渗透性抗冻剂为丙二醇和甘油。

实施例九

本实施例与实施例一的区别之处在于：所述非渗透性保护剂为乳糖。

虽然本发明披露如上，但并不局限于此。本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。